Conformational flexibility of DNA. Ein Vortrag im Rahmen des Seminars Moderne Anwendungen der magnetischen Resonanz von Julian Teichmann

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1 Conformational flexibility of DNA Ein Vortrag im Rahmen des Seminars Moderne Anwendungen der magnetischen Resonanz von Julian Teichmann

2 Inhalt Einleitung / Kurzer Überblick Motivation Vorangegangene Versuche Wesentliche Resultate des Papers Methodik PELDOR Auswertung Alternative/Anwendungen/Outlook Literaturverzeichnis 1

3 Einleitung / Kurzer Überblick Conformational Flexibility of DNA J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, Untersuchungen eines DNA-Doppelstranges mittels EPR Genauer: Dynamik des DNA-Stranges bei Bewegung (Dehnung) Bisher angenommen: Verhalten wie elastischer Stab 2

4 Motivation Bekannte Dynamik eines DNA Stranges erlaubt Vorhersagen über Verhalten bei verschieden Prozessen wie: Replikation Transkription Bildung von Nukleosomen etc. Bildquelle: DNA Strang wird gebogen und verdreht, um mit Proteinen zu wechselwirken Außerdem: vorangegangene Versuche zeigen unerwartetes Verhalten Abweichungen vom klassischen Modell 3

5 Erste Zweifel am klassischen Model / Vorangegangene Versuche DNA wurde mit Magnet auseinandergezogen Fluorophor in der Mitte des Strangs positioniert Rotierende Bewegung des Fluorophors gemessen Rotation + Dehnung = Verdrillung Passt nicht zum Modell des elastischen Stabes Modellierung: Steifer Draht (Zucker-Rückgrat) um elastischen Stab gewickelt 4

6 Weitere Versuche Goldpartikel an den Enden des DNA-Stranges befestigt Untersuchung mit Röntgenstrahlung Science 2008, 322, Zeigte bei Dehnung: Nicht lineare Verknüpfung zwischen Anzahl Basenpaare und Längenänderung und Abstandsverteilung Abnormales Verhalten passt ebenfalls nicht zum elastischen Stab Aber: Berechnungen ließen Abstoßung der Goldpartikel vermuten, sodass Ergebnisse angezweifelt wurden. 5

7 Ansatzpunkt des Papers Verschiedene Modelle wie ein DNA Strang auf Dehnung reagieren kann: A. Er wird länger und der die Abstände zwischen den Windungen wird größer B. Er wird länger und der Radius wird kleiner C. Er wird länger indem er sich verbiegt Bildquelle: J. Am. Chem. Soc. 2011, 133,

8 Ergebnisse des Papers Bildquelle: J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, Dehnung durch Radiusverkleinerung, bei gleichem Abstand zwischen den Windungen (Entspricht Modell B) 7

9 Methodik DNA Strang mit Nitroxid-Spinlabels an bestimmten Stellen In gefrorener wässriger Lösung bei 40 K Dadurch Schnappschuss der verschiedenen Dehnungszustände des DNA- Strangs Viele verschiedene Proben mit unterschiedlichem Abstand der Spinlabels Untersuchung mit PELDOR 8

10 PELDOR Pulsed Electron-Electron Double Resonance 1981 haben Yu.D. Tsvetkov et all aus Novosibirsk 3-Pulssequenz entwickelt Später wurde sie auf 4 Pulse erweitert ermöglich Messung ohne Totzeit Abstandsbestimmung im nm Bereich (2-8 nm) Ideal für Biomoleküle Auch kann Abstandsverteilung ΔR gemessen werden, aber dabei geht Winkelinformation verloren 9

11 Nicht nur Abstandsmessungen Nicht nur Abstandsmessung möglich, sondern auch Orientierung der Spinlabels. Genauer: die Orientierung des G-tensors Verändert sich bei Verdrillung Bildquelle: J. Am. Chem. Soc. 2011, 133,

12 PELDOR im Detail Messungen bei hohen Zeemanfeldern Verwendung von hohen Mikrowellfrequenzen typische X-band EPR Frequenzen Nutzt die Elektron-Elektron Dipolwechselwirkung: Durch unterschiedliche Ausrichtung der Spinlabels findet Absorption an unterschiedlichen Stellen des Nitroxidspektrums statt Erlaubt die Ermittlung der Orientierung des G-Tensors der gekoppelten Spinlabel 11

13 PELDOR Pulssequenz Modulation des Spin-Echos durch eine 4 Pulssequenz mit gleicher (selten) oder unterschiedlicher (häufig) Frequenz Nitroxidspektrums (links, schwarz) Beobachterfrequenz (A-Spins, rot) Pumpfrequenz (B-Spins, blau). t Bildquelle: Uni Konstanz Durch Hahn-Echo können Anregepuls und zeitlicher Nullpunkt zeitgleich gelegt werden keine Totzeit Die Intensität V(t) des refokussierten Echos wird moduliert durch zeitlichen Position (t) des Pumppulses. 12

14 Auswertung Vergleich der Versuchsdaten mit berechneten Werten für alle 3 Modelle Nur völlige Übereinstimmung mit Modell B Bildquelle: J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, A Variation der Frequenzdifferenz zwischen Anrege und Abtastpuls B Mit konstaten Frequenzdifferenzen an 3 Stellen des Nitroxid-Spektrums gemessen 3 Extrem-Position: xx, yy, zz 13

15 Auswertung der Abstandsverteilung A Bildquelle: Science 2008, 322, Bildquelle: J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, A: Vergleich der Abstandsverteilungen ΔR aus dem Experiment mit Goldpartikeln und PELDOR Bildquelle: J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, B: Auftragung von ΔR 2 gegen die Position des zweiten Labels: Nur Modell B (grün) passt zu den gemessenen Werten. 14

16 Outlook/Alternative zu PELDOR Single-frequency 6-pulse techniques DQC (double-quantumcoherence) von J.H. Freed et all aus Cornell Alle 6 Pulse bei gleicher Frequenz (Resonanzfrequenz von A) Starke Pulse um gesamte spektrale Verteilung der Spins anzuregen Vorteil: sensitiver Nachteil: Teure/unausgereifte Geräte/Pulssequenzen 15

17 Anwendung/Outlook Diese Methoden liefern: Wichtige Informationen zu Molekülen (Abstand/Abstandsverteilung und Orientierung von Teilen des Moleküls) Gute Ergänzung zu NMR oder Röntgen-Kristallographie Erlaubt Messung ohne Eingriffe in die Zelle! Was könnte man noch machen? Messungen an RNA DNA Stränge mit bestimmten Strukturen (Poly A, Fehlstellen etc.) messen Dynamik bei Bindung an Proteinen oder im Zellkern messen 16

18 Literaturverzeichnis Vorgestelltes Paper: Conformational Flexibility of DNA J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, Weitere Literatur: Nitroxyls and PELDOR: Nitroxyl radicals in pulsed electron-electron double resosonance spectroscopy Yu. D. Tsvetkov Journal of Structural Chemistry, Vol. 54, Supplement 1, pp. S42-S72, 2013 Pulsed electron electron double resonance: beyond nanometre distance measurements on biomacromolecules Gunnar W. REGINSSON and Olav SCHIEMANN Biochem. J. (2011) 434, Pulsed Electron Double Resonance (PELDOR) and Its Applications in Free-Radicals Research A. D. Milov, A. G. Maryasov, and Y. D. Tsvetkov Appl. Magn. Reson. 15, (1998) High-field EPR on membrane proteins Crossing the gap to NMR Klaus Möbius, Wolfgang Lubitz, Anton Savitsky Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 75 (2013)

19 Ende Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit 18