Der Kern-Overhauser-Effekt (Nuclear Overhauser Effect, NOE)

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1 Der Kern-Overhauser-Effekt (Nuclear Overhauser Effect, NOE) B 2 S I Die Intensität eines 1 H-Signals kann durch ein Entkopplungsexperiment verändert werden. Wird der Übergang eines ausgewählten H-Kerns S des Moleküls M für eine gewisse Zeit (im Sekundenbereich) selektiv durch ein Entkopplerfeld B 2 angeregt M und dabei sein Populations-Gleichgewicht gestört (Sättigung), kann das Relaxationsverhalten eines Nachbarkerns I durch die durch den Raum wirkende dipolare Kopplung in der Weise beeinflusst werden, dass seine Signalintensität vergrößert wird. Dies ist aber nur möglich, wenn der Abstand r zwischen S und I möglichst klein ist, weil die Wechselwirkung durch dipolare Kopplung mit r -6 abnimmt. Dies bedeutet, dass der Abstand keinesfalls größer als 3-5 Å werden darf. B 2 (selektiv) t 1

2 NOE-Experimente sind also hervorragend für die halbquantitive Bestimmung der räumlichen Abstände von Protonen geeignet. Ein frühes Beispiel aus den 60er Jahren ist die Bestimmung der Konfigurationsisomeren eines Chinuclidin-Derivats (von Philipsborn): 2

3 Die Beeinflussung der Signalintensität von I ist eine Konsequenz der Kreuzrelaxation. Betrachten wir das Spinpaar I und S: S I I S Im Gleichgewichtszustand sind die Populationsdifferenzen durch das Boltzmann-Gleichgewicht bestimmt, bei dem für jeden Übergang jeweils der Grundzustand überpopuliert ist. Der Populationsunterschied sei 1; dann sind die mittlere Niveaus gleich 0, das untere +1/2 und das obere 1/2. 3

4 S I I S Zu Beginn des Experiments wird der S-Übergang gesättigt. Sättigung bedeutet, dass durch S verbundene Energiezustände die gleiche Population bekommen. Damit wird die Population von αα (1/2 > +1/4) und von βα (0 > 1/4) kleiner und die von αβ (0 > +1/4) und von ββ ( 1/2 > 1/4) größer. Einquantenübergänge bei der Relaxation von I bringen keine Änderung der Signalintensitäten von I. Der Populationsunterschied ist in beiden Fällen 1/2 - wie zuvor. Im Gegensatz zur Anregung sind bei der Relaxation Doppelquantenübergänge möglich. Damit gibt es zwei weitere Relaxationswege der Übergangswahrscheinlichkeiten wir W 0 und W 2 nennen wollen. 4

5 S I I S Beginnen wir mit W 2 (DQ da ββ -> αα -> netto 2 Spinzustände geändert): Durch die Relaxation wird der αα-zustand in seiner Population um einen Betrag, den wir δ/4 nennen wollen, vermehrt; entsprechend wird der ββ-zustand erniedrigt. Wegen der zugleich andauernden Sättigung des S-Übergangs betrifft die Populationsänderung genauso die βαbzw. αβ-zustände. Damit lässt sich eine neue Populationsdifferenz für die I- Übergänge errechnen: +1/4 +δ/4 - (-1/4 -δ/4) = 1/2 + δ/2 Durch diesen Relaxationsweg wird die Signalintensität erhöht. Eine quantitative Berechnung ergibt als maximal mögliche Intensitätserhöhung η bei dominierender Dipol-Dipol- Relaxation: η = 1/2 γ(s)/γ(i) T 1 /T 1 DD 5

6 S I I S Wie ist es mit W 0 (ZQ da βα -> αβ -> netto 0 Spinzustände geändert)? Durch die Relaxation wird der βα-zustand in seiner Population um einen Betrag, den wir δ/4 nennen wollen vermehrt; entsprechend wird der αβ-zustand erniedrigt. Wegen der zugleich andauernden Sättigung des S- Übergangs betrifft die Populationsänderung genauso die ββ- bzw. αα-zustände. Damit lässt sich eine neue Populationsdifferenz für die I- Übergänge errechnen: +1/4 -δ/4 - (-1/4 +δ/4) = 1/2 - δ/2 Durch diesen Relaxationsweg wird die Signalintensität erniedrigt. Die quantitative Berechnung ergibt als maximal mögliche Intensitätserhöhung η bei dominierender Dipol-Dipol- Relaxation: η = - γ(s)/γ(i) T 1 /T 1 DD 6

7 Es stellt sich die Frage, wann dominiert die W 2 und wann die W 0 -Relaxation? Um dies zu beantworten, müssen wir uns nur die Größenordnungen der Frequenzen anschauen, die zu diesen Übergängen gehören. Nehmen wir an, dass wir 1 H-Kerne bei 500 MHz messen. Bei dem Doppelquanten-Übergangswahrscheinlichkeit W 2 kommen MHz = 10 9 Hz zusammen. Diese Relaxation wird also dann gut funktionieren, wenn die Molekularbewegung in der gleichen Größenordnung liegt. Das entspricht durchaus der Brownschen Bewegung kleiner bis mittlerer Moleküle. Umgekehrt gilt für W 0 eine Frequenz von maximal einigen 10 3 Hz, je nach Unterschied der chemischen Verschiebungen von I und S. Dies entspricht sehr langsamen Bewegungen wie sie bei sehr großen Molekülen wie z.b. Biopolymeren in polaren Lösungsmitteln (Wasser) oder hochviskose Polymere. Hier wird man also negative Signale bekommen; allerdings abhängig vom Pulsprogramm verbunden mit Spin-Diffusion ( siehe später). 7

8 Bei heteronuklearen NOE-Experimenten ( 1 H-X) ist die Bewegungsabhängigkeit wie folgt; zunächst für Kerne mit positivem magnetogyrischen Verhältnis γ: schnelle Bewegung kleine Moleküle langsame Bewegung große Moleküle 8

9 Nun für Kerne mit negativem magnetogyrischen Verhältnis γ: schnelle Bewegung kleine Moleküle langsame Bewegung große Moleküle 9

10 Im homonuklearen ({ 1 H} 1 H) Fall γ(s) = γ(i)), kann eine maximale Intensitätssteigerung von 50% erreicht werden, d.h. das Signal kann dann 1+η = 150% der Intensität ohne Entkopplung von S erreichen (siehe Formel für η wenn W2 dominiert). Weil der NOE ursächlich mit dem dipolaren Anteil der longitudinalen Relaxationszeit zusammenhängt, baut er sich nur langsam auf und erreicht sein Maximum im Gleichgewicht üblicherweise erst nach einigen Sekunden (5 T 1 DD ). Im allgemeinen wird der theoretische Wert (1+η = 150% im { 1 H} 1 H-Experiment) dabei aber nicht erreicht; vielmehr sind in der Praxis Signalerhöhungen von nur 1-15 % der Normalfall. Solch geringe Werte sind beim Vergleich von Signalen mit und ohne Einstrahlung nur sehr schwer zu erkennen. Hier ist das Experiment der NOE-Differenz-Spektroskopie hilfreich. Dies sei in einem schematisierten Gedankenexperiment erläutert: B 2 A B C B 2 (selektiv) M t 10

11 In einem Molekül M existieren drei Protonen A, B und C. A wird wie oben beschrieben mit einem Entkopplerfeld selektiv bestrahlt (Pfeil). Der Kern B zeigt eine NOE-Antwort (Signalerhöhung), weil er A sehr nahe ist, während die Signalintensität von C wegen der großen Entfernung von A praktisch nicht beeinflusst wird. Man führt nun zwei Messexperimente durch, die sich nur dadurch unterscheiden, dass bei dem einen der Entkoppler zum Aufbau einer NOE-Antwort benachbarter 1 H-Kerne (Erhöhung der Signalintensität) vor der eigentlichen Messung für eine Weile (0.5 bis 1.5 s) angeschaltet wird, während er bei dem anderen ausgeschaltet bleibt. Man erhält zwei sehr ähnliche Spektren, die sich nur in den Intensitäten der Signale des entkoppelten und der NOE-beeinflussten Signale unterscheiden. Das eingestrahlte Signal des Kerns A hat dann die Intensität 0 bzw. 1, während das von B (1+η) bzw. 1 hat; C bleibt unverändert (1 bzw. 1). Eine Differenzbildung der beiden Spektren zeigt dann für A ein starkes negatives Signal (-1), für B ein kleines Signal (η) und keines für C. Die erhaltenen Signalintensitäten sind zwar am Spektrometer quantitativ bestimmbar, man sollte sich aber mit halbquantitative Abschätzungen begnügen. 11

12 NOE Diff.: II - I Spektrum III (NOE-Diff.) NOE gesättigt Spektrum II (NOE-Exp.) B 2 A B C Spektrum I (normal) 12

13 Beispiel: 7-Methoxycumarin (Herniarin) Selektive Einstrahlung 4 H 3 C O O 2 O 13

14 Man erkennt die NOE-Effekte an den Atomen H-6 und H-8. Dies liegt an der konformativen Beweglichkeit der Methoxygruppe; mal ist die Methylgruppe nahe H-6 und mal nahe H-8. Merke: Da die Einstrahlungsdauer gegenüber der Verweildauer in den einzelnen Konformeren um viele Größenordnungen (wahrscheinlich mehr als 12) länger ist, werden NOE-Effekte aus allen denkbaren Konformationen im Spektrum angezeigt. Es kann also leicht passieren, dass in einem NOE-Experiment Signal-Intensitätserhöhungen angezeigt werden, die mit einer einzigen Struktur/Konformation gar nicht in Übereinstimmung stehen. An den Signalpositionen für H-4, H-5 und H-3 sieht man kleine Restsignale, die auf unvollkommene Differenzbildung zurückzuführen sind. Führt man über diese Signale eine Integration durch, wird man ungefähr 0 erhalten. Auch wenn NOE-Differenz-Experimente einfach zu sein scheinen, muss man dennoch einige Effekte und Artefaktbildungen beachten: 14

15 Achtung: Abhängigkeit der NOE-Effekte ( 1 H- 1 H) von der Beweglichkeit des Moleküls: schnelle Bewegung kleine Moleküle langsame Bewegung große Moleküle 15

16 Beispiel: Tetrasaccharid eines Triterpenoids (in Pyridin-d 5 ) Man erkennt negative NOE-Signale aufgrund gehinderter Beweglichkeit des großen polaren Moleküls. Spin-Diffusion, die mit totalem Verlust der Entfernungsabhängigkeit einhergeht, ist aber noch nicht zu bemerken. 16

17 Achtung: Gefahr von Verfälschungen der Intensitäten von Teilsignalen durch Polarisationstransfer (PT) aufgrund starker skalarer Kopplung (Bsp: Campher) PT Selektive Einstrahlung PT 17

18 Bei Sättigung des endo-ständigen Protons H S wird eine sehr starke NOE-Antwort am geminalen H I erzeugt. Solche geminalen NOEs sind wegen der räumlichen Nähe der Protonen meist die stärksten, die überhaupt beobachtet werden. Sie liegen oft bei 10-15%. Wenn jedoch die B 2 -Feldstärkeverteilung nicht optimal eingestellt ist, kann es zu Polarisations-Transfer-Effekten (PT, ) an Signalen von Kernen kommen, die eine starke Kopplung zu dem gestörten Kern (hier: H S ) aufweisen. H I und H S haben eine 2 J-Kopplung von ca. -17 Hz; solche Werte gehören zu den größten, die überhaupt in der 1 H-NMR-Spektroskopie organischer Verbindungen auftreten. PT-Effekte verändern die relativen Intensitäten von Teilsignalen; die Gesamtintensität für das Signal bleibt aber gleich. Mit anderen Worten: NOE- und PT-Effekte treten voneinander unabhängig auf. Man kann also unbesorgt das Gesamtsignal integrieren und aus dem Integral den NOE abschätzen. 18

19 NOE-Differenz-Experimente beruhen auf der selektiven Vorsättigung einzelner Kerne. Dies ist zum einen ein wenig umständlich, zum anderen häufig sogar gar nicht sauber möglich, weil 1 H-Kerne zu nahe beieinander liegen und die Selektivität von B 2 nicht ausreicht. Ein weiterer Nachteil ist die erwähnte Abhängigkeit von der Beweglichkeit. In den vergangenen Jahrzehnten sind daher zahlreiche Experimente entwickelt worden, die die genannten Schwierigkeiten umgehen können, ohne aber auf die NOE-Information bezüglich räumlicher Entfernungen verzichten zu müssen. Das zweidimensionale NOESY-Spektrum ( siehe später) bietet hier einen Ausweg an, weil Vorsättigung nicht erfolgt. Allerdings bleibt die unangenehme Abhängigkeit von der Beweglichkeit erhalten. Aber auch hier gibt es Ersatzmethoden: ROESY ( siehe später), ebenfalls ein 2D- Experiment. Von allen zweidimensionalen Methoden gibt es auch eindimensionale Varianten (1D- NOESY, 1D-ROESY), die im Aussehen den NOE-Differenzspektren ähneln. Folgend noch ein paar Anwendungsbeispiele für NOE-Differenzexperimente. 19

20 Beispiel 1: An welchem der Kohlenstoffatome C-6 bis C-9 sitzt die Nitrogruppe? (s) NOE-Differenz-Spektrum O 2 N H 3 C H N N O 4 O CH 3 (s) Selektive Einstrahlung (d) Normales 1 H-NMR-Spektrum 20

21 Für die Bestimmung der Position der Nitrogruppe muss man die Methingruppen des aromatischen Rings mit den Atomen des Diazepinonrings korrelieren. Dies über skalare Kopplungen (durch die Bindungen) zu tun, ist wegen der dazwischen liegenden quartären C- und der N-Atome sehr schwierig. Strahlt man dagegen den Übergang der Acetyl-Methylgruppe ein, kann man durch den Raum induzierte NOE-Antworten erzeugen. Da diese Gruppe um die C-N-Bindung rotieren kann, kommt sie häufig in die unmittelbare Nähe des Protons an C-6. Alle anderen aromatischen Protonen sind zu weit weg. Sollte also ein aromatisches Proton eine Antwort geben (eine erhöhte Signalintensität haben), muss es sich um H-6 handeln. Das NOE-Differenz-Spektrum zeigt in der Tat ein Signal bei δ = 8.25 (H-6). Dieses ist (bei genauem Hinsehen) ein Singulett, was beweist, dass H-6 keinen ortho-ständigen Kopplungspartner ( 3 J 8 Hz) haben kann, d.h. es kann kein H-7 geben. Damit ist bewiesen, dass die Nitrogruppe an C-7 steht. Man beachte auch den NOE für H-4 (δ = 5.12). Er wird ebenfalls durch die Methylrotation erzeugt. Die C 4 -CH 3 -Protonen sind ebenfalls betroffen, was aber hier nicht dargestellt ist. 21

22 Beispiel 2: Welche der beiden vorgeschlagenen Strukturen ist richtig? OH NOE-Differenz-Spektrum CH 3 - H 2 O Normales 1 H-NMR-Spektrum Selektive Einstrahlung CH 3 oder A B CH 3 22

23 In diesem Beispiel war durch Dehydratisierung eines ungesättigten, tricyclischen Alkohols ein methylierter tricyclischer Kohlenwasserstoff entstanden. Durch ein NOE-Differenz-Experiment konnte zwischen den alternativen Strukturvorschlägen unterschieden werden: Struktur A hat im Gegensatz zu B kein Methinproton, das nicht wenigestens ein benachbartes Methinproton besitzt, mit dem es eine vicinale Kopplung unterhalten kann ( 3 J 8 Hz). Wenn im Bereich δ = 7-9 des 1 H-NMR-Spektrums also ein Singulett auftritt, ist Struktur B richtig, wenn nicht, dann ist A entstanden. Das 1 H-NMR selbst lässt diese Entscheidung nicht zu, weil viele Signale trotz einer Messfrequenz von 400 MHz überlagert sind. Einstrahlung auf die Methylgruppe führt zu NOE-Antworten an zwei Signalen, von denen eines tatsächlich ein Singulett ist, was vorher nicht klar sichtbar war. Damit ist die Struktur B als korrekt ermittelt. Zu welchem Proton gehört das zweite NOE-Signal (Dublett)? 23

24 Heteronukleares NOE-Experiment: Fenchone Selektive Einstrahlung auf H-4 6 H 3 C H O 9 3 CH 3 10 CH

25 Gelegentlich kann man auch heteronukleare ({ 1 H} 13 C) NOE-Experimente antreffen. Das Messprinzip ist das gleiche: Vor der eigentlichen 13 C-Messung erfolgt selektive Sättigung eines ausgewählten Protonenüberganges. Räumlich nahegelegene 13 C-Kerne können damit in ihrer dipolaren longitudinalen Relaxation beeinflusst werden und ihre Intensität deutlich steigern ( 1 H-BB-Entkopplung). Dies wird am Beispiel des Fenchons demonstriert. Es gelingt auf diese Weise die eindeutige Unterscheidung der beiden quartären Kohlenstoffatome C-1 und C-3. Man beachte jedoch, dass i.a. nur quartäre Kohlenstoffatome gute NOE-Antworten geben. Wasserstofftragende (CH, CH 2 und CH 3 ) werden i.a. durch die eigenen Protonen so effektiv relaxiert, dass die Störung eines benachbarten Proton kaum noch ins Gewicht fällt. 25