Vorlesung Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie- Grundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung Teil X. Peter Schmieder AG NMR

Transkript

1 Vorlesung Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie- Grundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung Teil X

2 Das Programm 2/03 Beim letztes Mal Das dynamic range Problem Proteine SQC 3D- und 4D-NMR 5 N-editierte Spektren Kopplungskonstanten mit dem SQC Screening mit NMR

3 Das Programm 3/03 eute 3 C, 5 N-Tripelresonanzspektren Sequenzspezifische Zuordnung in Proteinen (3) Deuterierung von Proteinen TROSY Strukturbestimmung von Proteinen

4 4/03 Tripelresonanztechniken

5 5/03 Wir haben gesehen, dass die homonuklearen Spektren NOESY und TOCSY mit ilfe der heteronuklearen Techniken auf 3D-Spektren erweitert werden können um die Überlagerung zu reduzieren. Die Strategie der sequentiellen Zuordnung hat sich dadurch aber nicht grundlegend geändert. Es werden weiter NOESY und TOCSY verwendet, die bessere Auflösung in den 3D-Spektren ermöglicht die Zuordnung größerer Proteine.

6 6/03 Wenn aber das TOCSY bzw. ein Transfer via Protonen- Kopplungen nicht mehr funktioniert oder sehr ineffizient wird, wie das bei größeren Proteinen der Fall ist, dann versagt die Strategie. Die sequentielle und Seitenkettenzuordnung muss dann mit Techniken bewerkstelligt werden, die nicht mehr auf Protonen-Kopplungen basieren sondern auf den Kopplungen zwischen den eterokernen.

7 7/03 eteronukleare 3D-NOESY-Spektren werden nur noch für das Bestimmen von Abständen im Molekül verwendet. Der Transfer von Magnetisierung über heteronukelare Kopplungen ist auch bei größeren Proteinen noch effektiv. Man verwendet dabei Protein die sowohl an 5 N als auch an 3 C markiert sind und die Kopplungen zwischen diesen Kernen. Da nun, 3 C und 5 N verwendet werden spricht man von Tripelresonanztechniken

8 8/03 J-Kopplungen zwischen eterokernen in Proteinen R 2 J N,CO < z!! C 35 z 90 z C 7 z N z N 55 z C 5 z C O C O C 40 z R

9 9/03 Wegen der Unterschiede zwischen den aliphatischen und den Carbonyl-Kohlenstoffen betrachet man die beiden getrennt:. Chemische Verschiebung δ CO ~ ppm δ Cα/β ~ 0-70 ppm 2. Kohlenstoff-Kohlenstoffkopplung J(CO,Cα) ~ 55 z J(C,C) ~35 z 3. Carbonyle haben keine Protonen gebunden Die Carbonyle sind die vierte Kernsorte

10 0/03 Will man Carbonyle als vierte Kernsorte betrachten, dann muss man auch Pulse haben, die entweder die Carbonyle oder die aliphatischen Kerne treffen, aber nicht beide. Das kann durch selektiven Pulse mit ausgefeilten Pulsformen geschehen. Oder mit einem simplen Trick, der darauf basiert, dass das Magnetfeld, das der Puls ausübt, durch off-resonance -Effekte größer wird

11 /03 B eff = (B ) 2 + (B 0 ω/γ) 2 B eff = ( B B γ 2 2 ) + ( 0 ω/ ) γb eff = (γb ) 2 + Ω 2 B tan θ tan = (B 0 θ = ω/γ) Ω = ( B ω / γ ) γb B 0 θ B eff > B B eff B Zudem ist der Weg der Magnetisierung zurück zur z- Achse kürzer

12 2/03 Wir suchen also nun den Abstand vom Sender, an dem der Puls, der eine Drehung von 90 an der Stelle des Senders bewirkt, eine Drehung von 360 bewirkt, dann hat der Puls keinen Effekt gehabt. γb eff * τ p = τ p = /4 * γb γb eff = (γb ) 2 + Ω 2 (γb ) 2 + Ω 2 * /γb = 4 + Ω2 /(γb ) 2 = 4 Ω 2 /(γb ) 2 = 5 Ω = 5 * γb

13 3/03 Der Abstand zwischen den Carbonylen und den Cα Kohlenstoffen beträgt ca. 20 ppm. Auf einem 600 Mz-Gerät (ca. 50 Mz für 3 C) sind das 8000 z Ω = 5 * γb also γb = 4647 z und damit ist τ p = 54 μsec Damit haben wir einen sehr robusten selektiven Puls

14 4/03 Sequentielle Zuordnung Wir müssen mit den Tripelresonanzexperimenten das gleiche erreichen, was mit NOESY/TOCSY bewerkstelligt worden ist. Im TOCSY gab es nur eine Korrelation vom N zum α, beim NOESY gab es zwei, einmal die gleiche wie im TOCSY, dazu den über das Carbonyl hinweg

15 Sequenzspezifische Zuordnung 5/03 So sieht der sequential walk mit homonuklearen Spektren aus d αn 2 d Nα (i,i) 2 d αn 3 d Nα (i,i) 3 d αn 4 d Nα (i,i) 4

16 Sequenzspezifische Zuordnung 6/03 Wir machen mit den heteronuklearen Kopplungen auch eine sequential walk J NCα 2 J NCα 2 2 J NCα 3 J NCα 3 2 J NCα 4 J NCα 4

17 7/03 Die Unterscheidung der beiden Signale vom N zum C α gelingt uns durch ein Spektrum das eine ähnliche Korrelation ergibt, aber unter Nutzung des Carbonyl. Die beiden Experimente heißen NCA und N(CO)CA, wobei der Name schon den Weg der Magnetisierung verrät. NCA: N(CO)CA: J NN J NCα/ 2 J NCα N N C α J NN J NCΟ J C αcο N N CO C α ier gibt es keine 2 J NCΟ

18 8/03 NCA R C C 2 J NC = 7 z N J N = 90 z O C N C J NC = z C O C R

19 9/03 N(CO)CA R C C J NC = 5 z N J N = 90 z O C N C C J CC = 55 z O C R

20 20/03 Protonendetektion ist wie gehabt immer am empfindlichsten, in beiden Fällen geht man nach dem Weg von N zum Cα auch wieder zurück zum N und detektiert dort: out and back Dabei muss immer wieder Magnetisierung von einem Kern zu einem einer anderen Kernsorte transferiert werden, das geht am besten mit dem INEPT-Schritt

21 2/03 Der INEPT-Schritt kann dabei ganz allgemein zum Transfer zwischen zwei beliebigen Kernsorten dienen, die Wartezeiten müssen nur an die Kopplungskonstanten angepasst werden n X m Y 90 y Δ /2 Δ /2 Δ 2 /2 Δ 2 /2 90 y 2z X 80 y x Δ /2 Δ /2 Δ 2 /2 Δ 2 /2 90 x πj X Δ πj X Δ 2

22 22/03 Bei Protonen haben wir schon gesehen das man bei mehr als einem Kopplungspartner die Wartezeiten nicht auf /2J setzen darf sondern kürzer halten muss 90 y Δ /2 Δ /2 Δ 2 /2 Δ 2 /2 Entkopplung 2z X y x x πj X Δ 2 n X z 90 x πj X Δ

23 23/03 X: X x sin πj X Δ 2 X 2 : X x sin πj X Δ 2 cos πj 2X Δ 2 X 3 : X x sin πj X Δ 2 cos πj 2X Δ 2 cos πj 3X Δ 2 90 y Δ /2 Δ /2 Δ 2 /2 Δ 2 /2 Entkopplung 2z X y x x πj X Δ 2 n X z 90 x πj X Δ

24 24/03 Dann bauen wir uns unsere Pulssequenz 90 y Δ /2 Δ /2 5 N z 90 x πj X Δ Δ 2 /2 Δ 2 /2 Entkopplung πj X Δ 2 2z X y Δ 2 kann hier für den Fall N eingestellt werden, also genau /2J (5.5 msec). 2 N wird dann unterdrückt (Seitenketten von Asn und Gln). Damit sind wir vom Proton zum Stickstoff gekommen, nun weiter zum Kohlenstoff

25 25/03 90 y Δ /2 Δ /2 Δ 2 /2 Δ 2 /2 Entkopplung 5 N Δ 3 /2 Δ 3 /2 J = z Δ 3 = /4J = 22 msec 3 C α keine N-C-Kopplung Wir hängen ein weiteres INEPT an, dabei ist zu bedenken, dass der Stickstoff 2 Kopplungen zu C α hat, Δ 3 ist also nicht /2J sondern /4J

26 26/03 90 y Δ /2 Δ /2 Δ 2 /2 Δ 2 /2 Entkopplung 5 N Δ 3 /2 Δ 3 /2 3 C Man stellt aber fest, dass die 80 Pulse überhand nehmen, man muss bedenken wofür man die braucht...

27 27/03 n X m Y 90 y Δ /2 Δ /2 Δ 2 /2 Δ 2 /2 90 y 2z X 80 y x Δ /2 Δ /2 Δ 2 /2 Δ 2 /2 90 x πj X Δ πj X Δ 2 Während Δ 2 soll die J XY aktiv sein. Es soll aber keine chemische Verschiebung auf Y entstehen, deshalb der 80 Puls. Der alleine würde die Kopplung aber refocussieren, also brauchen wir noch den zweiten 80 Puls. Wäre uns die chemische Verschiebung egal, bräuchten wir keinen Puls.

28 28/03 90 y Δ /2 Δ /2 Δ 2 /2 Δ 2 /2 Entkopplung 5 N Δ 3 /2 Δ 3 /2 3 C Die Situation haben hier zweimal. Was wir eigentlich aber wollen ist Kopplung während Δ 2 und Δ 3 und keine chemische Verschiebung auf 5 N

29 29/03 90 y Δ /2 Δ /2 Δ 2 Entkopplung 5 N Δ 3 /2 Δ 3 /2 Δ 3 /2 > Δ 2 3 C α Dann kann man sehr viele streichen. Δ 2 und Δ 3 kann man zusammenfassen, ein 80 Puls muss in der Mitte der 5N-Evolution sitzen, ein zweiter 80 Puls ist nötig

30 30/03 90 y Δ /2 Δ /2 Δ 2 Entkopplung 5 N Δ 3 /2 Δ 3 /2 3 C α keine N-CO-Kopplung 3 CO Kopplung zwischen N und CO wird refocussiert, denn unsere Pulse sind ja selektiv für C α oder CO und ohne Puls auf CO kann sich Kopplung während Δ3 nicht entwickeln

31 3/03 90 y Δ /2 Δ /2 Δ 2 Entkopplung 5 N Δ 3 /2 Δ 3 /2 t /2 t /2 3 C α Nach dem zweiten INEPT-Transfer wird nicht refocussiert sondern wie beim SQC nur die chemische Verschiebung des zweiten Kerns detektiert

32 32/03 90 y 90 y Δ /2 Δ /2 Δ 2 Entkopplung Δ 2 Δ /2 Δ /2 5 N Δ 3 /2 Δ 3 /2 t /2 t /2 Entk. Δ 3 /2 Δ 3 /2 3 C α Dann geht s wieder zurück zum Stickstoff und dann zum Proton und dann wird mit 5 N-Entkopplung detektiert

33 33/03 90 y 90 y Δ /2 Δ /2 Δ 2 Entkopplung Δ 2 Δ /2 Δ /2 5 N Δ 3 /2 Δ 3 /2 t /2 t /2 Entk. Δ 3 /2 Δ 3 /2 3 C α In der Mitte der Pulssequenz haben wir ein 5 N, 3 C α -SQC durchgeführt

34 34/03 Damit haben wir das NCA gebaut, es wird normalerweise als 3D-Spektrum aufgenommen, mit den chemischen Verschiebungen von C α, N und N auf den 3 Achsen. Die chemische Verschiebung der 5 N-Kerne wird in einem constant-time Experiment detektiert 90 y Entkopplung Δ 2 Δ /2 Δ /2 t /2 t /2 (Δ 3 -t 2 )/2 (Δ 3 +t 2 )/2 Entk.

35 35/03 Dann müssen wir aber wegen der Kopplung von N zu CO etwas unternehmen und einen Entkopplungspuls einbauen, den brauchen 90 y Entkopplung Δ 2 Δ /2 Δ /2 t /2 t /2 (Δ 3 -t 2 )/2 (Δ 3 +t 2 )/2 Entk. t 2 /2 wir auch in t

36 36/03 Die Wasserunterdrückung machen wir mit WATERGATE 90 y Entkopplung Δ 2 Δ /2 90 2O 90 2O Δ /2 t /2 t /2 (Δ 3 -t 2 )/2 (Δ 3 +t 2 )/2 Entkopp. t 2 /2

37 37/03 Da der Stickstoffkern mit zwei C α koppelt bekommen wir auch jeweils zwei Korrelationen, die für eine sequentielle Zuordnung reichen, wenn wir sie denn unterscheiden können. Diese Unterscheidung kann durch das N(CO)CA bewerkstelligt werden, in dem der Transfer zum Carbonyl noch dazu kommnt

38 38/03 90 y Δ /2 Δ /2 Δ 2 Entkopplung 5 N Δ 3 /2 Δ 3 /2 J = 5 z Δ 3 = /2J = 33 msec 3 CO Der Anfang vom N(CO)CA ist genau wie beim NCA, nur gehen wir nicht zum C α sondern zum CO, hier gibt es nur eine Kopplung, also /2J für Δ3

39 39/03 90 y Δ /2 Δ /2 Δ 2 Entkopplung 5 N Δ 3 /2 Δ 3 /2 3 CO Δ 4 /2 Δ 4 /2 J = 55 z Δ 4 = /2J = 9 msec 3 C α Dann kommt der INEPT-Schritt zum C α

40 40/03 90 y Δ /2 Δ /2 Δ 2 Entkopplung 5 N Δ 3 /2 Δ 3 /2 3 CO Δ 4 /2 Δ 4 /2 3 C α Evolutionszeit um die chemische Verschiebung auf dem C α zu bekommen t /2 t /2

41 4/03 Der Rest ist wie beim NCA, Wasserunterdrückung mit WATERGATE, Evolutionszeit für 5 N als constant time Experiment und das Experiment wird als dreidimensionales Spektrum aufgenommen mit, 5 N und 3 C α chemischen Verschiebungen.

42 42/03 N(CO)CA Entkopplung 5 N Entk. 3 CO 3 C α G z

43 43/03 N(CO)CA Entkopplung 5 N Entk. 3 CO 3 C α G z 5 N, 3 CO-SQC

44 44/03 N(CO)CA Entkopplung 5 N Entk. 3 CO 3 C α G z 3 CO, 3 C α -SQC

45 45/03 Die 5 N-Verschiebung dient dabei der Beseitigung von Überlagerung durch die dritte Dimension, die sequentielle Zuordnung erfolgt über die -C-planes der 3D-Spektren

46 46/03 3D-NMR

47 47/03 NCA N(CO)CA δ C3 δ C3 = sequentielle Signale δ C2 δ C2 δ C4 δ C4 δ C δ C δ δ 2 δ 3 δ δ 2 δ 3

48 48/ δ C3 δ C2 Damit sind wir bereit für den sequential walk im NCA δ C4 δ C δ 2 δ 3 δ 4

49 49/03 Man kann analog zu NCA/N(CO)CA auch Experimente machen die die chemische Verschiebung des CO detektieren, auch da ist ein Paar von Experimente möglich: das NCO und das N(CA)CO. Zusammen ergeben sich wieder eine bzw. zwei Korrelationen so dass eine sequentielle Zuordnung möglich ist. Noch besser ist es aber, wenn das C β als weitere chemische Verschiebung hinzukommt.

50 50/03 Um nach dem Transfer vom N zum C α auch noch den Schritt zum C β zu machen, benötigt man einen COSY-artigen Transfer. Die Kopplungen zwischen C α und C β sind in Proteinen recht uniform, der Transfer wird sich also gut steuern lassen. Allerdings wollen wir ja C α und C β detektieren, der Transfer sollte also so angelegt sein, daß beide Signale ungefähr gleich groß sind

51 5/03 Die folgende Sequenz wird verwendet: 90 y 90 y 3 C Δ/2 Δ/2 t Δ/2 Δ/2 C αz 90 C x -C αy πj CC Δ -C αy cos πj CC Δ + 2C αx C βz sin πj CC Δ 90 C y -C αy cos πj CC Δ -2C αz C βx sin πj CC Δ

52 52/03 90 y 90 y 3 C Δ/2 Δ/2 t Δ/2 Δ/2 -C αy cos πj CC Δ -2C αz C βx sin πj CC Δ πωt -C αy cos πj CC Δ cos πω α t -2C αz C βx sin πj CC Δ cos πω β t 90 C y πj CC Δ -C αy cos πj CC Δ cos πω α t + 2C αx C βz sin πj CC Δ cos πω β t -C αy cos 2 πj CC Δ cos πω α t + C αy sin 2 πj CC Δ cos πω β t

53 53/03 90 y 90 y 3 C Δ/2 Δ/2 t Δ/2 Δ/2 -C αy cos 2 πj CC Δ cos πω α t + C αy sin 2 πj CC Δ cos πω β t Konstante! Konstante! Wir haben also am Ende vom C α zwei Signale mit gleicher Phase aber unterschiedlichem Vorzeichen, die die chemischen Verschiebungen von C α und C β tragen. Und mit Δ = /4J CC ergibt sich für beide Terme der Faktor ½.

54 54/03 NCACB R J CC = 35 z C C 2 J NC = 7 z N J N = 90 z O C N C J NC = z C O C J CC = 35 z R

55 55/03 N(CO)CACB R J CC = 35 z C C J NC = 5 z N J N = 90 z O C N C C J CC = 55 z O C R

56 56/03 Die Namen der Experimente ergeben sich aus der bisherigen Logik der Namensgebung. Allerdings kann man die gleichen Spektren mit einem kompakteren Paar an Pulssequenzen erhalten, die mit den C-gebundenen Protonen starten. Das sind das CBCA(CO)NN und das CBCANN. Wie die beiden arbeiten wollen wir uns jetzt schematisch anschauen

57 57/03 CBCA(CO)NN Entkopplung 5 N Entkopplung 3 C α/β 3 CO Beginn und Detektion auf dem Proton: Empfindlichkeit!

58 58/03 CBCA(CO)NN Δ /2 Δ /2 Δ 2 Entkopplung 5 N Entkopplung 3 C α/β 3 CO INEPT von Protonen zu Kohlenstoffen

59 59/03 CBCA(CO)NN Entkopplung 5 N Entkopplung 3 C α/β 3 CO COSY von Kohlenstoff zu Kohlenstoff

60 60/03 CBCA(CO)NN Entkopplung 5 N Entkopplung 3 C α/β 3 CO INEPT von aliphatischem C zu Carbonyl-C

61 6/03 CBCA(CO)NN Entkopplung 5 N Entkopplung 3 C α/β 3 CO INEPT von Carbonyl-C zu Stickstoff

62 62/03 CBCA(CO)NN Entkopplung 5 N Entkopplung 3 C α/β 3 C INEPT von Stickstoff zu Aminoproton

63 63/03 CBCA(CO)NN Entkopplung 5 N Entkopplung 3 C α/β 3 CO.Evolution: chemische Verschiebung von aliphatischen C, als constant time Experiment

64 64/03 CBCA(CO)NN Entkopplung 5 N Entkopplung 3 C α/β 3 CO 2.Evolution: chemische Verschiebung von Stickstoff, als constant time Experiment

65 65/03 CBCANN Entkopplung 5 N Entkopplung 3 C α/β ier wird wieder die Kopplung zwischen C α und N genutzt, also sind wieder zwei Wege für den Magnetisierungstransfer vorhanden und es sollten 4 Signale werden

66 66/03 Sequentielle Zuordnung

67 67/03 Sequentielle Zuordnung

68 68/03 Sequentielle Zuordnung

69 69/03 Sequentielle Zuordnung

70 70/03 Mit den beiden Experimenten sind wieder sequentielle Nachbarschaften etabliert worden. Um eine eindeutige Zuordnung zu machen muss man die Reihe der Aminosäuren mir der Sequenz abgleichen, d.h. man braucht Information über den Aminosäuretyp Die bekommt man entweder aus den Spinsystemen der Seitenketten (siehe unten) oder aus den chemischen Verschiebungen von Cα und Cβ.

71 7/03 Aminosäuretyp-Bestimmung

72 72/03 backbone -Zuordnung 5 N [ppm] N-SQC ohne Zuordnung [ppm] 35

73 73/03 backbone -Zuordnung G5 5 N [ppm] W4 ε M25 N47 L3 V53 G5 V58 V9 Y3 D48 A56 R2 V23 T4 D40 N35 G28 T37 S9 T32 Y57 K59 D4 F52 E45 Q50 T24 Y5 R49 K6 K8 E3 K39 I30 V44 E22 K27 N38 D29 W4 L0 E7 K46 D2 E7 L8 D62 K26 K60 V46 L6 L34 Q6 A L2 A55 L33 W42 ε S36 W42 N47 N 2 N38 N 2 N35 N 2 Q50 N 2 Q6 N N-SQC mit Zuordnung R49 ε [ppm] R2 ε 35

74 74/03 Diese backbone -Zuordnung beinhaltet die Zuordnung der Aminoprotonen, der Stickstoffkerne und der beiden Kohlenstoffe Cα und Cβ. Sie kann mit weiteren Tripelresonanzexperimenten auf die Seitenketten erweitert werden BA(CO)NN α und β (CCO)NN-TOCSY Protonen der Seitenkette ()C(CO)NN-TOCSY Kohlenstoffe der Seitenkette Man führt aber auch noch eine andere Zuordnung durch

75 75/03 Seitenkettenzuordnung

76 76/03 CC-COSY 3 C α/β Entkopplung Beginn und Detektion auf dem Proton: Empfindlichkeit!

77 77/03 CC-COSY 3 C α/β Entkopplung INEPT von Protonen zu Kohlenstoffen

78 78/03 CC-COSY 3 C α/β Entkopplung COSY von Kohlenstoff zu Kohlenstoff

79 79/03 CC-COSY 3 C α/β Entkopplung INEPT von Kohlenstoffen zu Protonen

80 80/03 CC-COSY 3 C α/β Entkopplung.Evolution: chemische Verschiebung von Protonen 2.Evolution: chemische Verschiebung von Kohlenstoffen

81 8/03 CC-TOCSY 3 C α/β TOCSY-Mix. Entkopplung So wie im Protonen-Fall das COSY durch das TOCSY ergänzt werden kann um das ganze Spinsystem abzuklopfen geht das auch im Kohlenstoff-Fall. Ansonsten ist das Experiment wie das CC-COSY

82 82/03 CC-COSY CC-COSY CC-TOCSY CC-TOCSY

83 83/03

84 84/03 NMR an großen Proteinen

85 NMR an großen Proteinen 85/03 Wenn die Größe der Proteine weiter zunimmt, wird es aber auch mit den bislang gezeigten Tripelresonanzexperimente immer schwieriger. Zum einen wird die Zahl der Signale immer größer ohne das die Dispersion der Signale sich ändert. Zum anderen wird die Relaxation der involvierten Kerne immer effizienter, dadurch wird die Linienbreite immer größer und der Transfer von Magnetisierung wird immer schwächer bei gleichbleibender Länge der Wartezeiten (da sich die Kopplungen nicht ändern)

86 NMR an großen Proteinen 86/03 Die Zahl der Signale nimmt zu Ubiquitin (76 aa) Cph-Δ2 (54 aa) ppm ppm ppm

87 NMR an großen Proteinen 87/03 Die Linien werden breiter, das sorgt für mehr Überlagerung und für ineffizienteren Magnetisierungstransfer z 0 z 50 z ppm ppm ppm

88 NMR an großen Proteinen 88/03 Während man gegen die zunehmende Zahl der Signale nur wenig tun kann, kann man sich überlegen wie man die zunehmende Relaxation zurückdrängt. Dazu gibt es zwei Vorgehensweisen, die man sowohl unabhängig als auch gemeinsam nutzen kann: Deuterierung TROSY

89 NMR an großen Proteinen 89/03 Die auptquelle der Relaxation ist für die involvierten Kerne unterschiedlich Protonen ( ) Kohlenstoff ( 3 C) Stickstoff ( 5 N) andere Protonen das direkt gebunden Proton das direkt gebunden Proton Wobei der Unterschied zwischen Stickstoff und Kohlenstoff gebundenen Protonen die Austauschbarkeit mit dem Wasser ist

90 NMR an großen Proteinen 90/03 Wir haben gesehen das viele der Experimente die wir bislang gesehen haben mit dem N beginnen und es auch detektieren. Das macht man sich zu nutze: Die Proteine werden deuteriert (in D 2 O) hergestellt und erst am Ende in 2 O überführt wo nur die austauschbaren Protonen (hauptsächlich die N ) zurücktauschen. Damit sind um die N -Protonen nur noch wenige andere Protonen und der auptrelaxationspartner der Kohlenstoffe ist weg

91 NMR an großen Proteinen 9/03 Deuterierung normales Protein deuteriertes Protein = - C = -N

92 NMR an großen Proteinen 92/03 Deuterierung Protonenspins werden verdünnt, die C-- Wechselwirkung entfernt N D D N N C D D N D D C D D γ D /γ ~ /6.5 C C D= D=0,02

93 NMR an großen Proteinen 93/03 Jetzt bleiben noch die Stickstoffkerne, die ihren auptrelaxationspartner noch haben. Beim TROSY (Transverse Relaxation Optimized SpectroscopY) werden nun unterschiedliche Relaxationseffekte genutzt um die Linien von Stickstoff und N zu verbessern

94 NMR an großen Proteinen 94/03 Zwei der wichtigsten Relaxationsmechanismen haben wir zu Beginn kennen gelernt, die Dipol-Dipol-Wechselwirkung (DD) und die chemical-shift-anisotropie (CSA). Beide Mechanismen können sich gegenseitig beeinflussen. DD CSA

95 NMR an großen Proteinen 95/03 Bei kleinen Molekülen ist diese Beeinflussung nicht leicht zu erkennen 5 N-SQC 5 N-SQC no decoupling

96 NMR an großen Proteinen 96/03 Wir erinnern uns aber, dass den vier Komponenten des Multipletts die beiden unterschiedlichen Spinzustände (α und β) zuzuordnen sind. Es stellt sich heraus, dass die Beeinflussung von CSA und DD bei jeder anders ist. αα βα αβ ββ N R α ~ (D N + CSA ) R β ~ (D N -CSA ) R αn ~ (D N + CSA N ) R βn ~ (D N -CSA N )

97 NMR an großen Proteinen 97/03 Und bei großen Molekülen ist das dann in der Tat zu sehen, jeweils eine Linie von und 5 N ist schmal, eine der vier Peaks des Multipletts also besonders scharf 5 N-SQC 5 N-SQC no decoupling 5 δ N(ppm) δ (ppm) δ (ppm)

98 NMR an großen Proteinen 98/03 Man kann nun berechnen wann der Effekt am größten ist D N =(/2 2) γ γ N μ(h/2π(r N ) 3 ) CSA =(/2 2) γ B 0 Δσ CSA N =(/2 2) γ N B 0 Δσ N γ = 2.6 *0 8 (Ts) - γ N = *0 7 (Ts) - Δσ = - 6 ppm Δσ N = - 60 ppm Δσ / Δσ N = γ N / γ (D N CSA N ) = (D N CSA ) = 0 for the same B 0 B 0 = 25.6 T ~. Gz

99 NMR an großen Proteinen 99/03 Mit realistischen Annahmen liegt das Maximum nah bei 950 Mz 900 Mz 900 Mz

100 NMR an großen Proteinen 00/03 Um nur den einen Peak zu erhalten benutzt man diese Pulssequenz, das ganze kann aber auch in jedes Tripelresonanzexperiment eingebaut werden y Δ/2 Δ/2 Δ/2 Δ/ n X t /2 t /2

101 NMR an großen Proteinen 0/03 Am Ende erhält man dann im TROSY scharfe Linien auch für größere Moleküle 5 δ N(ppm) δ (ppm)

102 02/03 Grundlagen der NMR-Spektroskopie Techniken für organische Moleküle Techniken für Peptide Techniken für Proteine

103 03/03 That s it Fragen: schmieder@fmp-berlin.de Scripte: