3D NMR Experimente. Pulssequenz des 3D 15N-NOESY-HSQC
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- Frieda Ursler
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1 3D NMR Experimente Pulssequenz des 3D 15N-NOESY-SQC 1) Zum Beispiel sinnvoll, wenn sich viele Signale in einem 2D Spektrum, z.b. einem 1-1 NOESY oder TOCSY überlagern. 2) Kombination mit einem anderen 2D Experiment, z.b. einem 1-15NSQC oder einem 1-13C-MQC -> 13C-Entkopplung (wenn 15N und 13C markiert) z. B. 15N-SQC + NOESY -> 3D 15N-NOESY-SQC -> nur NOEs von Protonen, die direkt an ein 15N-gebunden sind zu räumlich nahen Protonen 15N- 1 c.s. NOE 1->15N Evolution via 1J 15N c.s. Evolution 15N->1 via 1J & mehr Detektion von 1 unter 15NEntkopplung Gz - Gradientenpulse -> Selektion von Kohärenzen, Unterdrückung von Lösungsmittelsignale oder von Störsignale aufgrund imperfekter 180 Pulse PP von: 3D 15N-NOESY-SQC eines Proteins Das 3D NCA Experiment zur sequentiellen Zuordnung der Proteinsignale - ein Tripelresonanzexperiment F1:1 F2: 15N F3:1 Projektion von F1 auf F2/F3 Ebene! wie 2D 1-15N-SQC Projektion von F2 auf F1/F3 Ebene! wie Amidbereich von 2D 1-1-NOESY Von: Evolution der chemischen Verschiebung Magnetisierungstransfer Aus F. Lottspeich/. Zorbas!Bioanalytik" und J. Cavanagh und andere!protein NMR Spectroscopy"
2 Weitere NMR-Experimente für die Zuordnung der chemischen Verschiebungen in 15N- und 13C- makierten Proteinen Residual dipolar couplings (RDCs) - Normalerweise direkte dipolare Kopplung in Lösung aufgrund von isotroper Molekülbewegung ausgemittelt - Wenn in!orientierendem" Medium - eingeschränkte Beweglichkeit in eine Raumrichtung -> anisotrope Bewegung in anisotropem Medium Einschränkung der Beweglichkeit durch Messen der Probe in einem komprimierten Polyacrylamidgel Anfertigung einer Gelprobe einer gelösten Substanz squeeze - Messung von RDCs möglich -> Information über die Orientierung von Bindungsvektoren relativ zum Magnetfeldvektor (bzw. Alignmenttensor) Getrocknetes Gel Zugabe von Substanzlösung & Schwellvorgang Kompression mit Stempelinlet
3 Bestimmung von RDCs von Peptiden der Sequenz EGAAXAASS Anwendung von RDCs für die Strukturaufklärung in der OC 1) Messung isotrope Probe (Referenz) -> Aufspaltung = 1JN- 2) Messung der anisotropen Probe -> Aufspaltung = 1JN- + 1DN- 1)-2) ergibt 1DN- z.b. 1-15N-SQC ohne 15N-Entkopplung während Aufnahme, auch basierend auf natürlicher Isotopenhäufigkeit möglich X = I G W I G Zum Beispiel: Arbeiten der Arbeitsgruppe Thiele an TU Darmstadt 1) C. M. Thiele, Use of RDCs in Rigid Organic Compounds and Some Practical Considerations concerning Alignment Media, Conc. Magn. Res. 2007, 30A, ) C. M. Thiele, Residual Dipolar Couplings (RDCs) in Organic Structure Determination, Eur. J. Org. Chem. 2008, ) B. Böttcher, C. M. Thiele, Determining the Stereochemistry of Molecules from Residual Dipolar Couplings (RDCs), in Encyclopedia of Magnetic Resonance, (published by R. K. arris, R. E. Wasylishen), John Wiley, Chichester, ) R. Berger, J. Courtieu, R. R. Gil, C. Griesinger, M. Köck, P. Lesot, B. Luy, D. Merlet, A. Navarro-Vázquez, M. Reggelin, U. M. Reinscheid, C. M. Thiele, M. Zweckstetter, Is Enantiomer Assignment Possible by NMR Spectroscopy Using Residual Dipolar Couplings from Chiral Nonracemic Alignment Media? A Critical Assessment, Angew. Chem. 2012, 124, , Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, W S. A. Dames et al. J. Am. Chem. Soc., 128(41), (2006) Zusammenfassung1: Magnetisierungstransfer bzw. Korrelation von einem Kern mit benachbarten Kernen in einem Protein Skalare bzw. J-Kopplung - via Bindungselektronen -> Bestimmung der chemischen Verschiebungen einzelener Kernen und welche Kerne über chemische Bindungen verknüpft sind Dipolare Kopplung - durch den Raum zwischen Kernen, die sich räumlich nahe sind über NOE-Effekt -> z.b. zur Gewinnung struktureller Informationen in Form von interatomaren Distanzen (NOESY) R Zusammenfassung 2: Strukturinformationen aus NMR-Daten Distanzen (NOEs) Dihedrale Winkel (3J) Wasserstoffbrücken (3J, EX) Ionisierungskonstante -COO -COO- + + Dynamik N C" C N " O Orientierung von Bindungsvektoren (RDCs) Diffusionskonstanten RDCs Dissoziationskonstanten
4 Anhang: Atomkerne können eine magnetisches Moment haben Auf den folgenden Seiten sind einige ergänzende Informationen zur 1. Stunden und dem letzten Teil der Vorlesung Resonanz- bzw. Larmorfrequenz Für Kerne mit Spin 1/2, z.b. 1, 15 N, 13 C, 31 P Magnetfeld B 0 Aufbau eines Kernspinresonanzspektrometers Isotopenmarkierung Temperierbarer Probenkopf Für Kerne mit Spin 1/2, z.b. 1, 15 N, 13 C, 31 P Supraleitender Magnet Computer zur Steuerung und Datensicherung Elektronik (Temperaturkontrolle, Freqzenzsynthesizer, A- D Konverter, Verstärker) Zu gering -> Ausweg: Isotopenmarkierung Zum Beispiel durch Produktion des gewünschten Proteins in gentechnisch veränderten Bakterienzellen (Escherichia coli) -> einzige Stickstoffquelle 15 N-Ammoniumchlorid -> einzige Kohlenstoffquelle 13 C-Glucose
5 Erzeugung detektierbarer Magnetisierung Das 2D 1-15 N- SQC experiment - der Fingerabdruck eines Proteins R 1 J(N, N ) N C " C N " O 1/ 2 x 1 J(N, N ) 1D 1 Spektrum eines Proteins Detektion der 1 Kerne Entwicklung des chemischen Verschiebungen der 15 N Kerne (= Evolution) Transfer von Magnetisierung von 1 zu direkt gebundenem 15 N bzw. umgekehrt (= Mischzeit) Generierung von detekierbarer Protonenmagnetisierung (= Präparation)
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