Anwendung neuerer spektroskopischer Techniken in der pharmazeutischen Chemie

Transkript

1 Anwendung neuerer spektroskopischer Techniken in der pharmazeutischen Chemie (ausgewählte spektroskopische Methoden MR) Wolfgang Holzer Department für Arzneistoffsynthese Fakultät für Lebenswissenschaften, Universität Wien

2 Literatur - Bücher und Zeitschriften M. Hesse, H. Meier, B. Zeeh: Spektroskopische Techniken in der organischen Chemie, Thieme Verlag, 5. Auflage, H. Kessler, M. Gehrke, C. Griesinger: Zweidimensionale MR-Spektroskopie, Grundlagen und Übersicht über die Experimente. Angew. Chem. 1988, 100, S. Braun, H.-O. Kalinowski, S. Berger: 150 and more basic MR experiments. Wiley-VCH, H. Günther: MR-Spektroskopie. Thieme, A. Derome: Modern MR Techniques for Chemistry Research. Pergamon Press, W. F. Reynolds, R. G. Enriquez: Choosing the best sequences, acquisition parameters, postacquisition processing strategies, and probes for natural product structure elucidation by MR spectroscopy. J. at. Prod. 2002, 65,

3 Literatur - Internet lehre/lehredateien/scrips/ociv.pdf bis

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5 S. Sternhell, J. R. Kalman Organic Structures from Spectra (1986 ) The scope of each spectroscopic method can be defined as the amount of useful information obtainable and is a function not only of the total amount of information but of interpretability. The scope varies from problem to problem, but the overall utility undoubtly decreases in the order MR >> MS > IR > UV with the combined utility of 1 H and 13 C MR outstanding. The theoretical background needed for each method varies with the nature of the experiment, but the minimum overall amount of theory needed decreases in the order MR >> MS > UV ~ IR MR!!!

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12 wichtige Anwendungen der MR-Spektroskopie Analytik in der Synthese: Kontrolle präparativen Arbeitens (Konstitution, Einheitlichkeit) Strukturbestimmung in Lösung: Konstitution, Konformation auch für größere Moleküle (z.b. Proteine zur Zeit bis ca. 30 kd ~ 250 Aminosäuren, allerdings erst nach Isotopenanreicherung) Untersuchung intermolekularer Wechselwirkungen (Enzym-Inhibitor, DA-Interkalator oder Repressor, Rezeptor- Substrat, Rezeptor-Arzneistoff, Antikörper-Antigen usw.) Untersuchung der molekularen Dynamik (via Relaxationsparameter), z.b. Proteinfaltung, Proteinfunktion

13 Kernresonanz-Spektroskopie (MR) Einteilung der Atomkerne uklid ist charakterisiert durch Ordnungszahl (OZ) und Massenzahl (MZ) MZ OZ 14 7 gerade (g) 15 (ug) (uu) C (gu) C (gg) ungerade (u) 7 ug, gu, uu - Kerne: Spinquantenzahl I > 0 (1/2, 1, 3/2, 2,...), besitzen magnetisches Moment µ gg-kerne: Spinquantenzahl I = 0, kein magnetisches Moment µ, dem MR-Experiment nicht zugänglich! z.b. 12 C, 16 O! wichtige MR-aktive Kerne: 1 H (99.985%), 2 H (0.015%), 13 C (1.1%), 15 (0.36%), 19 F (100%), 31 P (100%), [ 17 O (0.037%)]

14 Der Spin des Wasserstoffkerns (Protons) Spin Magnetfeld Symbol für den Kernspin + S + S 1 H-Kerne (I = ½) verhalten sich wie kleine 'Stabmagnete' (richtiger: atomare Kreisel)

15 1 H-Kerne (I = ½) im Magnetfeld ohne Anlegen eines äußeren Magnetfelds sind die magnetischen Momente der Kerne gleichmäßig in alle Raumrichtungen verteilt, es existiert keine bevorzugte Richtung beim Anlegen eines äußeren Magnetfeldes B 0 ergeben sich 2 Einstellmöglichkeiten: 1. in Richtung von B 0 (energetisch günstiger) 2. gegen die Richtung von B 0 (energetisch etwas ungünstiger) B o

16 Kerne im statischen Magnetfeld - allgemein für I = ½ : m = + ½ m = ½ m: magnetische Quantenzahl (Orientierungsquantenzahl) m = I, I 1,, I B o insgesamt (2I+1) verschiedene Einstellungsmöglichkeiten 1 H (I = ½) m = +½, ½ (2 Einstellungsmöglichkeiten) 2 H (I = 1) m = +1, 0, 1 (3 Einstellungsmöglichkeiten)

17 ohne Magnetfeld Besetzung der Energieniveaus α und β (I=½) im Gleichgewichtszustand (Boltzmann-Verteilung) mit Magnetfeld β β α B o = 0 = e E kbt 1 E kbt = B o > 0 1 γhb kbt k B = Boltzmann-Konstante = JK -1 T = absolute Temperatur in K α,β = Anzahl der Kerne im α bzw. β-iveau 0 α E = h ν E für 1 H bei 400 MHz (B o = 9.5 T): 3.8 x 10-5 Kcal/mol α / β = je größer B 0, desto größer die Energiedifferenz zwischen α und β iveau möglichst starkes Magnetfeld!!!! je tiefer die Temperatur, desto größer E (wenig Spielraum!)

18 Anregung, Relaxation, Sättigung β E = hν Anregung Relaxation α β α Gleichgewicht (Boltzmann-Verteilung, nach Relaxation) nach Anregung (180 -Puls) Sättigung Relaxation: das System kehrt nach einer Störung wieder in das thermische Gleichgewicht (Boltzmann-Verteilung) zurück

19 Resonanzbedingung (Larmor-Gleichung) ω o µ B o auf µ wirken zwei Kräfte - die eine versucht ihn entlang B 0 auszurichten, die andere hält ihn 'spinning' es resultiert eine Kreiselbewegung (Präzessionsbewegung) in einem bestimmten Winkel zu B 0 ('Kernkreisel' ) Analogie zum mechanischen Kreisel (dort Schwerkraft anstatt B 0 ) E = bzw. h γ B 2π ω = 2πν 0 = h ν = γ B 0 ν = γ B0 2π γ = magnetogyrisches (gyromagnetisches) Verhältnis (aturkonstante welche die Empfindlichkeit eines Kernes für das MR-Experiment beschreibt) ν = Resonanzfrequenz ( MHz bei MR-Geräten) ω = Kreisfrequenz der Präzessionsbewegung, Larmorfrequenz

20 Abschirmung des Atomkernes durch die Elektronenbewegung B 0 B 0 in Abhängigkeit von der Beschaffenheit der Elektronenhülle erfährt der Atomkern eine mehr oder weniger große Abschirmung unterschiedliche elektronische Umgebung führt zu (leicht) unterschiedlichen Resonanzfrequenzen!!!

21 MR-Spektrometer (CW) - schematisch Empfänger -spule Proberöhrchen mit Lösung x Sweep- und Shim Spulen Magnet S Magnet z Computer, Bildschirm Schreiber Sender y Verstärker Oszilloskop Senderspule

22 MR - Meßverfahren 1) CW-Technik (continous wave) die einzelnen Resonanzen werden nacheinander durch kontinuierliche Veränderung von ν (Frequenz-sweep) oder B 0 (Feld-sweep) unter Erfüllung der Resonanzbedingung ν = γ/2π B 0 erfaßt veraltet, langsam, unempfindlich (nur für empfindliche Kerne), keine modernen MR-Experimente möglich 2) Puls-Fourier-Transform Technik (PFT) alle Resonanzen werden durch einen RF-Puls gleichzeitig angeregt das erhaltene Interferogramm (Überlagerung aller Abklingkurven = free induction decay - FID) wird durch eine mathematische Operation (Fourier-Transformation) in das MR-Spektrum umgewandelt schnell, empfindlich (Akkumlierung von FIDs üblich), besser bearbeitbar; moderne MR-Spektroskopie verwendet 'Pulsfolgen' = Kombination von mehreren Pulsen verschiedener Richtung und Größe, getrennt durch genau definierte Zeitintervalle

23 Kryomagnet (supraleitende Spule) heute praktisch ausschließlich verwendet (Permanent- oder Elektromagnete nur bis 100 MHz, Kryomagnet bis 1GHz)

24 FT- (Fourier-Transform) MR-Spektrometer heute fast ausschließlich verwendet Feldstärken derzeit bis T (900 MHz Protonenfrequenz) bestehen aus supraleitendem Magnet Konsole (Elektronik) Rechner und Peripheriegräte (Drucker usw.) in modernen MR-Laboratorien erfolgt ein Großteil des 'Processing' offline, d.h. die Daten werden auf externe Rechner übertragen und dort ausgewertet

25 Verteilung der Kerne auf dem Doppelpräzessionskegel z α 1 m = + 2 B 0 M 0 y Wegen α > β resultiert eine makroskopische Gesamt-Magnetisierung (bulk) M 0 in z-richtung (Richtung des Magnetfeldes B 0 ). Durch die statistische Verteilung in der xy-ebene sind die Komponenten entlang der x- und y-achse gleich ull! (keine tranversale Magnetisierung) B 0 x β m = 1 2 übliche vereinfachte Darstellung

26 Puls-MR Puls: kurzzeitiges Einschalten eines starken Radiofrequenz (RF)-Feldes (im µs-breich, z.b. 10 µs pulse width), dadurch Auslenkung der bulk- Magnetisierung M 0 um einen bestimmten Winkel α (Pulswinkel, Flipwinkel) z z B 0 90 y -Puls α M o x x y B 1 B 1 aus M xy

27 -1 z Puls-MR z B 0 B 1 y M o x 90 y -Puls B 1 aus y M xy ω o x nach 90 -Puls beginnt M in der xy-ebene zu rotieren (mit der Larmorfrequenz ω 0 ) damit detektierbare, transversale Magnetisierung erzeugt! Detektion mittels Empfängerspule(n) auf der x oder/und y-achse der rotierende Vektor M erzeugt dort eine sinus (cosinus) - förmige Wechselspannung mit der Frequenz ω 0 -x t +y +1 +x 0 usw.

28 Puls-MR Kerne mit unterschiedlichen chemischen Verschiebungen besitzen unterschiedliche Larmorfrequenzen Kopplung: Signal-Komponenten haben unterschiedliche Larmorfrequenzen ν 0 = δ z.b. Dublett: δ (ppm) A B chem. Verschiebung (Winkelhalbierende) ν 0 ν 0 rotierendes Koordinatensystem (rotiert mit ν = ν 0 ): ν 0 ν 0

29 Puls-MR - Relaxation und FID nach Abschalten des Pulses (Störung der GG-Population) kehrt das System wieder ins GG (M 0 in Richtung von B 0 ) zurück (Relaxation) der rotierende Vektor M richtet sich wieder in die z-richtung auf - die transversale Magnetisierung zerfällt. Es resultiert in der Empfängerspule daher eine Wechselspannung mit abnehmender Amplitude, im Realfall eine Überlagerung vieler Abklingkurven - der FID (free induction decay). Zeit Amplitude 'Realfall' (viele spins mit verschiedener Frequenz und verschiedener Amplitude)

30 Relaxation zwei verschiedene Arten der Relaxation: 1) Relaxation durch Energieaustausch mit der Umgebung (LM) 'Spin-Gitter-Relaxation', 'longitudinale Relaxation' Enthalpie-Prozeß, charaktersiert durch Zeitkonstante T 1, Relaxationsrate R 1 = 1/T 1 2) Relaxation durch Verlust an Phasenkohärenz 'Spin-Spin-Relaxation', 'transversale Relaxation' Entropie-Prozeß, charaktersiert durch Zeitkonstante T 2 T 1 T 2

31 Spin-Spin Relaxation Magnetisierung fächert auf (Verlust an Phasenkohärenz, Verlust an 'Gleichschritt') irgendwann einmal Gleichverteilung in alle Richtungen Vektoraddition ergibt 0 keine Quermagnetisierung mehr vorhanden (kein Signal!) T 2 abhängig von der Lebensdauer eines Spinzustandes T 2 bestimmt die Linienbreite eines MR-Signals (je schneller die transversale Relaxation, desto breitere Linien) = 1/πT 2 * : Linienbreite in halber Signalhöhe T 2 *: effektive T 2 -Zeit (Feldinhomogenitäten berücksichtigt)

32 Mechanismen bei der Relaxation spontane Relaxation: kommt praktisch nicht vor stimulierte Relaxation: verursacht durch zusätzliche fluktuierende Felder, deren Frequenzkomponenten den Frequenzen der angeregten Übergänge entsprechen Dipol-Dipol Relaxation: Kern A verursacht am Ort von Kern B ein zusätzliches Magnetfeld. Durch die Molekülbewegung (Reorientierung der Moleküle in Lösung) induziert Kern A am Ort von B ein fluktuierendes elektromagnetisches Feld Chemical shift anisotropy (CSA): icht sphärische Elektronenverteilung (p-elektronen!) verursacht ein fluktuierendes Magnetfeld am Kernort, welches eine effektive Relaxation ermöglicht (z.b. C=O sp 2 -Hybrid). Der Anteil dieses Relaxationsmechanismus steigt mit zunehmender Magnetfeldstärke drastisch an. Quadrupol-Relaxation (in der ähe von Quadrupol-Kernen - z.b durch den Einfluß des durch letzteren verursachten elektrischen Feldgradienten). Spin-Rotation (Relaxation durch schnelle Rotation, meist von Methylgruppen) Relaxation durch Wechselwirkung mit ungepaarten Elektronen (paramagnetische Substanzen oder Verunreinigungen führen zu schneller T 2 -Relaxation und damit zu breiten Linien, z.b. O 2 )

33 t1 sec vom FID zum MR-Spektrum Umwandlung der Zeitdomäne FID (Signalamplitude als Funktion der Zeit) in die Frequenzdomäne MR-Spektrum (Signalamplitude als Funktion der Frequenz) durch Fourier- Transformation f ( t) = FT + F( ν ) e i2πν dν F( ν ) = + f ( t) e i2πν dt Realteil Absorption Imaginärteil Dispersion FT

34 Quadraturdetektion FT ω ω cos(-ωt) = cos(ωt) 0 Hz + Summe ω ω FT ω 0 Hz ω sin(-ωt) = -sin(ωt) 0 Hz simultane Detektion des FID durch zwei Detektoren mit 90 Phasendifferenz

35 Puls RF-Puls: Kombination einer Welle (cos) der Frequenz ω 0 mit einer Stufenfunktion t * = PW t p FT Zeitdomäne ω o Frequenzdomäne (Anregungsprofil) das resultierende Signal (Anregungsprofil) ist um ω 0 symmetrisch; kürzere Pulsbreite (PW) breiterer Anregungsbereich längere Pulsbreite schmälerer Anregungsbereich

36 Puls ω 0

37 Beschreibung von MR-Experimenten klassische Beschreibung (Bloch-Gleichungen) beschreiben das Verhalten der Magnetisierung in einem Magnetfeld und bei Wechselwirkung mit einem externen RF-Feld. Mathematisch werdenvektorprodukte gebildet. Bei Vernachlässigung der Relaxation kann die zeitliche Veränderung des Magnetisierungsvektors durch einfache Rotationen im Raum beschrieben werden. Versagt bei gekoppelten Systemen Energieniveau-Schemata ungeeignet für zeitabhängige Phänomene Vektorbilder ähnliche Einschränkungen wie die Bloch-Gleichungen, kein exaktes Verständnis von Pulsfolgen Quantenmechanische Beschreibung kompliziert, aber exakt. Durch den Produktoperatorformalismus (ein vereinfachter quantenmechanischer Formalismus) ist die Beschreibung der meisten Experimente mit vertretbarem Aufwand gut möglich

38 Produktoperatorformalismus Ein Operator, die sogenannte Spin-Dichtematrix ρ(t) beschreibt den gesamten Zustand des Systems. Diagonalelemte der Matrix entsprechen Populationen, icht-diagonalelemente entsprechen Kohärenzen. Observable und nicht observable Größen werden durch Spurbildung (Summe der Diagonalelemente) nach Multiplikation mit den entsprechenden Operatoren (chem. Verschiebungen, Kopplungen, Pulse, etc.) 'abgelesen'. Die zeitliche Evolution der Dichtematrix unter dem Einfluß von chem. Verschiebungen, Kopplungen, Pulsen beschreibt die Liouville-voneumann Gleichung. αα αβ βα ββ αα αβ βα ββ αα αβ βα ββ αα αβ βα ββ αα αα αα αα αβ αβ αβ αβ βα βα βα βα ββ ββ ββ ββ Populationen Einquantenübergänge (SQC) ullquanten -übergänge (ZQC) Doppelquanten -übergänge (DQC)

39 Digitalisierung Umwandlung des analogen Signals FID in eine Folge einzelner, diskreter Punkte vertikale Digit. horizontale Digitalisierung

40 Digitalisierung vertikale Digitalisierung: erfaßt die Amplitude des MR- Signals, abh. von der Wortlänge des ADC bestimmt den dynamischen Bereich (sehr kleine Signale können nicht neben sehr großen Signalen gemessen werden) horizontale Digitalisierung: bestimmt die digitale Auflösung yquist-theorem: zur korrekten Digitalisierung sind mindestens 2 komplexe Datenpunkte pro volle Sinusperiode erforderlich; yquist-frequenz: größte Frequenz, die gerade noch korrekt erfaßt werden kann

41 1 korrekt yquist-theorem nicht korrekt nicht korrekt digitalisierte Frequenzen (> yquist-fr.) ergeben im Spektrum gefaltete Signale (nicht an der richtigen Position) Aliasing ( Abhilfe z.t. durch Verwendung digitaler Filter)

42 gefaltete Signale (Aliasing) korrekt nicht korrekt Phasenfehler!

43 Digitale Auflösung (Digital Resolution = DR): 1 DW = 2 SW AQ DR = DW TD = = SW SI = 2SW TD TD 2SW 1 = AQ DR (Hz/point) AQ (s) DW: dwell time (time between digital points) AQ: acquisition time (time the FID is sampled) TD: is the number of points collected in the FID DR: digital resolution SI: is the number of points in the frequency spectrum TD and SI are base 2 numbers (2, 4, 8,,1024, 2048, ) to make FFT work

44 Data Processing Window Funktionen der FID wird vor der FT meist mit verschiedenen mathematischen Methoden behandelt, um gewisse Informationen (auf Kosten anderer) hervorzuheben Signal/oise = Kopfbreite/Schwanzbreite t1 sec Good stuff hauptsächlich Rauschen Exponentielle Multiplikation (matched filter): FID mit abfallender Exponentialfunktion multipliziert besseres S/, geht auf Kosten der Auflösung (Standard bei 13 C-BB) Original FID nach EM

45 Gauss-Multiplikation (Lorentz Gauss Transformation) bessere Auflösung auf Kosten des S/ FID nach Gauss-Mult. Original-FID

46 Probleme mit abgeschnittenen FIDs clipped FID: zu hohe Empfänger-Verstärkung starke Basislinienverzerrungen truncated FID: zu kurze Acquisitionszeit

47 Ein-Puls Experimente Puls (µs) Transmitter (Sender) Receiver (Empfänger) on off AQ Acquisitionszeit, einige s RD Relaxations- Delay Zeit FID 1 H-MR usw. z.b. 5 µs z.b. 5 s z.b. 3 s 13 C-MR: Breitbandentkopplung des gesamten 1 H-Bereiches während AQ und RD

48 Integration von FT-MR Spektren 1 H-MR: Problem: Protonen innerhalb eines Moleküls relaxieren verschieden schnell; wartet man nach den Pulsen das Erreichen der Gleichgewichtsmagnetisierung nicht ab, so resultieren unterschiedliche Sättigungseffekte für die jeweiligen Protonen ungenaue Integrale! Für genaue Integrale: kleine Pulswinkel (30-50 ) und/oder genügend lange Relaxations-Delays (bis zu 5-10 T 1 ) 13 C-MR: sehr große Unterschiede im Relaxationsverhalten, quartäre C-Kerne relaxieren langsam, CH, CH 2, CH 3 aber meist wesentlich rascher Signale von quartären C s unter üblichen Aufnahmebedingungen meist weniger intensiv Zuordnungskriterium!

49 Integration bei 13 C-MR Spektren T 1 -Zeiten für die 13 C-Kerne in Phenylacetylen: 107s 9s 9s C C H 14s 14s 132s zusätzlich treten bei BB-Entkopplung OE-Effekte auf (OE = uclear Overhauser Enhancement), die zu Signalverstärkung führen normal aufgenommene, BB-entkoppelte 13 C- MR Spektren sind ICHT integrierbar!!!

50 13 C-MR 1 H Entkoppler immer on normale Aufnahme (BB-Entkopplung) Singulett-Signale 13 C FID PW AQ RD FID gated decoupling ( 1 H-gekoppelte 13 C- MR Spektren mit OE, alle Kopplungen zu H s sichtbar 1 H 13 C off FID PW AQ on off on RD FID inverse gated decoupling ( 1 H-entkoppelte 13 C-MR Spektren (Singuletts) ohne OE bei langem RD integrierbar) 1 H on 13 C FID PW AQ off RD (lang!) on FID off

51 13 C-MR BB-Entkopplung führt zu übersichtlichen Spektren (oft Interpretation dadurch erst überhaupt möglich) achteil: Kopplungsinformation geht vollständig verloren Rückgewinnung der Kopplungsinformation (Cq, CH, CH 2, CH 3 ): SFORD: Single frequency off resonance decoupling (veraltet) APT, DEPT, IEPT, J-resolved 2D-MR off-resonance (SFORD) entkoppeltes 13 C-MR: 2 J, 3 J eliminiert, 1 J reduziert 1 H-MR Bereich 13 C-MR Bereich CH CH 2 CH 3 C q CH CH 2 CH 3 1 H-gekoppeltes 13 C-MR 1 H-breitbandentkoppeltes 13 C-MR (lauter Singuletts)

52 1 H-gekoppeltes 13 C-MR - Anwendungen H O + Base - H2 O C COOCH 3 13 C-MR Reaktionsprodukt (BB-entkoppelt) H C COOCH 3 A oder H B C COOCH 3 C Ausschnitte ( 1 H-gekoppelt)???? C=O

53 Polarisationstransfer Probleme bei MR: Empfindlichkeit Zuordnung Lösung: höhere Magnetfelder, Spektrenakkumulation, OE, Polarisationstransfer Polarisationstransfer*: Übertragung von Magnetisierung von einem empfindlichen Kern (z.b. 1 H) auf einen unempfindlichen (z.b. 13 C, 15 ) Voraussetzung: skalare Kopplung zwischen empfindlichem und unempfindlichen Kern; je größer diese, desto besser * auch Populationstransfer, Kohärenztransfer

54 Polarisations-Transfer 1 Selektiver Populations-Transfer (SPT)* 13 C 1 H System, z.b. Chloroform (CHCl 3 ) Cl Cl 12 C 1 H Cl Cl 13 C 1 H Cl Cl 99% 1% 13 C-MR (nicht entkoppelt) 1 H-MR 1 J( 13 C, 1 H) ~ 209 Hz 1 J( 13 C, 1 H) δ 77 ppm δ 7.26 ppm * auch sel. Polarisationstranfer, sel. Kohärenztransfer, sel. Populations-Inversion (SPI)

55 Polarisations-Transfer 2 Selektiver Populations-Transfer (SPT) ungestörtes 13 C 1 H Spinsystem E βα C=1 13 C 3 4 ββ 1 H H=4 2,4 1,3 H=4 1 H αα 1 13 C 2 C=1 αβ 3,4 1,2 13 C 1 H n E γhb0 α kt 2 πkt n β = e Boltzmann-Verteilung: γ H : γ C ~ 4 : 1 = e

56 Polarisations-Transfer 2a Selektiver Populations-Transfer (SPT) ungestörtes 13 C 1 H Spinsystem selektiv E βα C=1 13 C 3 4 ββ 1 H H=4 2,4 1,3 H=4 1 H αα 1 13 C 2 C=1 αβ 3,4 1,2 13 C 1 H n E γhb0 α kt 2 πkt n β = e Boltzmann-Verteilung: γ H : γ C ~ 4 : 1 = e

57 13 Polarisations-Transfer 3 Selektiver Populations-Transfer (SPT) E 13 C 1 H Spinsystem mit invertiertem 1 H-Übergang 1,3 (selektiver 180 Puls auf 1,3 Übergang SPI) 3,4 2,4 C=5 13 C ββ 4 αβ 3 1 H H=4 H=-4 1 H βα 1 13 C 2 C=-3 αβ 13 C 1 H 3,4 1,2 jetzt: ursprünglich: 1,2

58 Polarisations-Transfer 4 icht selektiver Polarisations-Transfer (IEPT*) SPI: Polarisationstranfer immer nur selektiv für ein einzelnes H C System; selektive Inversion eines Übergangs bei komplizierten Molekülen unmöglich nicht selektiver Polarisationstransfer: alle H X Systeme gleichzeitig angeregt 1 H 90 x 180 x 90 y 1 τ = 1 τ = 4J 4J J 13 C 180 x 90 x CH CH 2 CH 3 mit der basic-iept Sequenz erhält man Antiphasen-Multipletts keine Entkopplung möglich! IEPT ist kürzeste und einfachste Pulsfolge für PT * IEPT: Insensitive uclei Enhanced by Polarization Transfer

59 Polarisations-Transfer 5 Empfindlichkeitsgewinn der durch Polarisationstranfer maximal erzielbare Intensitätsgewinn hängt von den Parametern H und X ab X = 13 C: X/ H ~ 1/4 H = 4 X X = 15 : X/ H ~ 1/-10 H = 10 X X = 57 Fe: X/ H ~ 1/31 H = 31 X

60 DEPT (Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer) 1 H 13 C 90 θ y x 180 x τ = 1 2J 1 2J τ = (BB) 90 x 180 x! τ = 1 2J BB-Entkopplung während der Aufnahme optional mit der DEPT-Sequenz erhält man ohne BB 'normale', verzerrungsfreie Multipletts; aber hier auch BB während Acquisition möglich Singuletts

61 'Editing' mit DEPT π/4 π/2 3π/4 CH Abhängigkeit der Signalintensität vom variablen Pulswinkel θ θ 1 = π/4 (45 ) θ 2 = π/2 (90 ) CH 2 θ 3 = 3π/4 (135 ) Subspektren: nur CH: θ 2 CH 3 nur CH 2 : θ 1 - θ 3 nur CH 3 : θ 1 + θ θ 2

62 Spektren-Editing via DEPT - Menthol CH 3 10 CH CH OH alle CH n quartäre C-Atome werden nicht erfaßt!

63 DEPT ohne Entkopplung: 15 -MR von Formamid H O H H

64 J-moduliertes Spin-Echo (JMODXH), APT, SEFT JMODXH: 13 C 180 x 90 x τ τ BB on off on Cq CH CH 2 CH 3 τ = 1/J

65 APT - Attached Proton Test (SEFT, JMODXH)* O A B C D E 4 2/6 u. 3/5 B C D E BB A ppm CH, CH 3 APT LM * SEFT = Spin Echo Fourier Transform JMODXH = J-modulated Spin-Echo C q, CH 2

66 APT (JMODXH, SEFT) Achtung bei sehr großen 1 J( 13 C, 1 H) Kopplungen! H 3 CO-CHO 1 J = 226 Hz Ph-C C-H 1 J = 226 Hz Ph-O-C C-H 1 J = 269 Hz 208 Hz H O H 231 Hz 208 Hz 217 Hz H H H H

67 1D-IADEQUATE* a) H 12 C 12 C H ~99%, dem 13 C-MR nicht zugänglich! b) H 13 C 12 C H ~1%, 'normales' 13 C-MR c) H 13 C 13 C H ~0.01%, IADEQUATE, normales 13 C-MR (b) wird unterdrückt SQC αβ SQC ββ SQC DQC βα SQC αα SQC = single quantum coherence (observabel) DQC = double quantum coherence (unter normalen Bedingungen nicht observabel) in einem 2-Spin-System ( 13 C- 13 C) sind Doppelquantenkoheränzen möglich, in einem 1-Spin-System ( 13 C- 12 C) nicht!! * IADEQUATE = Incredible atural Abundance DoubleQuantum Transfer Experiment

68 1D-IADEQUATE man erhält Antiphasen-Dubletts aufgespalten durch die 13 C, 13 C- Kopplungskonstante ( 1 J, 2 J, 3 J - je nachdem auf welchen Wert für J optimiert wird) da aber nun gegenseitige Kopplung zwischen 13 C-Kernen auftritt, erhält man Information über achbarschaftsbeziehungen zwischen 13 C-Kernen und damit wertvolle Direktinformation über das C-Gerüst der Verbindung mit spezieller Pulsfolge werden Doppelquantenkohärenzen (DQC, αα ββ) angeregt, eine 90 -Phasendifferenz zum 'normalen' 13 C-Signal erzeugt (damit vom 'normalen' 13 C-Spektrum separiert) und durch einen 'Lesepuls' sichtbar gemacht Probleme: Unterdrückung des > 100-fach intensiveren 'normalen' 13 C-Spektrums bei größeren Molekülen rasch uninterpretierbar wegen Überlappungsproblemen sehr unempfindlich genügend Substanz und ausreichende Löslichkeit erforderlich

69 1D-IADEQUATE Piperidin 35.2 Hz 35.2 Hz 33 Hz 33 Hz

70 OE (uclear Overhauser Effekt) C H 3 CH 3 O H Beobachtung: bei Bestrahlung der Resonanzlinie von CHO im DMF werden beide -Methyl-Signale intensiver allerdings in verschiedenem Ausmaß Grund: OE bei der Aufnahme von 13 C-MR Spektren unter Breitband-Entkopplung während AQ erfolgt Signalverstärkung Grund: OE OE verknüpft mit dipolarer Relaxation durch die schnelle Molekülbewegung in Lösung erzeugt Kern A am Ort von Kern B ein fluktuierendes Magnetfeld, welches die Relaxation von B stimuliert A und B sind dipolar gelinkt (gekoppelt) durch die schnelle Molekülbewegung in Lösung werden richtungsabhängige Unterschiede in den chemischen Verschiebungen herausgemittelt ('isotropic tumbling')

71 E 3 OE und dipolare Relaxation dipolare Relaxation abhängig von: Abstand zwischen den involvierten Kernen Molekülbewegung (charakterisiert durch die Korrelationszeit τ c, in diese diese gehen ein: Molekülgröße und form, Temperatur, ph, H-Brücken, Viskosität des LM, usw.) große Moleküle: τ c groß, kleine Moleküle: τ c klein atur der involvierten Kerne αβ I S ββ 4 W 34 I W 24 W 13 W 23 αα W 14 1 W 12 S βα 2 Energieniveau-Schema 2-er dipolar gelinkter Kerne I und S (keine skalare Kopplung!) W 23 (W 0 ): ullquantenübergang (ZQC) W 14 (W 2 ): Doppelquantenübergang (DQC) W 0 und W 2 sind quantenmechanisch 'verbotene' Übergänge 'cross relaxation'

72 OE, dipolar gekoppelte Kerne I und S zu viel! = 2 S = 4 I I = 4 S = 2 Gleichgewichtszustand = 0 zu wenig! = 4 S = 4 I zu viel! I S = 0 zu wenig! Sättigung des S-Überganges zu viel =5 =3 =5 W 2 W 0 =3 zu wenig W 2 W 0 zu viel W 2 dominiert Signal von I verstärkt W 0 dominiert Signal von I geschwächt zu wenig System versucht, via W 2

73 OE - Aspekte W 2 dominiert: positiver OE, bei kleinen Molekülen, nicht viskosen LM W 0 dominiert: negativer OE, bei großen Molekülen, viskosen LM W 0 ~ W 2 : OE verschwindet, bei mittelgroßen Molekülen (MG ~ 1000) dipolare Relaxation und damit OEs auch abhängig von der Feldstärke, Hochfeldgeräte: oft kleinerer Anteil an dipolarer Relaxation kleinere OEs Verstärkung durch OE proportional 0.5 (γ S /γ I ) homonuklearer Fall (I = 1 H, S = 1 H): = 0.5 maximal 50% Verstärkung 13 C: I = 13 C, S = 1 H : 0.5 4/1 = 2 maximal 200% Verstärkung 15 : I = 15, S = 1 H : 0.5 ( 10)/1 = 10!! maximal 500% Verstärkung 15 : +1 4 Verstärkung durch OE 100% (realistisch!): kein OE kein Signal mehr! OE

74 OE die Geschwindigkeit des OE-Aufbaues ist proportional 1/r IS 6 (r IS = Abstand zwischen den dipolar gelinkten Kernen I und S) unter gewissen Voraussetzungen können via OE räumliche achbarschaftsbeziehungen zwischen Kernen festgestellt werden! Abstandsgrenze ca. 4 5 Å in der Realität beobachtete OEs sind meist unter 10%, oft sogar < 1% für die Detektion solch kleiner Intensitätsänderungen der MR-Signale ist die übliche Integration nicht geeignet (Ungenauigkeiten bis 10%, stark abhängig von den Aufnahmebedingungen) je kleinere OEs man detektieren kann, desto weiter kann man man mit Hilfe dieser Methode 'sehen' (z.b. 1,3-diaxiale H's im Cyclohexan: OE berechnet ca. 3%, realistisch ca. 1%) Detektion via OE-Differenzspektroskopie!

75 OE-Differenzspektroskopie (bei kleinen Molekülen) 1. Spektrum 'on resonance', 2. Spektrum 'off-resonance', nach Differenzbildung bleiben nur jene Signale übrig, deren Intensität sich ändert. Voraussetzung: hohe Stabilität des Spektrometers H X 2Å H A 6Å H Y Molekül H Y H X H A a Einstrahlung 'off resonance', ungestörtes Spektrum b b-a Einstrahlung 'on resonance', auf Resonanzlinie von H A OE-Differenzspektrum, b-a

76 OE-Differenzspektroskopie O H O oder (E)-Isomer CH 3 OE H CH 3 (Z)-Isomer kein OE on resonance OH off resonance OH O 6 5 CH 3 3 CH 3 H 3 OH

77 OE-Differenzspektroskopie - Anwendungsbeispiele Konfiguration von Doppelbindungsisomeren mit C=C Partialstruktur A B A OE B kein OE oder nur kleiner OE Konfiguration von Verbindungen mit C= Partialstruktur (Oxime, Oximether, Semicarbazone, Thiosemicarbazone, Hydrazone, Schiff'sche Basen u.v.a) Y X H R 1 R 2 OE Bestimmung des Substitutionsmusters an Aromaten und Heteroaromaten Signalzuordnung Bestimmung der Stereochemie komplexer(er) (polycyclischer) Moleküle: eindeutig zugeordnete 1 H-Resonanz als Startpunkt, dann 'Weiterhanteln' durch das Molekül

78 Konfigurationsbestimmung von Oximen via OE-Differenzsp.

79 Signalzuordnung an Heteroaromaten via OE-Differenzsp. H 3 Br 5 H H H OE OE H-5 Ph H-2,6 CH 2

80 Unterscheidung positionsisomerer 1,2,4-Triazol-Derivate via OE-Differenzspektroskopie die Methylierung von 3-Brom-1,2,4-triazol liefert 3 positionsisomere Produkte Br H Br H Br H CH 3 I, Base Br CH 3 H H 3 C Br + + OE H Br kein OE (oder schwach) CH 3 OE H C D E

81 Indirekter OE 3-Spin System H A H B H C, Voraussetzung: ungefähr lineare Anordnung von H A, H B und H C H A pos. OE auf H B indirekter, negativer OE auf H C hier: CH 3 pos.oe auf H-5 indirekter, negativer OE auf H-6 (via H-5)

82 Heteronukleare 13 C{ 1 H} OE-Differenzspektroskopie H 2 5 O S H 3 O Zuordnung C-3, C-5??? C=O C ppm

83 OE Übung 1

84 OE Übung 2 CH 3 oder?? A CH 3 B

85 2D-MR Präparation Evolution/ Mixing Detektion FID t 1 t 2 Evolution mix Evolutionsphase t 1 wird systematisch variiert FID damit von 2 Zeitvariablen abhängig (t 1,t 2 ) 2 Fourier-Trasformation (nach t 1 und t 2 ) Signal durch 2 Frequenzen charakterisiert

86 2D MR-Signal nach 1. FT (nach t 2 ) Serie von 1D-Spektren mit Amplitudenmodulation oder Phasenmodulation

87 2D-MR 2-dimensionaler FID FID nach 1. FT (nach t 2 ) FID nach 2. FT 2-dimensionales MR-Signal, durch 2 Frequenzen charakterisiert

88 2D-MR - Darstellungsmöglichkeiten 1D-Spektrum 2D - Contour Plot (Konturdiagramm) ähnlich Landkarte, übliche Darstellungsweise 2D - Stacked Plot

89 Klassifizierung zweidimensionaler MR-Spektren J-aufgelöste 2D-Spektren (J-resolved oder δ,j-spektren): auf einer Achse chemische Verschiebung, auf der anderen Kopplung verschiebungskorrelierte Spektren (δ,δ-spektren): auf beiden Frequenzachsen chemische Verschiebungen homoskalar korreliert: z.b. auf beiden Achsen 1 H-chemische Verschiebungen heteroskalar korreliert: z.b. x-achse 1 H-, y-achse 13 C-chem. Verschiebung skalar korrelierte Spektren: Korrelation via skalare Kopplung Austauschspektren: Korrelation via OE oder chemischen Austausch

90 δ,j-spektren 13 C, 1 J-Spektrum von Saccharose Information: Zahl der direkt gebundenen Protonen, Größe von 1 J Saccharose 4 HO HO OH 6 O OH O HO O 5 6 OH OH G Glucose-Teil HO 1 F Fructose-Teil

91 homonukleare δ,δ-spektren über skalare Kopplungen COSY (Correlated Spectroscopy): Ermittlung des 1 H-Kopplungsnetzwerkes (welches H koppelt mit welchem H?), viele verschiedene Varianten H 2 J H H 3 J H H 4 J H C C C C C C TOCSY (Totally Correlated Spectroscopy): sukzessive Erfassung des gesamten Spinsystems, Magnetisierung wird über das gesamte Spinsystem 'verschmiert' H H H H H C C C C C 2D-IADEQUATE (Incredible atural Abundance Double Quantum Transfer Experiment): Ermittlung des C-Gerüstes (welches 13 C koppelt mit welchem 13 C?) 13 C 1 J 13 C 13 C X 13 C 13 C X X 13 C 2 J 3 J Relay-Experimente: Kombination zweier Experimente (z.b. 2 1 H, 1 H-COSY), damit Korrelation von Kernen, die miteinander nicht koppeln!

92 heteronukleare δ,δ-spektren über skalare Kopplungen H 'welches H hängt an welchem C?' 1 J CH H,C-COSY (HETCOR) ( 13 C-detektiert) C HMQC, HSQC ( 1 H-detektiert) 3 J CH 2 J CH H 'welches H koppelt über mehrere Bindungen mit welchem C?' damit auch Erfassung quartärer C-Atome COLOC ( 13 C-detektiert) C C quart. C HMBC ( 1 H-detektiert) HMQC: Heteronuclear Multiple Quantum Coherence HSQC: Heteronuclear Single Quantum Coherence HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation COLOC: Correlation via Long-Range Coupling

93 δ,δ-spektren über Austauschphänomene EXSY (Exchange Spectrsocopy): Korrelation via chemischer Austausch OESY (uclear Overhauser Enhancement Spectroscopy): Korrelation via OE (= dipolare Kopplung, 1 H, 1 H) HOESY (heteronuklearer OESY) H a H b OE H H EXSY OESY H b H a

94 COSY (Correlated Spectroscopy) Information über das Kopplungsnetzwerk (welches H koppelt mit welchem H?) Diagonalsignale: 'normales' Spektrum A B O B C A D E C D E E Kreuzsignale: zeigen Korrelationen an D C Diagonale A B

95 COSY verschiedene Varianten Absolutwert-COSY ( magnitude mode ) einfachste Variante, schnell, Signale haben absorptive und dispersive Anteile, daher Signalbildung 2 2 M = Re + Im COSY45: 45 Lesepuls, dadurch Intensitäten der uninteressanten Diagonalsignale reduziert long-range COSY: auf Fernkopplungen optimiert phasensensitives COSY (PS-COSY): rein absorptive Signale, enthält Information über Größe der Kopplungskonstanten DQF-COSY (COSY mit Doppelquantenfilter): 1-Spin Systeme eliminiert (z.b. störende Signale von LM, Methylgruppen usw. Diagonale wird entrümpelt, achteil: weniger empfindlich, dauert länger E.COSY und P.E.COSY: Ermittlung von 1 H, 1 H-Kopplungskonstanten

96 COSY - phasensensitiv der typische COSY-Kreuzpeak besteht aus Antiphasen-Dubletts und resultiert von der aktiven Kopplung zwischen den Kernen A und B, beim Vorhandensein passiver Kopplungen resultieren kompliziertere Signale nur aktive Kopplung zwischen A und B

97 COSY mit Doppelquantenfilter COSY normal DQF-COSY Signale von 1-Spin-Systemen eliminiert

98 TOCSY (Totally Correlated Spectroscopy) = 1 H A B C D liefert in-phase Kreuzpeaks zwischen Protonen, die einem gemeinsamen Spinsystem angehören alle Signale von H s, die einem Spinsystem angehören, befinden sich auf einer Linie COSY TOCSY D C B A D C B A A B C A B C D D

99 TOCSY A B C D das Verschmieren der Magnetisierung über das gesamte Spinsystem ist abhängig von der Mischzeit kurze Mischzeit: wie COSY

100 HETCOR (H,C-COSY) (idente Information: HMQC, HSQC)* Welches H hängt direkt an welchem C? 13 C-MR B C D E A O C E A B D E D C 1 H-MR A B HMQC: Heteronuclear Multiple Quantum Coherence; HSQC: Heteronuclear Single Quantum Coherence

101 HETCOR (H,C-COSY) versus HSQC/HMQC beide Typen von Experimenten liefern die gleiche Information (welches H hängt direkt an welchem C Korrelation über eine C H Bindung) HETCOR: Detektion des 13 C-Kerns, 1 H-Frequencen auf 13 C-Frequenz aufmoduliert Vorteil: gute Auflösung auf der 13 C-Achse, achteil: unempfindlich HSQC oder HMQC: Detektion von 1 H ( inverse oder reverse Detektion), die 13 C-Frequenz ist auf die 1 H-Frequenz aufmoduliert Vorteil: wesentlich empfindlicher als HETCOR (Faktor ~8!), achteil: schlechte Auflösung in der inkrementierten 13 C-Dimension heute wird fast auschließlich invers gemessen (HSQC, HMQC); HSQC und HMQC sind völlig verschiedene Pulssequenze, die jedoch zu vergleichbaren Resultaten führen, wobei HSQC gegenüber HMQC meist leichte Vorteile aufweist

102 13 C, 1 H HSQC (gradient-selected) von Chinin HO MeO 13 C APT CH, CH 3 Cq, CH 2

103 13 C, 1 H HMQC (mit BIRD-Filter) 7.2 F2 (ppm) O O H F1 (ppm)

104 Weitbereichs C,H-Korrelationen: COLOC versus HMBC-Experiment beide Typen von Experimenten liefern im Prinzip die gleiche Information welches H koppelt mit welchem 13 C über 2, 3 (oder 4, 5) Bindungen? COLOC: Detektion des 13 C-Kerns, 1 H-Frequencen auf 13 C-Frequenz aufmoduliert Vorteil: gute Auflösung auf der 13 C-Achse, achteil: sehr unempfindlich, Artefakte von 1 J-Kopplungen HMBC: Detektion von 1 H ( inverse oder reverse Detektion), die 13 C-Frequenz ist auf die 1 H-Frequenz aufmoduliert Vorteil: wesentlich empfindlicher als COLOC achteil: schlechte Auflösung in der inkrementierten 13 C-Dimension, nicht vollständig unterdrückte Dublett-Restpeaks von 1 J-Korrelationen heute wird fast auschließlich invers gemessen (HMBC)

105 COLOC (Correlation via Long-range Coupling) C=O Pyraz C-3 Pyraz C-4 OMe COMe COMe O MeO 3 4 Me 1 J! H OMe J(H5,C3) Pyraz H-5 2 J(H5,C4) 1 J!

106 HMBC von Chinin (Ausschnitt) MeO HO?? icht vollständig nterdrückte 1 J CH

107 15, 1 H HMBC H 2 O CH 3 CCH 3 Py-2,6 Py-3,5 H 3 C 6 O 5 1' -6 1 O CH 3 in DMSO-d 6-1 (Pyridin-) 1 nicht erfaßt!!! Besitzt keine Kopplung zu irgendeinem H für Polarisationstransfer -5 normales 1D 15 -Spektrum ohne Entkopplung: δ (1) ppm

108 protonendetektierte heteronukleare Spektroskopie (inverse Methoden) Cl Cl Cl 12 C 1 H Cl 13 C 1 H Cl Cl 99% 1% 99% 13 C-MR (nicht entkoppelt) 1 H-MR 1 J( 13 C, 1 H) ~ 209 Hz 1 J( 13 C, 1 H) 0.5% 0.5% Probleme: vollständige Unterdrückung der Signale von H 12 C (99%) Phasencyclus (Quantenfilter), Gradienten, BIRD-Filter u.a. Entkopplung des X-Kernes ( 13 C, 15 : wesentlich größerer Verschiebungsbereich als bei 1 H; 500 MHz-Spektrometer: 10 ppm für 1 H 5000 Hz; 200 ppm für 13 C Hz!) spezielle Entkopplungstechniken (z.b. GARP)

109 2D-IADEQUATE Ermittlung von 13 C 13 C Konnektivitäten OH HO δ( 13 C) x-achse: 13 C-chemische Verschiebungen; y-achse: Summe der Frequenzen der 13 C-chem. Verschiebungen der beiden koppelnden Kerne Kreuzpeaks haben Dublett-Feinstruktur

110 2D-IADEQUATE - Menthol in Benzol-d 6 F1 (Hz) CH H 3 C CH OH ppm F2 (ppm)

111 OESY uclear Overhauser Effect Spectroscopy Räumlich benachbarte Kerne (d < ~ 3.5Å) geben Kreuzpeaks (offdiagonal) Distanzinformation! Diagonalpeaks und Kreuzpeaks haben verschiedene Phase schwacher OE d größer Hb Ha starker OE, d klein C Hc Hd kein OE, d zu groß Hb Hd Ha Hc δ (f 2 ) δ (f 1 )

112 OESY von Melatonin CH 3 MeO A H B O H Melatonin

113 OEs bei der Strukturbestimmung von Proteinen C OE OE C C C

114 OEs bei der Strukturbestimmung von Proteinen α-helix(hi-hi+1) H(i) H(i-1) β-sheet ( Hi- HAi-1 ) ( HAi -HAj )

115 EXSY Exchange Spectroscopy Pulssequenz ident mit OESY, aber meist kürzere Mischzeiten Kreuzpeaks sind achweis für miteinander austauschende Kerne, haben dieselbe Phase wie die Diagonalpeaks (im Gegensatz zu OESY- Kreuzpeaks) Artefakte durch OESY-Peaks O H CH 3 CH 3 DMF

116 Selektive Anregung ormalfall: nicht selektive Anregung mit harten Rechteckpulsen das Anregungsprofil ist eine sinc-funktion (sinx/x), je kürzer Pulsdauer desto breiter die Anregung zur selektiven Anregung (Einige Hz Anregungsbreite) sind Rechteckpulse meist nicht geeignet (problematisch wegen langer Pulsdauer und uneinheitlicher Anregung) Anregung mittels shaped pulses häufig verwendete selektive shaped Pulse: Gauss-Pulse (90, half-gauss, 270 Gauss) BURP-Pulse (Tophat) DATE (Sequenz von n identen, sehr kurzen hard-pulses mit sehr kleinem Pulswinkel

117 Anregungsprofile verschieden geformter Pulse

118 Shaped Pulses: E-BURP-2

119 Selektive Anregung - Anwendungen 1D-Varianten 2-dimensionaler Spektren (z.b. 1D-COSY, 1D-TOCSY, 1D-OESY, 1D-HETCOR usw.) (nur Information über einige wenige Signale benötigt) 2D-Experimente mit selektiver Anregung in einer (semisoft- Experimente) oder in 2 Dimensionen (soft-experimente) semisoft soft 2D-Varianten 3-dimensionaler Spektren (für komplizierte Moleküle)

120 1D-HETCOR icotinsäureethylester 4 COOEt H C-2, C-6 Zuordnung? C-4 C-5 CO C-3 H-2 H-6 H-4 H-5 C ppm 170 ppm

121 1D-HETCOR eindeutige Zuordnung eng benachbarter 13 C-Signale (via 1 J) H H MeO 7.73 H S O H O 13 C-MR (BB) ppm ppm ppm D-HETCOR Anr. dd 8.55 ppm ppm ppm 8 scans, Aufnahmezeit < 1 Minute

122 1D-long-range IEPT (IAPT) H H O O H ppm

123 (δ,j) selective long-range IEPT Signal von Thiophen C-2 im 1 H-gekoppelten 13 C-MR: δ ppm, ddd, mit J = 5.9, 6.5, 10.9 Hz. Zuordnung der Kopplungskonstanten? selektive Anregung von H-3 (optimiert auf n J = 6 Hz): F2 120 (ppm) 2 J(C2,H3) = 5.9 Hz H H Hz J(C4,H3) = 4.8 Hz Me H 3 A 2 S Hz 145 O J(CA,H3) = 3.5 Hz Me Hz analog F1 (Hz) selektive Anregung von Th H-4 bzw. Th H-5: 3 J(C2,H4) = 10.9 Hz; 3 J(C2,H5) = 6.5 Hz

124 (δ,j) selective long-range IEPT

125 1D-TOCSY Amikacin Disulfat

126 'Trennung' der beiden Ph-H Spinsysteme 1D-TOCSY HO O O elektive Anregung von CPh H-2,6 selektive Anregung von Ph H-4 1 H-MR (Aromatenbereich) ppm

127 Strategie einer Strukturaufklärung mittels MR ( small molecule, organische Verbindung C, H, (), O, ) (Vorinformation via IR, MS, UV, CH-Analyse, Chromatographie, Synthese usw.) 1 H-MR: δ (funkt. Gruppen, chem. Umgebung), J (benachbarte Kerne), Integral, Linienbreite (Beweglichkeit, chem. Austausch) 13 C-MR: δ (Hybridisierung), Anzahl der C-Atome ( CH!!) Multiplizitätsbestimmung via DEPT, IEPT, APT usw. ev. 1 H-gekoppeltes 13 C-MR oder δ,j 2D-MR 1 H, 1 H-Kopplungsnetzwerk: COSY, TOCSY und 1D-Varianten 13 C, 1 H-Korrelation: Verknüpfung von 1 H- und 13 C-Information über eine Bindung (C-H COSY, HETCOR, HMQC, HSQC und 1D-Varianten Welches H hängt an welchem C?) über 2,3,4 Bindungen (COLOC, HMBC, IAPT) Ermittlung des C-Gerüstes: IADEQUATE (wenn möglich bzw. notwendig) KOSTITUTIO des Moleküls relative Konfiguration (bzw. Konformation) via OE (ROE), 3 J

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129 Zuordnung der Ph-C eines Benzylrestes via 1 H-gekoppeltes 13 C-MR

130 Übung 2 verschiedene Signale für Ester C=O (165.5 ppm, ppm) Zuordnung?? (welches C=O ist (E), welches (Z))??? (Z)-Teil O O (E)-Teil O O H H ppm Ausschnitt aus dem 1 H-gekoppelten 13 C-MR Spektrum (gated decoupling), ppm

131 Übung OE-Differenzspektroskopie H OH oder H OH 1-Benzylpyrazol- 4-carbaldehyd-Oxim in DMSO-d 6 (Z) (E)

132 Übung OE-Differenzspektroskopie H H H 2 O oder H H O H 2 1-Benzylpyrazol-4-carbaldehyd Semicarbazon in DMSO-d 6 (Z) (E)

133 Übung OE-Differenzspektroskopie H OH O oder HO H O

134 Übung OE-Differenzspektroskopie Zuordnung der Signale der Protonen am Benzolring? OH H O

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