Protein-NMR. Vertiefungsfach Analytische Chemie (WS2015/16) Dr. Peter Bellstedt NMR Plattform IAAC & IOMC

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1 Protein-NMR Vertiefungsfach Analytische Chemie (WS2015/16) Dr. Peter Bellstedt NMR Plattform IAAC & IOMC

2 Themenübersicht Termin 1 am : Biochemie von Proteinen (Aufbau, Struktur, gentechn. Herstellung) Termin 2 am : NMR-Experimente I (Labeling,1D/2D/3D-Exp. für Zuordnung und räuml. Erfassung) Termin 3 am : NMR-Experimente II (CS und NOE-basierte Strukturberechnung, prakt. Übung ) Termin 4 am : Spezielle NMR-Strategien (>4D Experimente, spez. Labeling-Strategien, RDCs)

3 Aufbau eines NMR-Spektrometers

4 Aufbau eines Probenkopfes

5 Die RF-Spule als Herzstück bestimmt die Probenkopf-Architektur Innere Spule Äußere Spule Bezeichnung Äußere Spule Innere Spule 1 H X Invers (BBI) X 1 H Observe (BBO) x ~2 Empf MHz BBI BBO

6 Atomkerne als Stabmagnete in einem externen Magnetfeld B 0 +B 0 (bei Spin=1/2 Kernen)

7 Stabmagnete in einem externen Magnetfeld B 0 Larmor-Frequenz (=Resonanzfreq.!) ν & B & ν & = γ B & 2π Gyromagnetisches Verh.

8 Die Resonanzfrequenzen liegen im UKW-Bereich Kern 9.4 Tesla Tesla 1 H 400 MHz 600 MHz 13 C 100 MHz 150 MHz 15 N 40 MHz 60 MHz

9 Stabmagnete in einem externen Magnetfeld B 0 N - N. = e01/34 Die Spins sind nahezu gleichverteilt auf beide Zustände. Nur 1 aus ca Spins trägt zur Magnetisierung bei, wodurch NMR eine sehr insensitive Methode ist.

10 Vom Ensemble zur Vektorsummendarstellung der Spins

11 Problem der natürlichen Häufigkeit Kern Spinquantenzahl I Natürliche Häufigkeit [%] Gyromagn. Verhältnis [ MHz / T ] 1 H 1/2 99,99 42,6 13 C 1/2 1,10 10,7 15 N 1/2 0,37-4,3 17 O 5/2 0,04-5,8 31 P 1/2 100,00 17,2

12 Vektordarstellung und der FID

13 Vor dem NMR-Experiment: 1. Locken (to lock = verriegeln/festklemmen) Unlocked Locked 2 H-Kanal Ziel: Erreichen eines konstanten Magnetfeldes während des gesamten Experiments.

14 Vor dem NMR-Experiment: 2. Tuning & Matching To tune = abgleichen To match = etw. aufeinander abstimmen Ziel: Anpassung der RF-Spule an spezifische Frequenz (tuning) und Impendanz von 50 Ω (matching) (Minimierung der RF-Reflektion / Maximierung des RF-Signals in der Probe )

15 Vor dem NMR-Experiment: 3. Shimmen (to shim = unterlegen) Ziel: Homogenes Magnetfeld über das gesamte, aktive Probenvolumen.

16 T1 Relaxation: Rückkehr zur Equilibrium (M z ) z 90 x z x y t x y M 7 (t)=m 7,9: (1 e 63% x y

17 T1 Relaxation: Rückkehr zur Equilibrium (M z )

18 T2-Relaxation: Verlust der Phasenkohärenz

19 T2-Relaxation: Verlust der Phasenkohärenz

20 T 2 dominiert das Relaxationsverhalten

21 T 2 bestimmt die Länge des FIDs, T 1 die Zeit bis zum Equilibrium

22 Die Länge des FID bestimmt die Linienbreite Langsame Relaxation (Hoher T1/T2 Wert) Abgeschnittener FID (zur kurze Aufnahme) Schnelle Relaxation (Niedriger T1/T2 Wert)

23 Einfluß der Füllhöhe auf B 0 -Homogenität (und Phasenkoheränz)

24 Einfluß der Füllhöhe auf B 0 -Homogenität 4 cm 5x 3 cm

25 Auch ungelöste Partikeln beeinflussen die Feldhomogenität (negativ)

26 Nachträgliche Gewichtung des FIDs ( apodization/window functions )

27 Nachträgliche Gewichtung des FIDs ( apodization/window functions )

28 Erhöhung des Sensitivität (Peakhöhe) auf Kosten der Linienbreite

29 Erhöhen der Auflösung auf Kosten des Signal/Rausch-Verhältnisses

30 Fourier-Transformation: Von der Zeit- zur Frequenzdimension

31 2 Atome fühlen sich verbunden: Die J-Kopplung

32 Die Amplitudenmodulation als Informationsträger

33 Das Prinzip eines 2D-Experimentes, Einführung der indirekten Zeitdimension t1

34 Die Information der indirekte Dimension ist also amplitudenmoduliert

35 Informationen im NMR-Spektrum: 1. Die chem. Verschiebung (Lage der Signale)

36 Informationen im NMR-Spektrum: 2. Die Aufspaltung der Signale (Splitting)

37 Informationen im NMR-Spektrum: 3. Der Abstand zwischen den Splittings (J-Kopplung) Die Einheit von J ist Hz und sie ist unabhängig vom Magnetfeld! Spektren zeigen den Betrag von J Die Größe von J hängt ab von: der Elektronendichte der Anzahl an Bindungen dem Winkel der Bindungsvektoren J HH

38 Informationen im NMR-Spektrum: 3. Die Kopplung Die Fläche ist grundsätzlich proportional zur Anzahl an Atomen, kann aber durch bestimmte Pulselemente (z.b. Entkopplung) verändert sein.

39 1 H-NMR

40 Einschub: Empfindlichkeit von NMR-Experimenten

41 Problem der natürlichen Häufigkeit Kern Spinquantenzahl I Natürliche Häufigkeit in % 1 H 1/2 99,99 13 C 1/2 1,10 15 N 1/2 0,37 17 O 5/2 0,04 Wie löst man das Problem der natural abundance in der NMR-Protein- Strukturaufklärung? 1 H[ppm]

42 Exkurs: Aminosäure-Stoffwechsel

43 Aminosäure-Stoffwechsel Herstellung von isotopenmarkierten Proteinen mit Hilfe von 13 C-Glucose und 15 NH 4 Cl im Minimalmedium während der Anzucht & Expression in E. coli

44 [-N-Ca-CO-] bildet das konstante Rückgrat von Proteinen Aus Löffler, Petrides, Biochemie und Pathobiochmie, 2007 Springer

45 1 H, 15 N- HSQC von Ubiquitin

46 1 H, 13 C -HSQC von Ubiquitin

47 13 C-Chemical Shift Bereiche der Aminosäuren

48 Visualisierung von 3D-Spektren

49 Visualisierung von 3D-Spektren Strips

50 Das 1 H, 15 N-HSQC - Experiment

51 Das HNCA - Experiment

52 Das HN(CO)CA - Experiment

53 Das HN(CA)CO - Experiment

54 Das HNCO - Experiment

55 Das HNCO - Experiment

56 Das HNCACB & CBCANH - Experiment

57 Das HN(CO)CACB & CBCA(CO)NH - Experiment

58 Das HBHA(CO)NH- Experiment

59 Das NOESY - Experiment

60 Zuordnungsstrategien: 1. (CA + CB)-basiert

61 Zuordnungsstrategien: 1. (CO + CA)-basiert

62 Das HCCH-COSY / HCCH-TOCSY Experiment

63 Seitenketten-Shiftsaus HCCH-Experimenten