Molekulare Biophysik. NMR-Spektroskopie (Teil 2)
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- Nelly Holzmann
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Transkript
1 Molekulare Biophysik NMR-Spektroskopie (Teil 2)
2
3 3/96 Folgenden NMR-Parameter sind von Interesse chemische Verschiebung skalare Kopplung dipolare Kopplung Relaxation / NOE-Effekt
4 4/96 Chemische Verschiebung ppm Die Position der Signale im Spektrum wird als die chemische Verschiebung bezeichnet, sie wird relativ zu einem willkürlichen Standard angegeben
5 5/96 Chemische Verschiebung B eff = (1 - ) B 0 = (1 - ) B 0 = ( ref ) / 0 x 10 6 = ( ref ) x 10 6 Die Elektronen um den Atomkern schirmen das äußere Magnetfeld ab, je mehr Elektronen desto Stärker die Abschirmung
6 6/96 typische 1 H Verschiebungen ArOH -CHO olefinic ROH RNH 2 aromatic CH -O n acetylenic CH nch -N CH 2 CH 3 -C n -CO CH -Ar 3 CH -C=C 3 TMS 1 ( H)/ppm
7 7/96 typische Bereiche für 1 H und 13 C 1 H, 600 MHz, 14.7 Tesla 6000 Hz 10 ppm 3000 Hz 5 ppm 0 Hz 0 ppm 13 C, 150 MHz, 14.7 Tesla Hz 200 ppm Hz 100 ppm 0 Hz 0 ppm
8 8/96 Eine Zuordnung kann über empirische Tabellen erfolgen...
9 9/96... oder über Inkrementsysteme.
10 10/96 Bei 13 C funktionieren Inkrementsysteme noch besser als bei 1 H...
11 11/96... und viele z.b. Formelzeichenprogramme sind zu einer Vorhersage in der Lage.
12 12/96 Aber eigentlich ist die Annahme das die Elektronen kugelförmig um den Kern verteilt sind gar nicht allgemein richtig Man hat eine anisotrope Verteilung Chemical Shift Anisotropy (CSA)
13 13/96 Die vielen chemischen Verschiebungen ergeben ein Pulver-Spektrum
14 14/96 In Lösung beseitigt die Lösung Rotation der Moleküle dieses Problem, man erhält eine isotrope chemische Verschiebung Festkörper Wie können wir es im Festkörper lösen?
15 15/96 Wenn wir dafür sorgen, dass die x, y und z-achse schnell untereinander ausgetauscht werden, sollten wird das Gleiche wie in Lösung erreichen. Dazu rotieren wir die Probe um die Diagonale durch einen Würfel tan m = 2 m = Der Winkel ist bekannt als der magische Winkel ( magic angle )
16 16/96 Wir nutzen also Magic Angle Spinning MAS Magic-Angle Spinning (MAS) drive bearing
17 17/96 Allerdings verschwindet auch in Lösung nur die lokale Anisotropie rund um einen einzelnen Kern. Ergibt sich aus der Struktur des Moleküls eine feste Orientierung der Anisotropie einer Stelle relativ zu einer anderen so wird dessen chemische Verschiebung vom zusätzlichen Magnetfeld beeinflusst: Anisotropieeffekte treten auf, die aber nur die isotrope chemische Verschiebung als ganzes verändern
18 18/96 Skalare oder J- Kopplung Die Signale zeigen neben der Position im Spektrum auch noch eine Feinaufspaltung: die skalare Kopplung ppm
19 19/96 skalare oder J- Kopplung Die Elektronen um die Atomkerne vermitteln eine indirekte Spin-Spin Wechselwirkung.
20 20/96 RCH - CH 2 3 Skalare J = 8 Hz Kopplungen sind meist viel kleiner als chemische Verschiebungen.
21 21/96 Man unterscheidet Kopplung zwischen gleichartigen Kernen (homonukleare Kopplung) und zwischen unterschiedlichen Kernen (heteronukleare Kopplung) und zwischen direkten und Weitbereichskopplungen.
22 22/96 Direkte Kopplungen sind im allgemeinen eine Größenordnung größer als solche über mehrere Bindungen. 1 J HH = 276 Hz 2 J HH = Hz 3 J HH = Hz 4 J HH = Hz 1 J HC = Hz 2 J HC = Hz 3 J HC = Hz 4 J HC = Hz 1 J HN = Hz 2 J HN = Hz 3 J HN = Hz 4 J HN = Hz
23 23/96 Im Spektrum zeigt sich Kopplung in Form unterschiedlicher Multiplizitäten. 2 Spins, eine Kopplung J 12 3 Spins, zwei Kopplungen J 12 und J 13
24 24/96 In heteronuklearen Fall sind die Kopplungen jeweils gleich, die Muster ganz eindeutig ppm
25 25/96 Im heteronuklearen Fall kann die Kopplung während der Aufnahme leicht aus dem Spektrum entfernt werden, man spricht von Entkopplung. Entkopplungssequenz 1 H 13 C
26 26/96 Man hat dann nur noch einzelne Linien im Spektrum ppm
27 27/96 Karplus-Kurven 3 J H NH H N CO J-Kopplung 3 J H NH =6.4 cos cos H R CO -Winkel IUPAC!! = - 300
28 28/96 Starke vs. schwache Kopplung Schwache Kopplung liegt vor wenn J < /10. Nur bei schwacher Kopplung ist die Kopplung von der chemischen Verschiebung unabhängig. Simulation für ein 2-Spin System mit J = 10 Hz
29 29/ ppm ppm Man kann die Effekte zur Zuordnung nutzen, denn beim Dacheffekt neigen sich die Dächer zueinander.
30 30/96 Ein gutes Beispiel für starke Kopplung ist die Methylgruppe. Die Kopplung zwischen den Protonen ist sicher nicht 0 aber es ist im Spektrum keine Aufspaltung zu sehen.
31 31/96 Skalare oder J- Kopplung Simulation für 3 Kerne, deren Abstand sich verringert
32 32/96 Dipolare Kopplung Hier handelt es sich um eine direkte Interaktion der magnetischen Dipole durch den Raum Die Größe der dipolaren Kopplung hängt vom Abstand der Spins (r jk ), vom Winkel der Verbindungslienie mit dem magntischen Feld ( jk ) un dem gyromagnetischen Verhältnis der beiden Kerne ( j,k ) ab. D ~ (3 cos 2 jk 1) j k r jk 3
33 33/96 Dipolare Kopplungen können sehr groß sein und die Spektren bis zur Unbrauchbarkeit verändern, wegen des großen ist 1 H besonders betroffen. 40,000 Hz 5,000 Hz Lösungs-NMR proton chemical shift (ppm)
34 34/96 0 π dθjk sinθ jk (3 cos 2 θ jk -1) = 0 In Lösung haben wir wieder eine Mittelung über alle Moleküle wegen ihrer Rotation und die Kopplung wird im Spektrum unsichtbar. Es bleiben allerdings lokale, fluktuierende magnetische Felder, die uns später bei der Relaxation wieder begegnen werden, wo sie einen wichtigen Effekt darstellen.
35 35/96 Im Festkörper rotieren wir die Probe ja um den magischen Winkel um die CSA auszumitteln. Für die dipolare Kopplung bedeutet das, dass jede Verbindungslinie zwischen Spins im Mittel im magischen Winkel zum Feld liegt. D ~ (3 cos 2 jk 1) cos (54.73 ) = 1 / 3 D ~ (3 cos 2 (54.73 ) 1) = 0 Die dipolare Kopplung mittelt sich zu 0!
36 36/96 Wie schnell dreht man den Rotor um den magischen Winkel? Als Faustregel gilt dass wir schneller rotieren müssen als die Interaktion, die wir entfernen wollen. Also hängt es auch vom Kern ab den wir beobachten wollen, im Fall von 1H müssen wir mit dipolaren Koplungen von ca. 100 khz umgehen. Diameter MAS frequency 7.0 mm < 8 khz 4.0 mm < 18 khz 3.2 mm < 23 khz 2.5 mm < 35 khz 1.3 mm < 70 khz 0.7 mm < 120 khz Aber wir müssen auch die entstehenden Kräfte ( x g für khz) und die Geschwindigkeit der Rotorenoberfläche im Blick haben, letztere sollte nicht größer sein als die Schallgeschwindigkeit.
37 37/96 Zudem beobachten wir Nebeneffekte, die Rotations-Seitenbanden Deren Lage hängt von 10,000 Hz Rotations- und Spektrometerfrequenz ab 10,000 Hz MHz magnet 12,000 Hz * 30,000 25,000 20,000 15,000 10,000 5, MHz magnet 12,000 Hz
38 38/96 Relaxationszeiten Relaxation ist der Vorgang, in dem die Kerne die durch die RF-Pulse in das System eingebrachte Energie wieder abgeben. Im Gegensatz zu vielen anderen Spektroskopie-Arten gibt es dazu nicht viele Möglichkeiten außer fluktuierenden Magnetfeldern, die das Molekül selbst erzeugt. Daher sind NMR-Zustände sehr langlebig!
39 39/96 Die fluktuierenden Magnetfelder werden durch die Bewegung der Moleküle erzeugt.
40 40/96 Größere Moleküle bewegen sich anders als kleine Moleküle, sie haben andere Korrelationszeiten c. Dadurch werden sie auch andere Relaxationseigenschaften haben.
41 41/96 Die zwei wichtigsten Relaxationsmechanismen sind die Dipol-Dipol-Wechselwirkung (DD) und die chemical-shiftanisotropie (CSA). Beide Mechanismen können sich gegenseitig beeinflussen. DD CSA
42 42/96 Wir haben ja schon gesehen, dass die Kerne im Gleichgewicht in einer Bolzmannverteilung vorliegen.
43 43/96 Pulse stören dieses Gleichgewicht und ermöglichen damit die Messung.
44 44/96 Relaxation ist die Rückkehr des Systems in den Gleichgewichtszustand. Man beschreibt die Relaxation phänomenologisch durch zwei Zeitkonstanten, die longitudinale Relaxationszeit T 1 und die transversale Relaxationszeit T 2.
45 45/96 Longitudinal beschreibt die Rückkehr der Magnetisierung in z-richtung in die Gleichverteilung nach Bolzmann, transversal beschreibt eine Gleichverteilung der Magnetisierungsvektoren auf dem Einheitskreis in der x,y- Ebene, was auch zum Verschwinden des Signals führt. Es gibt auch die verwirrenden Bezeichnungen Spin-Gitter und Spin-Spin Relaxation, die man aber besser nicht verwendet.
46 46/96 longitudinale Relaxation
47 47/96 Longitudinale Relaxation (T 1 ) M z (t) = M z (t 0 ) [ 1 2 exp(-t/t 1 )]
48 48/96 Transversale Relaxation (T 2 ) Nach einem 90 Puls sind die Spins synchron, lokal unterschiedliche und fluktuierende Felder bringen sie aus dem Takt, die Summe ergibt irgendwann 0.
49 49/96 Transversale Relaxation (T 2 ) M x (t) = M x (t 0 ) exp(-t/t 2 ) T 2 hat immer T 1 als Obergrenze, ist aber im allgemeinen kürzer, es bestimmt die Form der Einhüllenden.
50 50/96 Den Weg der Vektoren kann man dann so beschreiben: T 2 ist lang, das Signal klingt langsam ab und ergibt eine scharfe Linie. T 2 ist kurz, das Signal klingt schnell ab und ergibt eine breite Linie.
51 51/96 Der NOE-Effekt Neben der Relaxation durch Wechselwirkung der Spins mit ihrer Umgebung gibt es auch direkte Wechselwirkungen einzelner Spins untereinander, d.h. zwei Spins relaxieren sich gegenseitig und tauschen dadurch direkt Magnetisierung aus. Ein prominentes Beispiel dafür ist der Kern-Overhauser-Effekt, der NOE-Effekt (Nuclear Overhauser Enhancement). Man spricht deshalb auch von Kreuz-Relaxation.
52 52/96 Der NOE-Effekt ist vor allem wegen der Möglichkeit Abstände zu bestimmen von großer Bedeutung, vor allem für Raumstrukturen. I (NOE) 1/r 6 Wegen des schnelle Abfalls mit r 6 können nur Abstände bis 400 pm, manchmal 500 pm bestimmt werden. r
53 53/96 Experimente zur Bestimmung der Abstände aus dem NOE-Effekt unterscheiden sich je nach Molekülgröße. Bei kleinen Molekülen wählt man das eindimensionale NOE-Differenz-Experiment. Bei großen (Bio-) Molekülen bedient man sich des mehrdimensionalen NOESY Experimentes, das wir später noch genau kennen lernen werden.
54 Das Vektormodel
55 Das Vektormodel 55/96 Das Vektormodell ist eine semi-klassische Beschreibung von NMR-Experimenten und funktioniert gut für isolierte Spins, d.h. Spins zwischen denen keine skalare Kopplung wirkt. Mathematischer Formalismus sind die Blochgleichungen. F. Bloch Phys. Rev. 70, (1946)
56 Das Vektormodel 56/96 Im Falle von Kopplung kann es nur noch in bestimmten Grenzen verwendet werden. Da viele mehrdimensionale Experimente auf Kopplung basieren stößt man schnell an diese Grenzen und es sollte nicht mehr verwendet werden. Es eignet sich aber gut zur Beschreibung von Relaxation und der Berechnung von einfachen, meist eindimensionalen Pulssequenzen und selektiven Pulsen.
57 Das Vektormodel 57/96 Man betrachtet die Magnetisierung als Vektor, der sich nach den Regeln der Vektormanipulation verhält, wenn er Magnetfelder ausgesetzt ist
58 Das Vektormodel 58/96 Die erste Art von Magnetfeldern sind die RF-Pulse, sie sind im allgemeinen recht kurz
59 Das Vektormodel 59/96 90 Puls aus x: Der Vektor dreht sich um die x- Achse nach (-y) 180 Puls aus x: Der Vektor dreht sich um die x- Achse nach (-z)
60 Das Vektormodel 60/96 Die zweite Art von Magnetfeld ist das Hauptfeld oder B 0 -Feld, das sich als chemische Verschiebung und skalare Kopplung zeigt
61 Das Vektormodel 61/96 chemische Verschiebung wirkt nur auf x,y-magnetisierung und bewirkt eine Drehung um die z-achse mit einer Frequenz 0 (der chemischen Verschiebung)
62 Das Vektormodel 62/96 0 -J/2 0 +J/2 kennzeichnet den Spinzustand des Nachbarkerns skalare Kopplung wirkt ebenfalls nur auf x,y-magnetisierung und bewirkt eine Drehung um die z-achse. Dabei bewegen sich die Vektoren um J/2 schneller oder langsamer als 0
63 Das Vektormodel 63/96 Mit den Werkzeugen kann man nun einfache NMR- 90 x Sequenzen beschreiben, H1z 90 H x viele sind building blocks für komplizietere Experimente
64 Das Vektormodel 64/96 Kerne mit unterschiedlichen chemischen Verschiebungen laufen hier unterschiedlich weit, man hat zu Beginn der Datenaufnahmen unterschiedliche Phasen und kann nicht mehr korrigieren
65 Das Vektormodel 65/96 90 x 180 y Eine einfache Pulssequenz die als building block in vielen anderen NMR-Experimenten eine Rolle spielt ist das spin echo
66 Das Vektormodel 66/96 90 x 180 y H 1z 90 H x
67 Das Vektormodel 67/96 90 x 180 y H 1z 90 H x Zunächst betrachten wir in den Wartezeiten nur chemische Verschiebung, Kopplung kommt später
68 Das Vektormodel 68/96 90 x 180 y H 1z 90 H x
69 Das Vektormodel 69/96 90 x 180 y H 1z 90 H x
70 Das Vektormodel 70/96 90 x 180 y H 1z 90 H x Der Effekt der chemischen Verschiebung ist verschwunden!!
71 Das Vektormodel 71/96 Jetzt betrachten wir homonukleare Kopplung im Vektormodell, ein Kern sieht den Zustand seines Nachbarn ( oder ), der Nachbar wird von den Pulsen auch getroffen J HH H H C C
72 Das Vektormodel 72/96 90 x 180 y H 1z 90 H x
73 Das Vektormodel 73/96 90 x 180 y H 1z 90 H x /2
74 Das Vektormodel 74/96 90 x 180 y H 1z 90 H x tauschen auch
75 Das Vektormodel 75/96 90 x 180 y H 1z 90 H x /2 Der Effekt der chemischen Verschiebung ist verschwunden, die Kopplung nicht
76 Das Vektormodel 76/96 Im Falle von heteronukleare Kopplung wird der Nachbar von den Pulsen nicht getroffen H H J HC C C
77 Das Vektormodel 77/96 90 x 180 y H 1z 90 H x Der Effekt der chemischen Verschiebung und auch der Kopplung ist verschwunden!!
78 Das Vektormodel 78/96 Mit dem Vektormodell lassen sich Experimente zur Bestimmung von Relaxationszeiten gut verstehen. Das Experiment zur Bestimmung der longitudinalen T 1 -Zeiten wir als inversion recovery Experiment bezeichnet
79 Das Vektormodel 79/96 Den Effekt des 180 Pulses haben wir uns schon angeschaut, er dreht die z-magnetisierung herum
80 Das Vektormodel 80/96 Danach warten wir einfach eine Zeit ( ) und dabei kehrt z nach z zurück
81 Das Vektormodel 81/96 Was nach vorliegt, fragen wir mit einem 90 Puls ab der z-magnetisierung in detektierbare Magnetisierung verwandelt
82 Das Vektormodel 82/96 Man nimmt eine Serie von Experimenten mit unterschiedlichen Werten für auf und kann die Relaxationszeit durch Fitten der theoretischen Kurve ermitteln
83 Das Vektormodel 83/96 exp(t/t 2 ) t Ein Spin-Echo-Sequenz wird für die Messung der Relaxationszeit T 2 verwendet. Man nimmt mehrere Experimente mit unterschiedlichen Werten für auf und trägt die Intensität gegen die Zeit auf. Chemische Verschiebung würde aber zu unterscheidlichen Phasen im Spektrum führen, daher der 180 Puls
84 Gradienten
85 Gradienten 85/96 Wir haben jetzt gesehen das Pulse eine Art Handwerkszeug sind um Magnetisierung zu manipulieren. Richtig zusammengefügt mit Wartezeiten zwischen den Pulsen entstehen Pulssequenzen, mit denen wertvolle Information über eine Molekül erhalten werden kann. Neben Pulsen und Wartezeiten gibt es noch eine weiteres Werkzeug, die sogenannten (Feld-) Gradienten
86 Gradienten 86/96 Gradienten Probe Spule Hauptfeld z Gradienten stellen kontrollierte Störungen der Homogenität des Hauptmagnetfeldes dar. Die Stärke des Magnetfeldes und damit die Resonanzfrequenz wird damit von der Position des Moleküls in der Spule abhängig Gradient B = (1 + z) B 0 = - B = - (1 + z) B 0
87 Gradienten 87/96 1 H Normalerweise ist die chemische Verschiebung eines speziellen Kerns in allen Molekülen in der Probe gleich, alle Signale addieren sich auf, weil die Homogenität der Probe durch den sogenannten Shim sicher gestellt wird.
88 Gradienten 88/96 Wenn wir eine Spulenlänge von 2 cm und einen typischen Gradienten von 50 Gs/cm annehmen dann haben wir einen Unterschied von B = 10 mt ( 1 Gs = 0.1 mt) zwischen oberem und unterem Ende der Probe. Das gyromagnetische Verhältnis für Wasserstoff ( 1 H) z Hauptfeld ist =26.75 * 10 7 rad/st. In einem Magnetfeld von 14.1 T haben wir also eine Frequenz von = /2 = B/2 = 600 MHz = 700 ppm Mit B = 10 mt ergibt sich = 425 khz, was ~700 ppm entspricht. Feldgradient
89 Gradienten 89/96 1 H G z z Somit ist die chemische Verschiebung vom Ort abhängig, alle Signale in der Probe ergeben in der Summe 0
90 Gradienten 90/96 Wie kann man Gradienten konstruktiv einsetzen? 1 H /2 /2 G z 1 : 1 Wir wissen, dass ein 180 Puls die chemische Verschiebung refokussiert, er beseitigt also auch den Effekt von zwei gleichen Gradienten
91 Gradienten 91/96 Wir bemühen wieder unsere drei Linien, nur diesmal gehören sie zum gleichen Kern in unterschiedlichen Positionen der Probe und haben dadurch unterschiedliche Frequenzen y z x Wir schauen uns das mit dem Vektormodel an
92 Gradienten 92/96 /2 /2 y x Die unterschiedlichen Positionen in der Probe ergeben am Ende doch wieder die gleiche Position der Magnetisierung und die Signale addieren sich auf.
93 Gradienten 93/96 1 H /2 /2 G z 1 : -1 In der hier gezeigten Anordnung addieren sich die Gradienten für die Magnetisierung auf, das Signal wird zerstört, die Störung des Gesamtmagnetfeldes bleibt aber gering.
94 Gradienten 94/96 Im Vektormodel sieht das so aus: Die Positionen sind unterschiedlich, es kommt zur Auslöschung
95 Gradienten 95/96 1 H /2 /2 G z 1 : 1 Verwendet man nun eine Puls der nicht alle Signale triff (einen selektiven Puls), dann werden nur die Signale erhalten bleiben, für die der Puls die Wirkung der Gradienten aufhebt. Das wird z.b. für Messungen in Wasser genutzt, um das Lösungsmittelsignal zu entfernen
96 That s it Fragen: schmieder@fmp-berlin.de Scripte: schmieder.fmp-berlin.info/teaching/vorlesung_mbph.htm
4.57 ppm 1.45 ppm = 3.12 ppm 3.12 ppm * MHz = Hz Hz = rad/sec
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