Vorlesung Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie- Grundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung Teil IX. Peter Schmieder AG NMR

Transkript

1 Vorlesung Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie- Grundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung Teil IX

2 Das Programm 2/104 Beim letztes Mal Methoden zur Bestimmung von skalaren Kopplungskonstanten

3 Das Programm 3/104 Heute Das dynamic range Problem Proteine HSQC 3D- und 4D-NMR 15 N-editierte Spektren Kopplungskonstanten mit dem HSQC Liganden-Screening mit dem HSQC

4 4/104 Das dynamic range Problem

5 Das dynamic range Problem 5/104 Wir haben ja schon gesehen, dass das Signal für die Auswertung digitalisiert wird, also in binäre Zahlen verwandelt wird. analog rein digital raus

6 Das dynamic range Problem 6/ Der ADC (Analog-Digital-Converter) hat bei einem modernen Spektrometer 16 bis 18 Bit. Der Empfänger, der das Signal aufnimmt, das später digitalisiert wird, muss so eingestellt werden, dass das größte Signal durch diese bits angemessen dargestellt wird. 2 0

7 Das dynamic range Problem 7/ Das größte Signal wird das vom Lösungsmittel sein, das es ja in sehr hoher Konzentration vorliegt H 2 O (18 g/mol), Dicht 1.0, 55 mol/ltr CHCl 3 (119 g/mol), Dicht 1.5, 12 mol/ltr DMSO (78 g/mol), Dicht 1.1, 14 mol/ltr

8 Das dynamic range Problem 8/ Die Substanzen liegen aber u.u. nur mit eine Konzentration von 1 mm vor, d.h. in wässriger Lösung ist mal soviel Lösungsmittel wie Substanz = Wird also das Signal des Lösungsmittels gut digitalisiert, dann findet man das Substanzsignal zusammen mit dem Rauschen im untersten Bit

9 Das dynamic range Problem 9/ In einem Spektrum eines Proteins in wässriger Lösung sieht man nur schwer das Protein

10 Das dynamic range Problem 10/ Man muss es sehr vergrößern, doch Proteinsignale sind nah am Rauschen

11 Das dynamic range Problem 11/ Das Lösungsmittelsignal muss also entfernt werden. Eine Vorgehensweise ist die Deuterierung des Lösungsmittels. Ist DMSO zu % deuteriert entspricht das einer Protonenkonzentration 4 mm, das sind nur noch

12 Das dynamic range Problem 12/ Allerdings funktioniert das nicht wenn Lösungsmittel und Substanz austauschbare Protonen haben. CHCl 3 kann problemlos durch CDCl 3 ersetzt werden, H 2 O aber nicht durch D 2 O und CH 3 OH nur durch CD 3 OH, sonst verschwinden austauschbare Protonen. In diesen Fällen muss man das starke Lösungsmittelsignal experimentell unterdrücken

13 13/104 Lösungsmittelunterdrückung

14 Lösungsmittelunterdrückung 14/104 Die einfachste und robusteste Lösungsmittelunterdrückung ist die Vorsättigung, bei der vor Beginn des eigentlichen Experiments mit einem langen, schwachen und daher sehr selektiven Puls auf das Lösungsmittel eingestrahlt wird. Das erfordert aber, dass die Spektrenmitte auf der Lösungsmittelfrequenz sitzt. θ 1 H

15 Lösungsmittelunterdrückung 15/104 Das Wasser verschwindet zwar nicht vollständig, aber das dynamic range Problem wird überwunden

16 Lösungsmittelunterdrückung 16/104 Vorteile Die Methode ist mit jedem NMR-Experiment kombinierbar Man braucht keinen 90 -Puls zu kennen Nachteile Das Restsignal kann bei ungünstigen Verhältnissen breit und groß sein Die Sättigung kann sich auf austauschbare Protonen übertragen Der Bereich der Einstrahlung ist vollständig gelöscht

17 Lösungsmittelunterdrückung 17/104 Ein Experiment, das auf die Sättigung verzichten kann, ist die 1-1-Sequenz, die sehr simpel ist. 90 x 90 -x 1 H Δ 90 H H x 2πδ z -H H Δ y -H y cos 2πδ H Δ + H x sin 2πδ H Δ 90 H -x H z cos 2πδ H Δ + H x sin 2πδ H Δ nicht detektierbar

18 Lösungsmittelunterdrückung 18/104 Der Wert δ H ist relativ zur Spektren-Mitte ( onresonanz ) zu sehen. Die wird bei wässrigen Lösungen immer auf der Wasserfrequenz positioniert (was schon beim Vorsättigen unumgänglich ist). Für das Wasser ist also der Wert δ H (H 2 O) = 0 und damit ist auch der Sinus 0. Im Vektormodell ausgedrückt hat sich die Magnetisierung des Wassers zwischen den beiden Pulse nicht bewegt und wird einfach wieder in die z- Richtung gedreht. Das ist unabhängig von Δ!

19 Lösungsmittelunterdrückung 19/104 Welche Signale erscheinen hängt von der Wahl von Δ ab und von den chemischen Verschiebungen H x sin 2πδ H Δ Bei einer Wartezeit Δ von 100 usec liegt das Maximum an einem 600 MHz-Spektrometer bei δ H Δ = ¼, d.h. δ H = 2500 Hz = 4.1 ppm Wobei das relativ zur Spektrenmitte zu sehen ist.

20 Lösungsmittelunterdrückung 20/104 Das Anregungsprofil kann man mit einer einfachen Probe experimentell bestimmen δ H = 0 δ H = -1/4 Δ δ H = 1/4 Δ

21 Lösungsmittelunterdrückung 21/ Wasserunterdrückung

22 Lösungsmittelunterdrückung 22/104 Vorteile Die Methode vermeidet Sättigung der austauschbaren Protonen Sie lässt sich mit vielen Experimenten kombinieren und braucht keine besondere Spektrometeraustattung Nachteile Das Restsignal kann bei ungünstigen Verhältnissen breit und groß sein, der Sinus hat einen schmalen Nulldurchgang Man braucht den 90 -Puls

23 Lösungsmittelunterdrückung 23/104 Um das Problem mit der schmalen Nullstelle des Sinus zu lösen, wurde die 1-1-echo Sequenz erdacht. 90 x 90 -x 90 φ 90 -φ 1 H Δ τ 2Δ τ φ rec φ = x, y, -x, -y φ rec = +, -, +, - Durch die zweite Periode wird der Sinus in einen (Sinus) 3 verwandelt mit einer flacheren Nullstelle

24 Lösungsmittelunterdrückung 24/ echo Wasserunterdrückung

25 Lösungsmittelunterdrückung 25/104 Das Experiment, das eine optimale Lösungsmittelunterdrückung bietet ist die WATERGATE-Sequenz H2O 1 H Δ 90 H2O Δ G z Auch hier erkennt man wieder eine Spin-Echo-Sequenz

26 Lösungsmittelunterdrückung 26/ H2O 1 H Δ 90 H2O Δ G z Die beiden selektiven Pulse auf die Wasserfrequenz ergeben für das Wasser in der Summe einen 360 -Puls, für alle Signale die von diesen Pulsen nicht getroffen werden ergibt sich ein 180 Puls

27 Lösungsmittelunterdrückung 27/ H2O 1 H Δ 90 H2O Δ G z Der 180 Puls wird die Gradienten refocussieren, d.h. ihr Effekt verschwindet, ein 360 Puls bleibt dagegen ohne Wirkung, das Wasser wird von den Gradienten gelöscht

28 Lösungsmittelunterdrückung 28/104 Das Anregungsprofil hängt von der Wahl der selektiven Pulse ab δ H = 0

29 Lösungsmittelunterdrückung 29/104 Man wählt das Profil so, das die gewünschten Signale gute Intensität haben

30 Lösungsmittelunterdrückung 30/104 Bei all diesen Techniken geht man allerdings davon aus, das nur ein großes Signal zu unterdrücken ist. Sollten mehrere Signale zu entfernen sein wir es deutlich komplizierter, bei manchen kombinierten Techniken (LC-NMR) kann das aber durchaus relevant sein.

31 31/104 Proteine

32 Proteine 32/104 Die Primärstruktur

33 Proteine 33/104 Aminosäure-Seitenketten

34 Proteine 34/104 Ebenen struktureller Organisation

35 Proteine 35/104 Der Ramachandran-Plot Die Struktur einer Polypeptidkette kann durch die Winkel phi (φ) und psi (ψ) beschrieben werden. Aus sterischen Gründen sind nur bestimmte Winkelkombinationen erlaubt, die im Ramachandran-Plot zu erkennen sind.

36 Proteine 36/104 Sekundärstrukturelemente

37 Proteine 37/104 Unterschiede in der chemischen Verschiebung treten durch Strukturierung auf

38 NMR-Spektroskopie an Proteinen 38/104 1 H-1D-Spektrum von F3-008 (in d 6 -DMSO, 300 K) D-Pro Phe Phe Phe aromatische Protonen Trp Lys(Z) H N -Protonen Hα -Protonen aliphatische Protonen Indol-H N ppm

39 NMR-Spektroskopie an Proteinen 39/104 1 H NMR-Spektrum eines Proteins Aromaten Aromaten Aliphaten Aliphaten H N H N H α H α CH CH 3 3

40 NMR-Spektroskopie an Proteinen 40/104 Ist das Protein ungefaltet gibt es keine Anisotropieeffekte ppm

41 DO2 HO 2 NMR-Spektroskopie an Proteinen 41/ C NMR-Spektrum eines Proteins

42 DO2 HO 2 NMR-Spektroskopie an Proteinen 42/ N NMR-Spektrum eines Proteins

43 Sequenzspezifische Zuordnung 43/104 Bei Proteinen ist das Problem der Resonanzzuordnung in einem Polymer noch verschärft. Das einzige was vorher bekannt ist, ist die Primärsequenz, die MUSS aber bekannt sein. Basierend auf der Sequenz versucht man wieder Nachbarschaftsbeziehungen zwischen den Aminosäuren zu etablieren und auf diese Weise eine sequenz-spezifische Zuordnung durchzuführen

44 Sequenzspezifische Zuordnung 44/104 Die ursprüngliche Strategie basiert auf einer 1. Identifizierung von Spinsystemen über die skalare Kopplung (J-Kopplung) im DQF-COSY oder TOCSY 2. Verknüpfung der Spinsysteme über den NOE-Effekt zwischen benachbarten Aminosäuren 3. Abgleich der verknüpften Spinsysteme mit der Primärsequenz und damit Zuordnung zu definierten Aminosäuren

45 Sequenzspezifische Zuordnung 45/104 d Nα (i,i) Der Abstand vom H N zum H α, d Nα (i,i) innerhalb einer Aminosäure ist immer kurz genug für einen NOE

46 Sequenzspezifische Zuordnung 46/104 d αn Das gleiche gilt für den Abstand vom H N zum H α der Aminosäure (i-1), d αn

47 Sequenzspezifische Zuordnung 47/104 d βn und auch mit Einschränkungen - für den Abstand vom H N zum H β der Aminosäure (i-1), d βn

48 Sequenzspezifische Zuordnung 48/104 Identifizierung der Aminosäuretypen ppm 1.0 TOCSY D-Pro Phe Phe Phe Trp Lys(Z) K F/W F/W F/W F/W ppm Prolin hat kein H N, daher sind 5 Spinsysteme zu erkennen, Lysin ist eindeutig, die anderen sind Aromaten

49 Sequenzspezifische Zuordnung 49/104 Übertragung der Spinsysteme ins NOESY ppm TOCSY ppm 1.0 NOESY Spinsysteme K K F/W F/W F/W F/W ppm F/W F/W F/W F/W ppm

50 Sequenzspezifische Zuordnung 50/104 Sequential walk Erst in der Theorie d αn 1 2 d Nα (i,i) 2 d αn 3 d Nα (i,i) 3 d αn 4 d Nα (i,i) 4

51 Sequenzspezifische Zuordnung 51/104 ppm...dann im Spektrum D-Pro Phe Phe Phe 3.5 K4 4.0 W5 Trp Lys(Z) 4.5 F2 5.0 F3 F ppm

52 52/104 Sequenzspezifische Zuordnung ppm 2D-NOESY (100 msec) der SAM Domäne (83 Aminosäuren) ppm Vorlesung Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie

53 Sequenzspezifische Zuordnung 53/104 ppm D-TOCSY (65 msec) der SAM Domäne (83 Aminosäuren) ppm

54 Sequenzspezifische Zuordnung 54/104 ppm D-TOCSY (24 msec) der SAM Domäne (83 Aminosäuren) ppm

55 Sequenzspezifische Zuordnung 55/104 ppm ppm H N -Bereich von ppm ppm TOCSY und NOESY der SAM Domäne (83 Aminosäuren) Dieselbe Strategie zur Zuordnung kann verwendet werden, wird aber durch Überlagerung erschwert

56 Sequenzspezifische Zuordnung 56/104 Die sequenzspezifische Zuordnung und auch die Extraktion von strukturrelevanter Information wird mit zunehmender Proteingröße immer schwieriger: 1. Es sind mehr Signale im selben spektralen Bereich, die Wahrscheinlichkeit für Überlagerung nimmt zu 2. Mit zunehmender Molekülgröße ändern sich die Relaxationseigenschaften, die Linien werden breiter, die Überlagerung wird noch wahrscheinlicher und TOCSY und COSY funktionieren immer schlechter heteronukleare Spektren

57 Proteine: Isotopenmarkierung 57/104 Die Aufnahme von heteronuklearen Spektren ist bei Proteinen mit den Heterokernen in natürlicher Häufigkeit ( 13 C=1.1% und 15 N=0.4%) unrealistisch, es muß angereichert werden Chromatographie Plasmid SDS-Gel E.coli Zell-Lysat

58 Sequenzspezifische Zuordnung 58/104 Mit markierten Proteinen gibt es dann zwei Möglichkeiten: Die bislang vorgestellte Strategie zur sequenzspezifischen Zuordnung wird dann mit 15 N-editierten, dreidimensionalen Techniken erweitert und ist dann auch auf mittelgroße Proteine anwendbar Es wird eine neue Strategie basierend auf sogenannten Tripelresonanz-Techniken angewendet, die auch für sehr große Proteine noch anwendbar ist

59 59/104 HSQC

60 HSQC 60/104 Bei den heteronuklearen Spektren von Proteinen ist eine Optimierung hinsichtlich der Relaxationseigenschaften und der Linienbreiten erforderlich, man nimmt daher bei 15 N ein HSQC statt eines HMQC auf 90 x y 180 x 90 x H Δ/2 Δ/2 Δ/2 Δ/ x 90 x 180 n X t 1 /2 t 1 /2 Entkopplung

61 HSQC 61/ x y 180 x 90 x H Δ/2 Δ/2 Δ/2 Δ/ x 90 x 180 n X t 1 /2 t 1 /2 Entkopplung Heteronuclear Single Quantum Correlation Die Zeit in der transversale Protonenmagentisierung vorliegt ist von der Evolutionszeit unabhängig Es gibt in der Evolutionszeit keine Entwicklung von Protonen-Kopplung

62 HSQC 62/104 1 H 90 x Δ HSQC vs. HMQC 180 x Δ 90 x 90 x n X t 1 /2 t 1 /2 Entkopplung Bei sehr guter Auflösung sieht man die Aufspaltung im HMQC, die dadurch erzeugte Linienverbreiterung ist immer vorhanden ppm ppm

63 HSQC 63/104 Sowohl HMQC als auch HSQC arbeiten mit Protonendetektion und damit höherer Empfindlichkeit Das HMQC hat weniger Pulse und ist daher weniger fehleranfällig, vor allem bei 13 C kann das Vorteile haben Beim HSQC ist die Implementierung einer Lösungsmittelunterdrückung günstiger, sehr gut funktioniert das mit der WATERGATE-Sequenz

64 HSQC 64/104 HSQC mit WATERGATE-Wasserunterdrückung 90 x y 180 x 90 x H Δ/2 Δ/2 Δ/2 Δ/ x 90 x 180 n X t 1 /2 t 1 /2 Entkopplung G z

65 HSQC 65/ x y 180 x 90 x H Δ/2 Δ/2 Δ/2 Δ/ x 90 x 180 n X t 1 /2 t 1 /2 Entkopplung Kein δ H, aber J HX J HH für kurze Δ vernachlässigbar wie vorne Kein δ H, aber δ X Keine J HH und auch keine J HX Δ wird wieder 1/2J HX gesetzt

66 HSQC 66/ x y 180 x 90 x H Δ/2 Δ/2 Δ/2 Δ/ x 90 x 180 n X t 1 /2 t 1 /2 Entkopplung H z 90 H x πj HX Δ -H y cos πj HX Δ + 2H x X z sin πj HX Δ = 2H x X z 90 H y 2H x X z 90 X x 2H z X y 2πδ X t 1 2H z X y cos 2πδ X t 1 90 H y πj 2H 90 X x X z cos 2πδ X t HX Δ 1 x H y cos 2πδ X t 1

67 HSQC 67/104 H,X-HSQC δ H1 δ H2 δ H3 δ X2 δ X3 δ X1 H y cos 2πδ X t 1 Nach Detektion und 2D- Fouriertransformation entsteht ein 2D-Spektrum mit δ X in der indirekten Dimension und δ H der daran gebundenen Protonen in der direkten Dimension

68 HSQC 68/ N-HSQC der SAM Domäne (83 Aminosäuren)

69 HSQC 69/ C-HSQC der SAM Domäne (83 Aminosäuren)

70 HSQC 70/ H, 15 N-HSQC H, 1 H, 13 C-HSQC

71 71/104 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie mit mehr als zwei Dimensionen

72 nd-nmr 72/104 Ein dreidimensionales Experiment entsteht formal durch Kombination von zwei zweidimensionalen Experimenten 1. 2D-Sequenz Preparation Evolution Mischung Detektion 2. 2D-Sequenz Preparation Evolution Mischung Detektion 3D-Sequenz Preparation Evolution (1) Mischung (1) Evolution (2) Mischung (2) Detektion

73 nd-nmr 73/104 1 H t 1 τ m NOESY 1 H Δ/2 Δ/2 Δ/2 Δ/2 HSQC n X t 1 /2 t 1 /2 Entkopplung H t 1 τ m Δ/2 Δ/2 Δ/2 Δ/2 n X NOESY-HSQC t 2 /2 t 2 / Entkopplung

74 nd-nmr 74/ H t 1 τ m Δ/2 Δ/2 Δ/2 Δ/ n X t 2 /2 t 2 /2 Entkopplung Man hat nun zwei Evolutionszeiten (t 1 und t 2 ) die beide voneinander unabhängig systematisch variiert werden müssen. Auch bei verlängerter Messzeit ist dadurch die Zahl der möglichen Messpunkte und damit der Auflösung noch weiter begrenzt. Die dritte Dimension wiegt das aber auf.

75 nd-nmr 75/104 Das Spektrum ist dann keine Fläche mit Signalen mehr sondern ein Würfel, mit drei Achsen mit chemischer Verschiebung. Intensität zeigt sich als vierte Dimension

76 nd-nmr 76/104 Da der Würfel nur schwer zu analysieren ist, schneidet man aus dem Würfel bei konstanter Frequenz in einer Dimension ein 2D- Spektrum heraus, das man als herkömmliches 2D analysiert

77 nd-nmr 77/ H t 1 τ m Δ/2 Δ/2 Δ/2 Δ/ n X t 2 /2 t 2 /2 Entkopplung Ein Beispiel für ein 3D- Experiment ist das dreidimensionale n X-NOESY-HSQC Es wird dazu verwendet die Überlagerung in den NOESY- Spektren, die sowohl bei der Zuordnung als auch bei der Abstandsbestimmung ein Problem ist aufzulösen

78 nd-nmr 78/104 Als Beispiel dient der Bereich der Aminoprotonen, in dem bei Proteinen immer Überlagerung auftritt 1D- 1 H-Spektrum Bereich der Aminoprotonen eines Proteins, 4 Signale δ H Signale von denen 2 überlagert sind

79 nd-nmr 79/104 δ H (ppm) D-NOESY-Spektrum: Die Überlagerung im Bereich der Seitenketten wird aufgelöst, nicht aber im Bereich der Aminoprotonen 10 δ H (ppm) 9 8 7

80 nd-nmr 80/104 δ N (ppm) D- 15 N-HSQC-Spektrum Die Überlagerung im Bereich der Aminoprotonen wird aufgelöst δ H (ppm)

81 nd-nmr 81/104 Im 3D-Spektrum gibt es dann keine Überlagerung mehr Zwei der drei Seitenflächen entsprechen genau den zweidimensionalen Experimenten

82 nd-nmr 82/104 Aus dem Würfel wird eine Ebene ( plane ) extrahiert, hier bei einer bestimmten 15 N-Verschiebung plane

83 nd-nmr 83/104 Die Überlagerung ist verschwunden! 2D plane 0 δ H (ppm) δ H (ppm)

84 nd-nmr 84/104 plane δ H (ppm) Zur Analyse der Daten werden 6 8 strips aus dem 3D extrahiert 10 δ H (ppm) 9 8 7

85 nd-nmr 85/104 2D-NOESY 3D-NOESY H (ppm) H (ppm) N= ppm H (ppm) H (ppm)

86 nd-nmr 86/ H t 1 TOCSY Δ/2 Δ/2 Δ/2 Δ/ n X t 2 /2 t 2 /2 Entkopplung Genauso gibt es das dreidimensionale n X-TOCSY-HSQC Auch hier die Überlagerung in den Spektren aufgelöst und die bekannte Strategie der sequenzspezifischen Zuordnung greift wieder

87 nd-nmr 87/104 Das Schema der mehrdimensionalen NMR lässt sich problemlos auf eine vierte Dimension erweitern

88 88/104 Bestimmung von 3 J H NH α mit dem HSQC

89 Bestimmung von 3 J H NHα mit dem HSQC 89/104 Wir hatten schon gesehen, daß 3 J H N H α H N CO die 3 J H NHα Kopplungskonstante wichtige Strukturinformation enthält. H α R CO Sie ist aber mit zunehmender Größe des Proteins und damit dem Versagen des DQF-COSY mit dem Experiment nur noch schwer zu bestimmen

90 Bestimmung von 3 J H NHα mit dem HSQC 90/ x y 180 x 90 x H Δ/2 δ/2 δ/2 Δ/2 Δ/2 Δ/ x 90 x N t 1 /2 t 1 /2 Entkopplung Man nutzt daher das 15 N-HSQC zur Bestimmung der Kopplungskonstanten. Bislang hatten wir sie immer wegen der kurzen Wartezeiten vernachlässigt, macht man die Wartezeiten länger werden sie relevant.

91 Bestimmung von 3 J H NHα mit dem HSQC 91/104 1 H 90 x Δ/2 180 δ/2 δ/2 Δ/2 90 y Diesmal rechnen wir mit der 3 J HH, chemische x Verschiebung entwickelt 15 N sich auch hier nicht Heteronukleare Kopplung entwickelt sich nicht während der Wartezeit δ, sondern nur, wie gehabt während Δ/2, am Ende haben wir mit Δ = 1/2J wieder antiphase- Magnetisierung

92 Bestimmung von 3 J H NHα mit dem HSQC 92/104 1 H 90 x Δ/2 180 δ/2 δ/2 Δ/2 90 y Am Ende rechnen wir also nur mit 3 J HH,die x sich ungestört während 15 N Δ + δ entwicklet 90 H H x πj HH (Δ + δ) Nz 90 H y 2H Nx N z cos πj HH (Δ+δ) - 4H Ny N z H αz sin πj HH (Δ+δ) 2H Nz N y cos πj HH (Δ+δ)-4H Ny N y H αx sin πj HH (Δ+δ) 90 X x führt am Ende zu Signal nicht detektierbar

93 Bestimmung von 3 J H NHα mit dem HSQC 93/104 Damit erscheint die Kopplung als Intensität im HSQC Δ+δ=50 msec 3 J HH =10 Hz 3 J HH =4 Hz Δ+δ=125 msec Man nimmt nun eine Serie von HSQCs auf mit unterschiedlichen Werten für δ und erhält je nach Kopplungskonstante an verschiednen Stellen einen Nulldurchgang

94 Bestimmung von 3 J H NHα mit dem HSQC 94/104 Man bestimmt dann die Intensität der Signale in jedem HSQC und trägt gegen die verwendete Wartezeit auf. Daraus kann man mit einem einfachen fit die Nullstelle und damit die Kopplungskonstante bestimmen. Die Auflösung im HSQC ist viel besser als im COSY und daher gibt es weniger Überlagerung, die Signale werden auf sehr empfindliche Art und Weise durch die 1 J HN erzeugt, das Experiment funktioniert also auch bei größeren Proteinen

95 95/104 Liganden- Screening mit dem HSQC

96 Screening 96/104 Eine weitere, zunehmend wichtigere Anwendung der NMR-Spektroskopie ist das Screenen von Substanzbibliotheken zur Identifizierung von Leitstrukturen für Pharmaka Dazu gibt es inzwischen zahlreiche Verfahren, eines davon ist das sogenannte SAR-by-NMR Verfahren. Ausgangspunkt ist dabei ein vollständig zugeordnetes 15 N-HSQC Spektrum

97 Screening 97/104 HSQC-Spektren mit und ohne potentiellem Liganden werden verglichen Das ist auch als high-throughput Verfahren möglich

98 Screening 98/104 Damit wird ein erster Ligand identifiziert, der dann mit Synthese oder gezielter Suche noch optimiert werden kann

99 Screening 99/104 Dann wird ein zweiter Ligand identifiziert, der wiederum optimiert werden kann und dann mit dem ersten verknüpft wird

100 Screening 100/104 Anwendung auf einen Inhibitor von Stromelysin

101 Screening 101/104 Anwendung auf einen Inhibitor von Stromelysin

102 Screening 102/104 Neben dem Screening kann das gleiche Experiment natürlich auch zum Studium von Protein-Ligand- Wechselwirkungen genutzt werden. Dann wird nur ein, schon bekannter Ligand eingesetzt und die Bindungsstelle und gegebenenfalls auch die Bindungskonstante bestimmt. Neben dem Screening mit dem HSQC gibt es noch zahlreiche andere NMR-Screening-Techniken, die eine Veränderung an den Liganden nutzen um die Bindung zu detektieren

103 Zusammenfassung 103/104 Was haben wir uns heute angeschaut: Lösungsmittelunterdrückung Proteine und die sequenzspezifische Zuordnung HSQC Dreidimensionale NMR: NOESY-HSQC Kopplungskonstanten mit dem HSQC Screening mit dem HSQC

104 104/104 That s it for today Nächstes Mal: Tripelresonanzexperimente TROSY