Spin-Echo und J-Modulation; APT

Transkript

1 Spin-Echo und J-Modulation; APT Stellen wir uns ein PFT-Experiment vor, bei dem ν = ν 0 - ν 1 = 0 und der Puls ein Puls sein soll. Außerdem wollen wir der Einfachheit halber zunächst annehmen, dass die transversale Spin-Spin-Relaxation (T 2 ) so langsam ist, dass sie während des Zeitablauf des folgenden Spin-Echo-Experiments keine Rolle spielt. (Diese letzte Annahme ist in der Praxis zwar unrealistisch, spielt aber für das Folgende keine grundsätzliche Rolle; wir kommen darauf zurück.) Während des Pulses [Situation (a) im folgenden Schaubild] kippt die makroskopische (Gesamt-)Magnetisierung M von der z- auf die y -Achse (Notabene: wir sind im rotierenden Koordinatensystem, RKS). Nach Abschalten des Pulses beginnen aufgrund der unvermeidlichen Inhomogenitäten des äußeren Magnetfeldes Einzelkerne (Einzelspins) mit dem und gegen den Uhrzeigersinn zu rotieren; es öffnet sich langsam ein Kreissegment, das mit der Zeit immer größer wird (b). Zum Zeitpunkt τ erfolgt nun ein zweiter Puls (c), diesmal ein π-puls (180 0 ). Alle Einzelspins werden um um die x -Achse gedreht, landen also wieder in der x,y -Ebene, nur auf der anderen Seite (c). 1

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3 Da der Drehsinn der Einzelspins durch den Puls natürlich nicht verändert wurde, laufen nun die Einzelspins wieder zusammen (d), bis sie sich nach einem weiteren Zeitintervall τ alle wieder auf der negativen y -Achse treffen (e). Man nennt dies Refokussierung. Die dabei erzeugte Magnetisierung ist das Spin-Echo, das nun vom Detektor aufgenommen werden kann und gegenüber einem Signal unmittelbar nach dem Puls um phasenverschoben, also negativ ist. (π/2) x (π) x τ τ t Nach dem Spin-Echo laufen die Einzelspins wieder auseinander (f) und können nach einer weiteren Folge (τ - π-puls - τ) erneut als 2. Spin-Echo, diesmal positiv, registriert werden; usw... Merke: Die durch Inhomogenitätseffekte erzeugte transversale Relaxation kann durch eine solche Hahn-Spin-Echo-Pulsfolge rückgängig gemacht werden: 3

4 Diese Aussage gilt allerdings nicht für den entropie-kontrollierten Vorgang der echten Spin-Spin-Relaxation. Dieser verringert die Intensität des auf solche Weise aufgenommenen Spin-Echo-Signals von Mal zu Mal (1. Spin-Echo nach 2τ, 2. Spin-Echo nach 4τ, 3. Spin-Echo nach 6τ usw.). Beispiel: 13 C-T 2 -Messung von CH 3-13 COOH (60% angereichert) Mit einigen technischen Verbesserungen (Carr-Purcell-Meiboom-Gill) kann dies genutzt werden, aus der Zeitentwicklung der Spin-Echos die Relaxationszeit T 2 zu bestimmen. dm y /dt = -My x /T 2 und daraus ln M y = ln M 0 - t/t 2 4

5 Man kann diese Methode dadurch modifizieren, dass der Puls nicht in die x -, sondern in die y -Richtung gestrahlt wird. Dann werden die Einzelspins immer wieder auf die y -Richtung fokussiert: (π/2) x (π) y τ τ t B 1 y y x x 5

6 Man erhält immer nur positive Spin-Echos, die mit der Zeit kleiner werden: Beispiel: CPMG- 13 C-T 2 -Messung von CH 3-13 COOH Da dieser Messparameter aber keine besondere Bedeutung für die Anwendung in der organischen Chemie hat, soll hier auf eine Diskussion der Strukturabhängigkeit von T 2 verzichtet werden. 6

7 Man kann bei diesem Experimenten noch einen Schritt weitergehen, indem man die Wartezeit τ immer mehr verkürzt. Im Extremfall strebt τ gegen 0, und es erfolgt praktisch eine andauernde B 1 -Einstrahlung in die y -Richtung. Die Kerne reagieren darauf so, dass sie statt wie vorher um die B 0 - (z-)richtung nun um die B 1 -Richtung (y ) präzedieren. Damit bleibt M während dieser Bestrahlung auf der y -Achse liegen. Die Zeitkonstante, die nun die Verkleinerung von M beschreibt, nennt man T 1ρ anstatt T 2. B 0 z z M x y x B 1 M y Dieses Verfahren heißt Spin-Locking. Es ist ein wichtiger Bestandteil mehrerer NMR-Mulitplus-Experimente, z.b. Kreuzpolarisation (CP), TOCSY und ROESY. 7

8 Es war zuvor gezeigt worden, dass durch die Pulsfolge: BB 1 H an (π/2) x (π) x τ τ 13 C t nach einer Zeit 2τ (bzw. 4τ, 6τ...) Spin-Echos durch Refokussierung erzeugt werden können. Bei einem 13 C-NMR-Experiment wird man dies unter 1 H-BB- Entkopplung tun, um 13 C, 1 H-Kopplungen zu unterdrücken und die üblichen Singulettsignale für die 13 C-Kerne zu erhalten. Frage: Was passiert, wenn die 13 C, 1 H-Kopplung während der Evolutionszeit 2τ oder zumindest während Teilen dieser Zeit zugelassen wird? 8

9 BB an aus an 1 H (π/2) x (π) x τ τ 13 C t Das neue Schema für den Ablauf des Experiments zeigt jetzt, dass der 1 H-Entkoppler wie bisher angeschaltet bleibt, außer während der ersten τ-periode. Was ist die Konsequenz dieses Abschaltens für das Spinsystem im Vergleich zum normalen Experiment mit durchgehender Entkopplung? Stellen wir uns ein 13 C- 1 H-Fragment (AX-Spinsystem) vor mit ν 0 ( 13 C) = ν 1 (Pulsfrequenz). Außerdem soll die transversale Relaxation sehr langsam verlaufen (siehe Spin-Echo-Diskussion). 9

10 ν(2) = -J/2 M(2) (b) M (a) y M(1) ν(1) = +J/2 x Fall (a): Der Entkoppler wird nicht abgeschaltet. Das Experiment ist ein normales Spin-Echo-Experiment. Es wird ein Spin-Echo der Größe M (= M 0 ) erhalten, allerdings entlang der -y -Achse (!). Das Auffächern von M und das darauf folgende Refokussieren ist hier der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt. 10

11 Fall (b): Der Entkoppler wird während der ersten τ-zeit, d.h. unmittelbar nach dem Puls, abgeschaltet. Jetzt spaltet sich die Gesamtmagnetisierung M sofort in zwei Komponenten auf [M(1) und M(2)]. Gleichzeitig beginnen diese damit, sich von der y -Achse zu entfernen. Die relativen Umlaufgeschwindigkeiten der beiden Teilmagnetisierungen sind also ν(1) = +J/2 und ν(2) = -J/2 (Differenz = J). Dies entspricht im Spektrum der Aufspaltung des 13 C-Signals in ein Dublett mit einem Abstand von J; unter J verstehen wir im Folgenden eine 13 C, 1 H-Kopplung über eine Bindung mit einem für ein aliphatisches CH-Fragment typischen Wert von 125 Hz [ 1 J( 13 C, 1 H) = 125 Hz]. Während dieser Periode fächern M(1) und M(2) auf. Am Ende der ersten τ-zeit haben sie dann die Positionen erreicht, die in der Darstellung gezeigt sind. Gleichzeitig mit dem Puls wird nun der Entkoppler wieder eingeschaltet. Augenblicklich bricht die Kopplungsaufspaltung wieder zusammen, und die Gesamtmagnetisierung entspricht dem roten Pfeil (b). Sie wird als Spin-Echo refokussiert. Fazit dieser Betrachtung: Durch Zulassen der Kopplung J wird die Größe der messbaren Magnetisierung verändert (J-Modulation). 11

12 Es stellt sich die Frage, in welcher Weise die 13 C, 1 H-Kopplung die Größe der Magnetisierung moduliert und wie das von der Zahl der an einem 13 C-Atom direkt gebundenen Wasserstoffatome (C, CH, CH 2, CH 3 ) abhängt. Beginnen wir mit dem Trivialfall des quartären C, bei dem es keine Kopplung gibt. Unter der Annahme, dass ν = 0 unf T 2 sehr lang sind, gilt: Es gibt keine Kopplung und damit keine Aufspaltung von M. Der Magnetsierungsvektor bleibt auf der y -Achse liegen, fächert aber auf und wird M y nach der Zeit 2τ auf der negativen y -Achse als Spin-Echo refokussiert. M 2τ = M 0 [ exp(-2τ/t 2 ) ] x (Die eckige Klammer enthält den Ausdruck für die transversale Relaxation.) 12

13 Methin-Kohlenstoffatome (CH): M(2) ν(2) = -J/2 Die Magnetisierung M (= M 0 ) spaltet in zwei praktisch gleich intensive Komponenten mit unterschiedlichen ν auf. Für diese gilt: y M 2τ (1) = ½ M 0 cos 2π(+J/2)τ = ½ M 0 cos πj τ M(1) ν(1) = +J/2 M 2τ (2) = ½ M 0 cos 2π(-J/2)τ = ½ M 0 cos πj τ x Nach dem Einschalten des Entkopplers addieren sich die beiden Komponenten wieder: +J/2 0 -J/2 M 2τ = M 0 cos πj τ [ exp(-2τ/t 2 ) ] 13

14 Methylen-Kohlenstoffatome (CH 2 ): ν(3) = -J M(3) ν(2) = 0 M(2) M(1) ν(1) = +J x y Die Magnetisierung M (= M 0 ) spaltet nun in drei Komponenten mit dem Intensitätsverhältnis 1:2:1 und mit den angegebenen ν auf. Für diese gilt: M 2τ (1) = ¼ M 0 cos 2πJ τ M 2τ (2) = ½ M 0 M 2τ (3) = ¼ M 0 cos 2πJ τ Nach dem Einschalten des Entkopplers addieren sich die Komponenten wieder: +J 0 -J M 2τ = ½ M 0 (1 + cos 2πJ τ) M 2τ = M 0 cos 2 πj τ [ exp(-2τ/t 2 ) ] 14

15 Methyl-Kohlenstoffatome (CH 3 ): M(4) M(3) Die Magnetisierung M (= M 0 ) spaltet nun in vier Komponenten mit dem Intensitätsverhältnis 1:3:3:1 und mit den angegebenen ν auf. Für diese gilt: M(1) x M(2) y M 2τ (1) = 1/8 M 0 cos 3πJ τ M 2τ (2) = 3/8 M 0 cos πj τ M 2τ (3) = 3/8 M 0 cos πj τ M 2τ (4) = 1/8 M 0 cos 3πJ τ 0 Nach dem Einschalten des Entkopplers addieren sich die Komponenten wieder: +3/2 J +1/2 J -1/2 J -3/2 J M 2τ = 3/4 M 0 (cos πj τ + 1/3 cos 3πJ τ) M 2τ = M 0 cos 3 πj τ [ exp(-2τ/t 2 ) ] 15

16 C CH CH 2 CH 3 Zusammenfassend ergibt sich also für die im J-modulierten Spin-Echo-Experiment gemessene Signalintensität eine CH n -Kohlenstoffatoms: M 2τ = M 0 cos n πj τ [ exp(-2τ/t 2 ) ] Für jeden CH n -Typ entspricht also die Zeitentwicklung einer anderen Funktion. C: Cosinusfunktion mit unendlich langer Periode CH: Cosinus CH 2 : Cosinus-Quadrat; immer positiv CH 3 : Zusammengesetzt aus zwei Cosinusfunktionen τ J (J = 125 Hz) 16

17 Betrachten einige besondere Fälle: (a) τ J = 0.5 τ = 1/(2J): Alle CH n -Fragmente mit n > 0 haben ihren Nullduchgang. Es werden keine Signale außer denen von quartären Kohlenstoffatomen beobachtet. (b) τ J = 1 τ = 1/J : C und CH 2 geben positive, CH und CH 3 negative Signale. Mithilfe der Experimente (a) und (b) kann man also die Signale von quartären und Methylen-C s eindeutig identifizieren. (c) τ J = 0.25 τ = 1/(4J) und τ J = 0.75 τ = 3/(4J): Die Addition der FID s dieser beiden Experimente geben nur C- und CH 2 - Signale, erstere mit doppelter relativer Intensität. Die Subtraktion der FID s dieser beiden Experimente geben nur CH- und CH 3 - Signale, letztere mit halber relativer Intensität. Man kann also mit den Experimenten (b) und (c)-subtraktion die Signale von Methin- und Methyl-C s eindeutig identifizieren. Daher heißt dieses Experiment auch Attached Proton Test (APT). 17

18 Beispiel: Hecogeninacetat; unten: { 1 H}-BB, Mitte und oben: APT 18

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20 Beispiel: Hydrierungsprodukt von Moenomycin A (P. Welzel, Bochum) 4 2 Es geht um die Verknüpfung des Tetrasaccharidrestes (grün markiert) an der zentralen 3-Carbamoyl-4-methyl-glucopyranuronsäure (rot markiert). Sitzt er wirklich wie in der Formel gezeigt an C-2 oder etwa an C-4? Dazu muss die 13 C-chemische Verschiebung des (einzigen quartären) C-O-Atoms mit der für die unsubstituierte Uronsäure verglichen werden. Substitution an C-2 führt bei C-4 zu einer leichten Ab-, an C-4 aber zu einer deutlichen Entschirmung. 20

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22 BB { 1 H} 13 C-NMR-Spektrum DMSO-d 6 Lipidrest Bereich von CH-O & 1 C-O C=O anomere C s 22

23 APT, τ = 1/J C-4: δ = 72.8 negative CH-O-Signale 23

24 APT, τ = 1/(2J) C-4: δ = 72.8 Damit ist klar, dass C-4 eine geringe Abschirmung von 1 bis 1.5 ppm erfahren hat, was nur bedeuten kann, dass es eine freie OH-Gruppe trägt, während die OH-Gruppe an C-2 glycosyliert wurde. Die Abschirmung entspricht dem typischen δ-effekt bei Zuckerderivaten. 24