The Nature of Hydrogen Bonds in Cytidine-H + -Cytidine DNA Base Pairs

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1 The ature of Hydrogen Bonds in Cytidine-H + -Cytidine DA Base Pairs A. L. Lieblein, M. Krämer, A. Dreuw, B. Fürtig, H. Schwalbe, Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, Seminar Moderne Anwendungen der Magnetischen Resonanz Annabell Peters

2 i-motiv icht kanonische Basenpaarung Semiprotonierte Cytidin H + Cytidin-Basenpaare (C C + ) ph-wert 6 DA Sequenz: d(ccctaa) 3 CCC A 5 A 17 R 1 O + H H H H H O R 2 Abb. 1: C C + Basenpaar. T 4 C 3 C 2 C 1 5 A 18 C 19 C 20 C 21 3 A 6 T 16 C 7 C 15 C 8 C 14 C 9 C 13 T 10 A12 A 11 Abb.2: DA i-motiv-struktur. 1

3 Art der Wasserstoffbrückenbindung 1. Symmetrische Wasserstoffbrückenbindung H Asymmetrische Wasserstoffbrückenbindung k a a ----H b k b a H---- b R 1 H 2 O H O + H 2 R 2 k a k b R 1 H 2 + O H O H 2 R 2 Abb. 3: H + Wasserstoffbindungen im semiprotonierten C C + Basenpaar. 2

4 Untersuchung der C C + - Bindung MR Spektroskopisch Selektiv Isotopenmarkierte DA Stränge 1D 15 HMQC, 2D 1 H- 15 HMQC MR Experimente Bestimmung von: 1 J(H) Kopplungskonstanten 1 H 15 chemische Verschiebungen Solvenz Austauschparameter Quantenmechanische Untersuchungen density functional theory (DFT) Bestimmung von: Elektronische Struktur der Wasserstoffbindung Dynamik der Wasserstoffbindung 3

5 MR- Untersuchungen Labeling: Immer ein Cytidin ist 50% 13 C und 50% 15 angereichert 12 verschiedene, selektiv markierte DA Sequenzen 1 J(3 a,h3) und 1 J(3 b,h3) Kopplungskonstanten von allen Cytidinen konnten bestimmt werden 2h J(3 a, 3 b ) und 1h J(H3,3) Kopplungen wurden größtenteils unterdrückt Wasserstoffaustauschexperimente: Austauschhalbzeit t 1/2 im Sekundenbereich Austausch ist langsamer als in einer DA-Doppelhelix, da C C + -Basenpaare stabiler sind 4

6 Chemische Verschiebung 1 H chemische Verschiebung ist gleich (Δδ( 1 H) ppm) 15 chemische Verschiebung ist unterschiedlich (Δδ( 15 ) ppm) Basenpaar δ( 1 H) [ppm] δ( 15 ) [ppm] Δδ( 15 ) [ppm] ( 15 )C7-C C7-( 15 )C ( 15 )C3-C C3-( 15 )C ( 15 )C8-C C8-( 15 )C ( 15 )C2-C C2-( 15 )C ( 15 )C9-C C9-( 15 )C ( 15 )C13-C C13-( 15 )C Abb.4: 1D 15 -HMQC, 2D 1 H 15 -HMQC von C3 und C15. [1] Tab. 1: 1 H und 15 chemische Verschiebungen aus 15 - HMQC. [1] 5

7 Kopplungskonstanten Basenpaar 1 J(H) [Hz] Δ 1 J(H) [Hz] theoretisch (c/h/m) expt theoretisch expt ( 15 )C7-C /4.6/ C7-( 15 )C /5.1/ ( 15 )C3-C /0.0/ C3-( 15 )C /0.0/ ( 15 )C8-C /0.1/ C8-( 15 )C /0.1/ ( 15 )C2-C /0.1/ C2-( 15 )C /0.1/ ( 15 )C9-C /0.2/ C9-( 15 )C /0.3/ ( 15 )C13-C1 63.8/0.0/ C13-( 15 )C1 63.9/0.0/ * * Tab. 2: experimentell Bestimmte und berechnete 1 J(H) Kopplungskonstanten der Wasserstoffbindung in den Basenpaaren (c: kovalent gebunden, h: Wasserstoffbrückenbindung, m: populationsgewichteter Mittelwert, *große Fehler in den experimentellen Werten). 6

8 Konformere 2 verschiedene Konformere des DA i-motivs 1 J(H) Kopplungskonstanten beider Konformere sind ähnlich Abb. 5: Haupt-und ebenkonformation des DA i-motivs. [2] Abb. 6: 15 gefiltertes 1D Experiment. [1] 7

9 Quantenmechanische Untersuchungen Berechnung der MR Parameter mittels DFT Modelle wurden konstruiert aus MR Daten (PDB) Geometrieoptimierung Berechnung von: Energiedifferenzen Relative Bolzmanverteilung 1 J(H) Kopplungskonstanten 8

10 Quantenmechanische Untersuchungen Protonentransfer-Barriere beruht auf dem --Abstand ormaler - Abstand: 2,6-2,8 Å Energiebarriere höchstens 6 kcal mol -1 Protonentransfer mind s -1 Abb. 7: Energiebarriere und resultierende Wasserstoff-Austauschrate zwischen den Stickstoffatomen in einem C C + Basenpaar. [1] 9

11 Berechnete und Experimentelle Werte Basenpaare ΔE [kcal mol 1 ] Relative population 1 J(H) [Hz] Δ 1 J(H) [Hz] theory expt theoretisch (c/h/m) expt theoretisch expt ( 15 )C7-C /4.6/ C7-( 15 )C /5.1/ ( 15 )C3-C /0.0/ C3-( 15 )C /0.0/ ( 15 )C8-C /0.1/ C8-( 15 )C /0.1/ ( 15 )C2-C /0.1/ C2-( 15 )C /0.1/ ( 15 )C9-C /0.2/ n.d. C9-( 15 )C /0.3/ ( 15 )C13-C1 63.8/0.0/ C13-( 15 )C1 63.9/0.0/ Tab. 3: Berechnete sowie experimentell bestimmte Werte der -H + -- Bindungen im i-motiv. [1] 10

12 H + -Bindung asymmetrisches doppeltes Wannenpotential Verschiedene Potentialminima für den Protonentransfer Verschiedene Raten für den Hin- und Rück-Transfer Abb. 8: Energiediagramm der -H + --Bindung. [1] 11

13 Positionen der Protonen 1 J(H) 45 Hz Die Protonen sind nicht an nur einem Stickstoffatom A 5 A 18 A 17 A 6 lokalisiert 1 J(H) Kopplungskonstanten und 15 chemische Verschiebungen variieren für jedes Basenpaar T 4 C 3 C 19 C 20 C 7 C 8 T 16 C 15 C 14 QM Rechnungen spiegelten diese kleinen Unterschiede C 2 C 21 C 9 C 13 wieder C 1 3 T 10 A 12 5 Protonenkonzentration an den Cytidin-Resten C14, C15, C19, C20 und C21 sind leicht höher A 11 Abb. 9: Das i-motiv. Die rot markierten Cytidine weisen eine leicht erhöhte Protonenkonzentration auf. 12

14 Positionen der Protonen Vermutung: asymmetrische π-stapeln der sechs Basenpaare elektrostatische Repulsion Bevorzugte Position eines Protons: größter Abstand zum Proton des nächsten C-C + -Basenpaars ächstes Proton sitzt an der gegenüberliegenden Seite der großen Furche C 19 H + C 3 C 20 H + C 2 C 21 H + Große Furche C 7 C 8 C 9 H + C 15 H + C 14 Kleine Furche Abb. 10: Ausschnitt aus dem i-motiv. Die Protonenkonzentration ist an den rot markierten Cytidinen etwas höher. Vermutung: gekoppelter Protonentransfer entlang des i- Motivs 13

15 2D 1 H- 15 SOFAST-HMQC Band-Selective Optimized Flip-Angle Short-Transient heteronuclear multiple quantum coherence (SOFAST-HMQC) Experiment Für 15 und 13 C-markierte Makromoleküle Flip-Winkel α Ernstwinkel: β opt = cos -1 (exp(-t rec /T 1 )) Verbesserte Wiederholungsrate ohne Verlust an S/ pro Messzeit z α x Bandenselektive 1 H Pulse Verbesserte Spin-Gitter Relaxation T 1 Abb.11 Darstellung des Flipwinkels im Vektorraum. y Abb.12: Pulssequenz des SOFAST-HMQC Experiments. X = 13 C oder

16 Quellen [1] A. L. Lieblein, M. Krämer, A. Dreuw, B. Fürtig, H. Schwalbe, Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, [2] A. L. Lieblein, J. Buck, K. Schlepckow, B. Fürtig, H. Schwalbe, Angew. Chem. 2012, 124, [3] P. Schanda, B. Brutscher, J Am Chem Soc 2005, 127, [4] P. Schandaa, E. Kupce, B. Brutschera, J Biomol MR 2005, 33,

17 Vielen Dank für ihre Aufmerksamkeit