UMG. Bioinformatik/System Biologie Wintersemester Prof. Dr. Tim Beißbarth
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1 Mittwoch 13. Januar :30 /System Biologie Wintersemester 2010 Prof. Dr. UMG Georg-August-Universität Göttingen Abt. Medizinische Statistik - Biostatistik
2 Von Biologischen Problemen zu System-Biologischen Modellen Biological Samples & Data Generation Tissue from Patients - Cancer Technology & Development Gene expression Microarrays Data Analysis & Statistics Differential Gene Expression - Statistical Testing Functional Interpretation & Systems Biology GO:? p-value p-value p-value p-value p-value p-value Find overrepresented Functional Groups. Different Cell lines - Model Systems Cellular Assays RNAi Screens Classification - Machine Learning Integration of different data. S 1 S 2 S 3 S 4 E E E E E E E Cellular Pertubation - Knockdown - overexpression Protein Arrays Lysate Arrays Clustering - Visualization E Likelihood model Reconstruction of biological networks. E
3 System Biologie verschiedene Herangehensweise Bottom-Up Vernetzung weniger Proteine zu Interaktionsmodellen (Pathways) Ziel: Simulation von einfachen biologischen Systemen und vorhersage von Zuständen. Modellierungsansätze: Differentialgleichungen Petri-Netze Bayes-Netze Boolsche Netze Top-Down Genomische Ansätze zur Erhebung von Daten und Modellierung der Proteinnetzwerke einer ganzen Zelle. Ziel: Besseres Verständnis der komplexen biologischen Zusammenhänge einer Zelle. Methodische Ansätze: Protein-Protein-Interaktion Gen-Expressionsnetze Knock-Down Screens Topologische Analyse von Netzwerken
4 Übersicht Mi : Grundlagen Microarrays und R Mi : Normalisierung/Differentielle Genanalyse Mi : Clustern/Klassifikation Mi : Gene-Ontologien Übungen in R als Hausaufgabe Besprechungen in Anschluss an die Vorlesungen. Mi : Prüfungen für Vorlesung Systembiologie I (Anmeldung bei FlexNow)
5 Online Vorlesungsslides und R-Skripte: Lectures Terry Speed, Berkeley: Kurs NGFN Practical DNA Microarray Analysis : R/Bioconductor Dokumentation (Vignetten): R Tutorial von Günther Sawitzki Google, Pubmed, Wikipedia
6 1. Vorlesung Überblick über Methoden zur Genexpressionsanalyse und spezifische Probleme. 1. SAGE 2. Verschiedene Microarray Plattformen 1. cdna 2. Affymetrix Design von Microarray Experimenten Auswertung von Microarray Experimenten (Überblick) 1. Verschiedene Level von Wiederholungen 2. Normalisierung 3. Clusterung 4. Klassifikation
7 SAGE * * * * * Nylon membrane Illumina Bead Array Verschiedene Technologien GeneChip Affymetrix cdna microarray Agilent: Long oligo Ink Jet CGH
8 SAGE Normal Krank Sequenziere isoliere mrna Nla III Ditag Ditag Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Nla III Nla III Ditag Nla III Schneide bei CATG Extrahiere tags (14-21bp) AAAAAAAAA AAAAAAAAA AAAAAAAAA AAAAAAAAA AAAAAAAAA AAAAAAAAA AAAAAAAAA AAAAAAAAA Konkateniere tags Quantifiziere tags Normal Krank
9 cdna und Affimetrix (kurze, 25 bp) Oligo Technologien. Lange Oligos (60-75 bp) werden so ähnlich wie cdna benutzt.
10 Microarray Hybridisierung Gewebe 1 reversen Strang synthetisieren, labeln, mischen total RNA 1 Gewebe 2 total RNA 2 Hybridisierung
11 Definition von probe and target TARGET cdna A Cy5 gelabelt cdna B Cy3 gelabelt PROBE
12 Microarrays Geschichte Basiert auf Southern BIot Technologie (Edward Southern, 1975, J. Mol. Biol.) 1990: erste high-density Nylonfilter Arrays (Lennon/Lehrach, 1991, Trends Genet., Review) 1995: cdna-microarrays beschrieben von Schena et al, Science 1996: Affymetrix Genechip Technologie beschrieben von Lockhart et al, Nat. Biotechnol.
13 cdna Klone (probes) cdna arrays zusammengefasst excitation laser 2 laser 1 scanning printing PCR Produkt Amplifikation purification mrna target) Emission Bilder überlagern Microarray 0.1nl/spot Hybridisiere Target mit Microarray Analyse
14 Zwei verschiedene Aspekte von Array Design Design des Arrays cdna Allokierung der mrna Samples zu den Slides cdna A Cy5 gelabelt cdna B Cy3 gelabelt Arrayed Library (96 oder 384-well plates) Spotte Microarray auf Glas Slides Hybridisierung affy WT MT
15 cdna Bibliotheken und Expressed Sequence Tags (ESTs) schneiden / reverse Transkription cdna - Bank Zelle mrna-pool cdna - Klon GAATTCGATATCTCA...ATAGTCAGCATCAAGCTT GAATTCGATATCTCA...ATAGTCAGCATCAAGCTT 5 Vector 5 Read Vector 3-3 Vector 3 Read Vector 5 ESTs
16 Beispiel EST Cluster visualisiert:
17 Alle Klone auf einem cdna Array haben idealerweise Gleiche Schmelztemperatur (ähnliche Länge und Basenzusammensetzung) Keine Sekundärstruktur (i.e. Selbstkomlementarität) Keine Homologen im Genom (i.e. Genspezifität)
18 Verschiedene Aspekte von Design 2. Zuordnung der Samples zu den Slides A B Typen von Samples Replikate technische, biologische. Poolen von Samples. Amplifizieren von Samples. Verschiedene experimentelle Layouts Ziel des Experiments. Robustheit. Erweiterbarkeit. Effizienz: Anzahl der verbrauchten Slides. - Menge des benötigten Probenmaterials.
19 Experimenteller Zyklus Biologische Fragestellung Experimentelles Design fehlgeschlagen Microarray Experiment Qualitäts- Sicherung In Ordnung Bildanalyse Normalisierung Vorverarbeitung Auswerten Testen Analyse Clustern Klassifizierung Biologische Verifikation und Interpretation
20 mrna Samples präparieren: Maus Model Gewebe präparieren RNA Isolation Amplification Probe labelling Hybridisierung
21 mrna Samples präparieren: Maus Model Gewebe präparieren Biologische Replikate RNA Isolation Amplification Probe labelling Hybridisierung
22 mrna Samples präparieren : Maus Model Gewebe präparieren RNA Isolation Amplification Technische Replikate Probe labelling Hybridisierung
23 Gepoolte vs einzeln gemessene Samples Poolen kann als biologisches Mitteln gesehen werden. Trade off zwischen Kosten für eine Hybridisierung. Kosten für die mrna Samples. Fall 1: Kosten für mrna Sample << Kosten für Hybridisierung Poolen kann helfen die Anzahl der Hybridisierungen zu reduzieren. Fall 2: Kosten für mrna Sample >> Kosten für Hybridisierung Jedes Sample einzeln auf Array Auftragen um maximiale Information über biologische Varianz zu erhalten. Referenzen: Han, E.-S., Wu, Y., Bolstad, B., and Speed, T. P. (2003). A study of the effects of pooling on gene expression estimates using high density oligonucleotide array data. Department of Biological Science, University of Tulsa, February Kendziorski, C.M., Y. Zhang, H. Lan, and A.D. Attie. (2003). The efficiency of mrna pooling in microarray experiments. Biostatistics 4, /2003 Xuejun Peng, Constance L Wood, Eric M Blalock, Kuey Chu Chen, Philip W Landfield, Arnold J Stromberg (2003). Statistical implications of pooling RNA samples for microarray experiments. BMC Bioinformatics 4:26. 6/2003
24 Design eines Dye-Swap Experimentes Wiederholungen sind essentiell um die Qualität der Experimente beurteilen zu können. Ein Beispiel für Replikate ist der Dye-Swap, d.h. Replikate welche den Gleichen mrna Pool benutzen, aber die Label vertauschen. Der Dye-Swap gibt Aufschluß darüber ob bei den Experimenten ein Farbbias eingeführt wird.
25 Graphische Repräsentation Knoten: mrna samples; Kanten: Hybridisierungen; Richtung: dye Zuordnung. Cy3 sample Cy5 sample
26 Eine einfache Design Frage: Direkte oder indirekt Vergleiche Zwei Samples (A vs B) e.g. KO vs. WT oder mutant vs. WT Direkt Indirekt A A B B R mittelwert (log (A/B)) log (A / R) log (B / R ) 2 /2 2 2 Diese Berechnungen nehmen Unabhängigkeit der Samples an und sind in Wirklichkeit komplizierter.
27 Experimentelle Resultate 5 Sets von Experimenten mit ähnlicher Struktur. Vergleiche Y-Axe A) SE für avem mt B) SE für avem mt avem wt SE
28 Experimente für welche mehrere Designs in Frage kommen 4 Samples A B A.B C A C A C A C B A.B B A.B B A.B
29 Experimente für welche mehrere Designs in Frage kommen Zeitreihen T1 T2 T3 T4 Ref T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4
30 Experimentelles Design Benutze hoch korrelierte Referenz-Samples um die Nachteile des Common Reference Designs auszugleichen. Benutze biologische Replikate an Stelle von technischen Replikaten soweit möglich. Effizienz kann mit verschieden Massen gemessen werden Anzahl der Slides oder Hybridisierungen; Menge des verbrauchten biologischen Materials. Vergleiche, an denen der Experimentator besonders interessiert ist, sollten nach Möglichkeit auf einem Slide direkt gemacht werden. Referenzen T. P. Speed and Y. H Yang (2002). Direct versus indirect designs for cdna microarray experiments. Sankhya : The Indian Journal of Statistics, Vol. 64, Series A, Pt. 3, pp Y.H. Yang and T. P. Speed (2003). Design and analysis of comparative microarray Experiments In T. P Speed (ed) Statistical analysis of gene expression microarray data, Chapman & Hall. R. Simon, M. D. Radmacher and K. Dobbin (2002). Design of studies using DNA microarrays. Genetic Epidemiology 23: F. Bretz, J. Landgrebe and E. Brunner (2003). Efficient design and analysis of two color factorial microarray experiments. Biostaistics. G. Churchill (2003). Fundamentals of experimental design for cdna microarrays. Nature genetics review 32: G. Smyth, J. Michaud and H. Scott (2003) Use of within-array replicate spots for assessing differential experssion in microarray experiments. Technical Report In WEHI. Glonek, G. F. V., and Solomon, P. J. (2002). Factorial and time course designs for cdna microarray experiments. Technical Report, Department of Applied Mathematics, University of Adelaide. 10/2002
31 Gen-expressions Daten Gen-expressions Daten für G Gene und n Hybridisierungen. Gene x arrays Daten-matrix: Gene mrna Samples sample1 sample2 sample3 sample4 sample gene-expressions level or ratio für Gen i in mrna Sample j M = A = Log 2 (rote Intensität / Grüne Intensität) Vergleich jeweils zweier Bedingungen. mittel: log 2 (rote Intensity), log 2 (Grüne Intensität) Function (PM, MM) von MAS oder RMA
32 Der Scatterplot - Aus Vorlesung von Rainer König vom Vorjahr Daten Daten, logarithmisch
33 MA Plot M = log 2 (R/G) A = 1/2 log 2 (RG)
34 Vulcano Plot (B=Maß für die Reproduzierbarkeit, mehr dazu nächstes Mal)
35 Rotierter Scatter Plot Leere Spots Negative Kontrollen Positive Kontrollen Lowess Kurve (in verschiedenen Konzentrationen gespottet) M = log R/G = logr - logg A = ( logr + logg) /2
36 Dienstag 14. April :15 Analyse von Mikrorray Daten mit Hilfe von R/Bioconductor UMG Georg-August-Universität Göttingen Abt. Medizinische Statistik - Biostatistik
37 Was ist R? Umgebung zur statistischen Datenanalyse Open source, weitgehend kompatibel mit Splus Sehr dynamisch durch einfache Einbindung neuer Funktionen ( Packages ) In der wissenschaftlichen Gemeinschaft das (zusammen mit SAS) am weitesten verbreitete Statistik-Tool De facto - Standard bei Microarray-Analysen
38 Installation von R/Bioconductor
39 Installation von R/Bioconductor
40 Installation von R/Bioconductor
41 Installation von R/Bioconductor
42 Installation von R/Bioconductor
43 Installation von R/Bioconductor
44 Die R Syntax, elementare Rechenoperationen x 20*20 1*1 0* * * x x y > x = 0:20 > y = x*x > plot(x,y) x y
45 Die R Syntax, elementare Rechenoperationen x > x = 1:4 > y = x*2 > z = x*c(0,1) * * x*2 y * * x* z
46 Die Datenstruktur exprset > getbioc( vsn ) > library(vsn) > data(lymphoma) > class(lymphoma) [1] exprset lymphoma Gene mrna Samples sample1 sample2 sample3 sample lymphoma@exprs lymphoma@phenodata (other slots) name colour type sample1 red CLL... sample2 green CLL... sample3 red DLCL... sample4 green DLCL...
47 Microarray data analysis Pre-processing CEL, CDF affy vsn.gpr,.spot marray limma vsn exprset Annotation Differential expression edd genefilter limma multtest ROC + CRAN Graphs & networks graph RBGL Rgraphviz Cluster analysis CRAN class cluster MASS mva Prediction CRAN class e1071 ipred LogitBoost MASS nnet randomforest rpart annotate annaffy + metadata packages Graphics geneplotter hexbin + CRAN
48 Qualitätskontrolle II: Diagnostische Plots Scatterplot (absolute vs. logarithmische Skala) M-A-Plot Erkennen systematischer Fehler QQ-Plot, Boxplot, Ähnlichkeitsmatrix, Dendrogramm
49 Visualisierung der Daten: Scatterplots Vergleich zweier Microarraymessungen Absolutskala logarithmische Skala y = 4x > x = exprs[,1] > y = exprs[,2] y = 2x > plot(x,y) > x = exprs[,1] > y = y = exprs[,2] 2x > plot(x,y,log= xy ) y = ½ x y = 4x y = ½ x y = ¼ x y = ¼ x Vorteile der logarithmischen Transformation: Die Daten verteilen sich gleichmäßiger über den Plot Linien konstanter Fold ratios bilden Parallelen zur Hauptdiagonalen
50 Visualisierung der Daten: M(inus)-A(verage) Plot > x = log(exprs[,1]) > y = log(exprs[,2]) > plot(x,y) Drehen um 45 o > xma =(x+y)/2 > yma = y-x > plot(xma,yma) log (fold ratio von y und x) log (geometr. Mittel von x und y) Vorteile des M-A Plots: Linien konstanter Fold ratios bilden Parallelen zur x-achse M-A Plot ermöglicht das Erkennen systematischer Änderungen des Kanal1/Kanal2-Expressionsverhältnisses in Abhängigkeit von der mittleren Expressionsstärke eines Gens
51 Erkennen systematischer Fehler im M-A Plot Keine (kaum) systematische Abhängigkeiten Kanal 2 ist um einen konstanten Faktor stärker als Kanal 1 Multiplikativer Bias
52 Erkennen systematischer Fehler im M-A Plot Kanal 1 ist nur im niedrig exprimierten Bereich stärker als Kanal 2 Kombination aus additivem und multiplikativem Bias Additiver Bias
53 Vergleich zweier Messungen: QuantileQuantileplots Quantile-Quantile plot (QQ-plot). Um zwei durch dievektoren x und y gegebenen Verteilungen zu vergleichen, plotte für alle Werte q aus dem Intervall (0,1) das q-quantil der x-verteilung gegen das q-quantil der y-verteilung QQ-plot
54 Vergleich zweier Messungen: QQplots Interpretation: Unähnliche Verteilungen: Der QQplot ist nicht linear, insbesondere nicht im Zentrum der QQ-Linie. Ähnliche Verteilungen, die Enden der y- Verteiluing sind länger. Ähnliche Verteilungen, die Enden der x- Verteilung sind länger.
55 Vergleich mehrerer Messungen: Boxplots Five-point-Summary. Für einen Vektor x wird das 5-tuple der Quantile (x min, x 0.25, x med, x 0.75, x max ) das five-point-summary genannt. Boxplot. Ein Boxplot ist die Visualisierung des (mehrerer) Five-point-summarys: x max Swirl array 93: pre-norm x 0.75 x med x 0.25 x min ) M ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) Boxplots sind zum schnellen Vergleich mehrerer Verteilungen besonders gut geeignet
56 Vergleich mehrerer Messungen: Ähnlichkeitsmatrizen und Dendrogramme > distanzen = dist(t(exprs)) > dendrogramm = hclust(distanzen) > plot(dendrogramm) Cluster Dendrogram CLL-52 reference reference reference CLL-39 DLCL-0024 DLCL-0023 CLL-13 CLL-13 reference reference reference reference reference DLCL-0032 DLCL-0029 Mit Dendrogrammen / Ähnlichkeitsmatrizen lassen sich oft Batcheffekte erkennen oder einzelne defekte Chips identifizieren.
57 Acknowledgements Slides geborgt von Achim Tresch Benedikt Brors Wolfgang Huber Terry Speed Jean Yang
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