Untersuchung unterschiedlicher Bearbeitungstechniken auf das Ergebnis der Zellverteilung in der bronchoalveolären Lavage (BAL)

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1 Aus dem Zentrum für Innere Medizin der Universität zu Köln Klinik und Poliklinik für Innere Medizin III Kardiologie Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. St. Baldus Untersuchung unterschiedlicher Bearbeitungstechniken auf das Ergebnis der Zellverteilung in der bronchoalveolären Lavage (BAL) Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Merve Sevim aus Hildesheim promoviert am 23. August 2017

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3 Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h.c. Th. Krieg 1. Berichterstatter: Professor Dr. med. J. Müller-Ehmsen 2. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. S. Baldus Erklärung: Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie der Herstellung des Manuskriptes habe ich Unterstützungsleistungen von folgenden Personen erhalten: Professor Dr. med. Jochen Müller-Ehmsen, Chefarzt der Asklepios Klinik Altona Abteilung für Kardiologie, Pneumologie, Internistische Intensivmedizin, Privatdozent Dr. Hans-Peter Hauber, Sektionsleiter der 3. Medizinische Abteilung, Sektion Pneumologie der Asklepios Klinik Altona Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe einer Promotionsberaterin / eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertationsschrift stehen. Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Erklärung zur guten wissenschaftlichen Praxis: Ich erkläre hiermit, dass ich die Ordnung zur Sicherung guter wissenschaftlicher Praxis und zum Umgang mit wissenschaftlichem Fehlverhalten ( der Universität zu Köln gelesen habe und verpflichte mich hiermit, die dort genannten Vorgaben bei allen wissenschaftlichen Tätigkeiten zu beachten und umzusetzen. Köln, den Unterschrift:...

4 Die in dieser Arbeit zugrundeliegenden Daten wurden von mir anhand von bereits erstellten mikroskopischen Präparaten selbst erhoben. Die Durchführung der bronchoalveolären Lavage (BAL) erfolgte durch Herrn Privatdozent Dr. Hauber. Das Lagern und Aufarbeiten der BAL-Proben wurde durch das Labor-Team der Asklepios Klinik Altona in Hamburg durchgeführt. Auch die Daten der Durchflusszytometrie lagen mir zur Auswertung vor.

5 Danksagung Ich bedanke mich bei meinem betreuenden Doktorvater Herrn Prof. Dr. med. Müller- Ehmsen und Herrn Privatdozent Dr. Hauber für die Bereitstellung der Rahmenbedingungen, die diese Dissertation erst ermöglicht haben. Ganz besonderer Dank gilt Herrn Privatdozent Dr. Hauber für die inspirierenden Diskussionen und hilfreichen Verbesserungsvorschlägen. Mein Dank gilt auch dem Laborteam der Asklepios Klinik Altona, die mich fachlich unterstützt haben und offen für meine Fragen waren. Ein großes Dankeschön an Herrn Privatdozent Dr. med. Neuner und Frau Universitätsprofessorin Dr. rer. biol. hum. König für die Statistik-Beratung und Auswertung. Danken möchte ich auch meinen Eltern, die mir immer zur Seite standen und mir das Studium ermöglicht haben. Weiterhin möchte ich meiner Familie und Freunden für psychologisch-emotionale Unterstützung und das Korrekturlesen danken.

6 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Geschichte der Bronchoskopie Indikation Kontraindikationen und Komplikationen Befundinterpretation der BAL Lymphozytose Neutrophilie Eosinophilie Weitere BAL-Befunde Zielsetzung der Arbeit Material und Methoden Patientenkollektiv Bronchoalveoläre Lavage Aufarbeitung im Labor Bestimmung der Gesamtzellzahl und Differenzierung der Zellen mit dem Sysmex-Gerät Herstellung von Cytospin Präparaten mit der Zytozentrifuge Pappenheim-Färbung und Mikrobielle Auswertung Durchflusszytometrie Statistik Ergebnisse Gruppe A: Vergleich der Ergebnisse der direkt aufgearbeiteten gekühlten und der ungekühlten BAL-Proben Gruppe B: Vergleich der Ergebnisse der direkten und der nach 24 Stunden aufgearbeiteten BAL-Proben unter gekühlten Bedingungen Gruppe C: Vergleich der Ergebnisse der direkten und der nach 24 Stunden aufgearbeiteten BAL-Proben bei Raumtemperatur Gruppe D: Vergleich der Ergebnisse der gekühlten und ungekühlten Aufarbeitung nach 24 Stunden Gruppe E: Vergleich der Ergebnisse der Durchflusszytometrie der

7 gekühlten und ungekühlten BAL-Proben Vergleich der Ergebnisse der mikroskopischen Analyse aller Bearbeitungstechniken Diskussion Diskussion der Methode Diskussion der Ergebnisse Zusammenfassung Literaturverzeichnis Anhang Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Lebenslauf... 83

8 Abkürzungsverzeichnis 24kalt 24warm ANA ANCA APC ApC Cy7 BAL BNP BOOP c-anca COP CD CSS DAH EAA FACS FITC FSC GM-CSF GPA HES HIV HRCT IIP IL ILE IF-γ IPA IPF IQR Kalt KL-6 gekühlte BAL-Proben nach 24 Stunden aufgearbeitet ungekühlte BAL-Proben nach 24 Stunden aufgearbeitet antinukleäre Antikörper Anti-Neutrophilen-Cytoplasmatische-Antikörper Allophycocyanin APC+ cyanine dye bronchoalveoläre Lavage Brain Natriuretic Peptide Bronchiolitis obliterans mit organisierender Pneumonie cytoplasmatische Anti-Neutrophilen-Cytoplasmatische-Antikörper kryptogen organisierende Pneumonie Cluster of differentiation Churg-Strauss-Syndrom diffuse alveoläre Hämorrhagie exogen allergische Alveolitis Durchflusszytometrie; engl.: Fluorescence Activated Cell Sorting Fluoresceinisothiocyanat Forward Scatter Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor Granulomatose mit Polyangiitis hypereosinophiles Syndrom Humane Immundefizienz-Virus High-Resolution-Computertomographie idiopathische interstitielle Pneumonien Interleukin interstitielle Lungenerkrankungen Interferon gamma invasive pulmonale Aspergillose idiopathische pulmonale Fibrose Interquartilrange gekühlte BAL-Proben Krebs von den Lungen-6

9 μl Mikroliter ml Milliliter Max Maximumwert Min Minimumwert MPA mikroskopische Polyangiitis NK-Zelle Natürliche Killerzelle NSIP nicht spezifische interstitielle Pneumonie p-anca perinukleäre Anti-Neutrophilen-Cytoplasmatische-Antikörper PAS periodic acid Schiff PCR Polymerase-Kettenreaktion PE Phycoerythrin PerCP Peridin-Chlorophyl-A-Protein PJP Pneumocystsis-jirovecii-Pneumonie qpcr quantitative real-time Polymerase-Kettenreaktion SSC Sidewards Scatter TBLB transbronchiale Lungenbiopsie TBNA transbronchiale Nadelaspiration UIP Usual Interstitial Pneumonia V. a. Verdacht auf Warm ungekühlte BAL-Proben

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11 1 Einleitung Die Bronchoskopie ist eine invasive Maßnahme in der Pneumologie, die es ermöglicht die oberen und unteren Atemwege zu untersuchen. Sie dient nicht nur als diagnostisches Hilfsmittel, sondern kann auch für therapeutische Interventionen im palliativen und kurativen Bereich genutzt werden (32, 52, 57). Die im Rahmen der Bronchoskopie durchgeführte bronchoalveoläre Lavage (BAL) ist heute ein wichtiger Bestandteil der pneumologischen Diagnostik. Sie ist die am besten tolerierte Methode im Rahmen einer flexiblen Bronchoskopie um Zellen, inhalierte Stoffe und Erreger aus dem unteren Respirationstrakt zu gewinnen und somit die alveolären und interstitiellen Lungenbereiche zu untersuchen (6). Die gewonnene Flüssigkeit mit den Zellen und weiteren Bestandteilen des untersuchten Lungenbereichs kann durch die Analyse im Labor Aufschluss über ein breites Spektrum an Erkrankungen geben. Neben einer Erregerdiagnostik kann sie auch wichtige Hinweise in der Diagnostik unklarer interstitieller Lungenerkrankungen (ILE) geben (11, 94). Spezielle Untersuchungen können ebenfalls durchgeführt werden und sind bei der alveolären Proteinose, diffusen alveolären Hämorrhagien (DAH) und Staubexposition häufig ausreichend (6). Für die optimale Durchführung und Aufarbeitung der BAL gibt es keine einheitlichen Leitlinien (48, 94). Das Lagern und Aufarbeiten ist für die Qualität der Proben ein entscheidender Faktor, da abhängig von der Ausstattung der Klinik die Proben eventuell in externe Labore transportiert werden müssen. Die Lagerungsbedingungen und längere Transportwege können möglicherweise einen Einfluss auf die Haltbarkeit der Zellen haben (20, 70). 1.1 Geschichte der Bronchoskopie Im 19. Jahrhundert gelang erstmals weltweit die endoskopische Einsehung des Tracheobronchialsystems. Die Grundlage für die Entwicklung der modernen Bronchoskopie legte Gustav Kilian. Der Facharzt für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde war stets an der Verbesserung endoskopischer Verfahren interessiert und schaffte es schließlich einen Fremdkörper aus dem rechten Hauptbronchus zu entfernen. Von 11

12 der Fachwelt wurde diese neue Methode mit Begeisterung aufgenommen, da nun Fremdkörperextraktionen durchgeführt werden konnten. Das Indikationsspektrum der starren Bronchoskopie konnte erweitert werden und findet noch heute Anwendung in der Pneumologie (52, 68). Die Entwicklung der flexiblen fiberoptischen Bronchoskopie durch den Thoraxchirurg Shigeto Ikeda im Jahre 1966 ermöglichte neben der Einsehung der Subsegmentbronchien auch die Probeentnahme. Ikedas Bemühungen gingen auf sein Interesse zur Frühdiagnose des Bronchialkarzinoms zurück. Der Anwendungsschwerpunkt verschob sich von therapeutischen Indikationen der Bronchoskopie zu diagnostischen Maßnahmen. Es schien zunächst, als hätte die flexible Bronchoskopie die starre Bronchoskopie ersetzt. Heute wird jedoch je nach Indikationsstellung entschieden, welches Instrument eingesetzt wird (41, 52, 68). Die BAL hat ihren Ursprung in tierexperimentellen Untersuchungen, in denen die Lavage zur Gewinnung von Alveolarmakrophagen in Ratten genutzt wurde (66). Mit der Entwicklung der flexiblen Bronchoskopie erfolgte die BAL erstmals Dieses Verfahren ermöglicht Zellen aus dem peripheren Atemwegen und Alveolen zu gewinnen (79). 1.2 Indikation Die Indikationsstellung für eine bronchoskopische Untersuchung erfolgt nach eingehender Befragung des Patienten, Betrachtung des Röntgenbilds sowie weiteren Voruntersuchungen. Sie kann sowohl als diagnostisches Hilfsmittel als auch zur therapeutischen Intervention genutzt werden. Aus den vorliegenden Untersuchungsergebnissen wird entschieden, ob eine starre oder flexible Bronchoskopie durchgeführt wird (52). Die starre Bronchoskopie eignet sich bei pulmonalen Hämorrhagien, Verdacht auf (V. a.) Fremdkörperaspiration oder einer Stent-Implantation. Sie bedarf einer Vollnarkose des Patienten und ist bei intubierten Patienten oder instabiler Halswirbelsäule nicht möglich. Durch das starre Instrument ist die Verletzungsgefahr höher als bei der flexiblen Bronchoskopie. Neben einer besseren Übersicht der zentralen Bereiche, bietet sie gute Absaugmöglichkeiten von Blut, Sekret und 12

13 nekrotischem Gewebe. Durch den größeren Handlungsspielraum für den Untersucher ermöglicht sie es größere Bioptate zu entnehmen (52, 68). Die Vorteile des flexiblen Bronchoskops sind die Einsehung der Lunge bis in die Subsegmentbronchien, die Lokalanästhesie, der geringe technische und personelle Aufwand, die geringe Verletzungsgefahr und die Möglichkeit der Durchführung durch den Tubus (52). Des Weiteren können zusätzlich Eingriffe wie endobronchialer Ultraschall, Autofluoreszenzendoskopie, transbronchiale Nadelaspiration (TBNA) und eine BAL durchgeführt werden (34). Die Methode der Wahl bei der Abklärung bronchopulmonaler Symptome ist die flexible Bronchoskopie. Symptome können neben Hämoptysen oder persistierendem Husten auch rezidivierende pneumonische Infiltrate sein. Eine Erregerdiagnostik wird bei einer akuten Exazerbation der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung, Pneumonien unter Immunsuppression, ambulant erworbenen und nosokomialen Pneumonien, sowie bei V. a. Tuberkulose und V. a. atypischen Mykobakteriosen durchgeführt. Weitere Indikationen sind die Abklärung bei V. a. periphere Tumoren, zur postoperativen Kontrolle sowie in der Intensivmedizin zur Lagekontrolle des Tubus (52, 57). Die BAL stellt eine gut entwickelte Methode zur Auswertung eines breiten Spektrums an Lungenerkrankungen dar. Die Indikation war ursprünglich in therapeutischer Absicht für die zystische Fibrose, Alveolarproteinose und schwer zu bewältigendem Asthma. Heutzutage spielt sie besonders in der Diagnose alveolärer, entzündlicher und interstitieller Lungenerkrankungen eine Rolle. Sie kann hierbei neben einer Erregerdiagnostik in der Aktivitätsbeurteilung und Differentialdiagnose der interstitiellen Lungenerkrankungen (ILE) wichtig sein (21, 27, 77). Die ILE stellen eine Gruppe von Lungenerkrankungen dar, die mit einer Entzündung und Fibrose einhergehen. Eine Einteilung erfolgt unter Berücksichtigung der ätiologischen und histopathologischen Gesichtspunkte (4). Als Beispiel für idiopathische interstitielle Pneumonien (IIP) wird im Folgenden näher auf die idiopathische Lungenfibrose (IPF) und die nicht spezifische interstitielle Pneumonie (NSIP) eingegangen. Auf weitere Formen der ILE wie der Sarkoidose wird in Kapitel 1.4 eingegangen. Sowohl die IPF, als auch die NSIP sind interstitielle Pneumonien unbekannter Ursache, die chronisch fibrosierend sind. Der Nutzen der BAL in der Diagnostik der 13

14 IPF liegt laut den S2K-Leitlinien zufolge darin, dass andere Lungenerkrankungen wie die chronisch exogen allergische Alveolitis (EAA) (Lymphozytose > 40%) im Differenzialzellbild ausgeschlossen werden können. Weiterhin ist der Ausschluss von beispielsweise Infektionskrankheiten und malignen Erkrankungen möglich (8). Der Zugewinn durch das Differenzialzellbild der BAL an die diagnostische Spezifität der IPF ist unklar, sodass die S2K-Leitlinien eine BAL-Analyse zur Diagnose der IPF nicht empfehlen. Diese Empfehlung bezieht sich auf das Differenzialzellbild der BAL und sollte nach Einschätzung des behandelnden Arztes, den Erfahrungen und Kapazitäten der Einrichtung und des Labors erwogen werden (8). Der therapeutische Zugewinn durch die BAL kann enorm sein, sodass in der Diagnostik der ILE, auch bei V. a. eine IPF eine BAL häufig durchgeführt wird (8, 69). Das histopathologische Korrelat zur IPF ist das Usual Interstitial Pneumonia (UIP)- Muster. Neuere Studien konnten belegen, dass bei 8% der Patienten mit einem UIP- Muster in der High-Resolution-Computertomographie (HRCT), die BAL-Befunde auf eine unterschiedliche Diagnose hinweisen (69). Bei der IPF besteht die Möglichkeit, dass gleichzeitig unterschiedliche histologische Muster wie das einer UIP oder einer NSIP in verschiedenen Bereichen der Lunge auftreten (4, 62). Das histologische NSIP-Muster tritt auch bei der NSIP, einer weiteren chronisch fibrosierenden IIP, auf. Die NSIP ist eine Erkrankung, die häufiger Frauen betrifft und klinisch schwer von der IPF zu unterscheiden ist (37, 82). Eine Unterscheidung ist hinsichtlich der Prognose der Erkrankung des Patienten wichtig, da die NSIP eine bessere Prognose als die IPF aufweist (4). So liegt die 5-Jahres Mortalität von Patienten mit einer NSIP bei unter 15%, bei Patienten mit einer IPF hingegen bei bis zu 70% (37). Im BAL-Befund bei Patienten mit NSIP fällt eine Lymphozytose auf (3, 60, 61, 67). Neuere Studien konnten beweisen, dass die Zahl der neutrophilen Granulozyten bei UIP- und die Zahl der Lymphozyten bei NSIP-Patienten signifikant erhöht sind. Das Fehlen der Lymphozytose deutet auf ein UIP-Muster hin. Das Differenzialblutbild der BAL ist demnach in der Unterscheidung der NSIP von der UIP von Bedeutung (82). Aus der BAL konnten Biomarker gewonnen und in Studien untersucht werden. Sie geraten immer weiter in den Fokus und könnten in Zukunft Auswirkung in der Diagnose und im Management von Lungenerkrankungen haben. Die Frühdiagnose von Lungentumoren könnte ebenfalls gelingen (8, 95). Neue Techniken, die 14

15 bestimmte Komponenten der Genexpression mithilfe des Microarray-Verfahren, Proteinstrukturen untersuchen, könnten in Zukunft den diagnostischen Wert der BAL erhöhen und zusätzlich könnte die BAL in der Verlaufskontrolle bei Therapie eine Rolle spielen (60). 1.3 Kontraindikationen und Komplikationen Unter Berücksichtigung der Anamnese und Voruntersuchungen können Kontraindikationen wie ventilatorische Insuffizienz, therapieresistente Herzrhythmusstörungen und Koagulopathien ausgeschlossen werden. Patienten mit Asthma bronchiale können während der Untersuchung Bronchospasmen und Patienten mit pulmonaler Hypertonie Blutungen erleiden. Patienten mit einem akuten Koronarsyndrom können Herzrhythmusstörungen bekommen (52). Während Schleimhautblutungen häufig selbstlimitierend sind, können ernste Blutungen zu einem Notfall während der Bronchoskopie werden, sodass diese unterbrochen werden muss (53). Des Weiteren können progressiver und persistierender Sauerstoffsättigungsabfall und Hypoxämie Indikationen zum Abbruch der Untersuchung sein (52). Zu den Komplikationen einer Bronchoskopie zählen: Husten, Kollaps der Subsegmente, Aspiration, Verletzung der Zähne und Stimmbänder, Bronchospasmus, Laryngospasmus, Perforation von Trachea und Bronchien, subglottisches Ödem (40, 52, 53, 100). In den ersten Stunden nach einer BAL kann es zu Fieber kommen, welches von der instillierten Flüssigkeitsmenge abhängt (31). Des Weiteren kann sich vorübergehend ein radiologisch erkennbares Infiltrat darstellen sowie eine Verschlechterung der Lungenfunktion (52, 94). Laut einer Studie liegt die Komplikationsrate der flexiblen Bronchoskopie zwischen 0,08% und 0,3% (89). Einer neueren retrospektiven Studie zufolge liegen die Mortalitäts- und Komplikationsrate bei 0,5% (76). 1.4 Befundinterpretation der BAL Die zytopathologische Befundinterpretation sollte stets im Kontext mit der Vorgeschichte und den Voruntersuchungen erfolgen. Die Untersuchung im Labor kann Aufschluss über verschiedene Pathologien geben, wie bronchopulmonale 15

16 Infektionen, Neoplasien bis hin zu immunologischen Veränderungen (6, 60). Im normalen Zellbild des Erwachsenen liegen > 80% Alveolarmakrophagen, < 15% Lymphozyten, < 1% neutrophile Granulozyten, < 1% eosinophile Granulozyten vor (Abbildung 1a). Lediglich 1% Mastzellen sind vorhanden (Tabelle 1) (58). Ein Lymphozytenanteil von über 15% kann auf eine Sarkoidose, EAA, Bronchitis obliterans mit organisierender Pneumonie (BOOP), Berylliose, arzneimittelinduzierte Alveolitis, Tuberkulose, Kollagenosen, Infektionskrankheiten wie das Humane Immundefizienz-Virus (HIV), strahleninduzierte Pneumonien und chronisch entzündliche Darmerkrankungen hinweisen. Bei einem Vorliegen von über 1% neutrophilen Granulozyten können folgende Erkrankungen vorliegen: Infektionskrankheiten, Kollagenosen, Pneumokoniosen, Vaskulitiden, IPF, Acute Respiratory Distress Syndrome und eine Aspirationspneumonie (21, 57, 60). Das Zellprofil der BAL ist in der Diagnostik der ILE eher unspezifisch, kann aber als Differentialdiagnose, z.b. bei einem unklaren HRCT hilfreich sein (62). Bei V. a. eine durch anorganische Stäube hervorgerufene Erkrankung besteht die Möglichkeit, mithilfe der Lichtmikroskopie Asbestkörperchen in den Makrophagen oder die Asbestfasern in der Elektronenmikroskopie nachzuweisen (57). Eine Eosinophilie (> 1%) in der BAL hingegen kann auf eine eosinophile Pneumonie, Churg-Strauss-Syndrom (CSS), hypereosinophiles Syndrom (HES), parasitäre Infektion, arzneimittelinduzierte Alveolitis oder eine IPF hinweisen (21, 60). Beim Vorliegen von über 25% eosinophilen Granulozyten im Differentialzellbildbild, kann bei akutem Vorliegen mit hoher Wahrscheinlichkeit von einer eosinophilen Pneumonie ausgegangen werden. Das Vorkommen von einer erhöhten Prozentzahl von Mastzellen wurde bei der EAA, arzneimittelinduzierten Alveolitis, Sarkoidose, Kollagenosen, Vaskulitiden, IPF, BOOP, eosinophilen Pneumonie, neoplastischen Veränderungen beobachtet (60, 62). Des Weiteren besteht die Möglichkeit bei einem Anteil von 15% der Lymphozyten an der Gesamtzellzahl eine Durchflusszytometrie durchzuführen. Mithilfe der Durchflusszytometrie können die Oberflächenantigene der Lymphozyten bestimmt und somit der Subtyp angeben werden, die mit Cluster of differentiation (CD) bezeichnet werden. Der CD4/CD8-Quotient kann bestimmt werden, der das Verhältnis der T-Helferzellen zu den zytotoxischen T-Zellen angibt. Der Normwert liegt bei 0,7 3,5 (Tabelle 2) (58). 16

17 Eine Studie zur Diagnostik interstitieller Pneumonien konnte nachweisen, dass die Sensitivität der Durchflusszytometrie bei 53% liegt. Im Gegensatz dazu liegt die Sensitivität der Immunhistochemie bei 42,8% (63). Das Vorliegen einer lymphozytären Alveolitis mit einem CD4/CD8-Quotienten von über 3,5 weist mit einer Spezifität von über 80% und einer Sensitivität von 59% auf eine Sarkoidose hin (35). Studien konnten belegen, dass der CD4/CD8-Quotient bei einigen Patienten mit einer Sarkoidose nicht signifikant erhöht ist und bei einer EAA nicht signifikant erniedrigt ist. Des Weiteren kann der Quotient je nach Stadium der Erkrankung variieren und ist vom Alter des Patienten abhängig (62). Erniedrigte CD4/CD8Quotienten können bei einer EAA, medikamenten-induzierten Lungenerkrankung, BOOP, eosinophilen Pneumonie und IPF beobachtet werden (60). Die Gesamtzellzahl ist im Differentialzellbild von Rauchern erhöht. Die Makrophagen erscheinen mikroskopisch mit sphärischen dunklen Inklusionskörpern als Rauchermakrophagen (Abbildung 1b). Der CD4/CD8-Quotient ist erniedrigt (94). Abbildung 1: Normaler BAL-Zellbefund bei Nichtrauchern (a) und bei Rauchern (b). Im Folgenden werden Befundkonstellationen der BAL dargestellt. Die Befunde richten sich nach den Veränderungen in der BAL-Differentialzytologie und können diagnoseweisend sein. Es werden neben einer Lymphozytose, Neutrophilie, Eosinophilie weitere BAL-Befunde in der laboranalytischen Untersuchung dargestellt und dabei auf häufige Krankheitsbilder eingegangen. 17

18 1.4.1 Lymphozytose Sarkoidose Als granulomatöse Systemerkrankung kann die Sarkoidose unterschiedliche Organe befallen, wobei die Lunge zu den häufigsten Manifestationen zählt. Während verschiedene Einflussfaktoren diskutiert werden, ist die Ätiologie ist derzeit noch unklar (56). Anhand der BAL konnten immunologische Erkenntnisse gewonnen werden. Beispielsweise spielen T-Lymphozyten, die Zytokine wie Interleukin-2 (IL- 2) und Interferon gamma (IF-γ) freisetzen, in der Pathogenese der Erkrankung eine wichtige Rolle und konnten anhand der Bronchoskopie und BAL erforscht werden (23, 71, 80). Für die Diagnose der Erkrankung existieren derzeit keine spezifischen Testverfahren. Das klinische Bild der Sarkoidose ist abhängig vom Verlauf und der Organmanifestation und wird durch die radiologische Untersuchung gestützt (35, 98). Mithilfe bronchoskopischer Untersuchungen, wie der transbronchialen Lungenbiopsie (TBLB) und TBNA ist es gelungen, die Indikation für chirurgisch invasive Verfahren signifikant zu reduzieren (47). Studien zufolge sollten die TBLB und die endobronchiale Lungenbiopsie als Standardverfahren in der Diagnostik genutzt werden, während die BAL zum Ausschluss anderer Erkrankungen dient (14). Im Differentialzellbild fällt zunächst ein Anstieg der Lymphozytenzahl auf (Abbildung 2) (21). Auch die Gesamtzellzahl ist erhöht, während die Zahl der eosinophilen Granulozyten und in den meisten Fällen auch der neutrophilen Granulozyten im Normbereich ist. Plasmazellen kommen nicht vor. Diese Konstellation lässt bereits ILE wie die EAA, NSIP und IPF ausschließen (35). In der Regel liegt eine Dominanz der CD4-Zellen vor, mit der Folge eines erhöhten CD4/CD8-Quotienten, der zu diagnostischen Zwecken in der Pneumologie erfolgreich genutzt werden kann. In 50-60% der Fälle ist der CD4/CD8-Quotient erhöht (35). Die Spezifität eines CD4/CD8-Quotienten über 3,5 liegt bei 95,9%, wobei die Sensitivität lediglich bei 52% liegt (35, 91). Der Anstieg des CD4/CD8- Quotienten auf mindestens 2, bei gleichzeitigem Vorhandensein von höchstens 1% neutrophilen Granulozyten sowie höchstens 1% eosinophilen Granulozyten weist die selbe Sensitivität und den selben positiven prädiktiven Wert (93%) auf, wie die 18

19 TBLB mit dem Befund multipler nicht verkäsender Granulome für die Differenzierung der Sarkoidose von anderen ILE. Die BAL hat im Gegensatz zur TBLB jedoch eine niedrigere Invasivität und niedrigere Komplikationsrate (99). Abbildung 2: Lymphozytäre Alveolitis in der BAL Exogen allergische Alveolitis (EAA) In der Diagnostik der EAA, eine durch organische Stäube verursachte Erkrankung, kann die BAL als Hilfsmittel genutzt werden. Im Vergleich zu anderen ILE weist die EAA die höchste Gesamtzellzahl in der BAL auf. Daneben findet sich ein erhöhter Anteil an Lymphozyten. In der akuten Phase der EAA kommt es zu einer Neutrophilie und Eosinophilie in der BAL (24, 36). Die Alveolarmakrophagen sind schaumig verändert und heterogen (25). Weiterhin kann eine Mastzellvermehrung und Plasmazellen im Differenzialzellbild beobachtet werden. In der Regel ist der CD4/CD8-Quotient erniedrigt, wobei auch ein erhöhter Quotient bei der chronischen Form vorkommen kann und eine EAA nicht ausschließt (24, 50, 52, 60). Studien konnten zeigen, dass das Differentialzellbild der EAA vom Zeitpunkt der Antigenexposition und der Durchführung der BAL abhängig ist (36). 19

20 Berylliose Von einer Berylliumexposition kann in bestimmten Industriezweigen ausgegangen werden, sodass die Arbeitsanamnese Hinweise für Diagnose gibt (24). Den aktuellen Leitlinien zufolge kann durch den Lymphozytentransformationstest im peripheren Blut oder in der BAL eine Berylliose diagnostiziert werden. Die Sensitivität dieses Tests für den Nachweis einer Sensibilisierung liegt bei bis zu 68% und die Spezifität bei 97%. Der Nachweis nicht nekrotisierender Granulome kann durch Symptome oder andere Befunde, die mit einer Berylliose vereinbar sind, ersetzt werden (26) Vaskulitiden Die Rolle der Bronchoskopie in der Diagnose von Vaskulitiden ist dadurch gekennzeichnet, dass alveoläre Hämorrhagien oder Infektionen ausgeschlossen werden können. Weiterhin kann anhand der BAL eine Eosinophilie im Differentialzellbild diagnostiziert werden. Während eine TBLB selten durchgeführt wird, können endobronchiale Läsionen durch Biopsieentnahme wegweisend sein (12). Eine Lungenbeteiligung kann häufig bei primären idiopathischen Kleingefäßvaskulitiden und Anti-Neutrophilen-Cytoplasmatische-Antikörper (ANCA)-assoziierten Vaskulitiden, wie beispielsweise Granulomatose mit Polyangitis (GPA), mikroskopische Polyangitis (MPA) und CSS beobachtet werden. Bei einer GPA können röntgenologisch auffällige Rundherde oder fokale Milchglasmuster mit einer BAL-Lymphozytose bei CD4-Zellerhöhung assoziiert sein. Eine Neutrophilie kann im Rahmen einer Pneumonitis beobachtet werden (85) Kollagenosen Die klinische Manifestation einer Kollagenose kann eine ILE sein (8). Es werden sowohl im HRCT-Befund, als auch histologisch neben dem häufigeren NSIP- auch das UIP-Muster beobachtet (6). Da das UIP-Muster auch bei IPF-Patienten vorkommt, ergibt sich die Frage der routinemäßig durchzuführenden serologischen Untersuchung bei IPF-Patienten. Die S2K-Leitlinie zur Diagnostik der IPF empfiehlt 20

21 die Untersuchung auf Rheumafaktor, Antikörper gegen zyklisch-zitrullinierte Peptide und antinukleäre Antikörper (ANA) routinemäßig durchzuführen. Hierbei ist zu beachten, dass auch bei IPF-Patienten ein schwach positiver ANA-Titer vorkommen kann und diese Patienten gezielt auf Kollagenosen untersucht werden sollten (8). Die BAL-Befunde sind unterschiedlich und spielen daher in der Diagnostik nur eine begrenzte Rolle. Sie können jedoch Hinweise auf eine pulmonale Manifestation geben und andere Erkrankungen wie Infektionen ausschließen. Häufig ist die Neutrophilenzahl erhöht, die von einer Eosinophilie begleitet sein kann. Die Lymphozytenzahl ist im Regelfall höher als bei der IPF (6) Arzneimittelinduzierte Lungeninfiltrate Neben verschiedenen Risikofaktoren und pathogen wirkenden Substanzen, wie organischen und anorganischen Stäuben, können eine Reihe von Medikamenten zu Lungenerkrankungen führen. Medikamente, die zu ILE führen können sind Bleomycin, Busulfan, Cyclophosphamid, Methotrexat und Nitrofurantoin (87). In bis zu 10% werden unter der Einnahme von Chemotherapeutika Lungenschäden nachgewiesen. In einer Studie zur Bleomycin Wirkung auf die Lunge konnte gezeigt werden, dass in 8-10% Lungeninfiltrate vorliegen (44). Neuere Studien an Patienten mit gesichertem Hodgkin-Lymphom beschreiben eine signifikante Abnahme der 5- Jahres Überlebensrate bei Patienten mit einer Bleomycin induzierter pulmonaler Toxizität (55). Studien zufolge liegt bei arzneimittelinduzierten Lungeninfiltraten eine lymphozytäre Alveolitis mit einem Ungleichgewicht an T-Lymphozyten vor. Dieses Ungleichgewicht ist durch eine Dominanz der CD8-Lymphozyten zu erklären. Ein Übergewicht an CD4-Lymphozyten konnte bei Untersuchungen zu Methotrexat beobachtet werden. Makrophagen können durch die Einnahme von Amiodaron schaumig verändert sein (6). Die BAL kann zusammen mit der Anamnese und der röntgenologischen Untersuchung des Patienten die Diagnose der arzneimittelinduzierten Lungeninfiltrate stützen. Gleichzeitig können andere Lungenerkrankungen wie Metastasen, kardiologisch bedingte oder infektiöse Ursachen ausgeschlossen werden (22). 21

22 Lungentumore Die flexible Bronchoskopie ist eine der wichtigsten und sichersten diagnostischen Mittel in der Pneumologie zur Diagnostik des peripheren Bronchialkarzinoms. Neben der transbronchialen Zangenbiopsie für die histologische Untersuchung, können für die zytologische Diagnostik Bürstenabstriche, Feinnadelaspiration und die BAL angewendet werden. Generell steigt die diagnostische Sicherheit der Histologie mithilfe des zytologischen Befundes (38). Die zytologische Treffsicherheit von Karzinomen stieg in einer Vergleichsstudie zur Lavage- Durchführung vor und nach einer Biopsieentnahme signifikant an (92). Durch die Aufarbeitung der BAL gelingt es im Labor neoplastische Veränderungen nachzuweisen. Diese können neben primären Lungenkarzinomen, Hodgkin- Lymphome, Non-Hodgkin-Lymphome oder Metastasen sein (48, 78). Ein disseminierter oder diffuser Befall der Lunge mit malignen Zellen kann bei endoskopischer Sicht unauffällig sein. Die Wahrscheinlichkeit anhand der BAL in Fällen des Adenokarzinoms, bronchoalveolären Karzinoms oder bei lymphatischem Wachstum eine Diagnose zu stellen, liegt bei über 80% (75). Neben der BAL kann bei V. a. ein bronchoalveoläres Karzinom die Sputumzytologie oder TBLB hilfreich sein. Diese machen eine chirurgische Lungenbiopsie häufig überflüssig (60). Beim bronchoalveolären Karzinom, Adenokarzinomen und Tumoren > 3cm Durchmesser hat sich die BAL also als nützlich erwiesen. Dennoch ist die Rolle der Bronchoskopie mit BAL in der Diagnostik des peripheren Lungenherdes begrenzt (72). Das bronchoalveoläre Karzinom ist durch einen diffusen Befall der Lunge gekennzeichnet und radiologisch schwer von einer ILE zu unterscheiden. Als Hilfsmittel zum Nachweis eines bronchoalveolären Karzinoms dient die BAL und besitzt hierfür eine hohe Sensitivität von 93% (88). In B-Zell-Lymphomen und Mucosa-associated lymphoid tissue-lymphomen ist die Wahrscheinlichkeit eine Diagnose zu stellen ebenfalls hoch. Die morphologische Untersuchung wird durch die Immunhistochemie und molekulare Testverfahren unterstützt (75). Mithilfe der Oberflächenantigen-Diagnostik oder Polymerase- Kettenreaktion (PCR) gelingt anhand der Lavage eine Differenzierung zwischen B- und T-Zelllymphomen. Die Diagnostik monoklonaler B-Zellen in der BAL ist mit einer Spezifität von 97% mit einem Non-Hodgkin-Lymphom assoziiert. Demnach 22

23 kann mithilfe der BAL ein Non-Hodgkin-Lymphom ausgeschlossen und auf eine weitere Diagnostik, wie die histologische Untersuchung verzichtet werden (46, 101). In der Diagnostik der Hodgkin-Lymphome hingegen ist die BAL wenig hilfreich. Liegen pulmonale lymphozytäre Infiltrate durch chronisch lymphatische Leukämien in der BAL-Zytologie vor, können diese nicht nur diagnostiziert werden, sondern auch von Infiltraten durch beispielsweise einer Sarkoidose differenziert werden (75). Die frühzeitige Diagnose von Lungenkarzinomen bleibt unbefriedigend. Biomarker nehmen in der Frühdiagnose eine zunehmend wichtige Rolle ein. Eine wissenschaftliche Studie untersuchte verschiedene Biomarker, die mit einer Sensitivität von 95% ein Karzinom nachweisen und anhand der BAL untersucht werden konnten (95) Bronchitis obliterans mit organisierender Pneumonie (BOOP)/ Kryptogen organisierende Pneumonie (COP) Die BOOP oder COP nimmt besonders differentialdiagnostisch eine wichtige Rolle in der Diagnose der ILE ein. In der BAL ist eine Erhöhung der Gesamtzellzahl zu beobachten, wobei eine Lymphozytose im Vordergrund steht. Daneben finden sich auch eine Eosinophilie, Neutrophilie, schaumige Makrophagen, Mastzellvermehrung und Plasmazellen. Der CD4/CD8-Quotient ist erniedrigt (25). In Studien lag die Spezifität der BAL und TBLB ähnlich hoch bei 63% und 64%, sodass auf eine Biopsieentnahme häufig verzichtet werden kann (74) Neutrophilie Idiopathische Lungenfibrose (IPF) Der BAL-Befund der IPF ist unspezifisch und dient der differentialdiagnostischen Abgrenzung zu anderen ILE. Es dominiert eine neutrophile Alveolitis, die von einer Eosinophilie begleitet sein kann (Abbildung 3) (50). Das Vorliegen einer leichten Lymphozytose (< 30%) ist mit dem Bild der IPF vereinbar, während eine stärkere Lymphozytose den Verdacht auf eine EAA lenkt und weiter untersucht werden sollte (8). 23

24 Die histologische Klassifikation der IIP erlaubt eine prognostische Einschätzung der IPF. Patienten, die histologisch ein UIP-Muster aufweisen, haben im Gegensatz zu denen mit einem NSIP-Muster eine schlechtere Prognose. Das NSIP-Muster geht mit einer Lymphozytose und einer leichten Neutrophilie in der BAL einher. Das Differentialzellbild ähnelt dem einer BOOP, die eine ähnlich gute Prognose aufweist (6). Trotzdem ist der Stellenwert der BAL in der Einschätzung der Prognose der IPF nicht vollständig geklärt. Studien konnten beobachten, dass zirkulierende Fibrozyten ein Prädiktor für ein schlechteres Kurzzeitüberleben sind (8, 64). Biomarker zur Diagnose, Prognose und zum Therapieverlauf der IPF werden zunehmend durch Studien anhand der BAL, Blut und anderen Gewebsproben untersucht (97). Ein erhöhter Serumspiegel des Krebs von den Lungen-6 (KL-6) und des Brain Natriuretic Peptide (BNP) beispielsweise gehen mit einem erhöhten Risiko nachfolgender Mortalität einher. Der relative Stellenwert der Biomarker ist derzeit unklar und sollte in zukünftigen Studien untersucht werden (8). Abbildung 3: Neutrophilenvermehrung in der BAL Pneumokoniosen Der Nachweis von Asbestkörperchen ist beweisend für eine Asbestexposition, jedoch nicht für eine manifeste Lungenerkrankung durch Asbest. Außerdem kann bei einem negativen Befund eine Asbestose nicht ausgeschlossen werden (16). Auch das 24

25 Zellmuster in der BAL mit einem vermehrten Auftreten von neutrophilen Granulozyten ist nicht charakteristisch und kann somit eine Asbestose nicht beweisen (21). Der lichtmikroskopische Nachweis in der BAL gilt dennoch als sensitivstes Verfahren zum Nachweis von Asbestfasern, falls keine Lungenbiopsie zur Verfügung steht (16, 96). Schließlich dient es als Hilfsmittel in der Differenzialdiagnose ILE. Auch die Silikose zählt zu den Berufskrankheiten, die durch anorganische Stäube verursacht werden. Der BAL Befund ist nicht beweisend für die Diagnose der Silikose, kann jedoch ein diagnostisches Hilfsmittel sein. Es kann eine erhöhte Makrophagenzahl, normale oder erhöhte Neutrophilenzahl, Lymphozytose und ein erniedrigter CD4/CD8-Quotient beobachtet werden (62) Eosinophilie Eosinophile Pneumonie Die eosinophile Pneumonie ist eine ILE, dessen Leitsymptom eine Eosinophilie in der BAL ist. Man unterscheidet eine akute und eine chronische Form. In der BAL sind die eosinophilen Granulozyten mit einem Anteil von mehr als 25% im Differenzialzellbild vertreten und der CD4/CD8-Quotient kann erniedrigt sein (6, 60, 62). In einer retrospektiven Untersuchung, die sich mit den eosinophilen Granulozyten in der BAL bei Patienten mit einer akuten eosinophilen Pneumonie befasste, lag der Median bei 37% (1). Des Weiteren können bei der akuten Form auch die Lymphozyten im Durchschnitt mit 20% und die neutrophilen Granulozyten mit 15% erhöht sein (9). Zusammen mit dem klinischen Bild und dem HRCT- Befund ist die BAL als diagnostisches Mittel ausreichend (11). In der BAL findet sich bei einer chronisch eosinophilen Pneumonie ebenfalls ein Anstieg der eosinophilen Granulozyten. Die Lymphozyten und neutrophilen Granulozyten befinden sich im Normbereich (9, 13). 25

26 Abbildung 4: Eosinophile und neutrophile Granulozyten in der BAL Churg-Strauss-Syndrom (CSS) Die CSS ist mit einer Eosinophilie assoziiert, die sowohl in der BAL mit > 3%, als auch in der Laboruntersuchung auftritt. Die Erkrankung ist ähnlich wie die GPA und die MPA mit ANCA assoziiert (60, 84). In der Laboruntersuchung gelingt der Nachweis von cytoplasmatischen Anti-Neutrophilen-Cytoplasmatischen-Antikörpern (c-anca) und perinukleären Anti-Neutrophilen-Cytoplasmatischen-Antikörpern (panca) bei 70% der Patienten. Zur Diagnosesicherung dient der histologische Nachweis eosinophiler Infiltrate im Gewebe (50, 54). Die Bronchoskopie dient an erster Stelle dazu Infektionen auszuschließen oder alveoläre Hämorrhagien nachzuweisen, die bei ANCA-assoziierten Vaskulitiden auftreten können. Die alveoläre Hämorrhagie fällt durch eine blutige Lavage auf (12) Hypereosinophiles Syndrom (HES) Das HES stellt eine seltene Systemerkrankung dar, die mit einer anhaltenden Bluteosinophilie von länger als 6 Monaten einhergeht. Zu den Diagnosekriterien zählt eine Eosinophilie > 25% im Differenzialblutbild der BAL. Zur Diagnosesicherung können eine pathologische Lungenfunktion, Biopsie und ein HRCT-Befund herangezogen werden (50, 52). 26

27 1.4.4 Weitere BAL-Befunde BAL bei immunsupprimierten Patienten Das hohe Risiko von Immunsupprimierten für das Auftreten pulmonaler Infekte bedarf einer raschen Diagnostik und Therapie. Studien konnten belegen, dass die BAL in der Erregerdiagnostik von HIV-Patienten eine Rolle spielt, da bei diesen häufig Mykobakterien nachgewiesen werden können. Auch wenn eine Infektion mit Mykobakterien in anderen Fällen der Immunsuppression selten ist, kann sich eine Diagnose anhand der BAL manchmal als nützlich erweisen (43). Die im Regelfall durchgeführten Untersuchungen, wie bildgebende Verfahren, Sputumuntersuchung auf säurefeste Stäbchen und der kulturelle Nachweis können trotz einer Infektion negativ sein. Die Nukleinsäure-Amplifikationstechniken sind sensitiv und erlauben eine Differenzierung zwischen tuberkulösen und nicht tuberkulösen Mykobakterien (52, 54). Die BAL nimmt eine tragende Rolle ein, wenn bei klinischem und radiologischem Verdacht negative Sputa vorliegen. Gemeinsam mit der TBLB weist sie eine hohe Sensitivität von 84% auf. Im Zellbild und der Durchflusszytometrie fällt eine Lymphozytose mit niedrigem CD4/CD8-Quotienten auf (42). Des Weiteren eignet sich die BAL bei immunsupprimierten Patienten zum Nachweis von Erregern, wie dem Zytomegalievirus und Aspergillus (43, 60). Patienten mit hämatologischen und onkologischen Erkrankungen haben ein erhöhtes Risiko für Infektionen wie die invasive pulmonale Aspergillose (IPA) und Pneumocystsisjirovecii-Pneumonie (PJP). Die Diagnose der IPA und PJP konnte anhand der BAL bei 65% und 93% der Patienten gestellt werden (90). Die Sensitivität der BAL für die Diagnose der IPA war in älteren Studien variabel und lag lediglich bei 50% oder niedriger (51). Anhand der BAL ist neben dem zytopathologischen und kulturellen auch der Antigennachweis möglich. Der Galactomannan-Test kann eine frühzeitige Diagnose der IPA ermöglichen. Der Nachweis aus der BAL weist eine höhere Sensitivität und die gleiche Spezifität auf, wie der Nachweis aus dem Serum (28, 51, 59). Zusätzlich können ein Enzymimmuonassay und eine quantitative real-time Polymerase-Kettenreaktion (qpcr) die diagnostische Sicherheit erhöhen (65). Die qpcr aus der BAL erleichtert auch die Interpretation der PJP besonders bei immunsupprimierten Patienten. Die Methode weist hierfür eine Sensitivität und Spezifität von 100% und 91% auf (15). 27

28 Langerhanszell-Histiozytose Bei den meisten Patienten mit einer Langerhanszell-Histiozytose ist die Gesamtzellzahl in der BAL erhöht. Das vermehrte Vorkommen von Alveolarmakrophagen, insbesondere der Rauchermakrophagen, kann ein Hinweis auf das Vorliegen einer Langerhanszell-Histiozytose sein. Beide Zellbefunde sind zunächst nur Hinweise für eine positive Raucheranamnese, da bei Nichtrauchern beides nicht vorliegt. In der Differentialzytologie kann ein Eosinophilie und Neutrophilie beobachtet werden, während die Lymphozytenzahl erniedrigt oder unverändert ist. Der CD4/CD8-Quotient ist ebenfalls erniedrigt bei Rauchern (93). Studien konnten belegen, dass der Nachweis von CD1-Zellen in der BAL eine sinnvolle Untersuchung für die Diagnosestellung ist (5). Über 4% CD1-Zellen in der BAL weisen mit einer Sensitivität von 50% eine Langerhanszell-Histiozytose des Patienten nach (60, 62). Aufgrund der niedrigen Sensitivität dieses Tests, ist häufig der histologische Nachweis erforderlich. Schließlich nimmt die BAL in der Differenzialdiagnose und bei Patienten mit unklarem radiologischen Befund eine wichtige Rolle ein (93) Alveolarproteinose In der Diagnostik der Alveolarproteinose stellt die BAL den Goldstandard dar. Bereits die makroskopische Untersuchung der Lavage kann einen Hinweis auf die Erkrankung geben. Die Lavage-Recovery erscheint milchig trüb oder hellbraun bis weißlich mit Flocken, welche sich besonders nach dem Zentrifugieren darstellen. Bestätigt wird der V. a. eine Alveolarproteinose, indem das Sediment mit der periodic acid Schiff (PAS) Färbung untersucht wird (60). Charakteristisch erscheinen extrazelluläre PAS-positive Korpuskeln aus hyalinem Material. Die Alveolarmakrophagen können schaumig verändert sein und eosinophile Granula enthalten. Der Nachweis von Anti-Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) Antikörpern ist spezifisch für eine autoimmune Form der Alveolarproteinose (10). Therapeutisch stehen verschiedene Ansätze zur Verfügung. Die Methode der Wahl bei symptomatischen Patienten stellt die therapeutische Lavage dar. Schon nach wenigen Tagen kann in 75-95% der Fälle eine Besserung der Symptome, der 28

29 Sauerstoffkapazität, sowie der radiologischen Befunde beobachtet werden. Alternative und ergänzende Therapiemöglichkeiten stellen GM-CSF, Rituximab, Plasmapherese oder die Stammzelltherapie dar (81) Alveoläre Hämorrhagien In der Diagnose der diffusen alveolären Hämorrhagien (DAH) können die klinischen Symptome des Patienten in Form von Hämoptysen und intermittierenden Dyspnoen erste Hinweise geben. Die Bronchoskopie mit BAL hat sich in der Diagnose der DAH als nützlich erwiesen. Die DAH fällt bereits makroskopisch durch eine zunehmende Rotfärbung der Lavageflüssigkeit auf (52, 86). Die Makrophagen erscheinen bei älteren Blutungen rostbraun, was sich durch den hohen Hämosideringehalt erklärt. Mikroskopisch können Erythrozytenfragmente im Zytoplasma der Makrophagen auffallen (52, 94). 1.5 Zielsetzung der Arbeit Die Durchführung der BAL und die Verarbeitung der gewonnenen Lavageflüssigkeit werden weltweit unterschiedlich gehandhabt. Es wurden immer wieder Empfehlungen aus verschiedenen Institutionen versandt, wobei es jedoch keine allgemeingültigen Standards gibt. In den meisten Fällen ergeben sich die wichtigsten Informationen durch die Analyse im Labor. Eine Reihe von Einflussfaktoren kann die Analyse im Labor stören. Das Gefrieren, Kühlen und Lagern von Lavage-Proben ist verbreitet, falls die Verarbeitung nicht sofort erfolgen kann. Verzögerungen können entstehen, wenn Institutionen nicht über ausreichende Kapazitäten für die Verarbeitung der BAL-Proben verfügen und diese in externe Labore transportiert werden müssen. Eine weitere Ursache können Wartezeiten im Labor sein. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die zytologische Aufarbeitung der BAL-Proben bei Raumtemperatur, unter gekühlten Bedingungen und nach 24 Stunden zu untersuchen und zu vergleichen. Der Fokus bei der Untersuchung lag neben der zytologischen Untersuchung auch auf der Untersuchung der Oberflächenantigene der T-Lymphozyten anhand der Durchflusszytometrie. Die aus der BAL gewonnene Flüssigkeit wurde aufgeteilt. Die mikroskopische Auswertung und 29

30 Durchflusszytometrie von zwei Proben geschah zeitnah. Hierbei wurde der Einfluss der Temperatur auf die Zellen untersucht, indem eine Probe bei Raumtemperatur und die andere unter gekühlten Bedingungen (4 C) gelagert wurden. Die zeitliche Komponente wurde anhand einer weiteren Probe nach 24 Stunden ausgewertet. 30

31 2 Material und Methoden Dieses Kapitel beschreibt Methoden und Eigenschaften der Studie. In 2.1 ist das Patientenkollektiv beschrieben, von der die BAL-Proben analysiert wurden. 2.2 beschreibt die Durchführung der BAL und 2.3 die Aufarbeitung der BAL-Proben im Labor bis hin zur mikroskopischen Analyse und Durchflusszytometrie. 2.1 Patientenkollektiv Die Patientenauswahl erfolgte aus einem Patientenkollektiv mit 30 Patienten aus der Sektion Pneumologie der Asklepios Klinik Altona in Hamburg, bei dem im Zeitraum von 2013 bis 2015 die Indikation zur Durchführung der BAL bestand. Ein Votum war nach Rücksprache mit der zuständigen Ethikkommission der Ärztekammer Hamburg nicht erforderlich. Es erfolgte aber die Anzeige der Studie bei der Ethikkommission. Eine schriftliche Einwilligung der Patienten zum Einschluss in die Studie wurde nach Aufklärung eingeholt. 2.2 Bronchoalveoläre Lavage Nach einer Sedierung mit Midazolam und/oder Disoprivan in Kombination mit Pethidin wurde die BAL in transnasaler oder transoraler Technik durchgeführt. Das flexible Bronchoskop wurde bevorzugt in den Mittellappen oder die Lingula vorgeschoben und in Wedge-Position gebracht. Bei Vorliegen eines auffälligen radiologischen Befundes wurde das entsprechende Segment lavagiert. Insgesamt wurden Milliliter (ml) angewärmte Kochsalzlösung in 20 ml Fraktionen instilliert. Das Absaugventil wurde nach jeder Fraktion geöffnet und die Flüssigkeit mit einem sanften Sog aspiriert. Schließlich wurde das entnommene Probematerial in zwei Silikon- oder Polyethylen- Behälter verfrachtet. Diese verhinderten, dass Zellen an einer Glasoberfläche haften. Zusammen mit einem Begleitschein zu Angaben der klinischen Fragestellung wurde die BAL unter gekühlten Bedingungen und bei Raumtemperatur zur weiteren Untersuchung ins Labor transportiert. 31

32 2.3 Aufarbeitung im Labor Die Aufarbeitung im Labor der Asklepios Klinik Altona erfolgte nach einem festgesetzten Protokoll. Auf einem BAL-Befundbogen wurden die Ergebnisse dokumentiert. Eine zeitnahe Aufarbeitung mit einer Wartezeit von maximal Minuten verhinderte das unnötige Verweilen der Zellen in der Kochsalzlösung. Die makroskopische Untersuchung der BAL-Proben (30 ml Röhrchen, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) gab bereits erste diagnostische Hinweise wie Schleim, Blut oder Flocken. Im nächsten Schritt wurden die BAL-Proben durch eine sterile Lage Mull in je zwei 15 ml-röhrchen (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) gefiltert, sodass Schleimpartikel entfernt wurden. Im Anschluss bewirkte die Zentrifugierung (Heraeus Instruments GmbH, Hanau, Deutschland) eine Konzentrierung des Zellmaterials bei 1000 Umdrehungen/Minute und 8 C für 15 Minuten. Nach vorsichtiger Abnahme des Überstandes wurden die Sedimente aufgeschüttelt. Der Füllmenge entsprechend wurden 10:1 Stain Buffer (Dulbecco s Phosphate Buffered Saline (DBPS), 0,2% bovine serum albumin (BSA) / 0,09% SODIUM AZIDE NaN3, ph 7,4. BD Biosciences, San Diego, USA) dazu pipettiert und die Sedimente somit resuspendiert. Die bis hierhin beschriebenen Aufarbeitungsschritte wurden bei allen Proben durchgeführt. Sowohl bei denen, die bei Raumtemperatur transportiert wurden, als auch bei den gekühlten Proben. Die weiteren Schritte wurden entweder direkt im Anschluss an die BAL oder nach Lagerung der Proben (bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank) für 24 Stunden durchgeführt Bestimmung der Gesamtzellzahl und Differenzierung der Zellen mit dem Sysmex-Gerät Mit einer Transferpipette wurden die BAL-Proben in Spitzenröhrchen übertragen und zum Sysmex-Gerät (Sysmex Corporation, Kobe, Japan) transportiert. Dort erfolgte die Bestimmung der Gesamtzellzahl und eine Differenzierung zwischen mononukleären und polynukleären Zellen im Body Fluid Modus. Hierzu wurden die Proben von Spitzenröhrchen in Eppendorfer Hüttchen gefüllt und in das Sysmex- Gerät geschoben. Das Sysmex XN1000-Gerät ermöglichte es Körperflüssigkeiten im 32

33 Body Fluid Modus standardisiert zu messen Herstellung von Cytospin Präparaten mit der Zytozentrifuge Die Proben wurden zur Zytozentrifuge SHANDON Cytospin 4 (Thermo Scientific, Runcorn, UK) transportiert, wo je zwei Präparate für die mikroskopische Untersuchung hergestellt wurden. Pro Material wurden zwei Objektträger (Engelbrecht Medizin und Laborgesellschaft GmbH, Edermüde, Deutschland) beschriftet und die Probematerialien in die anliegenden Trichter gefüllt. Die Zytozentrifuge wurde für 8 Minuten bei 1300 Umdrehungen/Minute bei mittlerer Beschleunigung gestartet. Schließlich waren die Objektträger mit Sedimentationsstellen hergestellt. Während die Objektträger mit den Sedimentationsstellen für Minuten luftgetrocknet wurden, wurde das übriggebliebene Sediment inklusive Stain Buffer in den Kühlschrank gestellt und konnte innerhalb von 6 Stunden für die Lymphozytendifferenzierung genutzt werden Pappenheim-Färbung und Mikrobielle Auswertung Nach Minuten erfolgte die automatische Färbung mit Pappenheim mit dem SP 1000 i Ausstrich und Färbeautomaten (Sysmex Deutschland GmbH, Norderstedt, Deutschland). Die gefärbten Proben konnten anschließend mikroskopisch untersucht werden. Nach Auftropfen von Immersionsöl, folgte die Zählung von 400 Zellen und die Unterteilung in Alveolarmakrophagen, Lymphozyten, neutrophile und eosinophile Granulozyten, Mastzellen und sonstige Zellen. Die mikroskopische Untersuchung erfolgte in der Asklepios Klinik Altona innerhalb einer sehr kurzen Zeitspanne, da eine Durchflusszytometrie des Überstandes der gewonnen Lavage-Flüssigkeit 6 Stunden nach Probeentnahme erfolgen sollte. Im Zellbild dominieren bei gesunden Menschen mit > 80% Alveolarmakrophagen und < 15% Lymphozyten. Wohingegen < 5% neutrophile Granulozyten und < 1% eosinophile Granulozyten vorhanden sind. Lediglich 1% Mastzellen sind im Zellbild 33

34 vertreten (Tabelle 1). Bei Rauchern hingegen findet sich eine Erhöhung der Gesamtzellzahl (< /ml) (58). Tabelle 1: Befundtabelle der Zellen in der BAL bei Nichtrauchern. Zytologie Referenzbereich Gesamtzellzahl < /ml Alveolarmakrophagen > 80% Lymphozyten < 15% Neutrophile < 5% Eosinophile < 1% Mastzellen < 1% (Modifiziert nach (58)) Durchflusszytometrie Die Durchflusszytometrie diente der Erfassung und Quantifizierung von Zellen nach ihren physikalischen und fluoreszenzoptischen Eigenschaften. Die Methode kam dann zum Einsatz, wenn in der mikroskopischen Analyse der Zellen mehr als 15% Lymphozyten an der Gesamtzellzahl vorkamen. Die Lymphozyten konnten mithilfe ihrer Antigene unterschieden werden und erlangten somit Bedeutung in der Diagnosestellung. Um die absolute Zellzahl der Lymphozytensubpopulationen zu berechnen, wurde mithilfe eines hämatologischen Zellzählsystems, unter Berücksichtigung der zuvor ermittelten relativen Zellzahl, der absolute Wert berechnet (Dual Plattform). Die Untersuchung erfolgte im Labor der Asklepios Klinik Altona mit der BD FACS- Canto II-Software (BD Biosciences, San Jose, USA). Zuvor wurde den Proben die BD FACS Lysing Solution (BD Biosciences, San Jose, USA/ Benex Limited, Dun Laoghaire, Ireland) zugesetzt, um eine Erythrozytolyse zu induzieren. Diese war notwendig, um ein mögliches Hintergrundsignal durch eine Antikörperbindung an den Erythrozyten zu verhindern. Methode: 34

35 Zur Analyse war es notwendig, dass sich die Zellen hydrodynamisch, als feiner Flüssigkeitsstrahl perlschnurartig anordneten und auf einen Laserstrahl definierter Wellenlänge trafen. Wenn die Zellen den Laserstrahl passierten, wurden einerseits die entstehenden Streulichter und andererseits das emittierte Fluoreszenzlicht von Photodetektoren gemessen. Zu unterscheiden waren das Vorwärtsstreulicht (FSC= Forward Scatter) für die Zellgröße und das Seitwärtsstreulicht (SSC= Sidewards Scatter) für die Zellgranularität. Dadurch gelang zunächst eine morphologische Unterscheidung der Zellen, anhand der entstehenden Streulichter. Um die Zellen, insbesondere die Lymphozyten, anhand ihrer Antigene unterscheiden zu können, wurden diese mit fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörpern markiert. Dafür wurden 20 Mikroliter (µl) Antikörper-Pool (BD Multitest 6-Color TBNK, BD Biosciences, San Jose, USA) zu 50 ml Lavageflüssigkeit hinzugegeben. Die im Folgenden aufgezählten Fluoreszenzfarbstoffe wurden durch einen fokussierten Laserstrahl zur Fluoreszenz angeregt: Fluorescein Isothiocyanate (FITC), Phycoerythrin (PE), Peridin-Chlorophyl-A-Protein (PerCP 5,5), Allophycocyanin (APC), PE+ cyanine dye (PE Cy7), APC+ cyanine dye (ApC Cy7) (Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland). Die Intensität des Fluoreszenzsignals lässt auf die Expressionsstärke des Antigens schließen. Die Normbereiche der Lymphozytensubpopulationen für Erwachsene sind in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2: Befundtabelle der Oberflächenantigene in der BAL bei Nichtrauchern. Immunphänotypisierung % CD3-T-Lymphozyten CD3/CD8-Zellen CD3/CD4-Zellen CD4/CD8-Quotient 0,7 3,5 (Modifiziert nach (58)). Im Rahmen der Messung erstellte das Gerät eine Grafik, sogenannte Streulicht-Dot- Plots, wobei die x-achse die Vorwärts- und die y-achse die Seitwärtsstreuung beschrieben. Die Häufigkeitsverteilung der Zellen entsprechend ihrer Signalstärke wurde in einem zweidimensionalen Diagramm dargestellt. Neben den Lymphozyten, welche wenig Granula haben und klein waren, waren große Monozyten und große 35

36 neutrophile Granulozyten mit viel Granula unterscheidbar. Durch das sogenannte Gating gelang es in den nachfolgenden Untersuchungen nur die Lymphozyten zu berücksichtigen. Das farbliche Fluoreszenzsignal erlaubte die Antikörper markierten Lymphozyten zu identifizieren, indem eine Fluoreszenz-Dot-Plot-Grafik erstellt wurde. Jeder Punkt auf den Dot-Plots entsprach einer Zelle. Eine Einteilung unter Berücksichtigung der Fluoreszenzeigenschaften gelang mithilfe der Kompensationseinstellung. Die Einstellung bewirkte, dass Überlappungen von Fluoreszenzsignalen korrigiert werden konnten. Diese entstanden durch positiv erscheinende Fluoreszenzsignale in anderen Detektoren. Schließlich konnten einfach positive (links oben und rechts unten), doppelt positive (rechts oben) und Zellen mit Eigenfluoreszenz (links unten) unterschieden werden (Abbildung 5). Neben der Eigenfluoreszenz der Zellen konnte auch eine unspezifische Antikörperbindung der Grund dafür sein, dass sich die Zellen im Bereich links unten befanden. Abbildung 5: Dot-Plot-Grafik für CD4- und CD8-Zellen. Auf der x-achse die APC-Cy7-A-Fluoreszenz (gelb) und auf der y-achse die PE-Cy7-A- Fluoreszenz (blau). Zellen, die mit beiden Antigenen (CD4 und CD8) markiert sind befinden sich oben rechts (lila). CD4 positive Zellen sind oben links und CD8 positive Zellen unten rechts. 36

37 2.4 Statistik Die statistische Aufarbeitung der Daten erfolgte mit dem Programm IBM SPSS Statistics Version 21.0 (SPSS Incorporation, Chicago, USA) für Windows. Metrische normalverteilte Variablen wurden als Mittelwert und Standardabweichung und metrische nicht normalverteilte Variablen als Median und Interquartilrange (IQR) dargestellt. Zur graphischen Darstellung wurden Box- und Whisker-Plots verwendet, wobei die Box durch die 25%- beziehungsweise die 75%-Perzentile (erstes und drittes Quartil) begrenzt wurde. Der IQR entsprach somit der Länge der Box und markierte den Bereich, in dem 50% der beobachteten Ergebnisse lagen. Der Median (50%- Perzentile) entsprach dem mittleren Balken der Box. Die T-förmigen Ausläufer (oder Whisker) hatten maximal die 1,5-fache Länge des IQRs (Abbildung 6). Werte oberhalb der Whisker, sogenannte Ausreißer, wurden graphisch als Punkte dargestellt. Da viele Ergebnisse der Zellzählungen nicht normalverteilt waren, erfolgte eine nicht-parametrische Testung auf Unterschiede. Zur Testung auf Unterschiede zwischen zwei abhängigen Stichproben wurde der Wilcoxon-Test verwendet. Eine statistische Signifikanz wurde als p < 0,05 definiert. Abbildung 6: Legende zu den Box-Plots. 37

38 3 Ergebnisse Insgesamt wurden die BAL-Ergebnisse von 30 erwachsenen Patienten (17 Frauen, 13 Männer) untersucht, die zwischen 22 und 82 Jahren waren (Tabelle 3). Tabelle 3: Alter- und Geschlechtsverteilung der untersuchten Patienten. Geschlecht männlich weiblich Anzahl n=13 (43%) n=17 (57%) Alter (Median) Alter Minimum Alter Maximum Bei 27 Patienten wurden die BAL-Proben unter gekühlten Bedingungen (4 C) (kalt) und bei Raumtemperatur (warm) direkt aufgearbeitet. Diese wurden unter Gruppe A zusammengefasst. In Gruppe B wurden bei 10 Patienten die gekühlten Proben direkt (kalt) und nach 24 Stunden (24kalt) aufgearbeitet. Bei 8 Patienten wurden die bei Raumtemperatur aufbewahrten BAL-Proben direkt (warm) und nach 24 Stunden (24warm) im Labor aufgearbeitet. Diese wurden als Gruppe C definiert. In Gruppe D wurden die gekühlt und ungekühlt transportierten BAL-Proben nach Lagerung für 24 Stunden aufgearbeitet und verglichen. In Gruppe E mit 7 Patienten wurde nach der gekühlten und ungekühlten Aufarbeitung aufgrund der Lymphozytenzahl > 15% eine Durchflusszytometrie durchgeführt und die Ergebnisse untersucht (Tabelle 4). Tabelle 4: Einteilung der Patienten nach Aufarbeitungsmethode der BAL-Proben in die Gruppen A E. Gruppe Aufarbeitungsmethode der BAL-Probe A Kalte und warme Aufarbeitung 27 B Kalt und 24kalt 10 C Warm und 24warm 8 D 24kalt und 24warm 8 E Durchflusszytometrie: warm und kalt 7 Anzahl der Patienten Kalt= gekühlte Proben, warm= ungekühlte Proben, 24kalt= gekühlte Proben nach 24 Stunden aufgearbeitet, 24warm= ungekühlte Proben nach 24 Stunden aufgearbeitet. 38

39 3.1 Gruppe A: Vergleich der Ergebnisse der direkt aufgearbeiteten gekühlten und der ungekühlten BAL-Proben Zum besseren Vergleich der Ergebnisse sind im Folgenden die Mediane, Maximum (Max)- und Minimumwerte (Min) der Zellgruppen in Abhängigkeit der Aufarbeitungsmethode (warm/kalt) tabellarisch aufgelistet (Tabelle 5). Tabelle 5: Die Zellpopulationen der Gruppe A (kalt/warm) mit Angabe der Mediane und des Minimums und Maximums. Aufarbeitungsmethode der BAL-Probe Kalt (%) Warm (%) Alveolarmakrophagen Lymphozyten Neutrophile Granulozyten Eosinophile Granulozyten Mastzellen Median 61,50 54,50 Min 5 8 Max Median 7,50 5,50 Min 0 0 Max Median 14,75 26,75 Min 0 0 Max Median 1,00 1,50 Min 0 0 Max Median 0 0 Min 0 0 Max 0 1 Kalt= gekühlte Proben, warm= ungekühlte Proben, min= Minimum, max= Maximum. Die graphische Darstellung mithilfe von Box-Plots erfolgte in blau für die kalte Aufarbeitung und in orangefarben für die warme Aufarbeitung. 39

40 Abbildung 7: Alveolarmakrophagen in der BAL nach warmer und kalter Aufarbeitung (Darstellung in Box-Plots). Abbildung 8: Lymphozyten in der BAL nach warmer und kalter Aufarbeitung (Darstellung in Box-Plots). Bei den pro Methode 27 untersuchten Präparaten lag der Median der Alveolarmakrophagen bei der kalten Aufarbeitung bei 61,5 (5;95) und bei der warmen Aufarbeitung bei 54,5 (8;95) (Abbildung 7). Es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Aufarbeitungsmethoden festgestellt werden. Dennoch konnte beobachtet werden, dass bei ähnlichen Minimum- und Maximumwerten die kalte Aufarbeitung einen höheren Medianwert erreichte. 40

41 In Abbildung 8 ist die Anzahl der Lymphozyten nach warmer und kalter Aufarbeitung in der mikroskopischen Untersuchung im Labor dargestellt. Der Median lag höher bei der kalten (7,5) als bei der warmen Aufarbeitung (5,5). Die Lymphozytenzahl reichte bei der kalten Aufarbeitung von 0 bis 40 und bei der warmen bis 43. Es konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden. Abbildung 9: Neutrophile Granulozyten in der BAL nach warmer und kalter Aufarbeitung (Darstellung in Box-Plots). Abbildung 10: Eosinophile Granulozyten in der BAL nach warmer und kalter Aufarbeitung (Darstellung in Box-Plots). 41

42 Bei der mikroskopischen Untersuchung der neutrophilen Granulozyten lag der Median bei der warmen Aufarbeitungsmethode nahezu doppelt so hoch (26,75) als bei der kalten Aufarbeitung (14,75). Die maximalen Werte lagen bei beiden Aufarbeitungen ähnlich hoch (Abbildung 9). In der statistischen Auswertung stellte sich kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Methoden für die neutrophilen Granulozyten heraus. Für die eosinophilen Granulozyten lag der Median bei der kalten Aufarbeitung bei 1 bei der warmen Aufarbeitung bei 1,5. Das Minimum lag bei 0 und das Maximum bei 43 für die kalte und bei 33 für die warme Aufarbeitung (Abbildung 10). Es konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden. Abbildung 11: Mastzellen in der BAL nach warmer und kalter Aufarbeitung (Darstellung in Box-Plots). Die Mastzellen stellten sich in der Färbung nach Pappenheim dar, waren jedoch vergleichsweise wenig vertreten. Die Häufigkeit der Mastzellen in der BAL-Probe zeigte statistisch keine belegbaren Unterschiede in Abhängigkeit von den Aufarbeitungsbedingungen warm oder kalt. Bei beiden Methoden wiesen die Mastzellen einen Median, Minimal- und Maximalwert für die kalte Aufarbeitung von 0 auf. Der Maximalwert für die warme Methode lag bei 1 (Abbildung 11). 42

43 3.2 Gruppe B: Vergleich der Ergebnisse der direkten und der nach 24 Stunden aufgearbeiteten BAL-Proben unter gekühlten Bedingungen In Gruppe B wurden die BAL-Proben unter gekühlten Bedingungen zeitnah und nach 24 Stunden untersucht. Die statistische Auswertung präsentierte sich folgendermaßen (Tabelle 6). Tabelle 6: Die Zellpopulationen der Gruppe B (kalt/24kalt) mit Angabe der Mediane und des Minimums und Maximums. Aufarbeitungsmethode der BAL-Probe Kalt (%) 24kalt (%) Alveolarmakrophagen Median 51,25 46,75 Min 5 8 Max Lymphozyten Median 4 4,25 Neutrophile Granulozyten Eosinophile Granulozyten Min 0,25 0 Max Median 41,75 42,5 Min 2,5 0 Max Median 0,87 1,25 Min 0 0 Max 29,5 36 Mastzellen Median 0 0 Min 0 0 Max 0 2,5 Kalt= gekühlte Proben, 24kalt= gekühlter Proben nach 24 Stunden aufgearbeitet, min= Minimum, max= Maximum. Zur besseren Veranschaulichung sind die Box-Plot-Darstellungen des Sachverhalts in Abbildungen dargestellt. Hierbei wurde die kalte Aufarbeitung als blauer und nach 24 Stunden kalte Aufarbeitung als orangefarbener Box-Plot dargestellt. 43

44 Abbildung 12: Alveolarmakrophagen in der BAL in Abhängigkeit von der Aufarbeitungsmethode (kalt/24kalt) (Darstellung in Box-Plots). Abbildung 13: Lymphozyten in der BAL in Abhängigkeit von der Aufarbeitungsmethode (kalt/24kalt) (Darstellung in Box-Plots). Der Median für die Alveolarmakrophagen bei der zeitnahen Aufarbeitung unter gekühlten Bedingungen lag etwas höher (51,25) als bei der späteren Aufarbeitung nach 24 Stunden (46,75). Die maximale Zellzahl war höher bei der Auswertung nach 24 Stunden (Abbildung 12). Es konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden. 44

45 Vergleicht man die Anzahl der Lymphozyten hinsichtlich ihrer zeitlichen Aufarbeitung, wenn beide Proben unter gekühlten Bedingungen gelagert und aufgearbeitet wurden, so lässt sich kein signifikanter Unterschied erkennen. Es wurden jedoch deutlich mehr Zellen bei der zeitnahen Aufarbeitung erfasst (Abbildung 13). Der errechnete p-wert liegt bei 0,41 und ist somit nicht signifikant. Abbildung 14: Neutrophile Granulozyten in der BAL in Abhängigkeit von der Aufarbeitungsmethode (kalt/24kalt) (Darstellung in Box-Plots). Abbildung 15: Eosinophile Granulozyten in der BAL in Abhängigkeit von der Aufarbeitungsmethode (kalt/24kalt) (Darstellung in Box-Plots). 45

46 Der Median für die neutrophilen Granulozyten bei der kalten Aufarbeitung lag bei 41,7 und nach 24 Stunden bei 42,5 (Abbildung 14). Es stellte sich in der statistischen Auswertung keine Signifikanz dar p= 0,38. Der Referenzbereich der eosinophilen Granulozyten beträgt 0 1%. Die Mediane der kalten zeitnahen (0,87) und der Aufarbeitung nach 24 Stunden (1,25) lagen nah an dem Referenzbereich. Es wurden höhere Maximalwerte bei der Aufarbeitung nach 24 Stunden unter gekühlten Bedingungen erreicht (Abbildung 15). Das Signifikanzniveau mit p= 0,07 wurde hier fast erreicht. Abbildung 16: Mastzellen in der BAL in Abhängigkeit von der Aufarbeitungsmethode (kalt/24kalt) (Darstellung in Box-Plots). Die Mastzellen präsentierten sich mit einem Median von 0 und einem Maximum von 2,5 bei der Aufarbeitung nach 24 Stunden unter gekühlten Bedingungen (Abbildung 16). Es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den Methoden festgestellt werden. 46

47 3.3 Gruppe C: Vergleich der Ergebnisse der direkten und der nach 24 Stunden aufgearbeiteten BAL-Proben bei Raumtemperatur In Gruppe C mit 8 Patienten wurden die Zellen bei Raumtemperatur zeitnah und nach 24 Stunden aufgearbeitet und verglichen. Eine Übersicht der Zellpopulationen mit der deskriptiven Statistik ist in Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7: Die Zellpopulationen der Gruppe C (warm/24warm) mit Angabe der Mediane und des Minimums und Maximums. Aufarbeitungsmethode der BAL-Probe Warm(%) 24warm(%) Alveolarmakrophagen Median 34 31,5 Min 8 9,5 Max Lymphozyten Median 3,75 2,5 Min 0 0 Max 43 24,5 Neutrophile Granulozyten Median 55 57,25 Min 0 0 Max 90 87,5 Eosinophile Granulozyten Median 1 2,5 Min 0 0 Max 10,5 24,5 Mastzellen Median 0 0 Min 0 0 Max 1 2 Warm= ungekühlte Proben, 24warm= ungekühlte Proben nach 24 Stunden aufgearbeitet, min= Minimum, max= Maximum. Zur Veranschaulichung des Vergleichs wurden im Folgenden die Box-Plots in blau für die warme und in orangefarben für die warme Aufarbeitung nach 24 Stunden dargestellt. 47

48 Abbildung 17: Alveolarmakrophagen in der BAL in Abhängigkeit von der Aufarbeitungsmethode (warm/24warm) (Darstellung in Box-Plots). Abbildung 18: Lymphozyten in der BAL in Abhängigkeit von der Aufarbeitungsmethode (warm/24warm) (Darstellung in Box-Plots). Die Alveolarmakrophagen in der Gruppe C hatten in der warmen Aufarbeitung einen Median von 34 und bei der Aufarbeitung nach 24 Stunden von 31,5. Das Maximum lag bei 84 und 86. (Abbildung 17) Es konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. 48

49 Bei den Lymphozyten lagen die Mediane bei 3,7 für warm und 2,5 für 24warm nicht weit auseinander. In der Box-Plot-Darstellung lag das Maximum von warm bei 43 und von 24warm bei 24,5 (Abbildung 18). Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede für die Lymphozyten bezüglich der beiden Aufarbeitungsmethoden. Abbildung 19: Neutrophile Granulozyten in der BAL in Abhängigkeit von der Aufarbeitungsmethode (warm/24warm) (Darstellung in Box-Plots). Abbildung 20: Eosinophile Granulozyten in der BAL in Abhängigkeit von der Aufarbeitungsmethode (warm/24warm) (Darstellung in Box-Plots). 49

50 Beim Vergleich der beiden Aufarbeitungsmethoden für die neutrophilen Granulozyten stellten sich keine signifikanten Unterschiede dar, bei Medianwerten von 55 und 57,5, Maximalwerten von 90 und 87,5, Minimumwerten von 0 (Abbildung 19). Bei den eosinophilen Granulozyten lag der Median bei 24warm bei 2,5 und bei warm bei 1. Die Maximalerte bei 24warm (24,5) waren mehr als doppelt so hoch als bei warm (10,5) (Abbildung 20). Es lag kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Aufarbeitungsmethoden für die eosinophilen Granulozyten vor. Abbildung 21: Mastzellen in der BAL in Abhängigkeit von der Aufarbeitungsmethode (warm/24warm) (Darstellung in Box-Plots). Während die Mediane und Minimalwerte bei den Mastzellen bei 0 lagen, lag das Maximum bei der Methode 24warm doppelt so hoch als bei der warmen Aufarbeitung (Abbildung 21). 50

51 3.4 Gruppe D: Vergleich der Ergebnisse der gekühlten und ungekühlten Aufarbeitung nach 24 Stunden In Gruppe D befanden sich 8 Patienten, bei denen die BAL-Proben unter gekühlten Bedingungen oder bei Raumtemperatur gelagert wurden und nach 24 Stunden verarbeitet wurden. Es folgte die mikroskopische Untersuchung und die statistische Auswertung (Tabelle 8). Tabelle 8: Die Zellpopulationen der Gruppe D (24kalt/24warm) mit Angabe der Mediane und des Minimums und Maximums. Aufarbeitungsmethode der BAL-Probe 24kalt(%) 24warm(%) Alveolarmakrophagen Median 44,75 31,5 Min 8 9,5 Max Lymphozyten Median 3,25 2,5 Min 0 0 Max 34 24,5 Neutrophile Granulozyten Median 47,75 57,25 Min 0 0 Max 92 87,5 Eosinophile Granulozyten Median 1,25 2,5 Min 0 0 Max 36 24,5 Mastzellen Median 0 0 Min 0 0 Max 2,5 2 24kalt= gekühlte Proben nach 24 Stunden aufgearbeitet, 24warm= ungekühlte Proben nach 24 Stunden aufgearbeitet, min= Minimum, max= Maximum. In den Box-Plot-Darstellungen (Abbildung 22 26) wurden die Methode 24kalt blau dargestellt und die Methode 24warm orangefarben. 51

52 Abbildung 22: Alveolarmakrophagen in der BAL nach der Aufarbeitung nach 24 Stunden unter den Bedingungen warm und kalt (Darstellung in Box-Plots). Abbildung 23: Lymphozyten in der BAL nach der Aufarbeitung nach 24 Stunden unter den Bedingungen warm und kalt (Darstellung in Box-Plots). Die Alveolarmakrophagen hatten einen niedrigeren Median bei der Methode 24warm (31,5) als bei 24kalt (44,75). Während die gekühlte Aufarbeitung nach 24 Stunden nahezu normalverteilt war, fanden sich bei Raumtemperatur überproportional hohe Werte für die Zellzahl (Abbildung 22). Der Unterschied war nicht signifikant. Der Median für die Lymphozyten unter gekühlten Bedingungen (3,25) und bei 52

53 Raumtemperatur (2,5) nach 24 Stunden war nahezu gleich. Es konnte eine deutlich kleinere Streuung der Zellzahl um den Median bei der Methode 24kalt (IQR 6) im Gegensatz zu 24warm (IQR 17,2) beobachtet werden (Abbildung 23). Dieser Unterschied war statistisch nicht signifikant. Abbildung 24: Neutrophile Granulozyten in der BAL nach der Aufarbeitung nach 24 Stunden unter den Bedingungen warm und kalt (Darstellung in Box-Plots). Abbildung 25: Eosinophile Granulozyten in der BAL nach der Aufarbeitung nach 24 Stunden unter den Bedingungen warm und kalt (Darstellung in Box-Plots). 53

54 Der Median der neutrophilen Granulozyten betrug bei der Aufarbeitung nach 24 Stunden unter gekühlten Bedingungen 47,75 (0;92) und bei Raumtemperatur 57,25 (0;87,5). Der Unterschied war nicht signifikant (Abbildung 24). Bei den eosinophilen Granulozyten lag bei der Methode 24kalt der Median bei 1,25 und bei 24warm doppelt so hoch bei 2,5. Während das Minimum bei beiden Methoden bei 0 lag, betrug das Maximum für 24kalt 36 und bei 24warm 24,5 (Abbildung 25). Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Aufarbeitungsmethoden. Abbildung 26: Mastzellen in der BAL nach der Aufarbeitung nach 24 Stunden unter den Bedingungen warm und kalt (Darstellung in Box-Plots). Bei den Mastzellen stellte sich in der Box-Plot-Darstellung bei beiden Methoden ein Ausreißer dar bei 2,5 (24kalt) und 2 (24warm) (Abbildung 26). Zwischen den beiden Aufarbeitungsmethoden lag kein signifikanter Unterschied für die Mastzellen vor. 54

55 3.5 Gruppe E: Vergleich der Ergebnisse der Durchflusszytometrie der gekühlten und ungekühlten BAL-Proben In Gruppe E befanden sich 7 Patienten, bei denen eine Typisierung der Leukozyten stattfand. Es wurde eine Durchflusszytometrie der zuvor kalt und warm aufgearbeiteten BAL-Proben durchgeführt, um Veränderungen in der Zellzahl zu untersuchen. Im Antikörper-Pool befanden sich für den Nachweis von T- Lymphozyten CD3-Antikörper, CD8-Antikörper für die T-Suppressorzellen, CD4- Antikörper für die T-Helferzellen und CD56-Antikörper für die Bestimmung der Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen). Zusätzlich konnte der CD4/CD8-Quotient berechnet werden. Mithilfe der Messung entstanden Fluoreszenz-Dot-Plot-Grafiken und es konnten die Zellzahlen ermittelt werden. Im Rahmen der statistischen Auswertung wurden Box-Plots erstellt. So konnte überprüft werden, ob sich ein signifikanter Unterschied zwischen der kalten und warmen Methode ergeben würde. Es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen der warmen und kalten Aufarbeitungsmethode für die Lymphozytensubpopulationen festgestellt werden (Tabelle 9). Tabelle 9: Darstellung der Zellpopulationen unter Angabe des Median, Maximum (Max)/ Minimum (Min) und der statistischen Signifikanz, jeweils unter Berücksichtigung der Aufarbeitungsmethode: kalt und warm. Zellpopulation Median Max/Min p-wert (kalt; warm) (kalt; warm) (kalt; warm) T-Lymphozyten (CD3) (%) 91,42; 90,06 T-Suppressorzellen (CD8) (%) 36,10; 29,42 T-Helferzellen (CD4) (%) 62,92; 60,02 97/83; 100/97 0,75 67/17; 71/21 0,92 73/33; 73/34 0,92 NK-Zellen (CD56) (%) 5,06; 5,68 14/2; 11/0 0,34 CD4/CD8-Quotient (absolut) 2,09; 2,32 4/0; 3/0 0,75 Kalt= gekühlte Proben, warm= ungekühlte Proben. In den Abbildungen wurden die Ergebnisse der Duchflusszytometrie nach warmer (orangefarben) und kalter (blau) Aufarbeitung dargestellt. 55

56 Abbildung 27: T-Lymphozyten (CD3) in der BAL nach warmer und kalter Aufarbeitung in der Durchflusszytometrie (Darstellung in Box-Plots). Für die T-Lymphozyten (CD3) wurden bei Raumtemperatur höhere Werte (100) als unter gekühlten Bedingungen (97) in der Durchflusszytometrie erreicht (Abbildung 27). Ein signifikanter Unterschied konnte nicht gezeigt werden (Tabelle 9). Abbildung 28: T-Suppressorzellen (CD8) in der BAL nach warmer und kalter Aufarbeitung in der Durchflusszytometrie (Darstellung in Box-Plots). 56

57 Abbildung 29: T-Helferzellen (CD4) in der BAL nach warmer und kalter Aufarbeitung in der Durchflusszytometrie (Darstellung in Box-Plots). Zusammenfassend zeigten sich sowohl bei den CD4- als auch bei den CD8-Zellen unter Einfluss der Temperatur mit p > 0,05 keine signifikanten Unterschiede bezüglich der detektierten Zellzahl (Tabelle 8). In beiden Zellgruppen lag der Median der warmen Methode etwas niedriger (CD8-Zellen 29,42; CD4-Zellen 60,02), im Vergleich zur kalten Methode mit 36,1 und 62,9 (Abbildung 28 29). Abbildung 30: T-Lymphozyten-Vorstufen (CD4 und CD8) in der BAL nach warmer und kalter Aufarbeitung in der Durchflusszytometrie (Darstellung in Box-Plots). 57