Herpesviren II. Bettina Kempkes Helmholtz Zentrum München (HMGU)

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1 Herpesviren II Bettina Kempkes Helmholtz Zentrum München (HMGU)

2 Herpesviren: Strukturmerkmale 4. Hüllmembran mit Gykoproteinkomplexen (12-14 Proteine) 3.Tegument (HSV: 23 virale/49 zelluläre Proteine) 2. Kapsid (HSV: 8 virale Kapsid und Kapsid-assoziierte Pr.) 1. lineares Genom DNA Doppelstrang und Coreproteine

3 Herpesviridae: Gemeinsamkeiten Biologische Merkmale 1. virale Enzyme : DNA Metabolismus (Thymidinekinase; Thymidylatesynthase; Ribonukleotidkinase) DNA Synthese (DNA Polymerase, Helikase Prozessierung von Proteinen) 2. Subzelluläre Kompartimentierung Kern: Virale DNA Replikation und Kapsid Assemblierung Zytoplasma/ER: Morphogenese des Virion 3. Virusproduktion führt zum Tod der Zelle 4. Lebenslange Latenz Zirkuläres Genom Reaktivierung im natürlichen Wirt ("Das Virus verbleibt (persistiert) im Wirt. Es gibt jedoch Phasen oder infizierte Zellpopulation, in denen das Virus nicht mehr nachgewiesen werden kann.")

4 8 humanpathogene Herpesviren Herpes-Simplex Virus (HSV) 1+2 (HHV 1/2) Varizella-Zoster Virus (VZV) (HHV 3) Epstein-Barr Virus (EBV) (HHV 4) Cytomegalovirus (CMV) (HHV 5) Humanes Herpesvirus 6 A/B (HHV 6) Humanes Herpesvirus 7 (HHV 7) Kaposi Sarkom assoziiertes Herpesvirus (HHV 8)

5 Tierpathogene Herpesviren (Auswahl) Bovines Herpesvirus Typ1** (α) infektiöse Rhinotracheitis/genitale Manifestationen mit breiter Symptomatik Bovines Herpesvirus Typ2 (α) ulzerative Entzündung der Euter, Übertragung u.a. durch Fliegen Bovines Herpesvirus Typ3 (γ) bösartiges Katarrhalfieber Equine Herpesvirus Typ 1 (α) Aborte Porcine Herpesvirus *Typ1 (α) Pseudorabiesvirus*/ Aujeszkysche Krankheit Übertragung auf Hunde/Katzen und Rinder möglich Feline Herpesvirus (α) Katzenschnupfen Kanine Herpesvirus (α) Welpensterben Porcine Zytomegalovirus (β) Schäden des ZNS, hohe Mortalität Murine Zytomegalovirus (β) Wichtiges CMV Modell Galline Herpesvirus **(Typ1) (α) infektiöse Laryngotracheitis mit hoher Morbidität und Mortalitätund hohen wirtschaftlichen Verlusten (Hühner/Enten/Schwäne) Galline Herpesvirus (Typ2) (α) Mareksche Krankheit mit hoher Morbidität und Mortalitätund hohen wirtschaftlichen Verlusten Infektion und Transformation von T-Lymphozyten Virusintegration * DIVA Impfstoffe (differentiating between infection and vaccination) ** attenuierten Lebendimpfstoff

6 DNA Replikation im Zellkern (Latenz oder Lytische Replikation) E DE RE LATENZ oder TGN LYTISCHE REPLIKATION? Das virale Genom zirkularisiert. LATENZ: virus- und gewebespezifische eingeschränkte Genexpression LYTISCHE REPLIKATION: Kaskade TGNder viralen Genexpression immediate early: Transaktivatoren (delayed) early: Enzyme für virale DNA Synthese Lytische Replikation late: Strukturproteine (Kapsid-, Tegument und Hüllproteine) Prozessierung und Verpackung der linearen viralen Genome in Kapside.

7 Herpesviren Antivirale Therapie Chemotherapie (Zytokinbehandlung) Adoptive Immuntherapie

8 Latente oder lytische DNA Replikation orilyt TR orip orilyt Latente Replikation (zell. DNA Polymerase) TR orip TR orip orip orip Lytische Replikation virale DNA Polymerase und virale Kofaktoren TR TR TR TR TR TR orilyt

9 Azyklische Nukleosidanaloga (Azyklische Zucker) Analogon virale Thymidinkinase** zelluläre Kinase Acycloguanosin Guanosin + Famiciclovir (Pro-Drug)* Guanosin + Ganciclovir Guanosin virale zelluläre Kinase Birivudin Uracil + Cidovir Monophosphat Cytosin + * verbesserte Bioverfügbarkeit ** Entwicklung von Resistenzen Reduktion oder Verlust der Thymidinkinase oder Verlust der Substratspezifität für Azyklische Nukleosidanaloga Molekulare Virologie 3. Auflage Modrow et al. Principles of Virology 3. Auflage Flint et al.

10 Chemotherapie Nucleosidanaloga Beispiel: Acycloguanosin ACG Gertrude Elion Nobelpreis 1988

11 Nicht-nucleosidische Hemmstoffe Pyrophosphatanalog: Foscarnet bindet an die Pyrophosphatbindestelle der viralen DNA Polymerase Forscarnet Phosphoameisensäure Resistenzen: Aminosäureaustausche in der viralen DNA Polymerase Molekulare Virologie 3. Auflage Modrow et al.

12 Nucleosidanalogon Trifluridin Trifluormethylthymidin: Substrat der viralen DNA Polymerase Störungen der helicalen DNA Struktur nach Einbau Direkte Blockade der Polymerisation (Kinase?)

13 Fomivirsen:Antisense-Oligonucleotid zur spezifischen Blockade der Expression von "immediate early genes" des CMV phosphorothioate 5'-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3' CMV retinitis: intraocular injection in a concentration of 6.6 mg/ml ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, Sept. 1996, p Vol. 40, No. 9 Inhibition of Human Cytomegalovirus Immediate-Early Gene Expression by an Antisense Oligonucleotide Complementary to Immediate-Early RNA KEVIN P. et al.

14 HSV-1 Latenz Latenz: Virale Proteine werden nicht exprimiert. Epigenetische Modifikationen des Genoms verhindern die Expression lytischer Gene und entziehen die infizierten Zellen der Immunkontrolle durch Virus-spezifische B- und T-Zellen. Epithelzelle: Replikation Nervenzelle: Latenz (LAT RNA Expression) Reaktivierung

15 Virale Mimikry und virale Piraterie Mimikry (Funktionelle Konvergenz/Analoge) CD40/LMP1 B-Zellrezeptor/ LMP2A Notch-Signaltransduktion/EBNA-2 Piraterie (Homologe) "primordial genes or domains" ( evolutionär alt z. Bsp aus Bakteriophagen) Wirtsgene oder Domänen aus Wirtsgenen (häufig fehlen Introns/ retrovirale Übertragung?) (Beispiele: virale IRFs aus KSHV virales Interleukin 10)

16 Immune Evasion der Herpesviren "Immunsystem-Umgehungsstrategien" Angriffsmöglichkeiten: Angeborenes Immunsystem - Effektorzellen (Makrophagen, Monozyten, Dendriten, Granulozyten, Natürliche Killerzellen) - Zellautonome Syteme Interferone (α,β) und Zytokine Adaptive Immunsystem - Humorale Immunantwort B-Zellen - Zellvermittelte Immunantwort Antigenpräsentation T-Zellen (γ-interferone)

17 Lymphozyten

18 Humorale Immunantwort Zellvermittelte (restringierte) Immunantwort B-Zelle T-Helferzelle - MHC I T-Killerzelle MHC II

19 EBV infiziert und immortalisiert primäre B-Zellen in vitro Proliferative Latenz (Latenz III) LMP-2B p LMP-2A p C p EBV Nuclear Antigen Latent Membrane Protein LMP-1 LMP-2A/B EBNA-3A/B/C EBNA-2 EBNA-LP EBV EBNA-1 EBNA-2 C BF1 (C-promoter binding) S u(h) (Suppressor of hairless) L ag-1 (C.elegans) C EBNA-3 B A RBP-Jk/RBP-J/Jk/RBP (recombination signal binding protein kappa) CSL/CBF1

20 Die B-Zelle: Aktivierung und Differenzierung Activation of naive B cells by antigen Germinal center reaction Memory B cell Plasma cell

21 EBV: Latente Transkriptionsprogramme Latent reservoir in vivo: memory B cells Lytic reactivation in plasma cells "Latency in vivo" EBV associated diseases of B cell origin Type III: EBNA-1 EBNA-2,-3A,-3B,-3C,LP LMP-1,LMP2A/B Type III: Post-Transplant-Lmphoma AIDS ass. B cell Lymphoma Infectious Mononucleosis Type II: EBNA-1 LMP-1, LMP2A/B Type I EBNA-1 Type II: Hodgkin's disease Type I: Burkitt's lymphoma Type 0

22 The CSL protein CBF1 Corepressor CBF1 RHR-C C/GTGGGAA ubiqitously expressed highly conserved in evolution tissue differentiation and development sequence specific DNA binding factor recruits co-repressor activity RHR-N Beta-trefoil (BTD) ßC4 CSL structure: Kovall et al., 2004

23 The Notchpathway: CSL/CBF1 signalling in cells infected with γ-herpesviruses Notch/CBF1 signalling Notch Corepressor CBF1 C/GTGGGAA Coactivator Notch MAM-L1 CBF1 C/GTGGGAA Coactivator?? Herpesviral protein CBF1 Herpesviral CBF1 signalling??? EBV: EBNA-3A/C EBNA-2 CBF1 C/GTGGGAA CBF1 C/GTGGGAA Corepressor KSHV: virf/rta/lana CBF1 C/GTGGGAA

24 Das virale Protein LMP2A aus EBV und der B-Zellrezeptor Komplex rekrutieren die Kinasen Lyn und Syk über ITAM Motive Abberante Konstitutive Aktivierung Ligand-vermittelte Aktivierung Thorley-Lawson 2001

25 Kanonischer und alternativer NFkB Signalweg werden in Tumoren häufig dereguliert Jost und Ruland 2007

26 Das virale Protein LMP1 des EBV und der Ligand-aktivierte CD40 Rezeptor aktivieren ähnliche Signalwege und in der Folge kommt es auch zur Aktivierung der Transkription ähnlicher Zielgene im Kern Ligand-vermittelte Aktivierung Abberante Konstitutive Aktivierung AS1 AS 193 CD40 LMP1 Plasmamembran AS 24 NH2 AS187 verschiedene Adaptoren aus der TRAF Familie Zytoplasma Kanonischer NFkB Signalweg Alternativer NFkB Signalweg Kern p65 p50 RelB p52 FOS Jun MAP- Kinase Signalweg AP-1 aktivierte Gene ATF2 Elk-1 verändert aus Cornelia Hömig (Dissertation)

27 Adoptive Immuntherapie: Zellbasierte Krebstherapie am Beispiel EBV assoziierter Erkrankungen (Post-Transplantlymphome, Morbus Hodgkin) Vor der Transplantation: Patient oder Knochenmarksspender (EBV pos.) Nach der Transplantation: Peripheres Blut ex vivo: T-Zelle B-Zelle + EBV * * * * * Expansion EBV infizierter B-Zellen in vitro Ko-Kultur mit T-Zellen Expansion EBV spezifischer T-Zellen

28 Das latente KSHV Genom Latente Gene: LANA1, v-cyclin, v-flip, Kaposin, mirnas (virf3) virale Piraterie lytischer und latenter Gene

29 Reaktive Entzündung oder neoplastische Veränderung Zelluläre Heterogenität des Kaposi Sarkoms (Spindelzellen und zelluläres Infiltrat) Hämatoxylin und Eosin

30 Die Spindelzelle vgpcr K1 K15 vil-6 Lytischer oder abortiv lytischer Lebenszyklus Parakrine Stimulation der latent infizierten Nachbarzelle Angiogenese Entzündungsmediatoren KSHV Proteine LANA Latenter Lebenszyklus vcyclin Inhibition von p53 abh. Apoptose Zellzyklusregulation vcyclin LANA

31 Cyclin abhängige Kinasen (CDKs) werden von Cyclinen aktiviert und von spezifischen Inhibitoren (CKIs) kontrolliert.

32 Das Retinoblastoma Protein (Rb) inhibiert die Aktivierung von E2Fregulierten Genen im hypo-phosporyliertem Zustand. Die Rb Phosphorylierung führt zur Auflösung des Rb/E2-F Komplexes. Der Transkriptionsfaktor E2-F aktiviert die Transkription. cyclin cdk P Rb P Rb AUS AN. E2-F E2-F Gene des S-Phaseneintritt

33 v-cyclin wird in latent mit KSHV infizierten Zellen exprimiert. CKIs der INK Genfamilie p15 p16 p18 p19 Boshoff und Weiss, 2002

34 KSHV Blockade der A) Induktion der Immunantwort B) Interferon Wirkung (Expression antiviraler Proteine) Plasmamembran KSHV Proteine Kern Interferon Regulatory Factor (IRF) Coscoy 2007

35 Anti-apoptotische Proteine des KSHV: vbcl-2 blockiert BAX/BAC vermittelten Cytochrom C Ausstrom vflip aktiviert NF-kB Signaltransduktion viap blockiert die Aktivierung der Effektor-Kaspasen P. Krammer et al., 2007

36 Immune Evasion CMV Antigenprozessierung und Antigenpräsentation im Komplex mit MHC Klasse I Proteinen Proteasom Transporters Associated with Antigen Processing (TAP) hcmv T-Zellrezeptor T-Killerzelle CD8 MHC Klasse I ER MHC Klasse I Peptid-beladen Virusinfizierte Zielzelle Reddehase (2002) Zelllyse a) US6 blockiert TAP-vermittelten Transport von Peptiden ins ER (Early und Late) b) US3: MHC Klasse I Moleküle werden im ER zurückgehalten (Immediate Early) c) US11: US2: Rücktransport von MHC Klasse I und Degradation im Zytoplasma (Early)

37 MCMV: Antigenprozessierung und Antigenpräsentation durch MHC Klasse I Moleküle a) m04 (E/L) eskortiert nicht funktionelle/modifizierte MHC Klasse I Moleküle an die Plasmamembran b) m06 (E): lysosomale Degradation von MHC Klasse I und Antigen c) m152 (E): Retention von Antigen beladenen MHC Klasse I Molekülen im ER mcmv T-Killerzelle T-Zellrezeptor CD8 MHC Klasse I Natürliche Killerzelle Killer Inhibitorischer Rezeptor (KIR) MHC Klasse I Proteasom ER Virusinfizierte Zielzelle Virusinfizierte Zielzelle GOLGI Zelllyse Blockade der Zelllyse Reddehase (2002)

38 Herpesvirus Saimiri (HVS) Saimiri sciureus γ 2 -Herpesvirus, apathogen im natürlichen Wirt, Übertragung durch Speichel, lebenslange Persistenz HVS kann aus dem peripheren Blut infizierter Tiere durch Kokultur gewonnen werden Akute T-Zelllymphome in anderen Affenspezies (Tamarin, Krallenaffen) Langzeitproliferation humaner T Zellen

39 Herpesvirus Saimiri (HVS) Saimiri sciureus Transformations-assoziierte Membranproteine des HVS regulieren NF-kB, MAPK, STAT, Lck Signalwege

40 Murine γ-herpesvirus 68 (MHV68) ein Tiermodell für γ-herpesviren (EBV und KSHV) natürlicher Wirt: Waldmaus und Rötelmaus Übertragung: Experimentell durch Tröpfcheninfektion (intranasal) in Labormausstämmen Infektiöse Mononukleose und Splenomegalie Lebenslange Latenz in B-Zellen Anerkanntes Modell für Etablierung von Latenz aber als Tumormodell umstritten

41 Zeitverlauf der MHV 68 Infektion und der Virus-spezifischen Immunantwort Lytisches Virus A Virus-Titer Latentes Virus Zeit nach Infektion CD8 + T-Zellen Vβ4 + CD8 + CD8 + B Zeit nach Infektion Splenomegalie, Antikörper Polyklonale Antikörper Virusspezifische Antikörper Splenomegalie C Zeit nach Infektion

42 Herpesviren Vorlesung Principles in Virology Hrsg. Flint, Enquist, Racaniello, Skalka (2009) Medizinische Virologie Hrsg. Doer, Gerlich (2010) Molekulare Virologie Hrsg. Modrow, Falke,Truyen,Schätzl 3. Auflage (2010) Fields Virology Hrsg. Knipe, Howley Band 2 (2007) Zahlreiche Folien aus: Virologie Vorlesung LMU (Medizinische Fakultät) Bettina Kempkes Hämotologikum Helmholtz Zentrum München Marchioninistr München (Großhadern) Kempkes@helmholtz-muenchen.de