Wirkung von UV-B Strahlung auf Mikroorganismen

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1 Wirkung von UV-B Strahlung auf Mikroorganismen Herwig Friedl Februar 2002 Zusammenfassung Ziel der vorliegenden Studie ist die statistische Untersuchung der Abnahme der Keimanzahl in Wasser von der Dauer sowie Intensität einer UV-B Bestrahlung. Unter anderem wird dabei der Einfluss der Wassertrübung analysiert sowie das unterschiedliche Absterbeverhalten diverser Keimtypen näher betrachtet. Verwendet werden dafür Generalisierte Lineare Regressionsmodelle. Es wird gezeigt, dass die Überlebensperformance von Mikroorganismen im trüben Wasser signifikant besser ist als im klaren Wasser. Weiters ergibt sich, dass die Anzahl kolonienbildender Einheiten mit steigender Intensität der Bestrahlung signifikant abnimmt. Die Keimtypen E.Coli und Enterococcus faecalis weisen im Vergleich mit Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa eine weitaus bessere Resistenz gegen die UV- B Bestrahlung auf. Dieses Projekt wurde in Zusammenarbeit mit dem Büro des Landeshygienikers für Steiermark durchgeführt. 1 Absterberaten und Wassertrübung In diesem ersten Teil wird untersucht, ob und wie sich die Überlebensrate von Mikroorganismen durch andauerndes Einwirken von Sonnenlicht ändert und ob diese Änderung von der Wasserqualität und Trübung abhängt. Dazu liegen Keimgehaltsmessungen von Wasserproben in der Steiermark vor. Diese sind die Badegewässer in Schwanberg, Gleinstätten, Waldschach, Bad Gams, der Freibacher Stausee, sowie der Schotterteich Tillmitsch. Alle Messungen erfolgten bei direkter Sonneneinstrahlung, wolkenlosem Himmel, und einer Luxzahl größer als Nach der ersten Messung um 13:05 wurden alle 10 Minuten bis 14:35 neun weitere Messungen durchgeführt. Außer der Trübung bestimmte man die Anzahl kolonienbildender Einheiten (cfu s) in 1 ml Wasser. Der gesamte Datensatz beinhaltet somit 60 Beobachtungen. Für die folgende statistische Auswertung werden diese Daten zuerst einmal reduziert. Sobald nach einer gewissen Zeit keine cfu s mehr nachweisbar sind, müssen natürlich Institut für Statistik, Technische Universität Graz, Steyrergasse 17, A-8010 Graz 1

2 1 ABSTERBERATEN UND WASSERTRÜBUNG 2 Uhrzeit Gleinstätten Waldschach Bad Gams Freibach Tillmitsch 13: : : : : : : : : : Trübung (Stufe) 80 (stark) 45 (stark) 5.5 (leicht) 0.3 (leicht) 1.4 (leicht) Tabelle 1: Beobachtete cfu Werte pro ml Wasser sowie Wassertrübung zusammengefasst im Datensatz uvb. auch alle nachfolgenden Messungen dasselbe Ergebnis liefern. Um diese Abhängigkeit nicht überzubewerten, werden von den Daten nur jene verwendet, bis erstmals eine Null auftritt. Dadurch ergibt sich eine Datenreduktion auf 54 Beobachtungen. Weiters verhält sich sich das Badegewässer Schwanberg nicht homogen zu den restlichen fünf Gewässern, weshalb auf diese Serie von Beobachtungen gänzlich verzichtet wird. Die nachfolgenden statistischen Ergebnisse beziehen sich daher nur auf die Daten in der Tabelle 1. Es wird nun untersucht, ob sich die Absterberaten in stark und leicht trüben Gewässern unterscheiden. Dazu wird ein zweistufiger Faktor trueb generiert, der den Wert 0 für leichte Trübung (< 10) und 1 für starke Trübung (> 10) zugewiesen bekommt. Die Variable zeit beschreibt seit wie vielen Minuten die Keime der Sonnenlichteinwirkung ausgesetzt sind, und erstreckt sich somit über die Werte 0, 10,..., 90. Obwohl es sich bei den Daten um nicht-negative Anzahlen handelt, passt wegen der resultierenden viel zu großen Deviance die Standardannahme einer Poissonverteilung nicht. Die Variabilität in den cfu s scheint in den beiden Gruppen eher konstant über die Zeit zu sein, weshalb auch als Verteilungsannahme die Normalverteilung verwendet wird, d.h. y it N(µ it, σ 2 ), wobei y it, i = 1,..., 5, t 0 den cfu Wert im Gewässer i nach t minütiger Bestrahlung bezeichnet. Um die nicht-negativen Erwartungswerte µ it dieser Anzahlen auf der passenden Skala zu modellieren, wird ein log-lineares Modell (Generalisiertes Lineares Modell) eingesetzt, also log µ it = x it β mit dem Parametervektor β. Probleme mit Nullbeobachtungen und diesem log-link werden umgangen, indem zu jeder cfu Beobachtung künstlich der Wert 1 addiert wird, was jedoch zu vernachlässigen ist. Das Hauptaugenmerk ist die Untersuchung, ob für die beiden Trübungsstufen (stark/leicht) unterschiedliche Zeiteffekte benötigt werden, d.h. ob

3 1 ABSTERBERATEN UND WASSERTRÜBUNG 3 sich die zeitliche Abnahme der cfu Anzahlen bei verschieden trüben Gewässern unterscheidet. Im folgenden Modell werden für jede der beiden Trübungsstufen eigene konstante, lineare sowie auch quadratische Zeiteffekte für x verwendet. Die Notwendigkeit all dieser Parameter wird erst später getestet. Als Ergebnis erhält man mrz2tfac <- glm(kbe1 ~ trueb zeit*trueb I(zeit**2)*trueb, data = uvb, family=gaussian(link="log")); summary(mrz2tfac) Coefficients: Estimate Std. Error t value Pr(> t ) (Intercept) < 2e-16 *** trueb zeit I(zeit**2) *** trueb1:zeit trueb1:i(zeit**2) ** --- Signif. codes: 0 *** ** 0.01 * (Dispersion parameter for gaussian family taken to be ) Null deviance: e10 on 43 degrees of freedom Residual deviance: e08 on 38 degrees of freedom AIC: Das geschätzte Modell lautet somit { exp( t t ˆµ it = 2 ) für leicht trüb, exp(( ) ( )t ( )t 2 ) für stark trüb. Interpretation der Ergebnisse: Verschiedene quadratische Zeitterme für die beiden Trübungsstufen sind notwendig, da zu trueb1:i(zeit**2) ein p-value von gehört. Die beiden linearen Zeitterme unterscheiden sich nicht signifikant, denn der p-value zu trueb1:zeit ist mit 0.69 viel zu groß. Da zu zeit ein p-value von 0.56 gehört, scheint überhaupt kein linearer Zeitterm im Modell notwendig zu sein. Diese Hypothese wird nun auch varianzanalytisch getestet. m1wol <- glm(kbe1 ~ trueb I(zeit**2)*trueb, data = uvb, family=gaussian(link="log")) anova(mrz2tfac, m1wol, test="chisq") Model 1: kbe 1 ~ trueb zeit * trueb I(zeit^2) * trueb Model 2: kbe 1 ~ trueb I(zeit^2) * trueb

4 1 ABSTERBERATEN UND WASSERTRÜBUNG 4 Man würde sich zwei Parameter ersparen und dabei nur um Devianceeinheiten anwachsen was einem p-value von entspricht. Auf dem 5% Niveau kann man also auf die beiden linearen Zeitterme verzichten. Offen ist noch, ob unterschiedliche Modellkonstanten (Intercepts) benötigt werden. anova(m1wol, glm(kbe1 ~ I(zeit**2) I(zeit**2):trueb, data = uvb, family=gaussian(link="log")), test="chisq") Model 1: kbe 1 ~ trueb I(zeit^2) * trueb Model 2: kbe 1 ~ I(zeit^2) I(zeit^2):trueb Dies ist also der Fall. Das Modell mit nur einer gemeinsamen Konstante unterscheidet sich von jenem mit zwei unterschiedlichen Konstanten bzgl. eines p-values von Somit erlaubt das endgültige Modell vier Parameter und lautet summary(m1wol) Coefficients: Estimate Std. Error t value Pr(> t ) (Intercept) < 2e-16 *** trueb ** I(zeit**2) e-12 *** trueb1:i(zeit**2) e-10 *** --- Signif. codes: 0 *** ** 0.01 * (Dispersion parameter for gaussian family taken to be ) Null deviance: e10 on 43 degrees of freedom Residual deviance: e09 on 40 degrees of freedom AIC: 884 also { exp( t ˆµ it = 2 ) für leicht trüb, exp(( ) ( )t 2 für stark trüb. Als Schätzer für die Standardabweichung der cfu s erhält man unter diesem Modell ˆσ = = Grafisch veranschaulicht ist dieses Modell in der Abbildung 1. Man erkennt dabei deutlich, wie sich im trüben Wasser die Mikroorganismen länger am Leben halten als dies im klaren Wasser der Fall ist. Weiters zeigt das Modell auch, dass in den Daten die Ausgangsskonzentrationen unterschiedlich waren. Diese ist bei den Proben im trübem Wasser im Mittel geringer als im weniger trüben Wasser.

5 2 ÜBERLEBENSRATEN UND UV-STRAHLUNGSINTENSITÄT 5 cfu low turbidity high turbidity minutes Abbildung 1: Regressionsmodell für die Abnahme der Anzahl von Mikroorganismen (cfu) in zeitlicher Abhängigkeit (minutes) vom Trübungsgrad (low/high turbidity). 2 Überlebensraten und UV-Strahlungsintensität Verwendet werden hier die 27 Messungen aus Tabelle 2. Diese Daten beschreiben, wie viele cfu s nach einer gewissen Bestrahlung mit UV-B von einer Anfangsmenge übrig bleiben. Da es sich hier um Häufigkeiten handelt, sollte ein logistisches Regressionsmodell mit der erklärenden Variablen UV-B Intensität (uvb) die Kurve für die Absterberate hinreichend genau beschreiben können. Für dieses Modell wird wie üblich die Binomialverteilung und der Logitlink angenommen. Bezeichnen r i, i = 1,..., 27 die restlichen von a i verbleibenden cfu s, so wird angenommen, dass r i B(a i, π i ); mit E(r i ) = a i π i und var(r i ) = a i π i (1 π i ) mit der Überlebenswahrscheinlichkeit π i für eine cfu aus der iten Versuchseinheit. Weiters modelliert man π i log = x i β. 1 π i Da aber die r i eine höhere Variabilität aufweisen als dies durch die Binomialverteilung erklärt werden kann, wird der Quasi-Likelihood Ansatz verwendet mit der Annahme, dass die Varianz proportional zur Binomialvarianz ist, d.h. var(r i ) = φa i π i (1 π i ). Dies führt zu den folgenden Schätzern

6 3 ÜBERLEBENSRATEN UNTERSCHIEDLICHER KEIME 6 UV-B Anfang Rest UV-B Anfang Rest UV-B Anfang Rest Tabelle 2: Beobachtete absolute Anfangs- und Restanzahlen an cfu s nach einer Strahlungsintensität von UV-B zusammengefasst im Datensatz uvb2. Coefficients: Estimate Std. Error t value Pr(> t ) (Intercept) uvb * --- Signif. codes: 0 *** ** 0.01 * (Dispersion parameter for quasibinomial family taken to be ) Null deviance: on 26 degrees of freedom Residual deviance: on 25 degrees of freedom Als geschätztes Modell für die Überlebensrate erhält man ˆπ i = exp( uvb i) 1 exp( uvb i ). Diese nimmt mit zunehmender Strahlungsintensität ab, was aus dem negativen Vorzeichen des UV-B Parameters zu erkennen ist und auf dem 1.2% Niveau signifikant ist. Die Abbildung 2 vergleicht die beobachteten relativen Häufigkeiten r i /a i (durch ein gekennzeichnet) mit den Modellwerten ˆπ i (survival rate) für die UV-B Intensitäten. Ersichtlich ist auch die große Datenvariabilität für kleine UV-B Werte sowie der abnehmende Trend in der geschätzten Überlebenskurve. 3 Überlebensraten unterschiedlicher Keime Sind die Absterberaten verschiedener Keimtypen bei UV-B Strahlung unterschiedlich? Dafür liegen Messungen für E.Coli, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, und Pseudomonas aeruginosa in Institutswasser vor. Da diese Fragestellung der in Abschnitt 1 analysierten Problematik sehr ähnlich ist, basiert auch die statistische Analyse auf ein

7 3 ÜBERLEBENSRATEN UNTERSCHIEDLICHER KEIME 7 survival rate Abbildung 2: Logistisches Regressionsmodell für Überlebensrate der Mikroorgamismen in Abhängigkeit von der Intensität der UV-B Bestrahlung (uvb). uvb vergleichbares Datenmaterial. Wiederum werden nur Messungen bis zum ersten Auftreten einer Null verwendet, wodurch eine Stichprobe mit 36 Messungen resultiert. Zu hinterfragen ist die leichte Zunahme der Enterococcen um 14:30 von auf Wie zuvor wird ein log-lineares Regressionsmodell mit Normalverteilungsannahme für die cfu Werte eingesetzt. Der vierstufige Faktor typ beschreibt dabei den Keimtyp. Zuerst wird ein passender linearer Prediktor gesucht, in dem nur die Variable zeit (in Minuten) eingehen soll. Um eine Variablenselektion durchzuführen, werden einige Modelle geschätzt. Dazu zählt das volle Modell mfull mit keimtypspezifischen Intercepts, linearen und quadratischen Zeittermen, das Submodell mwoq mit nur einem gemeinsamen quadratischen Zeitterm, das Modell mwol mit einem linearen Zeitterm, das Modell mwol ohne lineare Zeitterme, und das Modell mwoi ohne unterschiedliche Intercepts aber mit typspezifischen quadratischen Zeittermen. mfull <- glm(kbe1 ~ type zeit I(zeit**2) zeit:type I(zeit**2):type, data = uvb3, family=gaussian(link="log")) mwoq <- glm(kbe1 ~ type zeit I(zeit**2) zeit:type, data = uvb3, family=gaussian(link="log")) mwol <- glm(kbe1 ~ type zeit I(zeit**2) I(zeit**2):type, data = uvb3, family=gaussian(link="log")) mwol <- glm(kbe1 ~ type I(zeit**2) I(zeit**2):type, data = uvb3, family=gaussian(link="log"))

8 3 ÜBERLEBENSRATEN UNTERSCHIEDLICHER KEIME 8 Uhrzeit E.coli Pseudomonas Enterococcus Staphylococcus aeruginosa faecalis aureus 14: : : : : : : : : : : Tabelle 3: Beobachtete cfu Werte pro ml Institutswasser für vier verschiedene Keimtypen zusammengefasst im Datensatz uvb3. mwoi <- glm(kbe1 ~ I(zeit**2) I(zeit**2):type, data = uvb3, family=gaussian(link="log")) Zuerst wird varianzanalytisch auf die Notwendigkeit unterschiedlicher quadratischer Zeitterme im Modell getestet, d.h. die Modellanpassung von mfull mit der von mwoq verglichen. anova.glm(mfull, mwoq, test="chisq") Model 1: kbe 1 ~ type zeit I(zeit**2) zeit:type I(zeit**2):type Model 2: kbe 1 ~ type zeit I(zeit**2) zeit:type e e e Fazit ist also, dass individuelle quadratische Terme signifikant (p = ) notwendig sind. Im nächsten Schritt wird auf unterschiedliche lineare Zeitterme getestet. anova.glm(mfull, mwol, test="chisq") Model 1: kbe 1 ~ type zeit I(zeit**2) zeit:type I(zeit**2):type Model 2: kbe 1 ~ type zeit I(zeit**2) I(zeit**2):type Wie in Abschnitt 1 sind auch hier keine individuellen Linearterme notwendig (p-value = 1). Ein zusätzlicher Test auf die Notwendigkeit eines gemeinsamen linearen Zeitterms

9 3 ÜBERLEBENSRATEN UNTERSCHIEDLICHER KEIME 9 anova.glm(mwol, mwol, test="chisq") Model 1: kbe 1 ~ type zeit I(zeit^2) I(zeit^2):type Model 2: kbe 1 ~ type I(zeit^2) I(zeit^2):type ergibt, dass auf lineare Terme überhaupt verzichtet werden kann (p-value = 1). Wir können uns daher weiterhin auf ein Modell ohne jeglichen linearen Zeiteffekt, jedoch mit unterschiedlichen quadratischen Zeittermen, beschränken. Testet man auf unterschiedliche Intercepts, so erhält man anova.glm(mwol, mwoi, test="chisq") Model 1: kbe 1 ~ type I(zeit^2) I(zeit^2):type Model 2: kbe 1 ~ I(zeit^2) I(zeit^2):type e e e e-61 Wieder sind individuelle Intercepts unbedingt (p-value = 0) notwendig. Diese Variablenselektion entspricht also genau dem Ergebnis der Studie im ersten Abschnitt. Verwendet wird daher das Modell mwol mit vier individuellen Intercepts und mit vier quadratischen Zeittermen. summary(mwol) Coefficients: Estimate Std. Error t value Pr(> t ) (Intercept) < 2e-16 *** typeentero e-08 *** typepseudo typestaphylo e-11 *** I(zeit**2) ** typeentero:i(zeit**2) * typepseudo:i(zeit**2) * typestaphylo:i(zeit**2) Signif. codes: 0 *** ** 0.01 * (Dispersion parameter for gaussian family taken to be ) Null deviance: e12 on 35 degrees of freedom Residual deviance: e10 on 28 degrees of freedom AIC:

10 3 ÜBERLEBENSRATEN UNTERSCHIEDLICHER KEIME 10 cfu fitted 0 e00 2 e05 4 e05 6 e05 0 e00 2 e05 4 e05 6 e05 cfu observed Abbildung 3: Durch das Modell mwol angepasste cfu Werte (fitted) gegen die beobachteten cfu Anzahlen (observed). Das geschätzte Modell lautet somit exp( t 2 ) exp(( ) ( )t ˆµ it = 2 ) exp(( ) ( )t 2 ) exp(( ) ( )t 2 ) für E.coli, für Entero, für Pseudo, für Staphylo. Als geschätzte Standardabweichung resultiert ˆσ = = Der Diagnostic- Plot in Abbildung 3 zeigt die gute Modellanpassung und keine auffälligen Muster. Das Verhalten dieses Modells ist für die vier Keimtypen in der Abbildung 4 gezeigt. Der Abfall bei Pseudomonas und Staphylococcus ist signifikant steiler als bei E.coli und Enterococcus. Die Enterococcen haben die beste Überlebensfähigkeit während bei Pseudomonas die schlechteste vorliegt. Auch die unterschiedlichen Ausgangskonzentrationen werden deutlich. Obwohl dieses Modell nur acht Parameter enthält, spiegeln die Modellkurven fast genau das Verhalten der Beobachtungen wieder.

11 3 ÜBERLEBENSRATEN UNTERSCHIEDLICHER KEIME 11 cfu 0 e00 2 e05 4 e05 6 e05 Entero Staphylo Ecoli Pseudo minutes Abbildung 4: Durch das Modell mwol angepasste cfu Werte gegen den Zeit.