Neuer Reinigungsmarker für die Bewertung der maschinellen Reinigung und deren Anwendung

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1 Neuer Reinigungsmarker für die Bewertung der maschinellen Reinigung und deren Anwendung Copyright 3mach GmbH Robert Simmoteit Aug Copyright 3mach GmbH

2 Biologische Marker Proteine Fette DNA (Nukliotide) Welcher Marker ist überall vorhanden und läßt sich in kleinsten Mengen nachweisen?

3 Viren, Bakterien und der Mensch DNA-Viren Parvoviren, Papillomaviren, Adenoviren, Hepadnaviren, Herpesviren, Pockenviren MRSA Bakterien im Speichel Bakterien im Zahnbelag Bakterien auf der Haut Bakterien im Magen Bakterien im Dickdarm Quelle:Thomas Böhm, Evolution, Braumüller Verlag 2013 Quelle: NRZ 2010

4 Ist DNA gefährlich? DNA ist nicht gefährlich, weil: DNA ohne Hüllenproteine nicht infektiös ist 1 10 mg DNA der Mensch jeden Tag selbst produziert DNA sen die DNA zerstören UV-Licht oder chemische Stoffe ebenfalls DNA zerstören können DNA ist gefährlich, weil: infektiöse DNA-Viren Erreger für Pocken, Influenza, Hepatitis, Röteln, Herpes etc. sind DNA bei Bakterien Information für Multiresistenzen überträgt DNA Krebszellen erzeugen kann horizontaler Gentransfer besteht (Konjugation und Transduktion zwischen Zellen von Lebewesen) Man muss sich darüber im Klaren sein, dass bei der Zerstörung von Bakterien oder Viren und Geweben deren Nukleinsäuren freigesetzt werden. Freie Nukleinsäuren (Plasmid-DNA) können Krebszellen erzeugen (von Burns et al. 1991). Aug Copyright 3mach GmbH

5 DNA-Quellen Quellen in Gesundheitseinrichtungen Raumluft Toiletten und Waschbecken Partikel und Fasern Mitarbeiter, Patienten und deren Kleidung Unreiner Bereich in der ZSVA Alle angeschmutzten Instrumente und Flächen in Gesundheitseinrichtungen Autoklav (Dampfphase)* *Quelle: 2007 AppliChem Es darf keine infektiöse DNA direkt in den Blutkreislauf gelangen, weil es vielfältige Mechanismen zur Aufnahme von Fremd- DNA in Zellen gibt. Die Förderung von multiresistenten Keimen sind zu vermeiden! Aug Copyright 3mach GmbH

6 Warum ist die DNA ein biologischer Leitparameter! Es kommt in alle Lebewesen und DNA-Viren vor. Träger von Informationen (Datenträger des Lebens). DNA ist ein robustes Biomolekül (Dinosaurier DNA) und wird durch den Reinigungsprozess und die anschließende Sterilisierung nicht zerstört. DNA kann auch infektiös sein (Bakterien & Viren).

7 Treshold cycle (Ct) Was macht die DNA als Leitmarker so interessant? DNA-Technologie Die DNA lässt sich noch in kleinsten Mengen nachweisen (pg). Die DNA-Quantifizierung kann über geeignete Marker erfolgen und ist standardisierbar. PCR-Technologie ermöglicht eine Automatisierung und einen Informationsgewinn. DNA-Eichkurve Konzentration (pg/0,5 ml) Der DNA-Nachweis ist 1 Millionen mal sensitiver als ein Standard Proteintest!

8 DNA-Nachweisprozess Edelstahlkörper werden mit ssdna ODN beschichtet ± Verunreinigung Edelstahlkörper werden im RDG gereinigt Ablösen der noch vorhandenen DNA mit Detergenz-Lsg. Zentrifugenfilter zur ssdna ODN Gewinnung 1. ssdna-kontrolle (300 ng) 2. ssdna-konzentrat in Wasser 3. SSDNA nach Durchfluss mit Wasser 4. SSDNA Konzentrat in Detergenz-Lsg. 5. ssdna nach Durchfluss mit Detergenz-Lsg. Quantitative PCR- Analyse Testansatz für ein PCR-Gerät Konzentrieren der abgelösten DNA in Amicon Ultra 30 K Zentrifugenfilter

9 DNA schmilzt DNA-Schmelzkurve Einzelstrang-DNA Lagert sich stabil an Edelstahloberflächen an, wenn die Temperatur unter 90 C fällt. Einmal angelagerte DNA ist schwer zu entfernen. Quelle: Höbartner / Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie

10 Eluierte Menge an ssdna in % DNA-Extraktion DNA-Ablösung Ablösung von Edelstahloberflächen (Einflussfaktoren) 60 Detergens 40 Temperatur 20 Einwirkzeit 0 Wasser Detergens Medienbewegung DNA Kontrolle DNA gelöst (n = 3 Experimente)

11 ssdna-marker ODN ssdna-markernachweis in Anwesenheit unterschiedlicher DNA

12 Reinigung von Edelstahloberflächen im RDG Bestimmung der Restmengen von ssdna ODN ( ) auf Edelstahloberflächen nach Anschmutzung mit 5 μg ssdna ODN und Reinigung im RDG. Reinigungstemperatur Lösung Reinigungszeit 10 min 20 min 25 mm 30 min 60 C med. Reiniger 17,67 17,01 n. N. n. N. Wasser 41,80 56,36 23,15 14,85 93 C med. Reiniger 0,43 0,22 n. N. n. N. Wasser 5,31 0,36 0,19 0,14 (n = 3 Experimente) Bei 93 C lässt sich DNA ca. 50 mal besser entfernen als 60 C!

13 Ergebnisse 1 2 GGGAGGACGATGCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAGACGACTCGCCCGA 3 Die Nachweisempfindlichkeit liegt bei ca. 0,01 pg DNA Der patentierte ssdna-marker und die Nachweismethode lässt sich Speziesunabhängig einsetzten. DNA lässt sich im RDG bei höheren Reinigungstemperaturen gut entfernen. Desinfektionstemperaturen schmelzen die DNA und die Einstrang-DNA lagert sich fest auf Edelstahloberflächen an. Aug Copyright 3mach GmbH

14 DNA-Marker zur Kontrolle von Reinigungsprozessen DNA-Marker sind kombinierbar mit bekannten Anschmutzungen. DNA und DNA-Marker werden nicht im RDG zerstört und ermöglichen einen qualifizierten und quantifizierten Nachweis biologischer Restaktivitäten auf Oberflächen. Die hohe Nachweissensitivität ermöglich Reinigungsvergleiche zwischen RDG s, Reinigungszubehör, Reinigungschemie, ZSVA s etc. DNA-Marker ermöglichen die Bewertung analytischer Methoden und die Entwicklung von Produkten im Bereich der Reinigungsanalytik. Aug Copyright 3mach GmbH

15 Evaluierung von 3mach- Reinigungskontrollen in RDG s 1000 Reinigungspraxis 160 Reinigungspraxis (bereinigte Daten) Aktivitätsindex (flächenabhängig) Aktivitätsindex (flächenabhängig) Lumen Außen 0 Lumen Außen 3mach-Prüfkörper nach EN ISO/TS (Praxisstudie mit 10 Kliniken, 2 RDG-Typen, 2 Serien, physikalische Nachweismethode in Testung) Okt Copyright 3mach GmbH

16 Ausblick Was wird empfohlen? QA-Leitlinie wissenschaftlich absichern Qualifizierung bereits vorhandener Anschmutzungen und Aufbereitungsprozesse Anschmutzungsuntersuchungen von kritischen Medizinprodukten (DNA- Restanalyse) Aug Copyright 3mach GmbH