Funktionelle Transkriptions-Topologie im Chloroplasten von Arabidopsis thaliana: zentrale und periphere Regulatoren

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1 Funktionelle Transkriptions-Topologie im Chloroplasten von Arabidopsis thaliana: zentrale und periphere Regulatoren Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie und Biotechnologie an der Internationalen Graduirtenschule Biowissenschaften der Ruhr-Universität Bochum angefertigt in der Arbeitsgruppe Pflanzliche Zellphysiologie und Molekularbiologie vorgelegt von Thomas Pieta aus Deutsch Piekar Bochum April, 2013 Referent: Prof. Dr. Gerhard Link Korreferent: Prof. Dr. Thomas Happe

2 Functional transcription topology in chloroplasts of Arabidopsis thaliana: central and peripheric regulators Dissertation to obtain the degree Doctor Rerum Naturalium (Dr. rer. nat.) at the Faculty of Biology and Biotechnology, Ruhr-University Bochum International Graduate School Biosciences Ruhr-University Bochum Laboratory of Plant Cell Physiology and Molecular Biology submitted by Thomas Pieta from Deutsch Piekar, Poland Bochum April, 2013 Supervisors: 1) Prof. Dr. Gerhard Link 2) Prof. Dr. Thomas Happe

3 Meinen Eltern

4 Danksagung Bei Herrn Prof. Dr. G. Link möchte ich mich für die Überlassung dieses interessanten Themas bedanken. Neben den vielen kleinen bench-talks, den optimalen Arbeitsbedingungen war es insbesondere die gezielte Förderung meiner Interessensgebiete, die zum Erfolg dieser Arbeit geführt haben. Bei Herrn Prof. Dr. Happe möchte ich mich für die Übernahme des Korreferates bedanken. Gleichzeitig geht der Dank an alle ehemaligen und derzeitigen Mitarbeiter der Arbeitsgruppe Pflanzliche Zellphysiologie und Molekularbiologie. Bei folgenden Personen möchte ich mich für die schöne und lehrreiche Zeit bedanken: Dr. Andrea Kolpack, Dr. Hacer Türkeri, Dr. Jennifer Ortelt, Dr. Sylvia Bock, B.Sc. Sarah Sommer, B.Sc. Sandro Zarbo, B.Sc. Lena Berlemann, B.Sc. Christin Eckert. Ein großer Dank gilt weiterhin der Arbeitsgruppe von Frau Prof. Dr D. Schünemann. Neben einer großartigen Hilfe bei der Isolierung von Protoplasten (Dank an Silke), waren es die Gespräche die einem fachlich und persönlich geholfen haben. Mein ganz besonderer Dank geht an Frau Brigitte Link und Herrn Dipl. Biol. Björn Walter. Erst durch ihre Lösungsvorschläge und Hilfestellungen wurden viele Probleme gelöst und machten diese Arbeit in weiten Teilen möglich. Mein allergrößter Dank gilt meinen Eltern und meiner Freundin Kathrin. Ihr habt immer an mich geglaubt und mir auch in schwierigen Zeiten den Rücken gestärkt. Ohne euch hätte ich das alles nicht geschafft. Danke für alles! Bei der DFG möchte ich mich für die finanzielle Unterstützung bedanken.

5 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abbildungs- und Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Genbezeichnung VI VIII X 1. Einleitung Das Plastom Transkription in Chloroplasten Die plastidäre Transkriptionsmaschinerie NEP (nucleus encoded polymerase) PEP (plastid encoded polymerase) Transkriptionsfaktoren in Chloroplasten Sigmafaktor-Gene in Arabidopsis thaliana Promotoren in Plastiden PEP-spezifische Promotoren NEP-spezifische Promotoren Unterteilung der plastidären Gene in Klassen Ribosomen-vermittelte Translation in Chloroplasten Dominant-Negative Effekte Zielsetzung Material & Methoden Material Chemikalien und Enzyme Chemikalien Enzyme Pflanzenmaterial 19 i

6 Inhaltsverzeichnis Bakterienstämme Plasmide Klone Oligonukleotide Antikörper Nährmedium Medien zur Anzucht von Arabidopsis thaliana Gele, Puffer und Lösungen Verwendete Geräte Internetadressen Computergestützte Bildbearbeitung Methoden Kultivierung der Organismen Wachstum von Bakterien in Flüssigkultur Wachstum und Selektion von Bakterien auf LB-Platten Anzucht von Arabidopsis thaliana Analytik Bestimmung des Chlorophyllgehalts Bestimmung der Zelldichte von E.coli Isolierung von Protoplasten Isolierung von Nukleinsäuren Isolierung genomischer Desoxyribonukleinsäuren Isolierung von bakteriellen Plasmid-Desoxyribonukleinsäuren Isolierung von Ribonukleinsäuren aus Arabidopsis thaliana Isolierung Polysomen-assoziierter mrna Herstellung DIG-markierter RNA-Sonden durch in-vitro Transkription Trennung von Nukleinsäuren Trennung von Ribonukleinsäuren Trennung von Desoxyribonukleinsäuren Northern-Transfer von Ribonukleinsäuren Hybridisierung und Detektion von Nukleinsäuren Amplifizierung von Nukleinsäuren 31 ii

7 Inhaltsverzeichnis Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (PCR) DNA-Sequenzierung Elution von DNA Fragmenten Isolierung von Gesamtproteinen aus Arabidopsis thaliana Affinitätsaufreinigung von TAP-tag markierten Proteinen Bestimmung des Proteingehalts Gelelektrophorese von Proteinen (Bis-Tris-PAGE) Elektropheretische Transfer von Proteinen und Immunodetektion Agrobakterium-vermittelte Transformation β-estradiol induzierte Expression Gateway-spezifische Klonierung Gateway-kompatible PCR-Produkte BP-Clonase Reaktion LR-Clonase Reaktion Ergebnisse Konstitutitve Überexpression eines Teilbereichs von SIG Konstrukte und mittels RT-PCR verifizierte Überexpression Charakterisierung der visuellen Phänotypen Northern-Blot Analyse plastidärer Zielgene (class I und class II) zur Überprüfung eines DNE Analyse eines überexprimierten Volllängenkonstrukts Expressionsanalyse des nativen Sig6 und des verkürzten crsig6 in der DNE-Linie Mikroskopischer Nachweis der Lokalisation des CRSIG RT-PCR Expressionsanalyse auf RNA-Ebene aller Mitglieder der Sigmafaktor-Familie in der DNE-Linie Erweiterte Northern-Blot Analyse plastidärer Zielgene (class I, class II und class III) in der DNE-Linie 46 iii

8 Inhaltsverzeichnis Analyse der Expression ribosomaler RNAs in der DNE-Linie Analyse Polysomen-assoziierter mrna in der DNE-Linie Analyse Polysomen-assoziierter ribosomaler RNAs in der DNE-Linie Immunologische Analyse plastidärer Proteine Chemisch induzierbare Überexpression des CRSIG Konstrukte, Induzierung und Expressionsnachweis mittels RT-PCR Analyse plastidärer Zielgene nach induzierter Überexpression Analyse ribosomaler RNAs nach induzierter Überexpression Affinitätschromatographische Isolierung eines TAP-tag versehenen SIG Konstrukte und mittels RT-PCR verifizierte Überexpression Charakterisierung visueller Sig6-TAP Phänotypen Northern-Blot Analyse plastidärer Zielgene (class I und class II) in Sig6-TAP-Linien Immunologische Analyse plastidärer Proteine in Sig6-TAP-Linien Lasermikroskopische Aufnahme der Chlorophyll-Autofluoreszenz von Protoplasten in Sig6-TAP-Linien Wachstumsanalyse auf MS-Medium ohne zusätzliche Kohlenstoffquelle von Sig6-TAP-Linien Aufreinigung und immunologische Detektion des SIG6-TAP Proteins Diskussion Plastidärer Transkriptions-DNE in Arabidopsis thaliana Funktionelle Charakterisierung eines konstitutiv exprimierten Sigmafaktor-Teilbereichs Induzierte Überexpression des CR-Anteils des SIG Hypothetische Funktion des CRSIG6 als DNE Affinitätschromatographische Isolierung eines TAP-getagten SIG Zusammenfassung Summary 89 iv

9 Inhaltsverzeichnis 8. Literaturverzeichnis Anhang Lebenslauf Erklärung 113 v

10 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis Abbildungs- und Tabellenverzeichnis Abb. 1 Abb. 2 Abb. 3 Abb. 4 Abb. 5 Abb. 6 Abb. 7 Abb. 8 Abb. 9 Abb. 10 Abb. 11 Abb. 12 Schematische Darstellung der Organisation eines ptdna-moleküls von Arabidopsis thaliana. Vergleichende Analyse der Aminosäuresequenz des konservierten Bereichs der Sigmafaktoren aus Arabidopsis thaliana. AtSig6 Architektur im Wildtyp und in der sig6-2 Knockout-Linie sowie Teilkonstrukte zum Nachweis möglicher DNEs. PCR-Analyse des konservierten Bereichs von Sig6 im Wildtyp, der sig6-2 und der wt 35S::crSig6 Linie zur Überprüfung der Insertion der cdna in die genomische DNA. Entwicklungsspezifischer Phänotyp des Wildtyp, der SIG6 Knockout Mutante (sig6-2), der CR-Linien (wt 35S::crSig6 und sig6-2 35S::crSig6) und der UCR-Linien (wt 35S::ucrSig6 und sig6-2 35S::ucrSig6). Northern-Blot Analyse plastidärer Zielgene in den transformierten Linien. Expressionsanalyse des Volllängen-Sig6 Konstrukts und plastidärer Zielgene im Wildtyp, der Knockout-Linie sig6-2 sowie den transformierten Linien (wt 35S::Sig6 und sig6-2 35S::Sig6). RNA-Expressionsanalyse des nativen AtSig6 (Sig6) und des konservierten Teilbereichs (crsig6) im Wildtyp, der sig6-2- und der DNE-Linie. Lokalisationsanalyse des GFP-fusionierten CRSIG6. RNA Expressionsprofil aller Mitglieder der A.th.-Sigma Familie im Wildtyp, der sig6-2 und der DNE-Linie. Northern-Blot Analyse plastidärer class I, II, III-Gene, des kernkodierten RbcS sowie des nukleo-cytosolischen Act2 Kontroll-Transkripts im Wildtyp, in der sig6-2 Knockout- sowie in der DNE-Linie. Analyse der Expression ribosomaler RNAs in der DNE-Linie. Abb. 13 Northern-Blot Analyse der plastidären ribosomalen-rnas 4.5S, 16S und 23S. Abb. 14 Abb. 15 Abb. 16 Abb. 17 Northern-Blot Analyse Polysomen-assoziierter mrna. Northern-Blot Analyse Polysomen-assoziierter mrna. Analyse polysomaler rrna. Analyse polysomaler rrna. vi

11 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis Abb. 18 Abb. 19 Abb. 20 Abb. 21 Abb.22 Abb. 23 Abb. 24 Abb. 25 Abb. 26 Abb. 27 Abb. 28 Analyse der Akkumulierung Photosynthese-relevanter, plastidärer Proteine. Schematische Struktur des Estrogen-induzierbaren Teils des pmdc7 und des eingebrachten crsig6-kontruktes. Mittels RT-PCR analysierte crsig6 Expression nach Induktion in der DNE-p7 Linie. Northern-Blot Analyse plastidärer Zielgene nach Induzierung der DNE-p7 Linie (wt 35S::crSig6 p7) mittels 17-β-Estradiol bzw. Applikation von DMSO. Northern-Blot Analyse der plastidären rrnas in der DNE-p7 Linie nach Induzierung mit 5µM 17-β-Estradiol. Schematische Darstellung des Fusionskonstrukts bestehend aus der Volllänge des Sigmafaktors 6 und einem C-terminalen TAP-tag. RT-PCR Analyse der Expression von Sig6 und dem Fusionskonstrukt Sig6-TAP. Stadium-spezifische Phänotypen des Wildtyps, der sig6-2 und der transformierten pe205-linien. Northern-Blot Analyse plastidärer Zielgene im Wildtyp, der Knockout und den pe- 205 Linien. Western-Blot Analyse photosynthese-relevanter Proteine der Chloroplasten. Konfokal-lasermikroskopische Aufnahme von Protoplasten isoliert aus 5 Tagen alten Wildtyp, sig6-2 und den pe-205 Linien. Abb. 29 Wachstumsanalyse auf MS-Medium ohne zusätzliche Kohlenstoffquelle für 28 Tage. Abb. 30 Abb. 31 Abb. 32 Abb. 33 Tab.1 Affinitätschromatographische Aufreinigung des SIG6-TAP Proteins. Schematische Darstellung der Maturierung von rrna-vorläufertranskripten in Chloroplasten. Übersicht genspezifischer Promotorregionen aus Arabidopsis thaliana. Schematische Darstellung der funktionellen Holoenyzm-Einheit innerhalb eines Plastiden und eines möglichen DNE-Effektes auf die plastidäre Transkription durch Überexpression des konservierten Bereichs von SIG6. Darstellung aller Gene, die in allen Plastomen Photosynthese-aktiver Organismen lokalisiert sind. vii

12 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis AA Acrylamid Abb. Abbildung Abk. Abkürzung AEBSF 4-(2-Aminoethyl)-benzensulfonylfluorid amp Ampicillin APS Ammoniumpersulfat AS Aminosäure A. thaliana Arabidopsis thaliana AtSIG Sigmafaktor aus Arabidopsis thaliana bp Basenpaare BSA Rinderserumalbumin bzw. beziehungsweise C Grad Celsius cdna copy DNA C-terminal carboxyterminal Da Dalton d.h. das heißt DNA Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuklease dntp Desoxynukleosidtriphosphat (datp, dctp, dgtp, dttp) E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiaminotetraessigsäure etc. et cetera et al. und andere (lat.: et alii) ggf. gegebenenfalls h Stunde hyg Hygromycin kan Kanamycin kb Kilobasenpaare KB konservierter Bereich kda Kilodalton M Molar viii

13 Abkürzungsverzeichnis Min Minute mrna messenger-rna NEP kernkodierte, phagenähnliche RNA Polymerase (nuclear-encoded RNApolymerase) nt Nukleotid(e) N-terminal aminoterminal OD optische Dichte PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PCR Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction) PEP plastidenkodierte RNA-Polymerase (plastid-encoded polymerase) ph Logarithmus der H Ionenkonzentration in mol/l RNA Ribonukleinsäure RNase Ribonuklease Rpm Umdrehungen pro Minute (revolts per minute) rrna ribosomale RNA RT Raumtemperatur RubisCO Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase sec. Sekunde spec Spectinomycin Tab. Tabelle TAC Membran-gebundener PEP Komplex Taq DNA-abhängige DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus TBS Tris-buffered Saline TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin TP Transitpeptid Tris Tris(hydroxymethyl)aminoethan Triton X-100 t-octylphenoxypolyethoxyethanol U Unit UE Untereinheit UKB unkonservierter Bereich v/v Volumen/Volumen (volume per volume) w/v Gewicht/Volumen (weight per volume) wt Wildtyp z.b. zum Beispiel zeo Zeocin ix

14 Genbezeichnung Genbezeichnung accd Gen für die β -Untereinheit der Acetyl-CoA Carboxyltransferase Act2 Gen für das Protein Aktin 2 atpb Gen für die β -Untereinheit der ATP-Synthase psaa Gen für die A -Kernuntereinheit des Photosystems I psab Gen für die B -Kernuntereinheit des Photosystems I psac Gen für die C -Untereinheit des Photosystems I psad Gen für die D -Untereinheit des Photosystems I psaj Gen für die J -Untereinheit des Photosystems I psba Gen für das D1-Protein des Photosystems II psbb Gen für das CP47-Protein des Photosystems II psbc Gen für das CP43-Protein des Photosystems II psbd Gen für die D -Untereinheit des Photosystems II psbe Gen für die alpha Cyt b559 -Untereinheit des Photosystems II psbf Gen für die beta Cyt b559 -Untereinheit des Photosystems II psbh Gen für die H -Untereinheit des Photosystems II psbi Gen für die I -Untereinheit des Photosystems II psbj Gen für die J -Untereinheit des Photosystems II psbk Gen für die K -Untereinheit des Photosystems II psbl Gen für die L -Untereinheit des Photosystems II peta Gen für die Cytochrom f Untereinheit des Cytb 6 f Komplexes petb Gen für die Cytochrom b 6 Untereinheit des Cytb 6 f Komplexes petd Gen für die IV- Untereinheit des Cytb 6 f Komplexes pete Gen für das Plastocyanin-Protein petg Gen für die G-Untereinheit des Cytb 6 f Komplexes rbcl Gen für die große Untereinheit der RubisCO RbcS Gen für die kleine Untereinheit der RubisCO rpl2 Gen für das ribosomale Protein L2 rpl14 Gen für das ribosomale Protein L14 rpl16 Gen für das ribosomale Protein L16 rpl20 Gen für das ribosomale Protein L20 rpl36 Gen für das ribosomale Protein L36 x

15 Genbezeichnung rps2 rps3 rps4 rps7 rps8 rps11 rps12 rps14 rps18 rps19 rpoa rpob rpoc1 rpoc2 rpotm rpotp rpotmp rrn16 rrn4.5 rrn18 rrn23 rrn25 Sig1-6 trne Gen für das ribosomale Protein S2 Gen für das ribosomale Protein S3 Gen für das ribosomale Protein S4 Gen für das ribosomale Protein S7 Gen für das ribosomale Protein S8 Gen für das ribosomale Protein S11 Gen für das ribosomale Protein S12 Gen für das ribosomale Protein S14 Gen für das ribosomale Protein S18 Gen für das ribosomale Protein S18 Gen für die α- Untereinheit der PEP Gen für die β-untereinheit der PEP Gen für die β -Untereinheit der PEP Gen für die β -Untereinheit der PEP Gen für die mitochondrial-lokalisierte NEP Gen für die plastiden-lokalisierte NEP Gen für die Plastiden- bzw. Mitochondrien lokalisierte NEP Gen für die plastidäre 16S rrna Gen für die plastidäre 4.5S rrna Gen für die cytosolische 18S rrna Gen für die plastidäre 23S rrna Gen für die cytosolische 25S rrna Gene für die Sigmafaktoren 1-6 aus Arabidopsis thaliana Gen für die trna für die Aminosäure Glutamin xi

16 Einleitung 1. Einleitung Eukaryotisches Leben kann nach aktueller Klassifizierung (Adl et al., 2005) in insgesamt sechs Gruppen gegliedert werden: Amoebozoa, Opisthokonta (Pilze und Tiere), Chromalveolata, Excavata, Archeaplastida (Grünalgen und Pflanzen) und Rhizaria. In den fünf letztgenannten Gruppen der Eukaryoten konnten spezielle Organellen, die Plastiden, nachgewiesen werden (Reyes-Prieto et al., 2007; Gould et al., 2008; Archibald, 2009). Plastiden sind durch Membranen abgegrenzte Reaktionsräume innerhalb einer Zelle und ermöglichen räumlich getrennte Organellspezifische Reaktionen. Eine davon ist die eigenständige Synthese von organischen Verbindungen aus den energiearmen Verbindungen CO 2 und H 2 0 mit Hilfe der Sonnenenergie. Diese als Photosynthese bezeichnete Reaktion findet in den Chloroplasten, einer spezialisierten Form der Plastiden statt. Neben den zuvor genannten Chloroplasten können weitere spezialisierte Formen definiert werden, z.b. stärkesynthetisierende Amyloplasten und Chromoplasten zur Speicherung von Carotinoiden und Xanthophyllen in Blüten, Früchten und Wurzeln. Der Erwerb dieser Plastiden wird auf eine einzelne Endosymbiose zurückgeführt, in der ein Cyanobakterium durch einen Vorläufer der heutigen Eukaryoten aufgenommen und nachfolgend funktionell integriert wurde (Mereschkowsky, 1905). Diese primären Plastiden sind vermehrt in den Archeaplastida vorhanden. Alle anderen Plastidenformen, wie sie z.b. in Braunalgen, Dinoflagellaten und dem Malaria-Parasiten Plasmodium falciparum vorkommen, sind wohl durch eine sekundäre Aufnahme einer eukaryotischen Alge in einen anderen Eukaryoten entstanden. Im Gegensatz zu den primären Plastiden mit zwei Hüllmembranen können in diesen sekundären Plastiden drei (Dinoflagelatten) bzw. vier Hüllmembranen (Plasmodium falciparum und Braunalgen) nachgewiesen werden (Schimper 1883; Mereschkowsky 1905; Herrmann, 1997; Martin und Muller, 1998; Reyes-Prieto et al., 2007; Bogorad, 2008; Gould et al., 2008; Archibald, 2009; Miyagishima, 2011). Im Zuge dieser Symbiose enstand ein Organell, das in das regulatorische Netzwerk innerhalb der Zelle eingebunden wurde (Jung und Chory, 2010). Gleichzeitig behielten die Plastiden einen Teil ihrer prokaryotischen Erbanlage in Form von DNA (ptdna) sowie einen vollständig funktionellen Transkriptions- und Translationsapparat. 1.1 Das Plastom Ebenso wie der Zellkern und die Mitochondrien besitzen auch die Plastiden eigenständiges genetisches Material, in seiner Gesamtheit als Plastom bezeichnet. Dieses liegt in Form multipler zirkulärer-doppelsträngiger Plastiden-DNA (ptdna) Moleküle vor, jedes mit einer artspezifischen 1

17 Einleitung Größe. Dabei variiert dieses typischerweise in seiner Größe zwischen 70 und 300 Kilobasenpaaren (kbp). Für einige Arten der Gattung Acetabularia wurden Plastomgrößen von 1,5 Mbp beschrieben (Simpson & Stern, 2002). Das kleinste beschriebene Plastom eines Photosyntheseaktiven Organismus konnte in Ostreococcus tauri mit einer Größe von 72 kbp und 86 Genen beschrieben werden (Robbens et al., 2007). Chlamydomonas rheindardtii, als bekanntester Vertreter der Grünalgen, weisst eine Plastomgröße von 203 kbp auf (Boudreau und Turmel, 1996). Bei Höheren Pflanzen liegt die Größe eines einzelnen ptdna-moleküls bei ca. 150 kbp. Im Falle der Modelpflanze Arabidopsis thaliana ist der genaue Wert bp mit einer Kodierungskapazität für etwa 125 Gene (Sato et al., 1999)(Abb.1). Abb.1: Schematische Darstellung der Organisation eines ptdna-moleküls von Arabidopsis thaliana. Der innere Kreis stellt die Bereiche der spezifischen Sturkturmerkmale (LSC, SSC und IR) und den darin lokalisierten Genen dar. Funktionsverwandte Gene sind entsprechend der Zugehörigkeit zueinander in gleichen Farben dargestellt. Genboxen, die außerhalb des Rings dargestellt sind, werden gegen den Uhrzeigersinn transkribiert, die inneren im Uhrzeigersinn (Schweer et al., 2006). 2

18 Einleitung Auch wenn eine erkennbare Varianz innerhalb aller Spezies vorhanden ist, so sind einige Gene in allen Plastomen Photosynthese-aktiver Organismen nachweisbar. Dazu zählen die Gene für die Untereinheiten beider Photosysteme, des Cytochrom b 6 f-komplexes, der ATP-Synthase, Komponenten der ribosomalen-proteine, der bakterien-typischen RNA-Polymerase (siehe ), sowie der ribosomalen RNAs (16S, 23S rrna) und aller trnas (z.b. trne, trnv). Viele dieser Gene liegen auf dem Plastom in polycistronischen Transkriptionseinheiten vor, wodurch auf einem Operon Gene lokalisiert sein können, die für Proteine (oder nicht proteincodierende RNAs) unterschiedlicher Funktion kodieren. In Folge posttranskriptioneller Prozessierungen entstehen mono- und oligocistronische RNAs (Sugita und Sugiura, 1996; Barkan, 2004). Tab.1: Darstellung aller Gene, die in allen Plastomen Photosynthese-aktiver Organismen lokalisiert sind. Nicht eingetragen sind die trna Gene. (verändert nach Barbrook et al., 2010). Photosystem I Photosystem II Cytochromeb 6f ATP Synthase Ribosomale Proteine (große UE) Ribosomale Proteine (kleine UE) RNA Polymerase RubisCO rrna psaa psba peta atpa rpl2 rps2 rpoa rbcl rrn23 psab psbb petb atpb rpl14 rps3 rpob rrn16 psac psbc petd atpe rpl16 rps4 rpoc1 psaj psbd petg atpf rpl20 rps7 rpoc2 psbe atph rpl36 rps8 psbf psbh psbi psbj psbk psbl rps11 rps12 rps14 rps18 rps19 Neben einer doppelsträngigen zirkulären Form kann die ptdna auch in linearer, multimerer und komplex-verzweigter Form vorliegen (Herrmann et al., 1975; Kolodner und Tewari, 1972; Maier und Schmitz-Linneweber, 2004, Bendich, 2004; Oldenburg und Bendich, 2004). Pro Plastid kann die Kopienzahl der ptdna zwischen 10 und 300 liegen (Bendich, 1987; Sugiura, 1992). Gleichzeitig können folgende Struturmerkmale beschrieben werden: zwei invertierte Sequenzwiederholungsbereiche (inverted repeats, IR), ein kleiner Einzelkopiebereich (small single copy, SSC) und ein großer Einzelkopiebereich (large single copy, LSC). Die geringe Zahl von plastidenkodierten Genen und der daraus resultierenden Proteine (50-200) deutet im Vergleich zu den Cyanobakterien (1884 bis 7400 Gene, Timmis et al., 2004) darauf hin, dass die Plastiden einen Teil ihrer genetischen Autonomie verloren haben. Obgleich die Zahl der Proteine innerhalb der Plastiden gleich geblieben ist (Abdallah et al., 2000; Cavalier-Smith, 3

19 Einleitung 2000b). In Folge einer genetischen Optimierung kam es zu einem so genannten endosymbiotischen Gentransfer zwischen den Chloroplasten und dem Zellkern (Brown, 2003). Als Voraussetzung dafür wurde gleichzeitig ein komplexer Proteinimport in den Chloroplasten etabliert (Strittmatter et al., 2010). In Arabidopsis scheinen rund 18 Prozent der Gene im Zellkern einen Ursprung aus den Cyanobakterien zu besitzen (Leister, 2003). Durch bioinformatische Analysen wurden weitere kernkodierte Chloroplasten-Proteine gefunden, die in Algen weiterhin im Plastom kodiert sind (ycf hypothetical chloroplast open reading frame) (Hallick und Bairoch, 1994). Ob dieser Transfer energetische oder funktionelle Vorteile in der Zelle hat, ist bisher nicht geklärt. Dass dieser Gentransfer auch im Labor durchgeführt werden kann, wurde in Nicotiana tabacum gezeigt (Stegemann et al., 2003). In der durchgeführten Selektion konnte eine Transferrate von den Chloroplasten in den Zellkern von etwa 0,02 bestimmt werden. 1.2 Transkription in Chloroplasten Sowohl die Anpassung an verschiedene biotische und abiotischen Faktoren, als auch entwicklungs- und zelltypabhängige Bedingungen erfordern eine Regulation der Genexpression innerhalb aller gentragenden Organellen. Einen entscheidenden Einfluss auf die Regulation besitzen die Transkriptionsfaktoren. Diese bilden oftmals mit den DNA-abhängigen RNA- Polymerasen einen Komplex, der eine Promoter-spezifische Bindung eingeht und somit eine differenzielle Transkription ermöglicht. Angesichts des bakteriellen Ursprung der Chloroplasten ist es nicht unerwartet, dass in diesen Organellen eine Vielzahl von Gemeinsamkeiten zu der Transkriptionsorganisation von Bakterien beschrieben werden kann. Dazu zählen neben einer plastidenkodierten, bakterienähnlichen DNA-abhängigen RNA-Polymerase (PEP), auch σ 70 - ähnliche Transkriptionsfaktoren. Als weitere prokaryotische Bestandteile des plastidären Transkriptionsapparates sind weiterhin als Besonderheit der Plastiden mindestens zwei Phagen-ähnliche RNA-Polymerasen vorhanden (RPOTp und RPOTmp). Im Unterschied zur PEP (s. oben) sind diese jedoch nach Gentransfer? kernkodiert und werden daher auch als NEP (nucleus-encoded polymerase) bezeichnet (Maliga, 1998). 4

20 Einleitung DNA-abhängige RNA-Polymerasen NEP (nucleus encoded polymerase) Bereits in frühen Studien mit Inhibitoren der cytoplasmatischen Translation und der plastidären Ribosomen wurde die Möglichkeit einer kernkodierten, plastidenlokalisierten Polymerase (NEP) postuliert (Ellis und Hartley, 1971). Die Detektion von Transkripten von rrnas und anderen Genen in Plastiden hitzgebleichter Roggenblätter (Büngeru und Feierabend, 1980), in einer Gerstenmutante mit einem weißen Phänotyp (Siemenroth et al., 1981), als auch in Studien mit ribosomenfreien Plastiden (Falk et al., 1993; Han et al., 1993) bestärkte die Annahme einer kernkodierten Polymerase. Weiterhin konnte in der parasitären Pflanze Epifagus virginiana (Plastomgröße 71 kbp) der Verlust der Gene rpob und rpoc (Untereinheiten der PEP, siehe ) beschrieben werden (depamphilis und Palmer 1990; Morden et al., 1992; Ems et al., 1995). Auch nach gezielter Deletion von rpo-genen (rpoa, rpob) in Nicotiana tabacum konnte eine Transkription von housekeeping -Genen in Chloroplasten festgestellt werden (Allison et. al, 1996; Hajdukiewicz et al., 1997; Krause et al., 2000; Legen et al., 2002). Jedoch erst die Isolierung einer etwa 110 kda großen Polymerase aus Arabidopsis thaliana mit folgender Funktionsanalyse bestätigte die Annahmen (Lerbs-Mache et al., 1993, Hedtke et al., 1997). Die Sequenzanalyse mit verschiedenen Polymerasen aus unterschiedlichen Organismen ergab weiterhin, dass diese Polymerase denen aus T3/T7 Phagen sehr ähnlich ist (Hedtke et al., 1999). Sie besteht aus einer katalytischen Untereinheit, benötigt im Gegensatz zur PEP keinen Transkriptionsfaktor und erkennt NEP-spezifische Promoterelemente (siehe ). Die Annahme, dass die NEP jedoch spezifisch housekeeping -Gene transkribiert, konnte in weiteren Untersuchungen nicht bestätigt werden. Eher im Gegenteil wurde gezeigt, dass tendenziell die NEP zur Transkription aller plastidären Gene befähigt ist (Krause et al., 2000; Legen et al., 2002; Schweer et al., 2006). Durch in-vivo und in-vitro Untersuchungen wurde weiterhin festgestellt, dass nicht nur eine Polymerase in den Chloroplasten lokalisiert ist, sondern mindestens zwei. Im Genom konnten insgesamt drei RpoT-Gene festgestellt werden, wovon eins für ein plastidenlokalisiertes (RpoTp), eins für ein mitochondriales (RpoTm) und eins mit einer Signalsequenz für beide Organellen (RpoTmp) vorliegt (Hedtke et al., 1997, 2000). Eine mögliche Entstehungsart der plastidären Phagenpolymerase könnte die Genduplikation der mitochondrialen Phagenpolymerase im Genom sein (Hedtke et al., 1997). 5

21 Einleitung PEP (plastid encoded polymerase) Die postulierte Entstehung der Plastiden aus frühen einzelligen Cyanobakterien durch Aufnahme und Integration in eine eukaryotische Zelle, liess es als naheliegend erscheinen, dass das Fusionsprodukt eine bakterienähnliche RNA-Polymeraseform enthalten könne. Durch Untersuchungen des Plastoms, insbesondere durch Hybridiesierungsstudien mit E.coli spezifischen DNA-Proben für das rpoa- und rpoc-gen (Untereinheiten der DNA-abhängigen RNA- Polymerase) wurde das Vorhandensein bestätigt (Watson und Surzycki, 1982). Die Methode der Sequenzierung ermöglichte es im Weiteren, Regionen auf dem Plastom ausfindig zu machen, die eine starke Homologie zu den E.coli RNA-Polymerase Untereinheiten α (rpoa), β (rpob) sowie β (rpoc) haben (Ohme et al., 1986; Sijben-Müller et al., 1986, Shinozaki et al., 1986). In E.coli war jedoch bereits bekannt, dass diese Form der Polymerase eine notwendige aber nicht hinreichende Funktionseinheit darstellt, sie benötigt zur Bindung an Promoterelemente der DNA einen so genannten Sigmafaktor (rpod) (Nakamura et al., 1977; Burton et al., 1981). Eine solche Sequenz konnte auf dem Plastom nicht beschrieben werden. Daher wurde davon ausgegangen, dass das Gen für diesen Faktor im Laufe der Evolution in das Kerngenom ausgelagert wurde und der Faktor selbst nach der Synthese an cytosolischen Polysomen als Vorläufer und nachfolgendem Import in den Plastiden dort mit der Plastiden-kodierten Polymerase (PEP) das funktionelle Holo-Enzym bildet. Bisherige Untersuchungen zeigen, dass sich die PEP aus den vier Untereinheiten α, β, β und β zusammensetzt. Die Assemblierung von zwei α-untereinheiten und je einer β, β und β führt zur Ausbildung des so genannten Core-Enzyms. Durch die Bindung eines Sigma-Faktors ( ) entsteht das Holo-Enzym. Die PEP konnte in zwei unterschiedlichen Zustandsformen aus Chloroplasten isoliert werden. Zum einem als unlösliche, DNA-gebundene Form, dem TAC (transcriptonally active chromosome), zum anderen als lösliche srnap-form (soluble RNA polymerase) (Little und Hallick, 1988; Hu und Bogorad, 1990; Hu et al., 1991; Suck et al., 1996, Pfalz et al., 2006). Insbesondere die letztgenannte entspricht in der Zusammensetzung dem multimeren Holo-Enzym. Der TAC-Komplex besteht neben der Polymerase aus mindestens weiteren akzzessorischen Proteinen, die in ihrer Zusammensetzung von der Plastidenform abhängig sind (Reiss und Link, 1985; Suck et al., 1996, Pfalz et al., 2006). 6

22 Einleitung Transkriptionsfaktoren in Chloroplasten Die ersten Beschreibungen von Sigmafaktoren in Höheren Pflanzen konnten durch den Einsatz von Primärantikörpern gerichtet gegen Epitope von Sigmafaktor-Untereinheiten aus E.coli gemacht werden (Lerbs et al., 1988). Weitere Analysen zeigten, dass Sigmafaktoren nicht nur in Sinapis alba (drei Sigmafaktoren; Bülow und Link, 1988; Tiller et al., 1991), sondern auch in Chlamydomonas reinhardtii, Ostreococcus tauri, Ostreococcus lucimarinus (je ein Sigmafaktor; Surzycki und Shellenbarger, 1976), Oryza sativa und Vitis vinifera vorhanden sind (je sechs Sigmafaktoren; Troxler et al., 1994; Maier et al., 2008). Somit ist erkennbar, dass pflanzliche Sigmafaktoren eine essentielle Rolle in der plastidären Transkription spielen und innerhalb der Evolution diese nicht weniger, sondern von den Algen hin zu den Höheren Pflanzen mehr und daher in ihrer Bedeutung sogar wichtiger- geworden sind. So konnten auch in Arabidopsis thaliana sechs Sigma-Faktoren beschrieben werden (Tanaka et al., 1997; Isono et al., 1997; Kanamura et al., 1999; Fujiwara et al., 2000). Die Funktion der Sigmafaktoren innerhalb der Chloroplasten, insbesondere bei den Höheren Pflanzen, scheint im Gegensatz zu den Prokaryoten weitaus differenzierter zu sein. So konnte bisher kein primärer Sigmafaktor beschrieben werden, der die Gesamtheit aller Transkriptionsinitiationen ausführt (Paget und Helmann, 2003). Eher scheint eine funktionelle Redundanz mit nur partieller Arbeitsteilung innerhalb der pflanzlichen Sigmafamilie vorzuliegen. Neben einer entwicklungs- und gewebespezifischen Aktivität, scheint dies auch für die Antwort auf verschiedene biotische und abiotische Faktoren zu gelten (Allison, 2000; Kanamura et al., 2001; Nagashima et al., 2004; Kanamura und Tanaka, 2004; Favory et al., 2005; Zghidi et al., 2007; Onda et al., 2008; Lai et al., 2011) Sigmafaktor-Gene in Arabidopsis thaliana Auf insgesamt vier von fünf Chromosomen, die im Zellkern von Arabidopsis thaliana vorliegen, konnten die Gene für die Sigmafaktoren lokalisiert werden. Davon befinden sich zwei auf dem Chromosom I (Sig1 und Sig2), jeweils eins auf dem Chromosom II (Sig6) und Chromosom III (Sig3), sowie zwei auf dem Chromosom V (Sig4 und Sig5). Auf dem Chromosom IV scheint kein Sigmafaktor vorzuliegen (Fujiwara et al., 2000). Sequenz- und Exon/ Intron-Architektur-Vergleiche sprechen dafür, dass die überwiegende Mehrzahl der Mitglieder der Sigma-Genfamilie sich durch Gen-Duplikationen aus einem einzigen Endosymbionten-Gen gebildet hat. Lediglich Sig5 weist eine abweichende Exon/ Intron-Architektur auf (z.b. Schweer, 2010). Sequenzanalysen der abgeleiteten Proteine zeigen innerhalb der Sigma-Familie Strukturhomologien. Im N-terminalen Bereich befindet sich das plastidäre Transitpeptid, das dem Vorläuferprotein den Transport in die Chloroplasten durch den TIC/TOC-Komplex ermöglicht und dann abgespalten wird. Dieser Peptidsequenz folgt ein eher variabler Bereich, der so genannte 7

23 Einleitung unkonservierte Bereich (ucrsig). Dieser besitzt eine Aminosäurenlänge von 116 bis 256 AS (Sig1: 156, Sig2: 204, Sig3: 256, Sig4: 116, Sig5: 210 und Sig6: 232) (Schweer, 2010). Untersuchungen dieser Region zeigten, dass dort viele Phosphorylierungsstellen der plastidären Casein-Kinase 2 (cpck2) liegen und durch Mutationen diese starke Veränderung nicht nur im Phänotyp, sondern auch in der plastidären Transkription herbeiführen (Schweer et al., 2010). Somit scheint diese Region eine regulatorische Funktion der selektiven Sigma-Aktivität zu besitzen. Eine funktionelle Analyse für alle Sigmafaktoren wurde bisher jedoch nicht gezeigt. Weiterhin kann im C-terminalen Bereich eine eher konservierte Region (crsig) beschrieben werden. Diese variiert in der Aminosäurenlänge zwischen 303 und 317 AS (Sig1: 312, Sig2: 317, Sig3: 315, Sig4: 303, Sig5: 307, Sig6: 315). Innerhalb dieser Region können die typischen σ 70 Elemente beschrieben werden (Region 1, Region 2, Region 3 und Region 4), die insbesondere die Basisfunktionen, wie die lokale DNA-Strangtrennung und die DNA-Bindung, beinhalten. Die nähere Betrachtung zeigt jedoch, dass dieser Bereich nicht hoch konserviert ist. Der Vergleich der Aminosäuresequenz für alle Sigmafaktoren (Fujiwara et al., 2000) führte zu folgendem Ergebnis: Von insgesamt 321 Aminosäuren sind 27 hoch konserviert (~8,4%), 55 stark konserviert (~17,1%) und 21 relativ konserviert (~6,5%). Somit ergibt sich ein Homologiegrad von etwa 32% beschrieben werden. Namentlich müsste diese Region somit eher als Basisregion (im Unterschied zur variablen regulatorischen ucrsig) bezeichnet werden. 8

24 Einleitung Abb.2: Vergleichende Analyse der Aminosäuresequenz des konservierten Bereichs der Sigmafaktoren aus Arabidopsis thaliana. Die Sequenzen mit den funktionellen Regionen von AtSig1 bis AtSig6 (von oben nach unten) sind dargestellt. Die Sequenzhomologien werden wie folgt dargestellt: übereinstimmende Aminosäure: * ; mehrheitliche Übereinstimmung: : ; starke Varianz:. ; keine Übereinstimmung: leeres Feld (verändert nach Fujiwara et al., 2000). Der Sigmafaktor mit dem höchsten Grad an Sequenzverwandschaft mit dem E.coli σ 70 ist dabei Sig2 (Lonetto et al., 1992; Fujiwara et al., 2000, Schweer, 2010). 9

25 Einleitung Promotoren in Plastiden Die Existenz zweier unterschiedlicher Arten von Polymerasen in den Chloroplasten legt auch die Möglichkeit nahe, dass ganz unterschiedliche Promotoren (Sequenzelemente für die spezifische Polymerasebindung und Transkriptions-Initiation) auf dem Plastom existieren können. Allgemein wird bei einem Promotor von einer DNA-Sequenz am 5`-Ende eines Gen gesprochen, die die Bindung einer Polymerase an die DNA und somit die Transkription ermöglicht. Durch selektive Benutzung PEP- bzw. NEP-spezifischer Promotoren kann es zu einer gewissen "Arbeitsteilung" zwischen den beiden RNA-Polymerasen kommen. Wie sehen diese Promotoren aus, vor welchen Genen befinden sie sich, und welche Konsequenzen ergeben sich für die plastidäre Transkription insgesamt? PEP-spezifische Promotoren Die PEP-spezifischen Promotoren ähneln entsprechend ihres phylogenetischen Ursprungs den bakteriellen σ 70 -Promotoren und sind in ihrer Form stark konserviert. Sie besitzen eine -35 (TTGaca) und -10 (TAtaaT ) Konsensussequenz, die eine Bindung des Holo-Enzyms an den Promoter ermöglicht. (Reznikov et al., 1985; Hajdukiewicz et al., 1997; Weihe, 2004; Lysenko und Kuznetsov, 2005; Shiina et al., 2005; Liere und Börner, 2007a, b). Bei einigen Typen konnten weiterhin cis-elemente beschrieben werden, die eine zusätzliche regulatorische Funktion einnehmen. So konnte für die Promotorregion des psba-gens in Sinapis alba zwischen der -35 und -10 Region ein TATATA-Promotorelement beschrieben werden, welches sehr stark den kernkodierten Promotoren (TATA-Box) der RNA-Polymerase II ähnelt (Link, 1984, Eisermann et al, 1990). Durch in-vitro Studien konnte weiterhin gezeigt werden, dass dieses TATA-Element mit einer fusionierten -10-Sequenz eine basale Transkription ausführen kann. Ähnliche Untersuchungen am entsprechenden Promoter aus Hordeum vulgare (Gerste) ergaben, dass eine aktive Transkription die Existenz der -35-Region voraussetzt (Kim et al., 1999). Die Varianz innerhalb des psba-promoters scheint das Resultat einer divergenten Evolution und Regulation in Mono- bzw. Dikotylen zu sein NEP-spezifische Promotoren Die Promotoren der kernkodierten Polymerase (NEP) können in insgesamt drei Typen gegliedert werden (Weihe und Börner, 1999; Liere und Maliga, 2001; Liere et al., 2011). Typ-I Promotoren besitzen ein konserviertes YRTa-Motiv, welches eingebettet in ein kleines DNA Fragment etwa -15 bis + 5 Nukleotide vor bzw. in der Transkriptions-Initiationsstelle liegt. In einer Subklasse der Typ-I Promotoren, dem Typ-Ib, kann ein weiteres konserviertes Motiv (ATAN 0-1 GAA) identifiziert 10

26 Einleitung werden. Dieses liegt etwa Nukleotide vor dem YRTa-Motiv und wird BoxII oder GAA-Box genannt (Silhavy und Maliga, 1998a; Kapoor und Sugiura, 1999; Xie und Allison, 2002; Liere et al., 2011). Typ-II Promotoren besitzen kein YRTa-Motiv, sind in ihrer Struktur inkonsistent. Bekannt ist für einen Fall des clpp-53 Promoters, dass dieser ebenfalls eine starke Funktion -5 bis +25 Nukleotide vor der Transkriptions-Initiationsstelle besitzt (Sriraman et al., 1998). Als dritter Promoter-Typ wird ebenfalls ein weiterer nicht-yrta-motiv Promoter, der rrn Operon Pc- Promoter, eingestuft. (Baeza et al., 1991, Iratni et al., 1994 und 1997, Pfannschmidt und Link, 1997, Sriraman et al., 1998, Swiatecka-Hagenbruch et al., 2007, Liere et al., 2011). Dieser besitzt allerdings auch typische σ 70 -Sequenzmotive und kann daher ebenfalls als PEP-Promoter fungieren (Courtois et al., 2007; Swiatecka-Hagenbruch et al., 2008) Unterteilung der plastidären Gene in Klassen Das Vorhandensein von zwei unterschiedlichen Polymerasetypen, die spezifische Promoterelemente erkennen, führte zu einer Einteilung von dahinterliegenden Genen in Klassen (class). In die erste Klasse (class I) werden Gene eingeordnet, die gezielt nur von der PEP transkribiert werden. Dazu zählen Gene wie psaa, psba, petb und rbcl. Der zweiten Klasse (class II) werden Gene zugeordnet die sowohl von der PEP als auch von der NEP transkribiert werden. Neben proteinkodierenen Genen (z.b. atpb, clpp und rps16) zählen auch Gene für die ribosomalen RNAs dazu (rrn4.5, rrn5, rrn16 und rrn23). Zu den Genen der Klasse III (class III) zählen NEPspezifischen Gene. Beispiele hierfür sind: accd, rps18 und rpob (Hajdukiewicz et al., 1997, Hübschmann und Börner, 1998, Silhavy und Maliga, 1998). 1.3 Ribosomen-vermittelte Translation in Chloroplasten Plastiden besitzen wie ihre prokaryotischen Vorläufer 70S Ribosomen, die die Translation der neusynthetisierten und meist prozessierten mrna katalysieren. Diese unterscheiden sich in ihrer Größe und Zusammensetzung stark von den kernkodierten, cytosolischen 80S Ribosomen (Trempe und Glitz, 1981, Manuell et al., 2007). Sowohl zahlreiche Proteine der beiden (50S und 30S) Untereinheiten als auch die beteiligten trnas und rrnas sind auf dem Plastom kodiert (Abb. 1). Die Gesamtheit der Bestandteile der Plastiden-Ribosomen konnte durch Proteomanalysen in Spinacia oleracea und Chlamydomonas reinhardtii beschrieben werden (Yamaguchi und Subramanian 2000, Beligni et al. 2004a). Die plastidären Ribosomen aus Spinacia oleracea bestehen aus 59 Proteinen, davon sind 33 Untereinheiten der 50S, 25 der 30S Untereinheit und ein ribosomaler Recycling-Faktor. 53 dieser Proteine besitzen eine starke Homologie zu denjenigen in E.coli Ribosomen, 6 Proteine sind rein Plastiden-spezifisch (Yamaguchi und Subramanian, 2000). 11

27 Einleitung Ein weiterer Bestandteil der Ribosomen sind die ribosomalen RNAs 4.5S, 5S 16S sowie 23S. In Chloroplasten liegen die Gene für die 16S, 23S, 4.5S und 5S rrnas als Operon vor und werden als einzelnes, großes Vorläufertranskript gebildet (Edwards und Kössel, 1981). Die Maturierung erfolgt in mehreren Stufen und wird durch Endo- und Exonukleasen katalysiert (Strittmatter und Kössel, 1984, Walter et al., 2002, Bollenbach et al., 2005). Die 16S RNA bindet dabei an die kleine 30S-Untereinheit der Ribosomen und ermöglicht die Erkennung der Shine-Dalgarno-Sequenz (üblicherweise GGAGG) der mrna (Lyska et al., 2013). In der 50S-Untereinheit der plastidären Ribosomen sind im Gegensatz zur prokaryotischen Untereinheit (23S und 5S rrna) drei rrnas lokalisiert (23S, 5S und 4.5S)(Chi et al., 2012). Untersuchungen der Sequenz konnten zeigen, dass die 4.5S rrna dabei aus einem Fragment der prokaryotischen 23S rrna entstanden ist (Strittmater und Kössel, 1984). Obwohl die strukturelle Organisation der Ribosomen beschrieben werden konnte, ist der molekulare Mechanismus der Biogenese bis jetzt nicht gänzlich verstanden. Viele Studien zum Mechanismus wurden insbesondere in E.coli durchgeführt. So konnte gezeigt werden, dass bei der Biogenese der Ribosomen eine Rekrutierung von vielen nicht-ribosomalen Proteinen nötig ist (Fromont-Racine et al., 2003; Henras, et al., 2008; Shajani et al., 2011). Dazu zählen AAA-ATPasen, GTPasen, Kinasen, Chaperone und RNA Helikasen (Kaczanowska und Rydén-Aulin; 2007; Shajani et al., 2011). In Höheren Pflanzen konnte eine Vielzahl von Mutanten in der Biogenese der plastidären Ribosomen beschrieben werden. Die meisten davon beruhten auf einem Defekt in der rrna-prozessierung (Schmitz-Linneweber et al., 2006; Beligni und Mayfield, 2008; Zybailov et al., 2009; Nishimura et al., 2010). 1.4 Dominant-Negative Effekte (DNE) Bau und Funktion eines Organismus werden maßgeblich durch das genetische Repertoire und dessen Veränderung infolge von Mutationen bestimmt. Die daraus resultierende genetische Variabilität kann ein Vorteil in der natürlichen Selektion sein und somit das Überleben der Art sichern. Soweit Protein-kodierende Gene betrachtet werden, kann dabei unterschieden werden, ob eine vollständige, eine partielle oder keine Wirkung auftritt. Funktionell können sie dabei in Leseraster-, Nonsense-, Missense- und Splice-Mutationen unterschieden werden (Siegenthaler und Blum, 2006). Die daraus resultierenden Auswirkungen auf den Phänotyp können in mehrere Klassen unterteilt werden. Dazu zählt zum einem die Loss-of-function-Mutation, bei der die Funktionsfähigkeit eines Gen (-produktes) eingeschränkt oder vollständig fehlt. Insbesondere Kompensationen durch andere Gene/Proteine oder auch veränderte Stoffwechselwege können die Auswirkungen vermindern, so dass ein direkter Zusammenhang nicht erkennbar wird. Zu 12

28 Einleitung dieser Form der Mutationen zählen z.b. viele T-DNA Insertionsinaktivierungs- (Knockout) Mutanten von Arabidopsis thaliana. Eine andere Klasse bilden die Gain-of-function-Mutationen, bei denen das Genprodukt durch die Mutation (natürliche oder auch gezielte genetische Veränderung) eine neue, verstärkte und/ oder abnorme Funktion erhält und somit z.b. einen negativen phänotypischen Effekt verursacht. Schließlich kann das Mutanten-Genprodukt zusätzlich zum funktionellen Protein gebildet werden und dieses meist negativ in seiner Wirkung beeinflussen. Man spricht daher von einem dominant-negativen Effekt (DNE) (Veitia, 2006). Die Ursachen der resultierenden physiologischen/molekularen Veränderung können dabei vielfältig sein. Der einfachste Fall kann bei Dimeren beobachtet werden. Besitzt das mutierte Protein weiterhin die Fähigkeit zur Ausbildung eines Dimer-Komplexes mit der nativen Form des Proteins, so kann dies zu einem dominanten Effekt führen, der sich auf den nativen Anteil auswirkt, wodurch die Ausführung der normalen Funktion gestört oder inhibiert wird (Herskowitz 1987, Veitia, 2006). In diesem Fall kann bei einem Gen, das für das mutierte Monomer codiert, von einem dominant-negativen Gen, bei einem Protein das dabei entsteht, von einem dominant-negativen Protein gesprochen werden (Ramalho et al., 2002). DNEs können dabei in allen regulatorischen Prozessen einer Zelle auftreten. So konnten in Arabidopsis thaliana neben DNEs in Chloroplasten (z.b. Cerutti et al., 1995, Pilgrim et al., 1998), Mitochondrien (z.b. Arimura et al., 2003; Xu et al., 2008), Cytosol (z.b. Moreno-Romero et al., 2008) auch solche im Zellkern, dort insbesondere durch veränderte Transkriptionsfaktoren (z.b. Fang und Dong, 2002) festgestellt werden. Wie anhand mehrerer Beispiele gezeigt werden kann, sind DNEs nicht beschränkt auf dimere Proteine, sondern können auch größere Oligomere bis hin zu komplexen Multikomponenten- Proteinen betreffen (Aurelio et al., 2000, Kim et al., 2010). RNA-Polymerasen und mit diesen zusammenwirkende Transkriptionsfaktoren gehören zweifellos in diese Kategorie. Dass solche dominant-negative Veränderungen nicht nur auf die Transkriptionsfaktoren von Eukaryoten beschränkt sind, zeigen Untersuchungen an E.coli. So führte ein überexprimierter, teilveränderter σ 70 - Transkriptionsfaktor zu einer inhibierenden Wirkung, bis zur vollständigen Letalität der Bakterien (Keener und Nomura, 1993). Untersuchungen von DNEs verursacht durch überexprimierte, plastidäre Sigmafaktoren in Arabidopsis thaliana, welche ähnliche Strukturelemente im konservierten Bereich zum bakteriellen σ 70 zeigen ( ), wurden bisher nicht beschrieben. Versuche, das Potential eines solchen experimentellen Ansatzes am Beispiel der plastidären Transkription auszuloten, spielen in der vorliegenden Arbeit eine zentrale Rolle. 13

29 Zielsetzung 2. Zielsetzung Eukaryotische Systeme mit komplexer Struktur-/Funktions-Topologie innerhalb einer Zelle rücken in ihrer Gesamtheit immer weiter in den Fokus der molekular-, zell- und entwicklungsbiologischen Forschung. Durch systemübergreifende Methoden (Genom-/ Transkriptom-/ Proteom-/ Interaktom-Analyse) erschließen sich dadurch vielseitige Vernetzungen einzelner, vormals nicht betrachteter Komponenten. So zeigt die Betrachtung der semiautonomen Chloroplasten in Höheren Pflanzen, dass diese eben nicht mehr einfache Relikter früherer Endosymbionten darstellen, sondern dass sie in ein weitreichendes, funktionelles Netzwerk innerhalb der Zelle eingeschlossen sind (Jung und Chory, 2010). Das Verständnis der Funktion von Proteinen innerhalb eines Systems benötigt oftmals eine Veränderung des steady-state -Zustandes. Eine Vielzahl von Möglichkeiten der (teilweisen oder vollständigen) Stilllegung von Proteinen in Chloroplasten wurden über die Jahre beschrieben, eingeschlossen anti-sense RNA (Knee und Murphy, 1997), T-DNA Insertion (Clough and Bent, 1998) und RNA-Interferenz (Fire et al., 1998; Chuang and Meyerowitz, 2000). Die Deletion einzelner Faktoren (auf DNA-, RNA- oder Proteinebene) führt nicht unweigerlich zu einer direkten negativen Auswirkung, insbesondere wenn es mehrere Mitglieder einer Genfamilie gibt, die eine kompensatorische Rolle des ausgeschalteten Faktors einnehmen können (Redundanz) (z.b. Zhang et al., 2003). Diese Redundanz einzelner Faktoren könnte innerhalb der plastidären Sigma-Familie, welche in Arabidopsis thaliana aus insgesamt sechs Mitgliedern besteht, eine große Rolle bei der Regulation der Transkription spielen. So zeigen viele der Einzelmutanten nur sehr schwache optische Phänotypen (Ausnahme: sig6-2). Molekulare Analysen zeigen oft nur eine Veränderung in rund 3-10% aller plastidärer Transkripte (Schweer, 2010). Bisherige Ansätze in der Arbeitsgruppe gingen eher der Frage nach, ob die plastidäre Zielgentranskription durch die Verschiebung des Sigma-Netzwerks durch Knockout einzelner Faktoren verändert ist (Einzel-/Doppelknockouts (Loschelder et. al., 2006, Schweer et al., 2006)). Andere Arbeiten untersuchten eine veränderte Interaktionsmöglichkeit mit regulatorischen Proteinen (z.b. Phosphorylierungsstellen für Kinasen (Schweer et al., 2009, Schweer et al., 2010)). In der vorliegenden Arbeit wurde hingegen ein neuer Ansatz gewählt, der sich mehr auf die Proteinebene konzentriert. Dieser basiert auf früheren Beobachtungen, wonach bei einem kernlokalisierten Transkriptionsfaktor eine Überexpression eines Teilbereichs zu einem Dominant- 14

30 Zielsetzung Negativen Effekt (DNE) führt (Herskowitz, 1987; Fang und Dong, 2002). Aufgrund von Untersuchungen einfacher Modellsysteme (z.b. Dimere) kann davon ausgegangen werden, dass es zu weitreichenden Folgen innerhalb eines Systems kommt. Im Falle des Transkriptionfaktors könnte es zum Verlust der Bindefähigkeit der Polymerase an Promoterregionen kommen, wodurch ein Teil der Transkription verändert wäre (Veitia, 2007). Da solche Transkriptions-DNEs in Plastiden bisher nicht analysiert wurden, sollte dies in dieser Arbeit durchgeführt werden. Strukturelle Analysen zeigen, dass plastidäre Sigmafaktoren in zwei typische Teilbereiche unterteilt werden können. Nach Abspaltung des Transitpeptids besteht der reife funktionelle Sigmafaktor aus einem (variablen) unkonservierten Bereich (UKB), sowie einem stärker konservierten Bereich (KB). Durch Fusion des UKB bzw. des KB einzelner Sigma-Faktoren an die Transitsequenz innerhalb eines Pflanzenüberexpressionsvektors und Transformation in Arabidopsis thaliana sollte die Auswirkung der Überexpression auf die plastidäre Transkription untersucht werden. Dabei sollte neben der Möglichkeit eines dauerhaft (konstitutiv) überexprimierten Systems, auch ein induzierbares System Verwendung haben. Insbesondere das letztgenannte eröffnet weitreichende Möglichkeiten der Analyse von DNEs, da eine entwicklungsspezifisch, einschaltbare Veränderung herbeigeführt werden kann. In einem weiteren Teil der Arbeit sollte die Möglichkeit der Affinitätsisolierung von Sigma- Faktoren in-vivo untersucht werden. Bisher existieren keine Berichte über eine Isolierung und weitgehende Aufreinigung dieser Faktoren aus Arabidopsis thaliana. Die gleichzeitige Co- Isolierung von Proteinen könnte das Verständnis der Interaktion von Proteinen in den Chloroplasten weiter verbessern. In bisherigen Untersuchungen konnte bereits ein einzelnes Bindeprotein ( DELAYED GREENING 1 DG1) des Sigma-Faktors 6 beschrieben werden (Chi et al., 2010), betrachtet man die prokaryotischen Systeme, so ist die Zahl von Interaktionspartnern der bakteriellen Sigma-Faktoren allerdings deutlich größer (Österberg et al., 2011, Ghosh et al., 2010, Campbell et al., 2008) und es kann nicht ausgeschlossen werden, dass dies auch für Plastiden zutrifft. Zur Isolierung des ATSIG6 als ersten Schritt zur Identifizierung weiterer Interaktionspartner sollte das System des Tandem-Affinity-Purification (TAP) -tag benutzt werden. Vorteil dieses System ist die zweistufige Affinitätsaufreinigung, die eine deutliche Reduktion von Kontaminationen verhindert (Rigaut et al., 1999). 15

31 Material und Methoden: Material 3. Material und Methoden 3.1 Material Chemikalien und Enzyme Chemikalien Chemikalie 17-β-Estradiol Aceton Acrylamid/Bis-Lösung 40% (29:1) Agarose Ammoniumperoxodisulfat (APS) Anti-Digoxigenin-AP, Fab-Fragmente Hersteller Sigma J.T. Baker Roth Life Technologies BRL Roche (150 U, 200 μl) Β-Mercaptoethanol Bis-(2-hydroxyethyl)-imino-tris-(hydroxymethyl)-methan (Bis-Tris) Bromphenolblau BSA CDP-Star (25 mm, 1 ml) Chloroform Coomassie Brilliant Blue G 250 Desoxyribonukleosidtriphosphate DIG- RNA Labeling Mix, 10x conc. Dimethylsulfoxid Dithiothreitol (DTT) Entwickler-Lösung Ethanol Ethidiumbromid Fixierer-Lösung Formaldehyd Formamid Gentamycin (50mg/ml) Glufosinat-Ammonium Sigma Roth Serva Sigma Roche J.T.Baker Serva Promega Roche Roth Sigma-Aldrich Kodak Riedel-de Haën Roth Kodak VWR International Prolab VWR International Prolab Roth Roth 16

32 Material und Methoden: Material GoTaq Flexi Puffer Hefeextrakt HEPES Hygromycin IgG-Sepharose Isoamylalkohol Isopropanol Kanamycin (50 mg/ml) Lambda Phage DNA (5 μg/ μl) Magermilchpulver Magnesiumchlorid (25 mm) 3-Morpholinopropansulfonsäure (MOPS) M-MLV RT-Puffer (5x) N,N,N,N - Tetramethylethylendiamin (TEMED) Natriumazid Natriumchlorid J.T. Natriumdodecylsulfat (SDS) Nitroblau-Tetrazoliumchlorid Nylonmembran + Oligo (dt)-primer Pierce ECL Western Blotting Substrate Ponceau S Random Primer Rifampicin ( 50 mg/ml) Phenol Silwet L-77 Spectinomycin (50 mg/ml) Sulfadiazin (50 mg/ml) SuperSignal West Pico Chemiluminescent Tween 20 Triton X-100 Zeocin Promega Difco Gerbu Roth Sigma Riedel-de Haën VWR International Prolab Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Heirler Promega Roth Promega Sigma-Aldrich Roth Baker Roth Roth Roth Roth Thermo Scientific Sigma-Aldrich Roth Sigma-Aldrich Roth Union Carbide Sigma-Aldrich Gerbu Thermo Scientific Roth Roth Life Technologies Alle weiteren verwendeten Chemikalien wurden in handelsüblicher Qualität von verschiedenen Herstellern über den örtlichen Fachhandel bezogen. 17

33 Material und Methoden: Material Enzyme Enzym Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Konjugat Anti-Mouse IgG (H+L), HRP Konjugat BamHI (10U/ µl) Cellulase R10 DNaseI (1 mg/ml) EcoRI (10U/ µl) dgateway BP-Clonase II Enzyme Mix Gateway LR-Clonase II Enzyme Mix Gotaq Flexi DNA Polymerase (100U/µl) HindIII (10U/ µl) Macerozyme R10 M-MLV Reverse Transkriptase (200 U/ μl) Plant Protease Inhibitor Cocktail Proteinase K (10mg/ml) ProTEV Plus (5 U/ µl) PstI (10U/ µl) Ribonuclease Inhibitor (RNasin 40 U/ μl) RNase A (80 U/mg) SalI (10U/ µl) SacI (10U/ µl) Sp6-RNA-Polymerase (15 U/μl) T4-DNA-Ligase (100 U/μl) T7-RNA-Polymerase (20 U/μl) Hersteller Promega Promega Promega Serva Worthington Promega Life Technologies Life Technologies Promega Promega Serva Promega Sigma Merck Promega Promega Promega Sigma-Aldrich Promega Promega Promega Promega Promega 18

34 Material und Methoden: Material Pflanzenmaterial Arabidopsis thaliana Linie Genotyp Quelle L Heynh. Cv. Columbia - NASC (Nottingham Arabidposis Stock Centre) sig6-2 T-DNA Insertion in Exon 5 Linie 242G06, GABI-Kat, MPI Köln des Sig6 Gens AT2G36990 Rosso et al., 2003 wt 35S::Sig6 Wildtyp mit Sig6 cdna In dieser Arbeit erstellt Insertion, CaMV 35S Promoter sig6-2 35S::Sig6 sig6-2 Linie mit Sig6 cdna In dieser Arbeit erstellt Insertion, CaMV 35S Promoter wt 35S::crSig6 Wildtyp mit cdna Insertion In dieser Arbeit erstellt des konservierten Bereichs von Sig6, CaMV 35S Promoter sig6-2 35S::crSig6 sig6-2 Linie mit cdna Insertion In dieser Arbeit erstellt des konservierten Bereichs von Sig6, CaMV 35S Promoter wt 35S::ucrSig6 Wildtyp mit cdna Insertion In dieser Arbeit erstellt des unkonservierten Bereichs von Sig6, CaMV 35S Promoter sig6-2 35S::ucrSig6 wt 35S::Sig6-TAP sig6-2 Linie mit cdna Insertion In dieser Arbeit erstellt des unkonservierten Bereichs von Sig6, CaMV 35S Promoter Wildtyp mit Sig6-TAP-tag cdna In dieser Arbeit erstellt Insertion, CaMV 35S Promoter sig6-2 35S::Sig6-TAP sig6-2 Linie mit Sig6-TAP-tag In dieser Arbeit erstellt cdna Insertion, CaMV 35S Promoter 19

35 Material und Methoden: Material Escherichia coli Bakterienstämme Stamm Genotyp Quelle DH5α F -, Φ80 lacz M15, reca1, enda1,, (laczya-argfv169) Hanahan, 1983 usdr17 (r - K m - K ), supe44, rela1, deor, gyra96, thi-1 One Shot F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Ф80lacX74 reca1 Life Technologies TOP 10 arad139 Δ/araleu)7697 galu galk rpsl (StrR) enda1 nupg Rhizobium radiobacter (Agrobacterium tumefaciens) GV3101 GV3101::pMP90RK, gen R, kan R Koncz und Schell, Plasmide pbin-ar (Höfgen und Willmitzer, 1990) Vektor zur Überexpression von klonierter DNA in Arabidopsis thaliana unter Verwendung des 35S- CaMV Promoters. Bakterieller und pflanzlicher Selektionsmarker: Kanamycin. pgem-t-easy (Promega) Klonierungsvektor mit bakterieller Blau/Weiß Selektion. Dient der vereinfachten Klonierung amplifizierter Fragmente und anschließender in-vitro Transkription (T7- und Sp6- RNA-Polymerase Promotoren). Bakterieller Selektionsmarker: Ampicillin. pdonr zeo (Life Technologies) Entry-Vektor zur Klonierung innerhalb des Gateway Systems. Beinhaltet die spezifischen attp-sites für die BP-Clonase Reaktion. Bakterieller Selektionsmarker: Zeocin. pmdc7 (Curtis und Grossniklaus, 2003) Destination-Vektor innerhalb Gateway Systems. Beinhaltet die spezifischen attr-sites für die LR- Clonase Reaktion. Durch das XVE-Element kann die Expression mit Hilfe von 17-β-Estradiol induziert werden. Bakterieller Selektionsmarker: Spectinomycin, pflanzlicher Selektionsmarker: Hygromycin. 20

36 Material und Methoden: Material pmdc32 (Curtis und Grossniklaus, 2003) Destination-Vektor innerhalb des Gateway Systems. Klonierung durch attr-sites bei der LR- Clonase Reaktion. Konstitutive Überexpression in Pflanzen durch einen doppelten 35S CaMV Promoter. Bakterieller Selektionsmarker: Kanamycin, pflanzlicher Selektionsmarker: Hygromycin. pmdc84 (Curtis und Grossniklaus, 2003) Destination-Vektor innerhalb des Gateway Systems. Klonierung durch attr-sites bei der LR- Clonase Reaktion. Die Expression führt zur Fusion mit einem C-terminalem GFP, wodurch eine mikroskopische Lokalisation möglich wird. Bakterieller Selektionsmarker: Kanamycin, pflanzlicher Selektionsmarker: Hygromycin. pearlygate 205 (Early et al., 2006) Destination-Vektor innerhalb des Gateway Systems. Klonierung durch attr-sites bei der LR- Clonase Reaktion. Die Expression führt zur Fusion mit einem C-terminalen TAP-tag, dies ermöglicht eine Zwei-Stufen Affinitätschromatographie. Bakterieller Selektionsmarker: Kanamycin, pflanzlicher Selektionsmarker: Basta. 21

37 Material und Methoden: Material Klone pbin-ar/sig6 (Loschelder et al., 2006) pdonr zeo /KBSig6 (Dissertation, Bock, 2013) pdonr zeo /UKBSig6 (Dissertation, Bock, 2013) pdonr zeo /Sig6 (in dieser Arbeit) pmdc7/kbsig6 (in dieser Arbeit) pmdc32/sig6 (in dieser Arbeit) pmdc32/kbsig6 (in dieser Arbeit) pmdc32/ukbsig6 (in dieser Arbeit) pmdc84/kbsig6 (in dieser Arbeit) pearlygate 205/Sig6 (in dieser Arbeit) pgem-t-easy/tpsig6 (S-Block, Pieta, 2009) pgem-t-easy/kbsig6 (S-Block, Pieta, 2009) pgem-t-easy/tp-kbsig6 (S-Block, Pieta, 2009) pgem-t-easy/tp-ukbsig6 (S-Block, Pieta, 2009) pgem-t-easy/psba (Loschelder et. al., 2006) pgem-t-easy/atpb (Loschelder et. al., 2006) pgem-t-easy/accd (Loschelder et. al., 2006) pgem-t-easy/rbcl (Loschelder et. al., 2006) pgem-t-easy/rbcs (Dissertation, Loschelder, 2007) pgem-t-easy/rrn4.5 (in dieser Arbeit) pgem-t-easy/rrn16 (Dissertation, Loschelder, 2007) pgem-t-easy/rrn23 (Bachelorarbeit, Just, 2012) 22

38 Material und Methoden: Material Oligonukleotide Die im folgenden Abschnitt benannten Oligonukleotide wurden unter Berücksichtigung einzelner Parameter (Sequenzlänge, Temperatur, GC-Gehalt, Restriktionsschnittstellen) mit Hilfe von Primer3web ( bzw. Primerquest ( erstellt. Die Synthese erfolgte von der Firma MWG-Biotech AG mit der Reinigungsqualität HPSF HighPuritySaltFree. Oligonukleotid AtSig1_for AtSig1_rev AtSig2_for AtSig2_rev AtSig3_for AtSig3_rev AtSig4_for AtSig4_rev AtSig5_for AtSig5_rev AtSiG6_for AtSig6_rev AtcrSig6_for AtcrSig6_rev AtucrSig6_for AtcrSig6_rev AtucrSig6_GW_for AtucrSig6_GW_rev AtcrSig6_GW_for AtcrSig6_GW_rev AtSig6_GW_for AtSig6_GW_rev 18S_for 18S_rev AtTPSig6_for AtucrSig6_rev AtcrSig6_rev AtTPcrSig6_for AtTPcrSig6_rev Nukeotidsequenz 5'-GAATTCGGATCCATGGCTACTGCAGCTGTTATAGGA-3' 3'-CTGCAGGTCGACTCAATTCTTAAGGATCATTGCCTC-5' 5'-GAATTCCCCGGGATGTCTTCTTGTCTTCTTCCTCAG-3' 3'-CTGCAGGTCGACTTATGATTGTGCAACCAAGTATTG -5' 5'-GAATTCGGATCCATGGCTTCCTTCAATTCGTTCCCC-3' 3'-CTGCAGGTCGACTTACTGATTCAAATAATATCTGAG-5' 5'-GAATTCGGATCCATGGCGACGACGATTCCCACTACA-3' 3'-CTGCAGGTCGACTTATTCACTAGAGGAATAGTATAT-5' 5'- ATGGGAGTTGTGTCTATTTCA -3' 3'-TTAGACGATGTATTGACGAAG-5' 5'- ATGGAAGCTACGAGGAACTTGGTT -3' 3'- CTAGACAAGCAAATCAGCATAAGC-5' 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGCGCTTCAGCTCTTCTTGTGGG-3' 3'- ATGGAAGCTACGAGGAACTTGGTT -5' 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGCGCTTCAGCTCTTCTTGTGGG-3' 3'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTACATCATTATCAGCCCCTTGTTTA-5' 5'- GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGGAAGCTACGAGGAACTTGGTT-3' 3'-TATTTGTTCCCCGACTATTACTACATCCTGGGTCGAAAGAACATGTTTCACCAGGG-5' 5'- GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGCGCTTCAGCTCTTCTTGTGGG -3' 3'-GAATACGACTAAACGAACAGATCCTGGGTCGAAAGAACATGTTTCACCAGGGG-5' 5'- GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGGAAGCTA -3' 3'-GAATACGACTAAACGAACAGATCCTGGGTCGAAAGAACATGTTTCACCAGGGG-5' 5'- AACCCCGACTTATGGAAG -3' 3'-TAAGACCAGGAGCGTATC-5' 5'-ATGGAAGCTACGAGGAACTT-3' 3'-ATCGTCCACATCGTTTGATTTTGG-5' 3'-CTAGACAAGCAAATCAGCATAAGCATG-5' 5'-ATCTCGACATTTTCCTGATGCGCTTCAGCT-3' 3'-AGCTGAAGCGCATCAGGAAAATGTCGAGAT-5' 23

39 Material und Methoden: Material Antikörper Ein Großteil der benutzen Antikörper wurde von der Firma Agrisera, Schweden bezogen. Ein Teil von nicht käuflich erwerbbaren Antikörpern konnte durch freundliche Leihgabe der Arbeitsgruppe Photobiotechnologie, RUB (Dissertation Phillipps, 2012) analysiert werden. Die jeweilige Verdünnung wurde zunächst durch Kontrollexperimente herausgearbeitet, um mögliche Kreuzreaktionen zu vermeiden. Name Antigen(e) Verdünnung Quelle Aktin2 Bestandteil des eukaryotischen Zytoskeletts 1 : Agrisera AtpB β-untereinheit der ATP-Synthase 1 : 2500 Agrisera Cal Calmodulin-Bindeprotein 1 : 5000 Millipore LhcB2 Lichtsammelkomplexe des PS II 1 : 5000 Agrisera PsaA Zentrales Protein des PS I 1 : 1000 Agrisera PsaC Fe-S Bindeprotein des PS I 1 : 1000 Agrisera PsaD D-Untereinheit des PS I 1 : 1000 Agrisera PsbA D1 Protein des PS II 1 : 2500 Agrisera PsbC CP43 Protein des PS II 1 : 1000 Agrisera PsbL L-Untereinheit des PS II 1 : 500 Philipps,Dissertation 2012 PetA Cytochrom f Untereinheit des b 6 f Komplexes 1 : 2500 Agrisera PetB Cytochrom b6 Untereinheit des b 6 f Komplexes 1 : 5000 Philipps,Dissertation 2012 PetE Plastocyanin 1 : 5000 Philipps, Dissertation 2012 RbcL Große Untereinheit der RubisCO 1 : Agrisera RbcS Kleine Untereinheit der RubisCO 1 : Agrisera TAP TAP-tag (CSSGALDYDIPTTASENLYFQ) 1 : 5000 Antikoerper-online anti-kaninchen Kaninchen-IgG 1 : 5000 Promega IgG-Peroxidase-Konjugat anti-maus Maus-IgG 1 : 5000 Promega IgG-Peroxidase-Konjugat 24

40 Material und Methoden: Material Nährmedium Für die Anzucht der Mikroorganismen in Flüssigkulturen oder auf Festagarplatten wurden die unten aufgeführten LB-Medien (Bertani et al., 1951) verwendet. Alle Medien wurden für 30 min bei 121 C autoklaviert. Zur Herstellung von Festagarplatten wurde dem entsprechend benötigtem Medium 2,4 % (w/v) Agar hinzugefügt. LB-Medium: 1 % (w/v) Pepton, 1 % (w/v) NaCl, 0,5 % (w/v) Hefeextrakt mit 1M NaOH auf ph 7,5 einstellen. LB amp -Medium: LB-Medium mit 50µg/ml Ampicillin LB kan -Medium: LB-Medium mit 50µg/ml Kanamycin LB gen,rif,kan -Medium: LB-Medium mit 25µg/ml Gentamycin, 50µg/ml Rifampicin und 50µg/ml Kanamycin LB gen,rif,spec -Medium: LB-Medium mit 25µg/ml Gentamycin, 50µg/ml Rifampicin und 100µg/ml Spectinomycin LB cam -Medium: LB-Medium mit 50µg/ml Chloramphenicol LB zeo -Medium: LB-Medium mit 50µg/ml Zeocin Medien zur Anzucht von Arabidopsis thaliana Für die Anzucht von Arabidopsis unter sterilen Kontrollbedingungen wurde folgendes MS-Medium verwendet. MS-Medium, ph 5,6-5,7 (KOH) Murashige und Skoog, 1962 Makroelemente: Mikroelemente: Eisen-Quelle: Vitamine: 1,65 g/l NH 4 NO 3 1,9 g/l KNO 3 0,44 g/l CaCl 2 0,37 g/l MgSO 4 16,3 mg/l H 3 BO 3 22,3 mg/l MnSO 4 8,6 mg/l ZnSO 4 0,83 mg/l KJ 37,2mg/l Na 2 EDTA 27,8 mg/l FeSO 4 0,5 mg/l Nicotinsäure 0,5 mg/l Pyridoxin HCl 0,1 mg/l Thiamin HCl 2 mg/l Glycin 100 mg/l myo-inositol 0,17 g/l KH 2 PO 4 0,025 mg/l CuSO 4 0,56 g/l FeSO 4 0,025 mg/l CaCl 2 0,75 g/l Na 2 EDTA 0,25 mg/l Na 2 MoO 4 ph 5,6 5,7, 1% (w/v) Saccharose 25

41 Material und Methoden: Material Gele, Puffer und Lösungen Bis-Tris Gel 10% (w/v) Acrylamid (Stocklösung: 40% (w/v), 29:1), 350mM Bis-Tris/ HCl ph. 6,6, 0,035% (w/v) APS, 0,12% (v/v) TEMED Blockierungslösung Coomassie-Entfärber Coomassie-Färbelösung DNA-Probenpuffer 10% (w/v) Magermilchpulver in TBS-T Puffer 50% (v/v) Methanol, 10% (v/v) Essigsäure 50% (v/v) Methanol, 12% (v/v) Essigsäure, 0,5% (w/v) Coomassie G % Ficoll (w/v), 0,5% (v/v) SDS, 0,1% (w/v) Xylencyanol, 0,1% (w/v) Bromphenolblau, 10mM EDTA Extraktionspuffer 200mM Tris-HCl ph9, 200mM KCl, 35mM MgCl 2, 25mM EGTA, 200mM Saccharose, 1% (v/v) Triton X-100, 2 %(w/v) PTE, 0,5 mg/ml Heparin, 25 µg/ml Cycloheximid 100mM β-mercaptoethanol, 100 µg/ml Chloramphenicol TAP-Puffer 100 mm NaCl, 50 mm Tris HCl, ph 7.5, 0.5% (v/v) Triton X-100, 1 mm phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), 5 mm NaF, 0.2% (v/v) Plant Protease Inhibitor Cocktail Ponceau S Färbelösung 1% (w/v) Ponceau S, 5% (v/v) Essigsäure Protoplasten Puffer A 1,5% (w/v) Cellulase R10, 0,4% (w/v) Macerozyme R10, 400mM Mannit, 20mM KCl, 20mM MES, 10mM CaCl 2, 0,15 (w/v) BSA MES-Puffer 500mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure, ph 5,7 MOPS-Puffer (10x) 500mM 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure, 500mM Tris, 10mM EDTA RNA-Gel (denaturierend) 1,2% (w/v) Agarose, 1x MOPS-Puffer, 6,7% (v/v) Formaldehyd (entionisiert) RNA-Probenpuffer 50% (v/v) Formamid, 6% (v/v) Formaldehyd (entionisiert), 1x MOPS-Puffer, 10% (v/v) Glycerin, 0,05% (w/v) BPB Saccharosestammlösung 40 mm Tris-HCl ph8, 20 mm KCl, 10 mm MgCl 2, 25 mm EGTA, 100 µg/ml Chloramphenicol, 25 µg/ml Cycloheximid, 55 % (w/v) Saccharose SDS-MOPS-Laufpuffer (10x) 500mM MOPS, 500mM Tris, 10mM EDTA, 1%(v/v) SDS SSC-Puffer (20x) 3M NaCl, 300mM Natriumcitrat TBE-Puffer 89mM Tris, 89mM Borsäure, 2mM EDTA 26

42 Material und Methoden: Material TBS-T Transferpuffer 50mM Tris/HCl ph 8, 150mM NaCl, 0,3% (v/v) Tween-20 25mM Tris, 192mM Glycin, 20% (v/v) Methanol Verwendete Geräte Bezeichnung Bio-Link BLX 254 Compact Line OV 4 Concentrator 5301 E.coli Pulser Kapillar-Blotting Apparatur ph-meter LSM 510 Mini-Protean III Mini Trans-Blot PAM 2100 Phosphoimager FLA-3000 Sterilbank Gradienten-PCR-Cycler Transilluminator UV Solo Hersteller Biometra Biometra Eppendorf BioRad Roth Schott Carl Zeiss BioRad BioRad Heinz Walz GmbH Fuji GelaireFlow Laboratories Biometra Biometra Internetadressen Clustal W2 BLAST NCBI Primerquest Primer3web Restrictionmapper TAIR Computergestützte Bildbearbeitung Die Detektion und digitale Aufnahme der belichteten Röntgenfilme erfolgte entweder mit dem Phosphoimager FLA-3000 (Fuji, Tokyo), oder einer ccd-kamera im Transilluminator UV Solo (Biometra). Alle Abbildungen wurden mit Hilfe des Programms Corel Draw X6 erstellt und inhaltsgetreu bearbeitet. 27

43 Material und Methoden: Methoden 3.2 Methoden Alle nicht gesondert aufgeführten Methoden wurden nach Ausubel et al., ; Maniatis et al., 1982 und Sambrook et al., 1989 oder nach Angaben des Herstellers durchgeführt Kultivierung der Organismen Wachstum von Bakterien in Flüssigkultur Die Anzucht von E. coli wurde bei 37 C und 200 U/min auf Rundschüttlern als Flüssigkultur in LB- Medium mit entsprechendem Antibiotikum als Selektionsdruck in Erlenmeyerkolben durchgeführt. Rhizobium radiobacter GV3101 wurde in LB-Medium mit 25 µg/ml Gentamycin, 50 µg/ml Rifampicin sowie dem entsprechendem Selektionsantibiotikum für zwei Tage bei 28 C und 200 U/min angezogen Wachstum und Selektion von Bakterien auf LB-Platten Die Anzucht auf LB-Festmedium erfolgte durch Ausstreichen einer geringen Menge Bakterien und anschließender Inkubation über Nacht bei 37 C für E. coli mit entsprechendem Antibiotikum bzw. für zwei Tage bei 28 C für Rhizobium radiobacter GV3101 mit 25 µg/ml Gentamycin, 50 µg/ml Rifampicin und entsprechendem Antibiotikum Anzucht von Arabidopsis thaliana Das Saatgut wurde unter sterilen Bedingungen durch Schütteln und Schwenken in 70% (v/v) Ethanol für 1 min und in 5% (v/v) Natriumhypochlorit für 5 min oberflächensterilisiert. Durch fünfmaliges Waschen mit Wasser für 5 min wurde im Folgenden das Desinfektionsmittel entfernt. Das Samenmaterial wurde in 1,5 ml 0,1% (w/v) Agarose aufgenommen und auf verfestigtes MS- Medium in einer Petrischale verteilt. Zur Stratifikation der Samen wurden diese in Petrischalen für 2 Tage abgedunkelt bei 4 C aufbewahrt und im Folgenden zur Anzucht im Phytotron unter Kurztagbedingungen (8h Licht, 120 µeinstein x cm -2 x min -1, Tagestemperatur 22 C, 16h Dunkelheit bei 18 C Nachttemperatur) kultiviert. Die Pflanzen wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren Verwendung bei -85 C gelagert. 28

44 Material und Methoden: Methoden Analytik Bestimmung des Chlorophyllgehalts Zur Bestimmung des Chlorophyllgehalts wurden innerhalb einer Einzelmessung mindestens 30 Keimlinge (5, 10 und 14 Tage) vom MS-Medium entnommen, gewogen und mit 1 ml 80%-Aceton in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß über Nacht bei 4 C inkubiert. Bei älteren Pflanzen wurden mindestens drei Blätter einer Pflanze abgetrennt, gewogen und ebenfalls mit 80% Aceton versetzt. Die Lösungen wurde am nächsten Tag für eine Minute bei 12,000 g zentrifugiert und im Folgenden die optische Dichte bei 663nm und 645nm bestimmt. Die Berechnung des Chlorophyllgehalts wurde nach Arnon (1949) durchgeführt Bestimmung der Zelldichte von E.coli Die optische Dichte von E.coli Bakterienkulturen wurde bei einer Wellenlänge von 600 nm mit einem Photometer unter Verwendung des Mediums als Referenz bestimmt. Bei dieser Wellenlänge entspricht eine OD von 1,0 einer Zelldichte von ca. 3 x 10 7 Zellen pro ml Kultur Isolierung von Protoplasten und Anregung von GFP und Chlorophyll Etwa Kotyledonen bzw Rosettenblätter wurden mit Hilfe eines Skalpells in etwa 0,5 mm große Streifen geschnitten. Diese wurden in 25ml Protoplastenpuffer A in einem Exsikkator unter Vakkum im Dunkeln für Stunden inkubiert. Durch leichtes Schwenken der Petrischale werden die Protoplasten von Zellwandresten befreit und mit Hilfe eines Nylonsiebs (45µm) abfiltriert. Die Aufnahme der Protoplasten und der GFP Fluoreszenz wurden am Lehrstuhl für Zellmorphologie und molekulare Neurobiologie, Ruhr-Universität Bochum durchgeführt. Zur Anregung und Detektion wurde das LSM 510 Meta der Firma Carl Zeiss benutzt. Das GFP wurde bei 488nm angeregt und die Emission bei 511nm detektiert, für das Chlorophyll lag die Anregung bei nm und die Emission wurde bei 650nm detektiert Isolierung von Nukleinsäuren Isolierung genomischer Desoxyribonukleinsäuren Genomische DNA wurde mit dem DNeasy Plant Mini Kit der Firma Qiagen, Hilden nach Herstellervorgaben isoliert Isolierung von bakteriellen Plasmid-Desoxyribonukleinsäuren Plasmid-DNA aus Bakterien wurde nach Birnboim und Doly (1979) bzw. mit dem Plasmid-DNA Purification Kit der Firma Macherey & Nagel isoliert. 29

45 Material und Methoden: Methoden Isolierung von Ribonukleinsäuren aus Arabidopsis thaliana Die Isolierung von Ribonukleinsäuren aus Pflanzenmaterial wurde nach der Methode von Chomzynski und Sacchi (1987) durchgeführt Isolierung Polysomen-assoziierter mrna Zur Isolierung Polysomen-assoziierter mrna wurden 400mg frisches Pflanzenmaterial mit einem Mörser und N 2 zu feinem Pulver homogenisiert. 1ml Extraktionspuffer wurde hinzugegeben und bis zum vollständigen Auftauen des Materials weiter homogenisiert. Zur Hemmung aller RNasen wurde ein RNase-Inhibitor (RNasin, Promega) bis zur Endkonzentration von 0,5 U/µl hinzugegeben und für 10 Minuten bei 4 C inkubiert. Nach einer anschließenden Zentrifugation (5 min, g und 4 C) wurde der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit 0,5% (w/v) Natriumdeoxycholat versetzt. Dies wurde bei 4 C für 5 Minuten inkubiert und für 15 Minuten zentrifugiert (11.000g 4 C). Der Überstand (~400µl) wurde auf einen 15%-55% (w/v) Saccharosegradienten (ca. 4ml) geladen und bei g, 4 C für 65 Minuten im Sorvall TST 60.4 Rotor zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden vom Gradient jeweils 280µl Fraktionen entnommen und die enthaltene RNA durch eine Phenol/Chloroformextraktion (siehe ) isoliert Herstellung DIG-markierter RNA-Sonden durch in-vitro Transkription Die Herstellung von Digoxigenin-11-UTP -markierten RNA-Sonden für Northern Analysen wurde den Herstellerangaben entsprechend durchgeführt (DIG User s Manual, Roche Diagnostics). Dabei wurden zunächst die unter genannten Plasmide mit Hilfe von Restriktionsenzymen linearisiert. Nach erfolgter in-vitro Transkription wurde die DNA-Matrize durch einen DNaseI- Verdau (37 C, 15min) entfernt Trennung von Nukleinsäuren Trennung von Ribonukleinsäuren Die Trennung von Ribonukleinsäuren erfolgte in einem denaturierenden Agarosegel (3.1.10) durch Anlegen einer Spannung von 80 Volt für rund zwei Stunden. Zur Kontrolle der gleichbleibenden Beladung wurden die Gele anschließend für 15 Minuten in eine 0,1 Ethidiumbromid-Färbelösung gegeben und danach für zwei Stunden in H 2 0 entfärbt. 30

46 Material und Methoden: Methoden Trennung von Desoxyribonukleinsäuren Desoxyribonukleinsäuren wurden in einem nativen 1% Agarosegel (w/v) in 1x TBE Puffer unter Anlegen einer Spannung von 120 Volt für 50 Minuten getrennt. Die Anfärbung der Banden erfolgte durch die Inkubation des Gels für 15 min in einer 0,1 Ethidiumbromid-Färbelösung Northern-Transfer von Ribonukleinsäuren RNA-Proben wurden nach der gelelektrophoretischen Auftrennung (siehe ) auf eine positiv geladene Nylonmembran durch Kapillarkräfte transferiert. Als Transferpuffer wurde dabei 10X SSC verwendet (3.1.10) Hybridisierung und Detektion von Nukleinsäuren Die Hybridisierungen mit DIG-markierten DNA-Fragmenten sowie die anschließende Chemilumineszenz-Detektion wurden nach Herstellerangaben durchgeführt. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 68 C. Die Detektion konnte durch die Umsetzung des Substrates CDP-Star durch ein Anti-Digoxigenin-Alkalische-Phosphatase-Konjugat durchgeführt werden Amplifizierung von Nukleinsäuren Reverse Transkription Die Synthese von cdna aus isolierter RNA wurde mit Hilfe der RNA-abhängigen DNA-Polymerase aus dem Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV, Promega) nach Herstellerangaben durchgeführt. Die synthetisierte cdna konnte direkt als Matrize für nachfolgende PCR-Versuche genutzt werden Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine Methode, in-vitro DNA-Fragmente mit Hilfe einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase zu vervielfältigen (Mullies und Faloona, 1987). Die Vervielfältigung von DNA-Abschnitten wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt. Initiale Denaturierung für 3 min bei 95 C, Denaturierung für 45 sec. bei 95 C, Annealing für 45 sec. bei C (entsprechend dem GC-Gehalt der Oligonukleotide), Elongation entsprechend der Größe des Produktes (Richtwert: 60 sec. pro 1000bp) bei 72 C. Zur Endprodukt-Amplifizierung wurden diese Zyklen 36x wiederholt. Bei den RT-PCR Analysen wurde die Zyklenzahl für jedes Produkt individuell in Vorversuchen herausgearbeitet. 31

47 Material und Methoden: Methoden Komponente Gotaq-Puffer MgCl 2 Oligonukleotide dntps GoTaq-HotStar- Polymerase Konzentration 1 x 0,75 mm je 50pmol 0,1 mm 1 U DNA-Sequenzierung Alle notwendigen DNA-Sequenzierungen wurden am Lehrstuhl Molekulare Neurobiochemie der Fakultät für Chemie, Ruhr-Universität Bochum unter Verwendung des Kapillarelektrophoresegerätes 3130cl Genetic Analyser (Applied Biosystems) nach der Kettenabbruchmethode (Sanger et al., 1977) durchgeführt. Die Auswertung der erhaltenen Daten erfolgte durch das Programm Sequence Scanner 1.0 (Applied Biosystems) Elution von DNA Fragmenten Die Isolierung und Aufreinigung eines PCR-Produktes aus einem Agarosegel ( ) erfolgte mit dem Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) Isolierung von Gesamtproteinen aus Arabidopsis thaliana Gesamtproteine aus schockgefrorenem Material wurde mit Hilfe des 5x PEB-Puffers versetzt mit 0,4mM AEBSF nach Herstellervorgaben isoliert (Agrisera). Für jede Isolierung wurden etwa 100mg Material verwendet. Die Konzentrationsbestimmung der isolierten Proteine erfolgte wie unter beschrieben Affinitätsaufreinigung von TAP-tag markierten Proteinen Zur Isolierung von TAP-tag markierten Proteinen wurden etwa 20g Blattmaterial mit 60ml TAP- Puffer in einem Mixer homogenisiert und für etwa 30min in einem Überkopfschüttler inkubiert. Nach Trennung der groben Bestandteile durch drei Lagen Verbandmull, wurde der Durchlauf für 10min bei 1,500g, 4 C zentrifugiert. Der Überstand wurde in Ultrazentrifugationsröhrchen überführt und für 60min bei 100,000g, 4 C zentrifugiert. Nach der Zentrifugation konnte der Überstand entnommen und die Proteinkonzentration (3.2.11) bestimmt werden. Typische Konzentrationen sollten dabei etwa 1 bis 5µg/µl sein. Zum Überstand wurden etwa 100µl IgG- Sepahrose hinzugegeben und über Nacht bei 4 C in einem Überkopfschüttler inkubiert. Die Lösung wurde am nächsten Tag auf eine Chromatographie-Säule gegeben und der Durchlauf 32

48 Material und Methoden: Methoden aufgefangen. Die zurückgehaltene IgG-Speharose wurde mit etwa 20ml TAP-Puffer gewaschen. Zur Abspaltung des Protein-A Anteils des TAP-tag wurde zur IgG-Sepharose etwa 50U ProTEV Plus Protease hinzugegeben und über Nacht bei 4 C inkubiert. Nach Elution konnten die enthaltenen Proteine durch eine Bis-Tris PAGE (3.2.12) aufgetrennt und immunohistologisch (3.2.13) untersucht werden Bestimmung des Proteingehalts Die Bestimmung der Proteinkonzentration wurde nach Herstellervorgaben (Roti-Quant universal, Roth) basierend auf der Biuret-Methode durchgeführt. Im Unterschied zu der meist üblichen Bradford Bestimmung von Proteinkonzentrationen zeichnet sich diese Nachweismethode durch eine deutlich höhere Toleranz gegenüber Detergenzien aus (lt. Roth-Handbuch: 1% SDS, 1x Triton X-100) Gelelektrophorese von Proteinen (Bis-Tris-PAGE) Die Auftrennung von Proteinen nach ihrem Molekulargewicht (kda) erfolgte in durchgängigen 10% Polyacrylamid-Bis-Tris Gelen (3.1.10). 5 µg jeder Probe wurden mit 4x LDS Probenpuffer (Life Technologies) versetzt und bei 100 C für 5 Minuten denaturiert. Nach sofortigem Abkühlen auf 4 C erfolgte die Auftrennung bei 120 Volt für etwa 90 Minuten. Zur Beladungskontrolle wurde nach jeder Bis-Tris-PAGE ein zusätzliches Gel durch Coomassie angefärbt Elektrophoretischer Transfer von Proteinen auf eine Nitrocellulose- Membran und anschließende Immunodetektion Nach erfolgter Bis-Tris PAGE wurden die aufgetrennten Proteine in einer Blottingapparatur der Firma BioRad elektrophoretisch bei etwa 100 Volt für 75 min im Tank-Blot Verfahren auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen. Zur Überprüfung der erfolgreichen Übertragung wurden die Proteinbanden durch eine Ponceau-S Lösung sichtbar gemacht. Zur Detektion der Proteine mittels spezifischer Antikörper wurden die Membranen zunächst für mindestens eine Stunde in der Blockierungslösung geschwenkt. Anschließend erfolgte eine Inkubation der jeweiligen primären Antikörper (3.1.7) in der angegebenen Verdünnung, gelöst in Blockierungslösung, für mindestens zwei Stunden, meist jedoch über Nacht. Durch mehrmaliges Waschen für jeweils 5 min (4-5x mit TBS-T) wurden überschüssige Antikörper von der Membran entfernt. Anschließend konnte die Membran für eine Stunde im Sekundär-Antikörper inkubiert werden. Nach erneutem 33

49 Material und Methoden: Methoden mehrmaligem Waschen konnte die Detektion mittels ECL nach Herstellervorgaben durchgeführt werden Agrobakterium-vermittelte Transformation Die Transformation der Teilbereiche bzw. Volllängenkonstrukte des AtSig6 in den Wildtyp und die Knockoutmutante sig6-2 wurde nach der floral dip Methode durchgeführt (Clough und Bent, 1998). Die transformierten Pflanzen wurden mit spezifischen Antibiotika (siehe 3.1.4) selektiert und die eingebrachten Konstrukte durch eine PCR ( ) nachgewiesen β-estradiol induzierte Expression Alle zu untersuchenden Linien wurden bis zu den angegebenen Zeitpunkten auf MS-Medium (siehe 3.1.9) mit jeweiligem Antibiotikum unter sterilen Bedingungen angezogen. Zur Induktion wurde eine 5µM 17-β-Estradiol Lösung in 0,05% (v/v) DMSO, versetzt mit 0,02% (v/v) Silwet L-77, erstellt. Als Kontrolllösung wurde die gleiche Lösung ohne 17-β-Estradiol eingesetzt. Die Pflanzen wurden mit Hilfe von Pumpsprühflaschen bis zur vollständigen Benetzung besprüht und bis zu den angegebenen Zeitpunkten unter Kurztagbedingungen weiter kultiviert. Die RNA wurde daraufhin wie unter beschrieben isoliert Gateway-spezifische Klonierung Die Gateway-spezifische Klonierung beruht auf der Rekombination verschiedener attachment - Sequenzen (att-sites) zwischen einem PCR-Produkt (attb1/2) und einem Entry-Vektor (attp1/2) innerhalb einer BP-Clonase-Reaktion bzw. zwischen einem Entry-Vektor (attl1/2) und einem Destination Vektor (attr1/2) innerhalb einer LR-Clonase-Reaktion. Es stellt eine vereinfachte Klonierung im Laboralltag da, bestehende PCR-Produkte können nach erfolgreicher BP-Clonase- Reaktion in alle Gateway-spezifischen Destination Vektoren kloniert werden. Somit muss keine Rücksicht auf eventuelle Probleme mit Restriktionsschnittstellen genommen werden. Diese Rekombination wird durch einen Mix von Enzymen durchgeführt, welche wie folgt enthalten sind: BP-Clonase Mix: Integration Host Factor aus E.coli (IHF) und einer Integrase (INT) aus dem λ- Phagen. LR-Clonase Mix: IHF, INT und eine Excisionase (XIS) ebenfalls aus dem λ-phagen. 34

50 Material und Methoden: Methoden Gateway-kompatible PCR-Produkte Im Rahmen vorausgehender Arbeiten (S-Block, Pieta, 2009) wurden die benötigten Konstrukte in den pgem-t-easy-vektor kloniert. Dazu wurde zum einem ein Konstrukt bestehend aus der Transitsequenz und dem unkonservierten Bereich des ATSIG6 in einer PCR ( ) erstellt. Die Sequenzbereiche des Sigmafaktors (Abb.3) zeigen hierbei, dass diese Teilbereiche nativ bereits aneinandergereiht vorliegen und somit durch die Wahl geeigneter Primer amplifiziert werden können. Zur Amplifizierung des konservierten Bereichs mit einer Transitsequenz mussten zunächst diese einzeln amplifiziert werden. In einer Fusions-PCR wurden diese dann zu einem Gesamtkonstrukt amplifiziert und dienten dann als Template für die Erstellung von Gatewaykompatiblen Konstrukten durch Anfügen von attb1/2 Sequenzbereichen (für Fusions-PCR, siehe S- Block Bericht Pieta, 2009). Diese Produkte konnten nach Aufreinigung und Überprüfung durch Sequenzierung für alle weiteren Reaktionen verwendet werden BP-Clonase Reaktion Die Gateway kompatiblen PCR-Produkte wurden in der BP-Clonase-Reaktion durch Rekombination in den pdnor zeo Entry-Vektor eingebracht. Die genutzten Volumina und Mengen wurden nach den Richtlinien des Herstellers eingesetzt. Zur Klonierung wurden die erstellten PCR- Produkte ( ) mit dem pdnor zeo Entry-Vektor und einem TE-Puffer gemischt. Nach Inkubation für 18h bei 25 C wurde 2µg Proteinase K hinzugegeben. Nach einem 10-minütigen Verdau der Proteine bei 37 C konnte diese Lösung zur Transformation eingesetzt werden. Nach der Transformation in TOP10 E.coli Zellen und Selektion auf LB-Medium, versetzt mit Zeocin, wurde die erfolgreiche Rekombination in einer Sequenzierung (siehe ) bestätigt. Diese Entry-Klone konnten nun für alle weiteren Klonierungen benutzt werden LR-Clonase-Reaktion Nach erfolgreich durchgeführten BP-Clonase-Reaktionen konnten die Entry-Klone für die weiteren Transformationen in ihre Zielvektoren (Destination-Vektor, siehe 3.1.4) genutzt werden. Die Vorgehensweise ist äquivalent zu der BP-Clonase-Reaktion ( ) mit Ausnahme der Benutzung des LR-Clonase Mixes. Die erfolgreiche Klonierung wurde ebenfalls in einer Sequenzierung bestätigt. 35

51 Ergebnisse 4. Ergebnisse Wie bereits in der Einleitung dargestellt, wird die plastidäre Transkription von Arabidopsis thaliana neben einer monomeren RNA-Polymerase vom T3/T7-Phagentyp (NEP) durch eine Multikomponenten-Polymerase vom Bakterien-Typ (PEP) ausgeführt. Als essentielle Untereinheit zur Formation und Regulation des aktiven PEP-Holoenzyms nehmen insgesamt sechs Sigmafaktoren (AtSIG1-6, Produkte der Sigmagene AtSig1-6) dabei eine zentrale Rolle ein (Allison, 2000). Wie bei bakteriellen Systemen hat sich die Funktionsanalyse zunächst vor allem auf gezielt veränderte Sigmagen-Mutanten gestützt (Kanamaru et al., 2001; Favory et al., 2005; Nagashima et al., 2004; Ishizaki et al., 2005; Loschelder et al., 2006). Ein anderer Weg, basierend auf inhibitorisch wirkenden Protein-Varianten in einem Wildtyp- System, ist im Falle von E. coli Sigma70 mit Erfolg zur Funktionsanalyse eingesetzt worden. Ein funktionsveränderter Sigma70 führte nach induzierter Expression zu einem dominantnegativen Effekt (Keener und Nomura, 1993). Dieser DNE beruht dabei größtenteils auf der Möglichkeit der Ausbildung eines inhibitorischen Polymerase-Sigma70 Komplexes mit negativer Wirkung auf Promotorerkennung und Transkriptionsinitiation. Dieser Ansatz - mit mehreren Varianten - steht im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit, mit der ein Beitrag zur Funktionsanalyse plastidärer Sigmafaktoren geliefert werden soll. Als Erklärung bot sich an, dass ein Derivat eines funktionsveränderten, plastidären Sigmafaktors mit der ursprünglichen, nativen Form in Chloroplasten interferieren würde, wodurch die Transkription aktiv inhibiert sein könnte (Dominant-Negativer Effekt (DNE)). Folgende Varianten wurden eingesetzt: (a) Konstitutive Expression in Arabidopsis-Linien, die ein zusätzliches Sigma-Derivat vom Anfang an über einen längeren Zeitraum bilden können (Kap. 4.1), (b) Induzierbare Linien, in denen die Bildung des Sigma-Derivats erst chemisch angeschaltet werden muss (Kap. 4.2). Als erfolgsversprechender Sigmafaktor wurde AtSig6 gewählt, dessen Knockout-Linie sig6-2 einen erkennbaren Phänotyp in der frühen Entwicklung zeigt (Ishizaki et al., 2005; Loschelder et al., 2006). Das AtSig6 Gen auf dem Chromosom 2 (At2g36990) besteht aus neun Exons getrennt durch acht Introns (Arabidopsis Genome Initiative, 2000). Weiterhin können drei funktionelle Grundbereiche beschrieben werden: N-terminal die Sequenz für die Plastidenlokalisation (TP, nur im Vorläuferprotein), der unkonservierten Region, UCR, und einer C-terminalen konservierten Region, CR (beide im reifen funktionsfähigen Sigmaprotein repräsentiert) (Abb. 3a). In früheren Arbeiten (Loschelder et al., 2006) wurde die Lokalisation der T-DNA in der sig6-2 Knockout Mutante im Exon 5 lokalisiert (Abb.3b). 36

52 Ergebnisse 4.1 Konstitutive Überexpression eines Teilbereichs von SIG Konstrukte und mittels RT-PCR verifizierte Überexpression In einem ersten Schritt sollte zunächst überprüft werden, durch welchen Anteil des Proteins ein Sig6-vermittelter DNE entsteht. Dazu wurden in den Gateway-kompatiblen Pflanzenvektor pmdc32 (Curtis und Grossniklaus, 2003) cdna-konstrukte eingebracht, die entweder für den N-terminalen, unkonservierten Anteil kodieren (Abb.3c) bzw. für den C-terminalen, konservierten Anteil (Abb.3d). Zur Plastidenlokalisation wurde jeweils N-terminal die Transitsequenz angefügt. Diese Konstrukte wurden durch Agrobakterium-vermittelte Transformation sowohl in den Wildtyp als auch in die sig6-2 Linie eingebracht (3.2.14). Abb.3: AtSig6 Architektur im Wildtyp und in der sig6-2 Knockout-Linie sowie Teilkonstrukte zum Nachweis möglicher DNEs. (a) Die genomische Region des authentischen Arabidopsis Gens für den Sigmafaktor SIG6 (At2g36990) besteht aus 9 Exons (grau) und 8 Introns (schwarz). Sowohl die proteinkodierenden Regionen für den konservierten und den unkonservierten Bereich als auch diejenige für das Transitpeptid sind dargestellt. (b) Die in der sig6-2 Knockout-Linie vorliegende T- DNA Insertionsstelle im Exon 5 ist eingezeichnet (GABI-Kat Linie 242G06). Die beiden unteren Zeichnungen (c/d) zeigen die cdna Konstrukte, die hinter den 35S Promotor des pmdc32 Vektors kloniert wurden. Nach der Selektion der transformierten Pflanzen durch das Antibiotikum Hygromycin wurde zunächst die genomische DNA untersucht. Dazu wurden die Primer so gewählt, dass der jeweils eingebrachte Bereich (CR bzw. UCR) amplifiziert wurde. Beispielhaft ist ein Ergebnis für den konservierten Bereich im Wildtyp (wt 35S::crSig6) in Abb.4 dargestellt. Im Wildtyp sowie der sig6-2 Linie konnte der konservierte Bereich mit seiner Intron-/Exon-Struktur mit 37

53 Ergebnisse etwa 1300bp amplifiziert werden. In der sig6-2-linie konnte dieser Bereich amplifiziert werden, da sich die T-DNA Insertionsstelle im unkonservierten Bereich befindet (Abb. 3). In der transformierten Linie (wt 35S::crSig6) ist neben der 1300bp Bande weiterhin eine etwa 850bp große Bande erkennbar, welche die eingebrachte cdna darstellt. Durch diese Analyse konnten mehrere voneinander unabhängige Linien der einzelnen eingebrachten Konstrukte festgestellt werden. Abb.4: PCR-Analyse des konservierten Bereichs von Sig6 im Wildtyp, der sig6-2 und der wt 35S::crSig6 Linie zur Überprüfung der Insertion der cdna in die genomische DNA. Im Wildytp und der sig6-2 Linie entsteht eine Bande bei etwa 1300bp. Neben dieser befindet sich in der wt 35S::crSig6 Linie die eingebrachte 850bp große cdna Bande Charakterisierung der visuellen Phänotypen Anhand des visuellen Phänotyps kann eine einfache und schnelle Beschreibung von starken Veränderungen und Auswirkungen durch molekulare Veränderungen durchgeführt werden. So konnte gezeigt werden, dass in der frühen Entwicklung von Arabidopsis thaliana (5-14d) der Verlust des SIG6 zu einer deutlichen Veränderung im optischen Phänotyp führt. Die Kotyledonen dieser als sig6-2 benannten Linie sind zunächst gelblich (5d) und verlieren in der weiteren Entwicklung (14d) alle Farbpigmente und erscheinen dadurch weiß (Loschelder et al., 2006). Der visuelle Phänotyp einer exemplarischen Linie der transformierten pmdc32- Konstrukte ist jeweils in Abb. 5 dargestellt. In keiner dieser Linien konnten entwicklungsspezifische Veränderungen in Bezug zur Ursprungslinie ausgemacht werden, mit Ausnahme von etwas hell-grünen Kotyledonen in der sehr frühen Entwicklung (5d) in der wt 35S::crSig6-Linie. Das Wachstum auch dieser Linie unterschied sich in der weiteren 38

54 Ergebnisse Entwicklung nicht zu dem des Wildtyps. Die Linien mit eingebrachtem Konstrukt in den sig6-2 als Hintergrund-Linie besaßen ebenso wie diese gelblich-weiße Kotyledonen, die darauf ausgebildeten ersten Folgeblätter waren jedoch wieder normal grün. Abb.5: Entwicklungsspezifischer Phänotyp des Wildtyp, der SIG6 Knockout Mutante (sig6-2), der CR- Linien (wt 35S::crSig6 und sig6-2 35S::crSig6) und der UCR-Linien (wt 35S::ucrSig6 und sig6-2 35S::ucrSig6). Die sig6-2-linie zeigt im frühen Entwicklungsstadium (5-14d) den Knockout spezifischen Phänotyp von gelblichen (5d) bis hin zu weißen (14d) Kotyledonen. Die ausgebildeten Folgeblätter (14d) sind jedoch wie beim Wildtyp grün. Die Überexpressionslinien zeigen innerhalb des untersuchten Zeitraumes keine deutlichen Unterschiede zu der jeweiligen Ausgangslinie, mit der möglichen Ausnahme der CR-Linie im Wildtyp bei 5d, deren Keimlinge häufig etwas heller grüne Kotyledonen als WT-Keimlinge aufwiesen. 39

55 Ergebnisse Northern-Blot Analyse plastidärer Zielgene (class I und class II) zur Überprüfung eines DNE Dass ein direkter Zusammenhang zwischen veränderter Transkription und dem visuellen Phänotyp nicht zwangsläufig bestehen muss, konnte bereits für viele Knockout-Mutanten der plastidären Sigmafaktoren gezeigt werden. Neben der Mutante von Sig6 zeigt nur die Knockout-Linie von Sig2 einen veränderten Phänotyp (Hanaoka et al., 2003). Für alle anderen Knockout-Linien (Sig1, Sig3, Sig4 und Sig5) konnten keine, oder nur sehr geringe äußerlich sichtbare Veränderungen festgestellt werden (Schweer, 2010). Um dominant-negative Effekte in der plastidären Transkription, die durch mögliche Überexpression des Sig6-Teilbereichs hervorgerufen waren, boten sich Northern-Blot Analysen für Plastiden-spezifische Transkripte an. Mit gleicher Methodik waren bereits in der sig6-2 Linie spezifische Veränderungen der class I Gene psba und rbcl sowie des class II Gens atpb gezeigt worden (Loschelder et al., 2006). Von jeder transformierten Linie wurden jeweils drei verschiedene Individuen untersucht. Exemplarisch sind die Ergebnisse der Northern-Blots in Abb. 6 für jeweils eine Linie dargestellt. Abb.6: Northern-Blot Analyse plastidärer Zielgene in den transformierten Linien. Sowohl der konservierte Bereich (crsig6) als auch der unkonservierte Bereich (ucrsig6) des Sigmafaktor 6 wurden in den Wildtyp und die sig6-2 Linie eingebracht. Eine mögliche Veränderung des Transkriptmusters für Plastidenproteine sollte untersucht werden. Von oben nach unten: Transkripte der Plastidengene psba, rbcl und atpb sowie der RbcS Kern-Genfamilie mit Größenangaben in kb (rechts). Die Ethidiumbromid gefärbte, nukleo-cytosolische 25S rrna ist als Beladungskontrolle dargestellt (ganz unten). 40

56 Ergebnisse So zeigte sich, dass nur für die Überexpressionslinie des konservierten Bereichs im Wildtyp (wt 35S::crSig6) eine Veränderung im Transkriptmuster gegenüber demjenigen im Wildtyp vorlag. Insbesondere für psba, rbcl und atpb war eine Reduktion der Bandenstärke feststellbar. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Ergebnisse entwicklungsspezifisch variierten. Bei 5d Keimlingen war die Transkriptstärke des psba-gens, nicht aber diejenige der anderen untersuchten Gene erniedrigt. Dagegen zeigten nach 14 Tagen alle untersuchten Transkripte ein vermindertes Hybridisierungssignal. Dies deutet auf eine starke Veränderung der PEP-Transkription hin. Mehr noch: auch das NEP-System scheint beeinflusst zu werden, denn neben dem (zu erwartenden) 2.6kb, PEP-spezifischen atpb-transkript konnte auch eine Reduzierung des 2.0kb, NEP-spezifischen Transkripts festgestellt werden. Schließlich zeigt die Schwächung des RbcS-Transkriptsignals, dass sogar die Expression von Kerngenen für Plastidenproteine betroffen sein kann (Retrograd-Regulation; s. Diskussion). Zusammenfassend festzuhalten ist somit, dass in der crsig6-expressionslinie ein - offenbar weitreichender dominant-negativer Effekt auf Transkripte für Plastidenproteine vorliegt. Für alle anderen untersuchten Linien konnten derartige Veränderungen im Transkriptspektrum nicht beobachtet werden. Dementsprechend sollte die Linie mit dem konservierten Bereich, die die Kriterien eines DNE erfüllt (Herskowitz, 1987), in weiteren Untersuchungen als DNE- Linie bezeichnet werden. Inwieweit diese entwicklungsspezifischen Veränderungen der Ziel- Transkriptmuster mit der Expression des eingebrachten crsig6-konstrukts korrelieren, sollte mit Hilfe einer semiquantitativen RT-PCR überprüft werden Analyse eines überexprimierten Volllängenkonstrukts Um die Möglichkeit eines DNEs durch die Überexpression eines Volllängenkonstrukts nicht auszuschließen, sollte dies in einem weiteren Versuch überprüft werden. Ein cdna- Volllängenkonstrukt basierend auf der nativen Sequenz von SIG6 (4.1.1) wurde in den pflanzlichen Überexpressionsvektor pbin einkloniert und in den Wildtyp bzw. in die sig6-2- Linie transformiert. Die daraus resultierenden Linien (wt 35S::Sig6, sig6-2 35S::Sig6) wurden dann auf RNA-Ebene mittels RT-PCR und Northern-Blot analysiert. 41

57 Ergebnisse Abb.7: Expressionsanalyse des Volllängen-Sig6 Konstrukts und plastidärer Zielgene im Wildtyp, der Knockout-Linie sig6-2 sowie den transformierten Linien (wt 35S::Sig6 und sig6-2 35S::Sig6). (a) Eine genspezifische RT-PCR zur Überprüfung der Überexpression des Sig6 zeigt eine entwicklungsunabhängige erhöhte Transkriptmenge. (b) Northern-Blot ausgewählter class I und class II Gene sowie des kernkodierten RbcS. Die Überexpressionslinie des Sig6- Volllängenkonstrukts (wt 35S::Sig6) zeigt keine Veränderungen im Transkriptmuster, die sig6-2 komplementierte Linie (sig6-2 35S::Sig6) zeigt innerhalb der gewählten Transkripte ein Wildtypähnliches Muster. Durch die Amplifizierung des Sig6 mit Hilfe genspezifischer Primer konnte eine dauerhafte Expression in den transformierten Linien gezeigt werden, während im Wildtyp mit der Entwicklung die Transkriptmenge sinkt und in der sig6-2-linie kein Transkript amplifiziert werden kann (Abb. 7a). Weiterhin zeigten die Ergebnisse der Northern-Blots (Abb. 7b), dass in der wt 35S::Sig6 Linie keine Veränderungen des Transkriptmusters im Vergleich zum Wildtyp erkennbar sind. Die Ergebnisse für die sig6-2 35S::Sig6 Linie zeigten ebenfalls, dass alle untersuchten Transkripte ein zum Wildtyp vergleichbares Muster aufwiesen. Neben dem 2,6 kb-atpb Transkript (5, 10 und 14 Tage) konnte weiterhin das 1,2 kb psba Transkript bei 5d in vergleichbarer Wildtyp-Intensität detektiert werden. Das sonst typische, zusätzliche 4,8 kbatpb Transkript (5, 10 und 14d) konnte nicht mehr detektiert werden. Somit zeigen diese Ergebnisse, dass durch die verstärkte Expression der Volllänge von SIG6 keine Veränderungen im Wildtyp verursacht werden. Eingebracht in die sig6-2 Knockout-Mutante wird diese komplementiert. Demnach scheint der in dieser Arbeit gezeigte DNE spezifisch in Bezug zum konservierten Bereich aufzutreten. 42

58 Ergebnisse Expressionsanalyse des nativen Sig6 und des verkürzten crsig6 in der DNE-Linie Zur Überprüfung der Expressionsstärke des eingebrachten Konstrukts und der eventuell daraus resultierenden Ergebnisse des unterschiedlich stark ausgeprägten DNE-Effekts (4.1.3) wurde eine RT-PCR mit genspezifischen Primern sowohl für den konservierten Bereich (crsig6) als auch den authentischen Volllängen Sig6 durchgeführt. Als Kontrolle diente die Amplifikation von nukleo-cytosolischen 18S rrna-sequenzen. Abb.8: RNA-Expressionsanalyse des nativen AtSig6 (Sig6) und des konservierten Teilbereichs (crsig6) im Wildtyp, der sig6-2- und der DNE-Linie. Mittels semiquantitativer RT-PCR konnte eine offenbar entwicklungsunabhängige - Überexpression des konservierten Bereichs (crsig6) in der wt 35S::crSig6 Linie belegt werden, wie die zu allen drei Zeitpunkten deutlich sichtbaren crsig6- Signale nahelegen. Unbeeinflusst davon ist das native Volllängenkonstrukt (Sig6). Die 18S rrna- Sequenz wurde als nukleo-cytosolische, interne Kontrolle amplifiziert. Im Wildtyp konnte eine entwicklungsspezifische Abnahme des Sig6-Transkripts von 5 bis 14d festgestellt werden. Gleiches gilt offenbar auch für das crsig6 Transkript. Im Falle der sig6-2 Knockout-Linie waren mit den verwendeten Primern keine amplifizierten Signale sichtbar -- das zu erwartende Ergebnis angesichts der T-DNA Insertion Abb. 3. In der DNE Linie konnte eine starke Expression des konservierten Bereichs festgestellt werden, und zwar offenbar ohne direkte Beeinflussung der Expression des nativen (Volllängen-) Sig6 Gens. Diese auf Transkriptebene sichtbare Beeinflussung der Zielgen-Expression war für alle drei Zeitpunkte feststellbar (5d, 10d und 14d). Somit scheint die ermittelte Beeinflussung der Transkription von (plastidärer und nukleärer) Zielgenen (4.1.3) auf die Überexpression des konservierten Bereichs des Sig6 in der DNE-Linie zurückführbar zu sein. 43

59 Ergebnisse Mikroskopischer Nachweis der Lokalisation des CRSIG6 Zur Überprüfung einer plastidären Lokalisation wurde weiterhin die cdna des crsig6- Konstrukts in den Gateway-Vektor pmdc84 (Curtis und Grossniklaus et al., 2005) kloniert. Dieser beinhaltet die Sequenz für das Grün-Fluoreszierendes-Protein, GFP (Shimomura et al., 1962) und ermöglicht durch eine lasermikroskopische Aufnahme und Überlagerung des GFP- Signals mit der Autofluoreszenz des Chlorophylls eine Lokalisation innerhalb von Protoplasten (Abb.9). Sowohl das GFP-Signal als auch die Chlorophyllfluoreszenz konnten deckungsgleich beschrieben werden. In einer Wiltyp negativ-kontrolle war lediglich ein sehr schwaches GFP- Signal detektierbar. Als Positivkontrolle diente ein Vektor mit einer plastidären Zielsequenz des RBCS fusioniert an ein GFP. Wie bereits für das untersuchte CRSIG6 konnte ein deutliches GFP-Signal deckungsgleich mit der Autofluoreszenz des Chlorophylls beschrieben werden. Somit konnte eine eindeutige Lokalisation in den Chloroplasten bestätigt werden. Abb.9: Lokalisationsanalyse des GFP-fusionierten CRSIG6. Die GFP- und Autofluoreszenz des plastidären Chlorophylls von Arabidopsis Mesophyll Protoplasten wurde mit Hilfe eines Konfokalmikroskop in der (i) crsig6-gfp-linie, (ii) einer Wildtyp-negativ Kontrolle sowie (iii) einer Posititvkontrolle bestehend aus einem Transitpeptid-fusioniert an ein GFP untersucht. 44

60 Ergebnisse RT-PCR Expressionsanalyse auf RNA-Ebene aller Mitglieder der Sigmafaktor-Familie in der DNE-Linie Um die Auswirkung des DNE (4.1.3) auf das Sigmafaktor-Netzwerk innerhalb der DNE-Linie zu untersuchen, wurden RT-PCR Analysen mit spezifischen Primern für die einzelnen Sigmafaktoren durchgeführt (Abb.10). Für einige Gene waren entweder zu allen drei untersuchten Zeitpunkten konstante Transkriptlevel in allen untersuchten Linien feststellbar (Sig2, zweite Zeile von oben), oder mindestens zu zwei Zeitpunkten (Sig1, 10 und 14d; Sig3, 5 und 10d). Die Expression von Sig4 und Sig5 scheint hingegen einer größeren Variabilität zu unterliegen. Ein zumeist gleiches Expressionsmuster war zum Zeitpunkt 10d sichtbar. Obwohl einige Transkripte bei 5d und 14d eine gleiche Intensität in allen drei Linien zeigten (Sig2 und Sig3 bzw. Sig1 und Sig2), konnte bei der Mehrheit der Transkripte in der DNE- und Knockout- Linie eine Reduzierung bzw. Intensivierung des Signals festgestellt werden. Bei der Beantwortung der Frage einer möglichen Gegensteuerung durch Hochregulierung einzelner Sigmafaktoren in der DNE-Linie, insbesondere bei 14d, konnte gezeigt werden, dass dies offenbar eher nicht, sondern vielleicht sogar das Gegenteil, zutrifft. Die Transkripte Sig1 und Sig2 zeigen im Vergleich zum Wildtyp keine Veränderung, Sig3-Sig5 eine Reduzierung, einzig Sig6 scheint etwas hochreguliert vorzuliegen. Abb.10: RNA Expressionsprofil aller Mitglieder der A.th.-Sigma Familie im Wildtyp, der sig6-2 und der DNE-Linie. Je 1µg RNA aus verschiedenen Entwicklungsstadien (5, 10, 14d nach Aussaat) wurde mittels der M-MLV Reversen Transcriptase zu cdna umgeschrieben und mit genspezifischen 45

61 Ergebnisse Oligonukleotiden amplifiziert. Im Wildtyp konnte eine transkriptspezifische Variabilität in der Akkumulierung zu den untersuchten Zeitpunkten beschrieben werden. Durch den Verlust des Sigmafaktor 6 (sig6-2) veränderte sich das Expressionsmuster für einige Faktoren (Bsp. vgl. Zeitpunkt 5d: Sig1, Sig4). In der DNE-Linie konnte ebenfalls eine Veränderung im Expressionsmuster festgestellt werden, dieses war jedoch in seiner Ausprägung schwächer als in der sig6-2 Linie (Bsp. vgl. Zeitpunkt 14d: Sig3, Sig5) Erweiterte Northern-Blot Analyse plastidärer Zielgene (class I, class II und class III) in der DNE-Linie Die Ergebnisse des class II Gens atpb mit einer reduzierten Doppelbande (2.0, 2.6 kb, siehe 4.1.3) hatten Hinweise auf eine mögliche Inhibierung der NEP (2.0kb Bande) durch die Überexpression des konservierten Bereichs von Sig6 ergeben. Um eine breitere Basis für eine solche Schlussfolgerung zu erhalten, wurden zusätzlich zu den bereits durchgeführten Untersuchungen der Transkripte der class I und class II Gene sowie des kernkodierten RbcS ein NEP-spezifisches Class III Gen (accd) sowie ein Kontrollgen (Act2) untersucht. Das NEPspezifische (d.h. ausschließlich von NEP transkribierte) Gen würde eine direkte Antwort auf eine mögliche Blockierung bzw. Veränderung der NEP zeigen. Weiterhin sollte die Analyse von Act2 zu einer Klärung beitragen, ob weiterreichende ( unspezifische ) Effekte, z.b. die Schädigung der gesamten zellulären Regulation eine Rolle spielen. Wie die Abb.11 zeigt, liegt die Act2 Transkriptbande zu allen drei untersuchten Zeiten jeweils in vergleichbarer Konzentration in den jeweils verglichenen Linien vor. Somit scheint keine gesamte Schädigung der Pflanze vorzuliegen. Dies bestätigt, dass es sich um eine Plastiden-spezifische Antwort auf die Überexpression des Teilbereichs handelt. Für das NEP-spezifische accd-transkript konnte in der DNE-Linie nach 10d und insbesondere nach 14d eine Reduzierung festgestellt werden. Dieser Befund unterstützt somit die Vorstellung, wonach eine Blockierung/Inhibierung der NEP vorliegt. 46

62 Ergebnisse Abb.11: Northern-Blot Analyse plastidärer class I, II, III-Gene, des kernkodierten RbcS sowie des nukleocytosolischen Act2 Kontroll-Transkripts im Wildtyp, in der sig6-2 Knockout- sowie in der DNE- Linie. Die sig6-2 Linie zeigt die bereits beschriebenen, entwicklungsspezifischen Veränderungen des psba, rbcl (class I) und atpb (class II) Transkripts, insbesondere bei 5d (Abb. 6 und Loschelder et al., 2006). In der DNE-Linie ist eine Reduktion des psba Transkripts bei 5d sowie in allen untersuchten class I-III Genen und RbcS bei 14d erkennbar. Für das Kontroll-Transkript Act2 ist kein Unterschied erkennbar Analyse der Expression ribosomaler RNAs in der DNE-Linie Die Bandenmuster der Ethidiumbromid-gefärbten rrnas (Abb.12a, unterste Reihe) zeigen sowohl für die Knockout-Mutante als auch für die DNE-Linie Veränderungen gegenüber der Wildtyp-Situation. Dies betrifft die plastidären 16S bzw. 23S rrna-spezies letztere in Form der typischen 1.2 und 1.0 kb Bruchstücke ( break products, Nishimura et al., 2010). Zumindest im Falle der 23S Spaltprodukte scheint dieser negative Effekt bei der DNE-Linie noch ausgeprägter als bei der Knockout-Linie zu sein. Um dies detaillierter zu untersuchen, wurden DIG-markierte RNA-Sonden hergestellt, die gegen die plastidären ribosomalen-rnas 16S, 23S und 4.5S hybridisieren (Abb. 12b). 47

63 Ergebnisse Abb.12: Analyse der Expression ribosomaler RNAs in der DNE-Linie. (a) EtBr-gefärbte Detailaufnahme der ribosomalen-rnas in 5d alten Wildtyp, SIG6-Knockout- und DNE-Linien Pflanzen. Die Pfeile deuten auf die reduzierten Banden der 16S und der break products der 23S rrna. (b) Schematische Darstellung des rrn Operons aus Arabidopsis thaliana (Sato et al., 1999). Die ribosomalen RNAs sind als graue Boxen dargestellt. Balken unterhalb der Boxen zeigen die Hybridisierungsregion der verwendeten DIG-markierten RNA-Sonden. Durch die Wahl der Sonde konnten für die 23S rrna insgesamt sechs Hybridisierungssignale detektiert werden. Davon sind vier Vorläuferprodukte (23S precursor) und zwei maturierte rrna-fragmente, die aus break products stammen (Nishimura et al., 2010). Im Wildtyp sind zu allen Zeitpunkten sowohl alle vier Vorläuferprodukte (1.7 kb, 2.4 kb, 2.9 kb und 3.2 kb), als auch die maturierten Fragmente (1.0 kb und 1.2 kb) detektierbar. Die relative Intensität der jeweiligen Fragmente zueinander bleibt innerhalb der Entwicklung gleich. Neben der sig6-2 Linie konnte in der DNE-Linie eine Reduzierung des 1.7 kb und 2.4 kb Vorläuferproduktes bei 5d festgestellt werden. Eine weitere Veränderung des Bandenmusters konnte zu diesem Zeitpunkt nicht festgestellt werden. In der weiteren Entwicklung der sig6-2 glich sich das Muster dem des Wildtyps an. In der DNE-Linie konnte wie bereits für die proteinkodierenden Transkripte eine starke Veränderung bei 14d festgestellt werden. Hier waren die 2.4 und 3.2 kb Vorläufertranskripte nur noch sehr schwach detektierbar. 48

64 Ergebnisse Abb.13: Northern-Blot Analyse der plastidären ribosomalen-rnas 4.5S, 16S und 23S. Es wurden jeweils drei identische Membranen mit Gesamt-RNA (1µg) des Wildtyps, der sig6-2 und der DNE-Linie mit den links bezeichneten, spezifischen DIG-RNA-Sonden hybridisiert. Die Hybridisierungssignale mit ihrer jeweiligen Größe (kb, rechts) sind dargestellt. Als Beladungskontrolle ist die EtBr-gefärbte cytosolische 25S rrna dargestellt. Für die 16S rrna wurde hingegen nur im Falle der sig6-2 Linie, nicht aber für die DNE-Linie, eine qualitative Veränderung gegenüber der Wildtyp-Situation beobachtet (Doppelbande). Zum sehr frühen Entwicklungszeitpunkt (5d) lag diese als Doppelbande, bestehend aus einem 1.7 kb großem Vorläuferprodukt sowie einer 1.5 kb maturierten Form, vor. Beide Signale waren jedoch in ihrer Intensität deutlich schwächer als die Einzelbande im Wildtyp und der DNE-Linie. Nach 10d konnte eine Verstärkung der Signale festgestellt werden, bis nach 14d das Signal in seiner Intensität mit der des Wildtyps vergleichbar war. Das Vorläuferprodukt wurde zum 14d-Zeitpunkt nicht mehr detektiert. Die 4.5S rrna kann durch zwei Hybridisierungssignale beschrieben werden. Zum einen als Bestandteil eines 3.2 kb rrna Vorläuferproduktes und zum anderen als 0.1 kb maturierte Form (vgl. Abb. 13). Im Wildtyp konnten beide Signale detektiert werden. Deren relative 49

65 Ergebnisse Intensität sich während der Entwicklung nicht unterscheid. Anders dagegen in der sig6-2- Linie, in der nach 5d ein sehr schwaches Signal für beide Produkte festgestellt wurde. Nach 10d war eine Zunahme des Vorläuferproduktes feststellbar, bis nach 14d das Signal wieder mit dem des Wildtyps vergleichbar war. In der DNE-Linie konnte ebenfalls eine Veränderung festgestellt werden. Nach 5d waren die Signale ähnlich denen in der sig6-2 Linie, nach 10d nahmen sie in der Intensität zu und es waren keine Unterschiede zum Wildtyp feststellbar. Nach 14d konnte kein Signal für das 3.2 kb große Vorläuferprodukt und nur ein sehr schwaches für die maturierte Form (0.1 kb) detektiert werden. Somit konnte in der sig6-2 Linie eine entwicklungsspezifische Veränderung hin zum Wildtypniveau aller untersuchten Transkripte festgestellt werden. Dies scheint in einer direkten Korrelation zur Ausbildung von grünen Folgeblättern zu stehen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass offenbar innerhalb von Kotyledonen und den ausgebildeten Folgeblättern eine Veränderung nicht nur von mrnas, sondern auch von rrna (-Vorstufen) stattfindet. In der DNE-Linie konnte wiederum ein starker DNE-abhängiger Effekt bei 14d gezeigt werden Analyse Polysomen-assoziierter mrnas in der DNE-Linie Durch die Ergebnisse der Northern-Blots für die ribosomalen-rnas S (Abb. 13) wurde weiterhin die Frage aufgeworfen, inwieweit eine funktionelle Assemblierung von Ribosomen in der sig6-2-linie im frühen Entwicklungsstadium (5d) und der DNE-Linie bei 14d noch möglich ist. Zu diesem Zweck wurden neben der freien RNA auch die Polysomen-assoziierte RNA durch einen linearen Saccharose-Gradienten zu den angegebenen Zeitpunkten isoliert (Barkan, 1998). Dabei sedimentiert die polysomale-rna im Gradienten umso schneller, je mehr Ribosomen sich an einer mrna befinden (untere Fraktionen). Die freie bzw. Monoribosomen-assoziierte RNA verbleibt dagegen in den oberen Fraktionen. Die 14 entnommenen Einzelfraktionen wurden mit Hilfe von Northern-Blots und spezifischen DIGmarkierten RNA-Sonden analysiert. Zunächst sollte die Assoziierung des psba-transkripts mit Polysomen analysiert werden. Im Wildtyp konnte dabei in fast allen 14 Fraktionen ein Signal detektiert werden. Dieses war bis Fraktion sechs recht stark, nahm daraufhin bis Fraktion 14 in seiner Intensität ab. Entwicklungsspezifische Unterschiede konnten dabei nicht festgestellt werden. Kontrollversuche des Polysomenzerfalls in Gegenwart von EDTA zeigten, dass freie mrna bis 50

66 Ergebnisse zur Fraktion 4 vorliegt, ab Fraktion 5 bis Fraktion 14 somit Polysomen-assoziierte mrna detektiert wird. Abb.14: Northern-Blot Analyse Polysomen-assoziierter mrna. (a) Polysomen wurden mit Hilfe eines linearen Saccharose-Dichtegradienten nach Größe aufgetrennt und die in den Fraktionen enthaltene RNA durch ein denaturierendes Agarose-Gel aufgetrennt. Die Detektion des psba- Transkripts erfolgte durch eine spezifische DIG-markierte RNA-Sonde (vgl. Material und Methoden) (b) Als Beladungskontrolle sind die EtBr-gefärbten rrna-banden dargestellt. In der sig6-2-linie konnte wiederum eine entwicklungsspezifische Veränderung des Musters festgestellt werden. In 5d alten Keimlingen war lediglich ein Signal in den Fraktionen 1-3 detektierbar, dies sind die Fraktionen der freien mrna. Bei 10d alten Pflanzen konnte das Hybridisierungssignal bereits wieder bis Fraktion 10 detektiert werden (sehr schwache Signale bei Fraktion 12-14) und nahmen in ihrer Intensität bei 14d in allen Fraktionen zu. Somit scheint die Assoziierung der prozessierten psba-mrna an Polysomen in der frühen Mutanten- Entwicklung (5d) nicht möglich. Erst durch eine bisher unbekannte regulatorische Veränderung kann dies nach etwa 10d wieder stattfinden. In der DNE-Linie konnten vergleichbare Bandenmuster wie im Wildtyp festgestellt werden. In allen 14 Fraktionen waren Signale detektierbar, deren Muster keine Veränderung innerhalb aller untersuchten Zeitpunkte hatte. 51

67 Ergebnisse Insbesondere die Ergebnisse der Knockout-Linie sig6-2 deuteten somit auf eine starke Veränderung des plastidären Translationsapparates hin. Ob dies spezifisch für das psba- Transkript war, oder ob es sich hierbei um eine globale Veränderung innerhalb der Plastiden handelt, sollte durch zwei weitere spezifische DIG-markierte Sonden für plastidäre Zielgene (rbcl und atpb) untersucht werden (Abb.15). Abb.15: Northern-Blot Analyse Polysomen-assoziierter mrna. Intakte Polysomen wurden mittels einer Ultrazentrifugation fraktioniert, die enthaltene RNA auf einem denaturierenden Agarose-Gel aufgetrennt und mit den angegeben DIG-markierten RNA-Sonden detektiert. Die Hybridisierungsergebnisse für das (a) class II Gen atpb und (b) class I Gen rbcl sind dargestellt. Die erhaltenen Profile wichen in mehrerer Hinsicht von jenen ab, die mit der psba- Sonde erhalten worden waren: Zu allen drei Untersuchungszeiten und mit allen drei Linien wurden jeweils lange Profile mit Signalen bis in die hochmolekularen Fraktionen hinein erhalten. Dies gilt auch für die sig6-2-mutante, die ebenfalls ein Wildtyp-ähnliches Hybridisierungsmuster aufwies. Bemerkenswert ist andererseits die relativ schwache Hybridisierung im oberen Bereich der freien mrna und Monoribosomen. Diese relative Abreicherung ist besonders ausgeprägt im Falle der DNE-Linie. So waren Hybridisierungssignale erst ab der vierten Fraktion deutlich 52

68 Ergebnisse nachweisbar. Das Muster zeigte in den hinteren Fraktionen dabei keine Unterschiede zum Wildtyp. Diese Ergebnisse könnten darauf hinweisen, dass die aktive Transkription beider Gene zu diesem Zeitpunkt inhibiert ist und somit keine oder wenig freie mrna in den ersten vier Fraktionen detektiert werden kann. Dies korreliert gut mit den Beobachtungen an zellulärer Gesamt-RNA (vgl. Abb. 12, Kap.4.1.8) Analyse Polysomen-assoziierter ribosomaler RNAs in der DNE-Linie Eine funktionelle Einheit der Ribosomen besteht neben einer Vielzahl von Proteinen auch aus trnas und rrnas. Ob die zuvor aufgezeigten Ergebnisse der veränderten Assoziierung der proteinkodierenden mrna (psba, rbcl und atpb) in der sig6-2 und der DNE-Linie Ursache einer defekte Assemblierungsfähigkeit der Ribosomen selber sind, sollte durch die Assoziierung der rrnas an die Ribosomen untersucht werden. Wie bereits in den Untersuchungen für die Gesamt-RNA sollten dabei die rrnas 16S, 4.5S und 23S analysiert werden. Abb.16: Analyse polysomaler rrna. Northern-Blots der Saccharose-Dichtegradienten Fraktionen vom Wildtyp, der sig6-2 und der DNE-Linie. Die Hybridisierung der isolierten RNA zu den angegebenen Zeitpunkten wurde mit einer spezifischen DIG-RNA Sonde gegen rrn16 durchgeführt. 53

69 Ergebnisse Das Muster für die 16S rrna zeigte im Wildtyp und der DNE-Linie keine Unterschiede. In den Fraktionen 2-14 waren Signale detektierbar, die in den oberen Fraktionen in der Intensität etwas stärker vorlagen. In der sig6-2 Linie konnten Ähnlichkeiten zu den Ergebnissen der Gesamt-RNA-Analyse festgestellt werden (Doppelbande aus Vorläufer- und reifem Transkript; vgl. Abb.13). Bei 5d waren Signale in den Fraktionen 2 bis (mindestens) 10 feststellbar. Die erwähnte Doppelbande war zu diesem Zeitpunkt allerdings nur schwach und mit Schwerpunkt in Fraktion 2 und 3 erkennbar. Bei 10d nahm jedoch sowohl die relative Menge als auch die Assoziation mit schneller sedimentierender Polysomen zu (Fraktion 4, 5 und weitere). Nach 14d allerdings war die Vorläuferbande wieder fast vollständig verschwunden, d.h. es lag dann auch in der Mutante wieder ein Polysomen-Assoziationsprofil ähnlich dem des Wildtyps vor. Für die beiden rrnas 4.5S und 23S konnte keine wirklich signifikanten Veränderungen in der Assoziierung an Polysomen im Vergleich zwischen Knockout- und DNE-Linie festgestellt werden (Abb.17). Die erkennbaren, spezifischen Unterschiede in den Vorläufer- bzw. maturierten RNAs sind mit den Gesamt-RNA erzielten Ergebnissen vergleichbar (Abb.13, Kap.4.1.9). Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass vermehrt die jeweils maturierte Form der beiden rrnas an Polysomen assoziiert ist. 54

70 Ergebnisse Abb.17: Analyse polysomaler rrna. Northern Analyse der polysomalen Fraktionen mit Sonden gegen rrn4.5 (links) bzw. rrn23 (rechts) im Wildtyp, der sig6-2 und der DNE-Linie. Die erzielten Ergebnisse können daher die Vermutung in Ansätzen untermauern, dass kein Assemblierungsdefekt der Ribosomen in der sig6-2-knockout- und der DNE-Linie vorliegt. Eher scheinen die für beide Linien erhaltenen Ergebnisse das Resultat einer veränderten Transkriptionsfähigkeit zu den jeweiligen Zeitpunkten zu sein. Untersuchungen der aktiven 55

71 Ergebnisse Transkription (organello run-on, Steiner et al., 2011) könnten diesen Sachverhalt näher charakterisieren. Umgekehrt könnte die fehlende Auswirkung von Transkriptionsdefekten auf die Translation dazu führen, dass auch die betreffenden Ziel -Proteine mengenmäßig nicht beeinflusst sind Immunologische Analyse plastidärer Proteine Um die Auswirkung reduzierter Transkriptmengen auf die stationäre Konzentration der Protein-Genprodukte zu prüfen, wurde zu den drei Entwicklungszeitpunkten Gesamtprotein isoliert und die Genprodukte mit Hilfe von spezifischen Erst-Antikörpern (PSBA, ATPB, RBCL und RBCS) immunologisch nachgewiesen werden (Abb. 18). In der Knockout-Linie sig6-2 liegt offenbar ein vom Wildtyp abweichendes Muster vor. In den beiden frühen Entwicklungszeitpunkten (5d und 10) waren die Proteine PSBA, RBCL und RBCS nicht nachweisbar. Zum Zeitpunkt, an dem die Ausbildung der ersten grünen Folgeblätter stattfindet (vgl. Abb.3, 14d), war eine Detektion der Proteine in geringer Menge wieder möglich. Das Protein ATPB sowie als Kontrolle ACTIN2 konnten zu allen Zeitpunkten nachgewiesen werden, bei ATPB kann jedoch nicht zwischen der Untereinheit lokalisiert in den Mitochondrien bzw. in den Chloroplasten unterschieden werden, so dass keine Aussage über den Zustand in den Chloroplasten selber gemacht werden kann. Dazu müssten in einem weiteren Versuch spezifisch Chloroplastenproteine isoliert und erneut analysiert werden. Abb.18: Analyse der Akkumulierung Photosynthese-relevanter, plastidärer Proteine. Gesamtproteine aus 5, 10 und 14d alten Pflanzen wurden isoliert, mittels Bis-Tris-PAGE (5µg pro Spur) aufgetrennt und durch Western-Blots mit spezifischen Antikörpern gegen PSBA, ATPB, RBCL, RBCS und ACTIN2 detektiert. 56

72 Ergebnisse In der DNE-Linie konnten, mit Ausnahme von RBCL und RBCS bei 5d, keine Unterschiede in der steady-state (stationären) Konzentration der geprüften Proteine im Vergleich zum Wildtyp festgestellt werden. Die Veränderungen in den Transkripten, die durch die Analyse der Gesamt-RNA bzw. der Polysomen-assoziierten RNA festgestellt wurden, spiegeln sich also nicht in der Menge der synthetisierten Proteine wider. Demnach scheint in der konstitutiven hier untersuchten Linie ein Dominant-negativer Effekt (DNE) strikt auf die RNA-Ebene beschränkt zu sein. Dieser ist weiterhin entwicklungsabhängig und nach bisherigen Untersuchungen führt er zu keinen fortwährenden Schädigungen der Pflanze. 57

73 Ergebnisse 4.2 Chemisch induzierbare Überexpression des CRSIG Konstrukte, Induzierung und Expressionsnachweis mittels RT-PCR Nachdem eine konstitutive Überexpression des konservierten Bereichs des Sig6 im pmdc32 Vektor einen DNE verursacht hatte, stellte sich die Frage, ob dies auch durch ein induzierbares System ermöglicht werden kann. Eine Induzierbarkeit bietet den Vorteil, dass zunächst keine Beeinflussung des Systems in seinem Normalzustand vorliegt. Erst durch die Zugabe des Induktionsmittels wird entwicklungsspezifisch in das System eingegriffen und Auswirkungen können direkt zugeordnet werden. Zu diesem Zweck wurde der Gatewaykompatible pmdc7 Vektor gewählt (Curtis und Grossniklaus, 2003), welcher eine Estrogeninduzierbare Transaktivator-Kassette aus dem Vektor per8 besitzt (Zuo et al., 2000). So wird zunächst konstitutiv ein aktives XVE-Proteins exprimiert, welches durch seine DNA- Bindedomäne des LexA-Repressors an die O LexA -46-Operator Sequenz vor dem eingebrachten Konstrukt bindet und die Expression dahinterliegender Gensequenzen behindert. Durch Zugabe von z.b. 17-β-Estradiol kommt es zur Bindung an den Estrogenrezeptor-Anteil des chimären XVE-Proteins, wodurch eine Veränderung in der Konformation stattfindet und somit die Bindung an die O LexA -46-Operator-Sequenz nicht mehr möglich ist. Dadurch wird der CaMV 35S Promotor-Anteil der O LexA -46-Operator-Sequenz frei und die Expression nachfolgender Gene kann stattfinden. Abb.19: Schematische Struktur des Estrogen-induzierbaren Teils des pmdc7 und des eingebrachten crsig6-kontruktes. Von links nach rechts: G10-90 Promoter, XVE Hybrid Transaktivator (bestehend aus der DNA Bindedomäne des LexA Repressors, einer Transkriptions-Aktivator Domäne des VP1 und einem Estrogenrezeptor), einer T3A RBCS 3A poly(a) Terminationssequenz, HPT Hygromycin Phosphotransferase Gen, O LexA -46 multicopy LexA Operator Sequence fusioniert an den -46 CaMV 35S Promotor-Anteil (Zuo et al., 2000). Nach erfolgreicher Klonierung des Konstrukts mittels der LR-CLonase-Reaktion ( ) in den pmdc7 Vektor wurde dieser mittels floral-dip (3.2.14) in den Wildtyp transformiert. Nach Selektion und der Überprüfung der genomischen DNA wurde zunächst die optimale Konzentration und Applikationsmethode überprüft. Mit Hilfe einer RT-PCR ( ) wurde der konservierte Bereich amplifiziert und bei einer erfolgreichen Induzierung sollte das Signal in seiner Stärke in Bezug zum Kontrollversuch zunehmen. Es zeigte sich, dass das Besprühen der 58

74 Ergebnisse jungen Keimlinge mit einer 5µM 17-β-Estradiol Konzentration in 0,05% DMSO (v/v) und einer Induktionszeit von mindestens sechs Stunden (6h bei 5d alten Keimlingen, 24 Stunden bei 10 und 14d) zu einem verstärkten Signal für den konservierten Bereich führt. Unter Kontrollbedingungen mit dem Lösungsmittel DMSO allein war keine Zunahme, eher eine bereits beschriebene entwicklungsspezifische Abnahme (Abb.8) des Signals feststellbar. Abb.20: Mittels RT-PCR analysierte crsig6 Expression nach Induktion in der DNE-p7 Linie. Keimlinge (5d) oder junge Pflanzen (10 und 14d) wurden mit 0,05% DMSO (v/v) + 5µM 17- β-estradiol bzw. zur Kontrolle mit 0,05% DMSO (v/v) besprüht. RNA wurde direkt nach Applikation isoliert (0h) oder nach weiteren 6 (6h) bzw. 24 (24h) Stunden Wachstum. Ob diese induzierte Überexpression des konservierten Bereichs ebenfalls einen Einfluss auf plastidäre Zielgene besaß, wie es bereits bei der konstitutiven DNE-Linie festgestellt wurde (4.1.3), sollte auch hier, in diesem System durch Northern-Blot Analysen für die bereits untersuchten Gene (psba, rbcl, atpb, RbcS und Act2) durchgeführt werden Analyse plastidärer Zielgene nach induzierter Überexpression Es zeigten sich ähnliche Ergebnisse wie im konstitutiven System für die Expression der untersuchten plastidären Zielgene psba, rbcl, atpb und RbcS nach der Induzierung für mindestens sechs Stunden. Insbesondere bei 14 Tage alten Pflanzen konnte eine deutliche Abnahme aller genannten Hybridisierungssignale festgestellt werden. Wie in der konstitutiven DNE-Linie war ebenfalls nach der Induzierung keine Veränderung des Kontrolltranskripts Act2 feststellbar. In den Kontrollversuchen nur mit dem Lösungsmittel DMSO war ebenfalls keine Veränderung feststellbar. Somit scheint die induzierte Überexpression zu einem DNE-Effekt zu führen, wie er bereits im konstitutiven System festgestellt wurde. Auch in diesem induzierten System scheint die Entwicklung der Pflanzen eine entscheidende Rolle zu besitzen. Konnte eine deutliche Veränderung nach 14d festgestellt werden, waren die Ergebnisse bei 5d und 10d deutlich schwächer bzw. keine Veränderungen feststellbar. 59

75 Ergebnisse Abb.21: Northern-Blot Analyse plastidärer Zielgene nach Induzierung der DNE-p7 Linie (wt 35S::crSig6 p7) mittels 17-β-Estradiol bzw. Applikation von DMSO. RNA-Proben (je 1µg) wurden elektrophoretisch aufgetrennt und mit den angegebenen genspezifischen DIG-markierten Sonden hybridisiert. Durch die Induzierung des konservierten Bereichs in der DNE-p7 Linie konnte insbesondere bei 14 Tage alten Pflanzen eine Reduzierung der Transkripte für alle untersuchten Gene, bis auf das nukleo-cytosolische Kontrolltranskript Act2, festgestellt werden. Die Applikation mit DMSO allein führte zu keiner Veränderung. Gleichzeitig wurde neben dem Wildtyp auch die Knockout-Linie sig6-2 äquivalent mit dem Induktionsmittel (5µM 17-β-Estradiol) bzw. der Kontrolllösung (+DMSO) besprüht. Für beide Pflanzenlinien waren keine Veränderungen nach der Applikation der jeweiligen Lösungen feststellbar, so dass auf die Darstellung dieser Ergebnisse verzichtet und auf die entwicklungsspezifischen Ergebnisse in Abb. 6 verwiesen wird Analyse ribosomaler RNAs nach induzierter Überexpression Wie die Untersuchung der konstitutiven DNE-Linie bereits gezeigt hatte, konnte eine im Vergleich zum Wildtyp veränderte Akkumulierung der rrnas festgestellt werden (Abb.13). Daher stellte sich die Frage, ob in der DNE-p7-Linie ebenfalls eine Abnahme von rrna Transkript induziert vorliegt. 60

76 Ergebnisse Dies ist in der Tat der Fall. Wie in Abb.22 gezeigt, kommt es nach Induktion, insbesondere bei 14d alten Pflanzen, zu einer Verminderung von spezifischen Transkripten. Eine Reduktion der Vorläufertranskripte (3.2, 2.9 und 1.7 kb) der 23S rrna, der maturierte 16S rrna und beider Transkripte (3.2 und 0.1 kb) der 4.5S rrna waren feststellbar. Abb.22: Northern-Blot Analyse der plastidären rrnas in der DNE-p7 Linie nach Induzierung mit 5µM 17- β-estradiol. Genspezifische Sonden für ribosomale RNAs der Plastiden wurden mit Gesamt-RNA der pflanzlichen Untersuchungsstadien (Alter und Behandlungsdauer wie angegeben) hybridisiert. Bei 14 Tage alten Pflanzen konnte nach 6 und 24 Stunden Applikationsdauer sowohl für die 3,2 kb und 2,4 kb 23S Vorläufer rrna und 3,2 kb Vorläufer-, als auch 0,1kb reife 4,5S rrna eine Reduzierung gezeigt werden. Als Gel-Beladungskontrolle ist die EtBr-gefärbte, cytosolische 25S rrna gezeigt. Als Fazit dieser Experimente ist festzuhalten, dass (1) grundsätzlich DNEs induziert werden können und (2) Ausmaß und Zeitverlauf dieser induzierten Effekte recht gut mit der Situation in der konstitutiven Linie (Kap.4.1) korrelieren. Dies scheint dafür zu sprechen, dass bei der DNE-Ausprägung eine entwicklungsspezifische, zeitliche Komponente eine Rolle spielt (siehe Diskussion). Somit konnten im Prinzip gleichartige Ergebnisse durch zwei unterschiedliche Herangehensweisen festgestellt werden, was für eine kausal-funktionelle Bedeutung des (CR)SIG6 in diesem Geschehen spricht. 61

77 Ergebnisse 4.3 Affinitätschromatographische Isolierung eines TAP-tag versehenen SIG Konstrukte und mittels RT-PCR verifizierte Überexpression Parallel zur Etablierung und Charakterisierung eines DNE durch Überexpression eines Sigmafaktor-Teilbereichs sollten Möglichkeiten (gangbare Wege) zum Nachweis und zur Isolierung des Sigmafaktors 6 überprüft werden. Dies würde helfen, den DNE-Mechanismus auf Proteinebene zu studieren und die Rolle möglicher Interaktoren einzubeziehen. Bisherige Ansätze beruhten auf der Isolierung der plastiden-kodierten Polymerase (PEP) (Pfalz et al., 2006, Steiner et al., 2011) und der damit co-isolierten Interaktionspartner. Als direkte Interaktionspartner der Sigmafaktoren sind bisher nur DG1 für SIG6 (Chi et al., 2010) und SIB1/SIB2 für SIG1 (Morikawa et al., 2002) beschrieben. Zur möglichen Aufreinigung wurde der TAP-tag (tandem affinity purification) ausgewählt (Rigaut et. al, 1999). Der TAP-tag beruht auf zwei unterschiedlichen Bindedomänen, die durch eine Protease-Schnittstelle voneinander getrennt sind (Abb.23). Durch diese doppelte Affinitätschromatographie kann eine Kontamination mit anderen Proteinen vermindert werden. Abb.23: Schematische Darstellung des Fusionskonstrukts bestehend aus der Volllänge des Sigmafaktors 6 und einem C-terminalen TAP-tag. Dieser besteht aus einer Calmodulin-binde-Domäne (CaM), einer TEV-Protease-Schnittstelle (TEV) sowie der IgG-bindenden doppelten Z-Domäne des Proteins A aus Staphylococcus aureus. Durch die Fusion des TAP-tags an das C-terminale Ende des Faktors ist sichergestellt, dass die plastidäre Zielsequenz erkannt wird. In einem ersten Schritt wird zunächst nativer Gesamtproteinextrakt über eine IgG-bindende Sepharose/Agarose Säule gegeben, die doppelte Z-Domäne des Protein A Anteils am TAP-tag führt zur Bindung an das IgG, wodurch nach mehreren Waschschritten ein großer Teil aller Proteine von der Säule eluiert werden kann. Das getaggte Protein mit seinen potenziellen Interaktionspartner kann nun mit Hilfe der TEV-Protease von der Säule abgespalten und eluiert werden. Das Eluat kann in einem dritten Schritt auf eine Säule mit Calmodulin- Affinitätsmatrix gegeben werden, wodurch der 26 Aminosäuren große Teil der Calmodulin- 62

78 Ergebnisse bindenden Domäne des TAP-tag unter Anwesenheit von CaCl 2 an das Calmodulin bindet. Nach erneutem Waschen kann das Zielprotein weitestgehend von Kontamination durch EGTA eluiert werden. Einen kritischen Aspekt dieser Aufreinigung würde die Behandlung mit einer Protease darstellen, jedoch handelt es sich bei der TEV-Protease um eine hochspezifische Cysteinprotease, die nur die Erkennungssequenz Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser) (ENLYFQ(G/S)) erkennt und zwischen dem Gln und dem Gly/Ser schneidet (Kapust et al., 2002), wodurch eine Proteolyse vermieden werden kann. Zur Affinitätsaufreinigung wurde die Volllängen-cDNA in den Gateway-spezifischen pflanzlichen Überexpressionsvektor pearlygate-205 (Early et al., 2006) einkloniert und in den Wildtyp bzw. die Knockout-Mutante transformiert, jedoch als Fusionskonstrukt mit einem TAP-tag. Im Gegensatz zu den bisherigen Untersuchungen, bei denen keine Veränderungen des SIG6 (Teil-) Bereichs durchgeführt wurden, handelt es sich bei dem TAP-tag um einen zusätzlichen Peptid-Bereich mit einem Molekulargewicht von rund 21 kda (Gloeckner et al., 2007) bestehend aus zwei Bindedomänen und einer TEV-Protease-Schnittstelle. Durch die Größe dieses Fusionsproteins könnte es zu einer gänzlich veränderten Konformation des SIG6- TAP kommen, inaktiv in der Zelle exprimiert vorliegen und einen somit negativen Einfluss auf plastidäre Prozesse besitzen. Da in diesem Fall die Co-Fraktionierung von Interaktionspartnern zu falschen Ergebnissen führen würde, sollte zunächst die Funktionalität des Proteins auf mehreren Ebenen untersucht werden. Nach erfolgreicher Transformation der Sig6-TAP Konstrukte in den Wildtyp (wt 35S::Sig6-TAP) und die Knockout-Mutante (sig6-2 35S::Sig6-TAP), beide nachfolgend als pe-205-linien bezeichnet, sollte die Überexpression des Sig6-TAP Konstrukts mittels einer RT-PCR mit genspezifischen Primern bei fünf Tage alten Keimlingen nachgewiesen werden. Dabei wurden neben dem nativen Sig6, das Fusionsprodukt Sig6-TAP sowie die nukleo-cytosolische 18S rrna als PCR-Kontrolle amplifiziert (Abb.24). In den pe-205 Linien konnte ein im Vergleich zum Wildtyp starkes Signal sowohl für das Sig6-Transkript, als auch für das Sig6-TAP Konstrukt amplifiziert werden. Damit konnte die Expression des Fusionsprodukts bestätigt werden. 63

79 Ergebnisse Abb.24: RT-PCR Analyse der Expression von Sig6 und dem Fusionskonstrukt Sig6-TAP. Gesamt-RNA wurde aus 5 Tage alten wt, sig6-2 und pe-205 Linien isoliert und mittels Reverser-Transkriptase zu cdna umgeschrieben. Durch spezifische Primer für den TAP-tag konnte die Expression des Fusionskonstrukts Sig6-TAP gezeigt werden. Weiterhin sollte der Phänotyp in der frühen Entwicklung untersucht werden, da der Knockout des Sigmafaktors 6 zu einem starken Phänotyp führt und eventuelle Kompensationen (sig6-2 als Ausgangslinie) bzw. negative Auswirkungen (im Wildtyp verursachte DNEs) durch das Fusionskonstrukt gezeigt werden könnten. In anderen Arbeitsgruppen durchgeführte Untersuchungen zeigten bereits, dass Fusionskonstrukte von Proteinen mit einem TAP-tag in Arabidopsis thaliana zu Veränderungen im Phänotyp führen können (Kohorn et al., 2011). 64

80 Ergebnisse Charakterisierung visueller Sig6-TAP Phänotypen Abb.25: Stadium-spezifische Phänotypen des Wildtyps, der sig6-2 und der transformierten pe205- Linien. Samen wurden auf MS-Medium mit entsprechendem Antibiotikum ausplattiert und bis zu den angegebenen Zeitpunkten unter Kurztagbedingungen angezogen. Maßstabsbalken: 1mm Die Überprüfung des Phänotyps des eingebrachten Sig6-TAP im Wildtyp (wt 35S::Sig6-TAP) zeigte keine Veränderungen im Vergleich zur Wildtyp-Ausgangslinie. Dagegen führte die Überexpression des Sig6-TAP in der sig6-2 Knockout-Linie (sig6-2 35S::Sig6-TAP) zu einer Komplementierung des optischen Phänotyps. Die Kotyledonen zeigten eine wildtypvergleichbare grüne Färbung, weiterhin konnten keine Veränderungen im Wachstum festgestellt werden. Es kann somit vermutet werden, dass es sich hierbei um einen funktionellen Faktor handelt, der den Verlust des nativen Sig6 in der Knockout-Linie (sig6-2) kompensieren kann. Nach der Bestätigung der Expression und der Untersuchung des Phänotyps sollten weiterhin auch die Zielgene der plastidären Transkription untersucht werden. Die in dieser Arbeit untersuchte DNE-Linie (wt 35S::crSig6) zeigte ebenfalls keine äußerlich feststellbaren Unterschiede zum Wildtyp, hatte jedoch erkennbare Veränderungen im Transkriptmuster (Abb. 6). 65

81 Ergebnisse Northern-Blot Analyse plastidärer Zielgene (class I und class II) in Sig6-TAP-Linien Die Ergebnisse der Northern-Blots (Abb.26) zeigten für die wt pe-205-linie keine Veränderungen in allen untersuchten Proben. Auch in diesem Fall führt die Überexpression eines Volllängenkonstrukts nicht zu einem DNE. Die Ergebnisse der sig6-2-pe-205 Linie konnten die Vermutung einer Komplementierung verstärken. Die Knockout spezifischen Veränderungen der Transkription konnten in der Linie nicht mehr gezeigt werden, das Muster war weitestgehend mit dem des Wildtyps vergleichbar. Abb.26: Northern-Blot Analyse plastidärer Zielgene im Wildtyp, der Knockout und den pe-205 Linien. Gesamt RNA (1µg) isoliert nach 5, 10 und 14 Tagen wurde auf einem 1,2% denaturierenden Agarose Gel aufgetrennt, geblottet und mit genspezifischen, DIG-markierten RNA-Sonden hybridisiert Immunologische Analyse plastidärer Proteine in Sig6-TAP-Linien Die Analyse plastidärer Transkripte durch Northern-Blot Hybridisierung (4.3.3) hatte bereits Veränderungen auf RNA-Ebene ergeben. Wie jedoch in dieser Arbeit gezeigt, scheint die Deletion von Sigmafaktoren auch zu Veränderungen in photosynthese-relevanten Proteinen zu führen. Die Analyse in der sig6-2-linie zeigte, dass durch den Knockout mindestens drei Proteine (PsbA, RbcL und RbcS) nicht mehr nachweisbar sind (Abb. 18). Ob dies nur ein teilweiser Verlust von Proteinen ist oder eine deutlich höhere Zahl verändert ist, sollte in der Knockout-Linie und in den transformierten TAP-Linien mit insgesamt 13 photosyntheserelevanten Proteinantikörpern untersucht werden. 66

82 Ergebnisse Abb.27: Western-Blot Analyse photosynthese-relevanter Proteine der Chloroplasten. Gesamtproteine aus dem Wildtyp, der sig6-2 und den pe-205 Linien wurden zu den angegebenen Entwicklungszeitpunkten isoliert und mittels Bis-Tris-PAGE gelelektrophoretisch aufgetrennt (jeweils 5µg) und mit spezifischen Antikörpern immunospezifisch detektiert. Durch die Analyse der plastidären Proteine konnten weiterhin einzelne, jedoch keine globalen Auswirkungen in der sig6-2 Linie festgestellt werden. Neben dem bereits gezeigten Verlust der Proteine PsbA, RbcL und RbcS (4.1.12) konnte weiterhin der Verlust der Lichtsammelkomplexe des Photosystem II (LhcB) festgestellt werden. Schwache Reduzierungen insbesondere bei 5d konnten für die Proteine PsbC und PsbL nachgewiesen werden. Alle bereits gezeigten oder neu festgestellten Veränderungen waren spätestens nach 28d nicht mehr sichtbar. Zu diesem Zeitpunkt konnte kein Unterschied zum Wildtyp ermittelt werden. In beiden Überexpressionslinien des Sig6-TAP Konstrukts waren keine 67

83 Ergebnisse Veränderungen in allen untersuchten Proteinen feststellbar. Dies deutet ebenfalls auf eine volle Funktionalität des in der Linie eingebrachten Sig6-TAP-Konstrukts Lasermikroskopische Aufnahme der Chlorophyll-Autofluoreszenz von Protoplasten in Sig6-TAP-Linien Die elektronenmikroskopische Aufnahme von Chloroplasten einer anderen Sigmafaktor 6 Knockout-Linie (sig6-1) zeigte bereits, dass innerhalb des Organells strukturelle Veränderungen vorliegen. So konnte die Ausbildung von Granathylakoiden nicht festgestellt werden (Ishizaki et al., 2005). Inwieweit die im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersuchte Knockout-Linie (sig6-2) ebenfalls einen Defekt in der Chloroplastenstruktur, insbesondere bei 5d, besitzt, sollte durch eine lasermikroskopische Aufnahme von isolierten Protoplasten überprüft werden. Durch die Autofluoreszenz des Chlorophylls ist eine genaue Abgrenzung der Chloroplasten zu den anderen Kompartimenten und Organellen möglich. Abb.28: Konfokal-lasermikroskopische Aufnahme von Protoplasten isoliert aus 5 Tagen alten Wildtyp, sig6-2 und den pe-205 Linien. Durch Anregung der Protoplasten mit einem Argonlaser bei 645 bis 663nm wurde das Chlorophyll innerhalb der Chloroplasten angeregt und die Chlorophyllfluoreszenz bei 650nm detektiert. Die Ergebnisse für die Knockout-Linie sig6-2 zeigen eine deutliche strukturelle Veränderung. Es sind keine ovalen Bereiche mit einer zusammenhängenden 68

84 Ergebnisse Chlorophyllfluoreszenz feststellbar. Nur einzelne Spots innerhalb des Protoplasten sind erkennbar. Somit kann von einem Defekt in der Ausbildung von funktionsfähigen Chloroplasten ausgegangen werden. Dies deutet erneut auf eine essentielle Rolle des Sigmafaktors 6 in der frühen Entwicklung von Arabidopsis thaliana. Die Ergebnisse der transformierten sig6-2-linie mit dem TAP-Konstrukt zeigen wiederrum, dass durch das eingebrachte Konstrukt die Linie komplementiert wird. Eine Mehrzahl von Chloroplasten mit deutlicher Fluoreszenz ist vorhanden Wachstumsanalyse auf MS-Medium ohne zusätzliche Kohlenstoffquelle von Sig6-TAP- Linien Die bisherigen Ergebnisse (fehlende RubisCO-Protein-Untereinheiten, strukturell veränderte Chloroplasten mit geringer Fluoreszenz) deuteten in der Knockout Mutante, insbesondere in der frühen Entwicklung, auf eine Heterotrophie hin. Unter Normalbedingungen wird dem Wachstumsmedium zusätzlich Saccharose zugegeben. Im folgenden Versuch sollte das Wachstum von Pflanzen auf MS-Medium ohne Saccharose untersucht werden (Abb.29) Abb.29: Wachstumsanalyse auf MS-Medium ohne zusätzliche Kohlenstoffquelle für 28 Tage. Zur Überprüfung der Photoautotrophie wurden die zuvor untersuchten Linien auf MS-Medium ohne Saccharose unter Kurztagbedingungen kultiviert. Der Fortschritt des Wachstums wurde nach 5d (A 1 -D 1 ), 14d (A 2 -D 2 ) und 28d (A 3 -D 3 ) festgehalten. 69

85 Ergebnisse Es zeigte sich, dass die Knockout-Mutante ohne eine externe Kohlenstoffquelle nicht überleben kann. Die Keimung und sehr frühe Entwicklung erfolgte wie die Anzucht unter Normalbedingungen. Nach 14 Tagen stagnierte das Wachstum, eine Bildung von Folgeblättern konnte nicht mehr verzeichnet werden, bis nach 28 Tagen die Linie eingegangen ist. Der Wildtyp und die transformierten Linien zeigten insgesamt ein reduziertes Wachstum, dennoch konnten diese Linien überleben und eine Rosette ausbilden Aufreinigung und immunologische Detektion des SIG6-TAP Proteins Nach der Absicherung der Funktionalität der beiden transformierten Linien waren die Voraussetzungen für eine sinnvolle Nutzung dieser Linien für eine SIG6-TAP Isolierung und Charakterisierung gegeben. Allerdings erwies sich dieses Vorhaben als unerwartet schwierig und führte trotz aller Strategien nur in Ansätzen zum gewünschten Erfolg. Da auch experimentelle Schwierigkeiten wissenschaftlichen Wert besitzen und für nachfolgende Arbeiten hilfreich sein können, seien diese Arbeiten hier abschliessend kurz skizziert: In ersten Versuchen wurde dazu Gesamtprotein isoliert und es wurde versucht, dieses mittels eines spezifischen TAP-tag Antikörpers immunologisch zu detektieren. Dieser Weg erbrachte jedoch nur negative Ergebnisse, ebenso wie ein modifizierter Ansatz über die Aufarbeitung von Chloroplasten mit anschließender Proteinisolierung. Zur Bestimmung der Detektionsgrenze des Antikörpers wurde eine Verdünnungsreihe eines rekombinanten TAP-Proteins mit anschließender Immunodetektion durchgeführt. Dies ergab, dass der Antikörper noch eine Proteinmenge von 1ng nachweisen kann. So wurde trotz der vorherigen Misserfolge bei der Detektion eine Aufreinigung des SIG6-TAP nach der Methode von Andrès et al., 2011 durchgeführt, jedoch wurde auf eine zweite Affinitätschromatographie mit einer Calmodulin-Matrix verzichtet. Nach der Elution der gebundenen Proteine durch die TEV-Protease wurde wiederrum ein Western-Blot mit anschließender Immunodetektion durchgeführt. Auch dies zeigte keinen Erfolg. Erst durch eine Immunodetektion mit einem Antikörper gerichtet gegen Calmodulin konnten Signale des SIG6-TAP nachgewiesen werden. Wie in Abb. 30b dargestellt ist, konnten in den entnommenen Fraktionen des Durchlaufs (D) und in den Waschschritten 1-3 (W 1-3 ) mehrere Signal im Bereich zwischen 25 und 75 kda detektiert werden. In den Waschschrittten 4 bis 10 konnte kein Signal beschrieben werden. In der Fraktion nach dem TEV-Protease-Verdau und anschließender Elution konnte ein starkes Signal im Bereich zwischen 37 und 50 kda ermittelt werden. Ein Silber-gefärbtes Acrylamid Gel (Abb. 30a) zeigt ebenfalls eine Bande in der Höhe 70

86 Ergebnisse zwischen 37 und 50 kda. Diese Ergebnisse liefern die ersten Hinweise auf eine möglicherweise spezifische Immundetektion. Allerdings wird es zur Sicherheit notwendig sein, das immunoreaktive Material z.b. durch Massenspektrometrie auf seine Identität zu prüfen. Abb.30: Affinitätschromatographische Aufreinigung des SIG6-TAP Proteins. (A) Silber-gefärbtes Bis-Tris- Polyacrylamid-Gel mit aufgetragener Elutionsfraktion. (B) Immunochemische Detektion des TAPtag Anteils des Fusionsproteins mit Hilfe des anti-calmodulin Antikörpers in den entnommenen Fraktionen. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass ein TAP-fusionierter SIG6 eine funktionelle Rolle in den Chloroplasten einnehmen kann. Er führt zu keiner Deregulierung innerhalb der plastidären Transkription und kann somit eine Co-Isolierung von Interaktoren ermöglichen. 71

87 Diskussion 5. Diskussion 5.1 Plastidärer Transkriptions-DNE in Arabidopsis thaliana Funktionelle Charakterisierung eines konstitutiv exprimierten Sigmafaktor-Teilbereichs Plastidäre Sigmafaktoren wie ihre prokaryotischen Gegenstücke können eine Bindung mit anderen Proteinen eingehen, die nicht Bestandteil des Transkriptions-aktiven Enzyms sind. Beispiele hierfür sind z.b. die SIB (Sigmafaktor-binde)-Proteine (Morikawa et al., 2002). Obwohl sie strukturell nicht den bakteriellen Anti-Sigmafaktoren (Helmann, 2009) ähneln, besitzen sie trotzdem sowohl das Potenzial funktionelle Eigenschaften der plastidären Sigmafaktoren zu verändern (Morikawa et al., 2002), als auch zusätzlich die Bindung mit anderen nicht - Sigmafaktoren einzugehen. So konnte für das SIG1-bindende Protein SIB1 eine Rolle bei der Antwort auf eine phytopathogene Infektion beschrieben werden (Xie et al., 2010). Neben der Lokalisation in den Chloroplasten konnte weiterhin für SIB1 und ein sequenz-ähnliches Protein (SIB2) ebenfalls eine Co-Lokalisation im Zellkern beschrieben werden, wo eine Interaktion mit einem WRKY-Transkriptionsfaktor stattfindet. Die damit einhergehenden Veränderungen in der nukleären Transkription und die Konsequenzen für den Chloroplasten konnten bisher nicht beschrieben werden (Lai et al., 2011). Ein SIG6-bindendes Protein, DELAYED GREENING 1 (DG1), konnte in die Gruppe der plastidären PPR-Proteine (pentatricopeptide repeat) eingeordnet werden (Chi et al., 2010). Viele dieser PPR-Proteine scheinen eine Funktion bei der posttranskriptionellen Regulation in Organellen zu besitzen (Schmitz-Linneweber und Small, 2008; Barkan, 2011). Hefe-zwei-Hybrid-Studien (yeast two-hybrid) zeigten ebenfalls, dass eine Interaktion eines SIB-Proteins mit der plastidären Casein-Kinase 2 (cpck2) vorhanden ist. Diese Kinase ist bei der Regulierung der Sigmafaktoren durch Phosphorylierung des unkonservierten Bereichs (UCR) beteiligt (Shimizu et al., 2010; Schweer et al., 2010a; Türkeri et al., 2012). Dies zeigt, dass durch die vielfältige Interaktion der Sigmafaktoren mit anderen Proteinen, insbesondere des UCR-Anteils, eine Modulation der plastidären Transkription via Sigmafaktor- Mutagenese und damit einhergehender Knockout-Mutanten zwangsläufig zu einer negativen downstream - Veränderung posttranskriptioneller und/oder inter-organeller Prozesse führen muss. Basierend auf den Untersuchungen der Sigmafaktor 6 Knockout-Linie (sig6-2) mit weitreichenden Veränderungen im Phänotyp und in plastidären, proteinkodierenden Transkripten (Lochelder et al., 2006, Schweer et al., 2006) sollte die Rolle des jeweiligen Sigma-Anteils (CR bzw. UCR) durch eine in-vivo Überexpression näher charakterisiert werden. In einem besonderen Fokus sollte dabei die Auswirkung der Überexpression des CR-Anteils stehen, da dieser strukturell 72

88 Diskussion insbesondere dem bakteriellen Sigma70 ähnelt und in E.coli bereits gezeigt wurde, dass durch eine Überexpression ein letaler DNE (Dominant-negativer Effekt) auftritt (Keener und Nomura, 1993). Im weiteren Sinne wird bei einer dominant-negativen Mutation (DNM) bzw. Effekt (DNE) (Herskowitz, 1987) eine (überexprimierten) Variante eines Proteins bezeichnet, das durch seine eigene negative Funktion mit dem ursprünglichen Wildtyp-Gen Produkt interferiert. Daraus resultiert eine partielle bzw. volle Blockade der Genfunktion auf Proteinlevel. In seiner einfachsten Form führt dies zur Ausbildung von inaktiven Dimer-(oder Oligomer-) Proteinkomplexen, deren negative Beeinflussung auch auf Transkriptionsfaktoren wirken kann (Veitia, 2007). Beispiele der Transkriptionsfaktor-bedingten DNEs wurden bereits in vielen Organismen beschrieben (Boyer et al., 2004) mit Auswirkungen auf Entwicklung, Krankheit und evolutionäre Kompetenz (Veitia, 2009). Die dominat-negative Strategie kann gegenüber anderen Methoden, wie dem Knockout, einen deutlichen Vorteil bieten, insbesondere wenn Proteine einer Genfamilie die Funktion des ausgeschalteten Faktors einnehmen können (Veitia, 2007; Seo et al., 2012). In einer ersten Analyse wurde nach erfolgreicher Transformation und Selektion der optische Phänotyp aller untersuchten Linien untersucht (Abb.5). Bezogen auf die jeweilige Ursprungslinie konnten dabei entweder keine oder nur geringe Veränderungen (wt 35S::crSig6, 5d) festgestellt werden. Einerseits zeigten alle transformierten Linien, die einen Wildtyp-Hintergrund hatten, in der Pigmentierung und im Wachstum äquivalente Eigenschaften zum Wildtyp, andererseits konnten die gelblich-weißen Kotyledonen in der frühen Entwicklung in allen Linien mit einem Knockout-Hintergrund beschrieben werden. Dies deutet darauf hin, dass durch die eingebrachten Teilkonstrukte entweder keine oder nur sehr schwach ausgeprägte Veränderung vorliegen. Die Betrachtung der gesamten Sigmafaktor-Familie und der jeweiligen Knockout-Mutanten (Schweer, 2010) zeigt bereits in diesem Aspekt, dass es keinen essentiellen Faktor in der Biogenese der Plastiden gibt. Vielmehr muss von einer synergetischen Funktion aller Mitglieder ausgegangen werden, welche durch einen Verlust durch einen anderen Faktor kompensiert bzw. abgemildert werden kann. Anders sieht es jedoch in Mutanten mit funktionsveränderten Sigmafaktoren aus. Insbesondere durch Punktmutationen der Kinase-spezifischen (cpck2) Sigma- Phosphorylierungsstellen im unkonservierten Bereich (UCR) konnte eine derartige Kompensation nicht gezeigt werden (Schweer et al., 2010). Dies bestärkt die Annahme, dass eine intra- und inter-zelluläre Regulation der Sigmafaktoren durch bindende Proteine, insbesondere durch den UCR-Anteil, vermittelt wird. 73

89 Diskussion Situations- und entwicklungsspezifische Anpassungen erfordern sowohl in Pro- als auch Eukaryoten eine zielgerichtete Genexpression. In Bakterien scheint insbesondere die Transkriptionsinitiation der dabei dominierende Regulator zu sein, wohingegen in Chloroplasten eher eine Regulation durch unterschiedliche Wege vermittelt wird. Neben der posttranskriptionellen Modifizierung wird weiterhin eine retrograde Vernetzung zwischen Chloroplast und Zellkern vermutet, wodurch kernkodierte Proteine (RNA-bindende Proteine, Sigmafaktoren) bei der Genexpression in Chloroplasten als regulatorisches Element eine wichtige Rolle spielen (Link, 1996; Pfannschmidt et al., 1999; Eberhard et al., 2002; Barkan, 2011). Insbesondere der letztgenannte Aspekt wird durch eine erst kürzlich erschienene Publikation weiter gestärkt. So wurde festgestellt, dass die Circadiane-Uhr der Pflanzen die Produktion von Sigmafaktoren beeinflusst und somit direkt Einfluss auf die Expression von plastidären Genen nimmt (Noordally et al., 2013). Dementsprechend wurde die Expression von plastidären Zielgenen mit Hilfe von Northern-Blots und DIG-markierten RNA-Sonden gerichtet gegen drei plastiden- und ein kernkodiertes Gen untersucht, die bereits Sigma-Knockout-spezifische Veränderungen (bei den plastidären Genen) zeigten (Abb. 6 ). So wurden neben dem Transkript für die D1-Untereinheit des Photosystem II (psba), die β-untereinheit der ATPase (atpb) sowie die große, plastidenkodierte und kleine, kernkodierte Untereinheit der RubisCO (rbcl und RbcS) untersucht (Isono et al., 1997). Eine entwicklungsspezifische Veränderung im Transkript-Muster konnte nur in der Linie mit eingebrachtem CR-Anteil im Wildtyp festgestellt werden. Diese Linie zeigte insbesondere nach 14d eine stark verminderte Akkumulierung aller PEP- und NEP-spezifischer, plastidärer (psba, rbcl, atpb) Transkripte und interessanterweise auch des kernkodierten RbcS-Transkripts. Die veränderte Akkumulierung des RbcS-Transkripts zeigt, dass ein bisher unbekannter Regulationsmechanismus zwischen Plastid und dem Zellkern vorliegt, der auf eine Veränderung des steady-state Zustand reagiert. Dass die Expression des RbcS-Gens im Zellkern koordiniert zur aktiven Transkription im Chloroplasten stattfindet, wurde bereits von Rapp und Mullet, 1991 beschrieben. Sie zeigten, dass durch Zugabe eines Inhibitors der PEP keine Akkumulierung des RbcS-Transkripts stattfindet. Eine mögliche Rolle könnten dabei die bereits beschriebenen PPR- Proteine spielen (Schmitz-Linneweber und Small, 2008), insbesondere das für SIG6 beschriebene DG1 (Chi et al., 2010) könnte ein Bestandteil der retrograden Signalkaskade sein. Somit könnte der vermehrt vorliegende CR-Anteil ein physiologischer Inhibitor sein, der simultan die plastidäre und Teile der kernlokalisierten Transkription hemmt. Zusätzliche Northern-Blot Analysen (Abb.11) unter Einbezug eines plastidären, NEP-spezifischen class III Gens (accd) ergaben weiterhin, dass dieses ebenfalls wie das 2.0 kb atpb-transkript durch 74

90 Diskussion diesen DNE in seiner Akkumulierung reduziert vorliegt. Ein aus der der Literatur beschriebenes Kontrollgen, Aktin2 (Act2; Kreps et al., 2002), zeigte keine Veränderung. In Kontrollversuchen mit Volllängenbereichen des SIG6 im Wildtyp und der Knockout-Linie unter der Kontrolle eines 35S CaMV-Promotors (Abb. 7) konnte weiterhin festgestellt werden, dass im Wildtyp keine Veränderung in der Transkriptakkumulation feststellbar ist. In einer transformierten sig6-2-linie komplementierte das eingebrachte Konstrukt alle Mutanten-spezifischen Veränderungen hin zum Wildtyp. Diese Ergebnisse bestärken erneut die bereits beschriebene regulatorische Rolle des UCR-Anteils (Schweer et al., 2010), wodurch sowohl die Expression dieses Anteils zu keinem DNE führt, als auch durch das Fehlen der funktionellen Bestandteile, keine Komplementierung der Knockout- Linie möglich ist. Bisherige Untersuchungen einer veränderten plastidären Transkription durch Sigma-spezifische Veränderung (Knockout, anti-sense) konnten eine derartige globale Veränderung bisher nicht beschreiben. Insbesondere für die NEP-spezifischen class III Gene konnte eher eine erhöhte Akkumulierung festgestellt werden (Kanamaru et al., 2001; Ishizaki et al., 2005). Es wird daher von einer kompensatorischen Funktion der NEP ausgegangen. Inwieweit die NEP durch die Überexpression des konservierten Bereichs in der DNE-Linie beeinflusst wird, insbesondere da für accd bisher kein PEP-Promotor beschrieben werden konnte (Abb. 32), ist bisher unverstanden und bedarf weiterer Untersuchungen. Ob die gezeigte entwicklungsspezifische Variabilität in der Veränderung der untersuchten Transkripte in der DNE-Linie durch eine veränderte Expressionsrate des Teilbereichs verursacht wird, wurde weiterhin durch eine RT-PCR untersucht. Unter der Kontrolle des 35S CaMV- Promotors unterliegen die dahinter eingebrachten Gene einer konstitutiven, unregulierten Genexpression (Benfy und Chua, 1990). Durch ihre TATA-Box (-46 bis +8) ist eine Bindung der Kern-Transkriptionsfaktoren möglich, gleichzeitig liegen zwei enhancer -Regionen vor (-90 bis -46 ; -343 bis -90), die eine verstärkte Expression katalysieren (Ho et al., 1999). So konnte auch bei der Überprüfung ein entwicklungsunabhängiges, verstärktes Signal für den eingebrachten, konservierten Teilbereich detektiert werden. Demnach scheint die beschriebene Veränderung der plastidären Genexpression auf anderen regulatorischen Prozessen zu beruhen. Zur Klärung einer eventuellen Fehl- bzw. Co-Lokalisation des verkürzten Sigma-CR-Anteils innerhalb verschiedener Kompartimente der pflanzlichen Zelle wurden weiterhin GFP- Lokalisationsstudien durchgeführt. Durch die Überlagerung der Signale der Autofluoreszenz des Chlorophylls und des GFP konnte eine Lokalisation eindeutig innerhalb der Chloroplasten nachgewiesen werden (Abb. 9). Demnach scheint die N-terminal angefügte plastidäre Zielsequenz 75

91 Diskussion erkannt zu werden und die beschriebenen Ergebnisse eine direkte Folge einer Interaktion von Proteinen im Chloroplasten zu sein. In einer weiteren Analyse wurde die Expression der gesamten Arabidopsis-Sigmafaktor-Familie exemplarisch mittels semiquantitativer RT-PCR überprüft (Abb. 10). Referenzanalysen von Woodson et al., 2013 zeigten bereits mittels qrt-pcr, dass innerhalb der Wachstumsperiode von 5d bis 10d eine starke Variabilität der Sigmafaktor-Genfamilie vorliegt. Diese regulatorische Steuerung scheint die Antwort auf die entwicklungsspezifische Rekrutierung einzelner Faktoren und einer damit verbundenen veränderten - Genexpression zu sein. Im gleichen Zusammenhang wurde die Genexpression der Sigmafaktoren in der Knockout-Linie sig6-1 untersucht. Neben der zuvor genannten zeitlichen Variabilität innerhalb der Expression einzelner Faktoren konnte auch dort eine Verschiebung der Expressionsstärke festgestellt werden. Insbesondere für SIG1, SIG3, SIG4 und SIG5 wurde dabei eine quantitative Zunahme der Transkripte zu beinah allen untersuchten Zeitpunkten festgestellt. Diese verstärkte Expression könnte eine nukleäre Strategie sein, um dem Verlust von SIG6 zu kompensieren. Inwieweit diese anderen Faktoren die Funktion komplett übernehmen, ist bisher nicht geklärt. Jedoch kann vermutet werden, dass einzelne Faktoren keine generelle Spezialisierung besitzen und somit den Verlust von einem, maximal von zwei Sigmafaktoren ausgleichen können. Mittels genspezifischer RT-PCR-Analysen konnte die in der Knockout-Linie festgestellte, erhöhte Expressionsstärke der Transkripte von SIG1, SIG4 und SIG5 insbesondere zum frühen Entwicklungszeitpunkt (5d) bestätigt werden. Ob diese hochregulierten Sigmafaktoren eine redundante Funktion in Bezug zu SIG6 besitzen und damit die Transkription in weiten Teilen übernehmen können, ist bisher nicht geklärt. In der DNE-Linie konnte eine derartig ausgeprägte Veränderung nicht festgestellt werden. Eher im Gegenteil konnte eine partielle Verminderung der Signalstärke für einige Transkripte beschrieben werden. Einzig für SIG6 konnte ein verstärktes Signal zu allen Zeitpunkten festgestellt werden. Demnach scheint in der DNE-Linie lediglich eine gezielte Gegensteuerung vorzuliegen, um das vermehrt vorhandene Teilfragment und den damit verbundenen Effekt durch den nativen Volllängenfaktor zu minimieren. 76

92 Diskussion Bei näherer Betrachtung der Ethidiumbromid-gefärbten RNA-Gele fiel ferner auf, dass die Stöchiometrie der rrna-banden verändert vorlag (Abb. 12). In der Knockout- (bei 5d) und der DNE-Linie (verstärkt bei 14d) waren die Signale für die 16S und die hidden-break products der 23S in geringerer Quantität feststellbar. Die plastidären rrnas (23S, 16S, 4.5S und 5S) liegen wie bereits in der Einleitung beschrieben als rrn-operon auf dem Plastom kodiert vor. Sie werden zunächst als 7.4 kb großes, polyzistronisches Vorläufertranskript gebildet und in ihre jeweilige maturierte (rrn)-form durch Endo- und Exonukleasen geschnitten (Abb. 31). Die dabei beteiligten Enzyme und Co-Faktoren sind jedoch bisher nur unzureichend beschrieben (Bollenbach et al., 2005; Stoppel und Meurer, 2012). Abb.31: Schematische Darstellung der Maturierung von rrna-vorläufertranskripten in Chloroplasten. Aus dem plastidären rrn-operon entsteht das primäre 7.4 kb große Transkript. Die Mehrheit, der bei der Prozessierung beteiligten RNasen (Pfeile) sind bisher unbekannt. So konnte nur die 5`-Maturierung der 23S rrna der CSP41a/b zugeordnet werden (Beligni und Mayfield, 2008). Die Endonuklease Rh39 (Dreieck) scheint eine Rolle bei der Prozessierung des zweiten hidden-break products der 23S rrna zu besitzen. Intermediate der endonukleolytischen Prozessierungen werden am 3`-Ende durch eine PNPase und/oder RNAse R (grau) und am 5`-Ende durch die RNase J (?) -Exonuklease (schwarz) weiter prozessiert (verändert nach Stoppel und Meurer, 2012). Nach der Hybridisierung der Blots mit einer Sonde spezifisch gegen die 23S rrna konnte ein komplexes Muster detektiert werden. Dieses beruht auf der Prozessierung aus dem 7.4 kb Vorläufertranskript. In einem ersten Schritt entsteht durch die CSP41a/b Endonuklease am 5`- Ende sowie durch ein bisher unbekanntes Enzym am 3`-Ende ein 3.2 kb Vorläuferprodukt, das unprozessiert aus dem 23S- und dem 4.5S rrna-anteil besteht. In einem weiteren Schritt wird der 4.5S-Anteil abgespalten und die maturierte Form (2.9 kb) der rrna liegt fertig prozessiert vor. Weiterhin wird die maturierte Form in katalytischen Schritten zu den hidden-break products prozessiert (Leaver, 1973). Die Funktion dieser zusätzlich modifizierten rrnas in der großen ribosomalen Untereinheit (50S) ist bisher nicht geklärt (Stoppel und Meurer, 2012). Interessanterweise konnte in Linien mit einem Defekt in der oben beschriebenen 3`-Prozessierung 77

93 Diskussion der Vorläufertranskripte und der Polysomenassemblierung gezeigt werden, dass das 23S-4.5Sunprozessierte Vorläufertranskript (3.2 kb) verstärkt akkumuliert vorliegt (Bellaoui et al. 2003; Bisanz et al. 2003; Bollenbach et al. 2005, Stoppel und Meurer, 2012). Eine derartige Akkumulierung des 23S-4.5S Vorläufertranskripts konnte in der DNE-Linie (Abb. 13, oberste Reihe, 14d) nicht festgestellt werden. Eher im Gegenteil war ein vermindertes Hybridisierungssignal für das Transkript vorliegend. Eine ähnliche Reduktion zeigte das prozessierte 2.4 kb Transkript. Gleichzeitig blieb das Signal für die maturierte Form (2.9 kb) in seiner Intensität im Verhältnis zum Wildtyp relativ konstant. Durch die Hybridisierung einer RNA-Sonde gegen die 16S rrna ergibt sich ein weitaus einfacheres Muster. Dieses besteht aus einem Vorläufer- (1.7 kb) und dem maturierten Transkript (1.5 kb). Im Gegensatz zur prokaryotischen 16S rrna wird das plastidäre rrn16 Vorläufertranskript weitaus weniger prozessiert und nur um etwa 180nt downstream des 3`-Ende durch eine Exonuklease verändert (Bisanz et al., 2003). Wie in vorherigen Untersuchungen bereits gezeigt wurde, ist das Signal des Vorläufertranskript zur maturierten Form meist deutlich schwächer ausgeprägt (Bollenbach et al., 2005; Liu et al., 2010). Demnach scheint eine direkte Prozessierung dieses Transkripts stattzufinden. Vergleichbare Ergebnisse konnten in der DNE-Linie beschrieben werden. So war die maturierte 16S rrna zu allen Zeitpunkten in vergleichbarer Intensität zum Wildtyp detektierbar, jedoch nicht das Vorläuferprodukt.In der Knockout-Mutante waren erneut entwicklungsspezifische Unterschiede feststellbar. Zum Zeitpunkt 5d war eine reduzierte Akkumulierung des Vorläufertranskripts sowie eine Verstärkung der Vorläufer-rRNA feststellbar. Zu den späteren Zeitpunkten konnte diese Varianz nicht mehr festgestellt werden. Somit scheint die Knockout-Linie eine kompensatorische Gegensteuerung zur Aufrechterhaltung der Translationsinitiation durch eine verstärkte Prozessierung des rrn16-transkripts auszuführen. Bei der Detektion der 4.5S rrna können insgesamt zwei Hybridisierungssignale festgestellt werden. Neben der bereits bei der 23S rrna genannten 3.2 kb Vorläuferform, entsteht das nach der Prozessierung abgespaltene 0.1 kb Transkript. Die Ergebnisse in der DNE-Linie spiegeln die bereits für die 23S rrna erzielten Ergebnisse wider. Zum Zeitpunkt des stärksten DNE (14d) konnte eine äquivalente Reduktion des 3.2 kb Transkripts und der maturierten 0.1 kb Form festgestellt werden. In der Knockout-Linie konnte wiederum eine entwicklungsspezifische Anpassung festgestellt werden. Während zunächst beide Signale nur sehr schwach detektiert werden konnten (5d), nahm das Vorläufertranskript in seiner Intensität zu (10d), bis kein Unterschied in beiden Hybridisierungssignalen im Vergleich zum Wildtyp festgestellt werden konnte (14d). 78

94 Diskussion Die Ergebnisse der Untersuchung der Produkte des rrn-operons können die bereits beschriebene NEP-Promotorspezifität (Cortouis et al., 2007) nur in der frühen Entwicklung bis 14d bestätigen. Es muss daher von einer dynamischen Funktion ausgegangen werden. Erst nachdem die PEP die aktive Rolle in der Transkription des rrn-operons übernommen hat, wird diese durch die Bindung mit dem CRSIG6 inhibiert. Die Betrachtung der rrn-promotoren (Abb. 32) zeigt, dass neben einem NEP-spezifischen Promotor Prrn16-139, auch zwei PEP-Promotoren (Prrn und Prrn16-112) vorliegen, die strukturelle Eigenschaften der Sigma70 aufweisen (Shiina et al., 1998; Swiatecka- Hagenbruch et al., 2007). Ein derartiger Wechsel der zuständigen Promotoren könnte Grundlage des beschriebenen, entwicklungsabhängigen DNE sein. Abb.32: Übersicht genspezifischer Promotorregionen aus Arabidopsis thaliana. (A) PEP- Promotoren mit konservierten -35/-10-Regionen (grau unterlegt). (B) NEP-Promotoren des Typs Ia, Ib sowie Pc mit jeweiligen konservierten Bereichen (grau unterlegt). Die vorwiegende Bindung der genannten Polymerase an den jeweils dargestellten Promotor ist durch ein + dargestellt. Bei Promotoren mit einem (+) konnte eine genaue Zuordnung der Polymerasenform bisher in-vivo nicht gezeigt werden (Shiina et al., 1998; Swiatecka- Hagenbruch et al., 2007; Swiatecka-Hagenbruch, 2009). Zur Überprüfung einer fehlenden Neusynthese des rrn-vorläufertranskripts könnten organello run-ons (Steiner et al., 2009) oder Northern-Blot-Analysen unter näherer Betrachtung des 7.2kb Vorläufertranskript durchgeführt werden. Gleichzeitig müsste die Frage beantwortet werden, inwieweit das maturierte Transkript vor dem DNE geschützt ist, da es zu allen untersuchten Zeitpunkten keiner Veränderung unterliegt. Eine katalytische Schutzfunktion vor Nukleasen könnte durch die Bindung an die 50S-Untereinheit der Ribosomen vorhanden sein, wie sie bereits in E.coli für die 16S und 23S rrna beschrieben werden konnte (Merryman et al., 1999a und b). 79

95 Diskussion Nach dem Nachweis einer veränderten Transkriptakkumulierung der ribosomalen RNAs und im Zusammenhang bereits beschriebener Ergebnisse hinsichtlich daraus resultierender Polysomenassemblierung (Bollenbach et al. 2005) sollte geklärt werden, ob die Ribosomen in der Knockout- und der DNE-Linie translationsaktiv vorliegen. Einen ersten Anhaltspunkt sollten dazu Northern-Analysen Polysomen-assoziierter mrna liefern, welche in dieser Arbeit exemplarisch für das psba-, atpb- und rbcl-transkript durchgeführt wurden. Zur Überprüfung der korrekten Zusammensetzung der Ribosomen/Polysomen wurde weiterhin die Assoziierung der rrnas an Polysomen unter gleichen Bedingungen überprüft. Da jedoch bereits in Spinatchloroplasten für das psba-transkript gezeigt wurde, dass die Elongation vom plastidären Redox-Zustand abhängt (Zhang et al., 2000), müssten zur grundsätzlichen Bestätigung in-organello Translationsstudien mit radioaktiv markierten Aminosäuren durchgeführt werden. Die durchgeführten Northern-Blots der isolierten RNA aus der Polysomenisolierung zeigten in der Knockout-Linie Transkript-spezifische Unterschiede. Für das rbcl-und das atpb-transkript wurde ein Wildtyp-ähnliches Hybridisierungs-Muster festgestellt. Dagegen konnte für psba keine Assoziierung und eine damit verbundene Transkriptionsinitiation bei den Proben der 5d alten Pflanzen festgestellt werden. Dies könnte damit zusammenhängen, dass das psba-transkript vielen Kontrollmechanismen unterliegt und daher die Translationsinitiation zu diesem Zeitpunkt durch nicht-gegebene Eigenschaften zunächst arretiert ist (Zhang et al., 2000). Die DNE-Linie zeigte dagegen in der Assoziierung der mrna keinen Transkript-spezifischen Unterschied. Die Hybridisierungssignale der freien mrna zum Zeitpunkt des stärksten DNE (14d), zeigten jedoch nur eine geringe bis nicht vorhandene Intensität. Diese Ergebnisse zeigen, dass posttranskriptionelle Prozesse durch den DNE unbeeinflusst sind, jedoch die eigentliche Neusynthese von Transkripten unterbrochen ist. Dies bestärkt die Annahme, dass es sich bei dem vermehrt vorliegenden CR-Anteil um einen physiologischen Inhibitor der PEP handelt. Die Überprüfung der Assoziierung der rrnas an Polysomen zeigte weiterhin, dass keine Veränderungen in allen untersuchten Linien vorlagen. Demnach konnte der Zusammenhang einer verstärkten Akkumulierung des zuvor bereits genannten 23S-4.5S-unprozessierten Vorläufertranskript und dem daraus resultierenden Defekt in der Polysomenassemblierung, durch das nicht-vorhandensein in der Knockout- und der DNE-Linie, bestätigt werden (Bollenbach et al. 2005). 80

96 Diskussion Der nächste Schritt in der Analyse war die Untersuchung plastidenlokalisierter Proteine mit Fokus auf die Produkte der zuvor untersuchten mrnas. Insbesondere die Translationsprodukte der psba-mrna wurden unter Berücksichtigung der zuvor genannten Veränderungen in den Polysomenfraktionen besonders untersucht. In einer aktuell veröffentlichten Arbeit (Woodson et al., 2013) wurden ebenfalls die Proteine RBCL und PSBA untersucht. So konnten deutlich reduzierte Signale für beide Proteine festgestellt werden, jedoch wurde in dieser Arbeit die sig6-1-linie (Ishizaki et al., 2005) näher charakterisiert, welche einen weniger ausgeprägten optischen und molekularen Phänotyp aufweist. Die Ergebnisse der plastidären Proteine zeigten, dass nur in der Knockout-Linie starke Veränderungen in drei von insgesamt fünf untersuchten Proteinen vorlagen. Die Proteine PSBA, RBCL und RBCS konnten bei 5d und 10d nicht detektiert werden. Erst ab 14d waren die Signale in einer quantitativ reduzierten Form nachweisbar. Ein für RBCS vergleichbares Ergebnis konnte in einer Arabidopsis Knockout-Mutante für das ptac14-protein des bereits in der Einleitung beschriebenen TAC (transcriptionally active chromosome)-komplexes beschrieben werden (Gao et al., 2011). Neben der bereits genannten, nicht vorhandenen RBCS-Akkumulierung zeigt diese Mutante weiterhin einen vergleichbaren optischen Phänotyp und eine Reduktion in der Transkriptakkumulation. Die Autoren gehen von einer Interaktion des ptac14 mit SIG6 aus. Eine in-vivo und in-vitro Interaktion wurde bisher nicht gezeigt, jedoch wird insbesondere durch äquivalente Veränderungen der plastidären Genexpression dem ptac14-protein eine Beteiligung an der SIG6-Aktivität zugesprochen. Die genaue Funktion von ptac14 konnte ebenfalls nicht beschrieben werden, jedoch könnte dieses Protein ein weiterer Regulator innerhalb und außerhalb der Chloroplasten des SIG6 sein, da trotz vorhandener Transkripte in der sig6-2-linie (Abb. 11) eine Akkumulierung der Proteine in den Chloroplasten nicht stattfindet. Das Wachstum der Knockout-Linie auf MS-Medium ohne eine externe Kohlenstoffquelle zeigte weiterhin, dass durch die fehlende RubisCO und das zentrale D1-Protein des Photosystems II ein photoautotrophes Wachstum nicht möglich ist und demnach der Knockout unter diesen Bedingungen eine letale Ausprägung erhält (Abb. 29). Diese Ergebnisse bestärken die These, dass der Sigmafaktor 6 in der frühen Phase der Entwicklung von Arabidopsis thaliana eine entscheidende Rolle innerhalb einer plastidären Regulation spielt (Ishizaki et al., 2005; Loschelder et al., 2006). Das relativ stabile Proteinexpressionsmuster der DNE-Linie könnte das Ergebnis der zwar reduziert vorliegenden mrna sein, die jedoch in ausreichendem Maße für den turn-over der Proteinsynthese zur Verfügung steht. Inwieweit diese Stabilität im weiteren Wachstum vorliegt, müsste durch weitere Untersuchungen des Proteinprofils nachgewiesen werden. Da jedoch kein 81

97 Diskussion letaler Phänotyp beschrieben werden konnte, muss davon ausgegangen werden, dass die Mutante diesen Zustand in irgendeiner bisher unbekannten Form kompensieren kann Induzierte Überexpression des CR-Anteils des SIG6 Nachdem ein plastidärer Transkriptions-DNE durch die konstitutive Überexpression des konservierten Bereichs in einer Wildtyp-Ausgangslinie gezeigt werden konnte, der jedoch in seiner Ausprägung an eine entwicklungsspezifische Komponente gebunden war, wurde weiterhin die Möglichkeit eines induzierten DNE mit dem gleichen Teilbereich überprüft. So konnten zwischen dem 35S- und dem induzierbaren XVE-System in der vorliegenden Arbeit keine Unterschiede festgestellt werden. Die bereits für die konstitutive Linie beschriebenen Veränderungen konnten durch eine hormonbasierte Induzierung mit anschließender Überexpression erneut festgestellt werden. Alle untersuchten plastidären Zielgene (Abb. 21) zeigten eine äquivalente Reduktion, die interessanterweise ihre stärkste Ausprägung ebenfalls nach 14d hatten. Demnach scheint dieser plastidäre Transkriptions-DNE unabhängig von der vorherigen zellulären Situation aufzutreten. Nach bisherigen Untersuchungen kann dieser Umstand nicht näher erklärt werden, eine mögliche Erklärung soll jedoch im weiteren Abschnitt angesprochen werden Hypothetische Funktion des CRSIG6 als DNE Die verstärkte Expression des CR-Anteils mit einer nachgewiesenen Lokalisierung innerhalb der Chloroplasten bestätigte einen Dominant-negativen Effekt, wie er bereits in E.coli bei einem äquivalenten Sigma70 Anteil bereits gezeigt werden konnte (Keener und Nomura, 1993). Funktionsanalysen der plastidären Sigmafaktoren aus Arabidopsis thaliana zeigten bereits, dass bedingt durch die strukturellen Homologien eine Promotorbindung in-vitro mit einem Core-Enzym aus E.coli möglich sind (Schweer et al., 2010). Demnach kann nach bisherigem Kenntnisstand eine Interaktion des CR-Anteils mit der Polymerase vermutet werden. Die folgende Abbildung (Abb.33) stellt schematisch die daraus resultierende Wirkung dar. (a) Unter Normalbedingungen führt die Bindung eines Sigmafaktors an die PEP zur Bildung des funktionellen Core-Enzyms, wodurch die Bindung dieser Multiproteineinheit an eine spezifische Promotorregion möglich ist und die Transkription stattfinden kann. (b) Durch die konstitutive/induzierte Expression des CR- Teilbereichs kommt es zu einer Übersättigung der Plastiden, verbunden mit einer dauerhaften Bindung an die PEP. Diese wird dadurch inhibiert und eine Bindung an Promotorregionen ist nicht mehr möglich. 82

98 Diskussion Abb.33: Schematische Darstellung der funktionellen Holoenyzm-Einheit innerhalb eines Plastiden und eines möglichen DNE-Effektes auf die plastidäre Transkription durch Überexpression des konservierten Bereichs von SIG6 (a) Die Bindung eines Sigmafaktors an das Core- Enzym führt zur Bildung des Holoenzym und anschließender Transkription von Zielgenen. (b) Eine erhöhte Expression des CRSIG6 führt zu einer Konkurrenzsituation mit dem authentischen Sigmafaktor, daraus resultiert eine reduzierte/gehinderte funktionelle PEP- Sigma Holoenzym Formation und Promotorbindung. Infolgedessen kommt es zur Reduzierung der steady-state Konzentration von Zielgentranskripten. Weiterhin stellt sich jedoch die Frage, durch welche Komponente eine zeitspezifische Ausprägung des DNE verursacht wird, insbesondere da gleiche Ergebnisse sowohl in der konstitutiven als auch in der induzierten Expression jeweils nach 14 Tagen detektiert wurden. Eine Möglichkeit wäre, dass zu diesem Zeitpunkt innerhalb des Chloroplasten die Rekrutierung verschiedener Sigmafaktoren zur PEP variiert, demnach eine unspezifische Bindung des CRSIG6 (bedingt durch die relative Variabilität des CR-Anteils) nicht möglich ist. Eine weitere Möglichkeit könnte sein, dass im Kotyledonen-Stadium eine generell höhere Aktivität der NEP zu verzeichnen ist, erst in den Folgeblättern die Transkriptionsaktivität durch die PEP übernommen wird, wodurch zu diesem Zeitpunkt die Inhibierung erst stattfinden kann. Welche regulatorische Komponente dafür verantwortlich ist, konnte bisher nicht beschrieben werden und würde die Frage des beschriebenen DNE eventuell klären. Ziel weitergehender Arbeiten wird es sein, sowohl den konstitutiven als auch den induzierten DNE in einen regulatorischen Kontext zwischen Zellkern und Chloroplast einzubinden. Die Rolle der zuvor erwähnten SIB-Proteine und insbesondere der an der vermuteten - retrograden Signalkaskade beteiligten PPR-Proteine müssten dabei näher untersucht werden. 83