3 Enzymkinetik * von ganzen Zellen zur Katalyse beeinflusst. * Autoren: Andreas Liese, Lutz Hilterhaus, Michael Howaldt, Horst Chmiel

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1 3 Enzyineti * In apitel wurde bereits die besondere Rolle der Enzye herorgehoben, die nicht nur atalytische, sondern auch regulatorische Aufgaben wahrnehen. Vor alle die atalytische Atiität on Enzyen ist für den Biotechnologen on Bedeutung (Liese 6, Tao 9), wobei die enntnis der Enzyineti es eröglicht, ithilfe der linearen und nicht-linearen Regression aus einzelnen Messwerten ein inetisches Modell zu erstellen. Diese Modellorstellungen gestatten es, innerhalb enzytechnologischer Prozesse eine Voraussage über den zu erwartenden Usatz und beispielsweise optiale Enzyonzentrationen zu treffen (Abb. 3.). Auch bei Einsatz on ganzen Zellen zur atalyse beeinflusst * Autoren: Andreas Liese, Lutz Hilterhaus, Michael Howal, Horst Chiel das Wechselspiel der Enzye in der Zelle die etabolische Atiität und dait das Verhalten der Zellpopulation. Für die Auslegung und Analyse eines solchen Reationssystes wird eine atheatische Funtion benötigt, welche das Verhalten der Enzye in Abhängigeit on den Reationsbedingungen beschreibt (Vasic-Raci 3). Auch ein Bioreator ist ein solches Reationssyste, dessen atheatische Beschreibung eine Optiierung eröglicht, die eine erhöhte Produtiität zu Ziel hat. In den folgenden Abschnitten werden erschiedene Geschwindigeitsgleichungen abgeleitet und der Einfluss on Zusaensetzung, Druc, Teperatur, Ionenstäre und ph-wert der Reationsischung auf die Enzyineti beschrieben. Die Grundoraussetzung, dass überhaupt irgendeine cheische Reation ablaufen ann, liegt jedoch in den Abb. 3. Scheatische Darstellung der Bestiung inetischer Paraeter H. C h i e l ( e d. ), B i o p r o z e s s t e c h n i S p e t r u A a d e i s c h e r V e r l a g H e i d e l b e r g

2 Enzyineti therodynaischen Paraetern der Reation begründet, was or alle bei reersiblen Reationen on besondere Interesse ist. Auf diese speziellen therodynaischen Paraeter ann innerhalb dieses apitels nicht weiter eingegangen werden. 3. Atiität und Stabilität Lösungen on Ionen erfüllen das Massenwirungsgesetz nicht exat. Aufgrund ihrer Ladungen beeinflussen die Ionen sich gegenseitig, und zwar uso stärer, je höher die Gesationenonzentration in der Lösung ist. Die zwischen entgegengesetzt geladenen Ionen wirenden Anziehungsräfte führen zu einer ereintlich geringeren Zahl an dissoziierten Ionenpaaren innerhalb der Lösung. Das Massenwirungsgesetz ann nichtsdestotrotz auch bei größeren onzentrationen angewendet werden, wenn die onzentration c eines Stoffes j jeweils it eine orreturfator f, de Atiitätsoeffizienten, ultipliziert wird: a f c (3.) j j j Anstatt der onzentration c wird jeweils die Atiität a in das Massenwirungsgesetz eingesetzt. Der Atiitätsoeffizient f hat Zahlenwerte zwischen und. Er ist uso leiner, je größer die Gesatonzentration der Ionen, einschließlich der an der Reation unbeteiligten Ionen, ist. Eine größere Ionenladung der Teilchen führt ebenfalls zu leineren Werten des Atiitätsoeffizienten f. Je erdünnter eine Lösung ist, uso näher liegen die Atiitätsoeffizienten bei, d. h. das Massenwirungsgesetz ist in eine solchen Fall bei Verwendung on onzentrationswerten erfüllt. Bei schwachen Eletrolyten ann das Massenwirungsgesetz ohne Berücsichtigung on Atiitätsoeffizienten bis zu onzentrationen on, M erwendet werden. Die Enzyenge wird noralerweise über ihre atalytische Atiität ausgedrüct. Die Einheit der atalytischen Atiität ist nach Epfehlung der IUB (International Union of Biocheistry) das atal. atal (Abürzung at) ist diejenige Enzyenge, die unter den für dieses Enzy gewählten Bedingungen bei 3 C die Usetzung on ol Substrat pro Seunde atalysiert. Eine andere häufig erwendete Einheit ist die unit of actiity (d. h. Atiitätseinheit oder auch nur unit, Abürzung U), die aus de Englischen übernoen worden ist. U entspricht der Enzyenge, die unter definierten Reationsbedingungen μol Substrat pro Minute uzusetzen erag (d. h. at 6 7 U). Diese Reationsbedingungen sind in der Regel für erschiedene Enzye unterschiedlich definiert. Bei der Angabe der Enzyatiität in Units uss daher genau geprüft werden, welche Reationsbedingungen eingesetzt wurden. Die Atiität eines Enzys entspricht der Anfangsgeschwindigeit der atalysierten Reation, d. h. de initialen Substratusatz pro Zeiteinheit. Man isst entweder die Abnahe der onzentration eines Substrates ( d[/) oder die Zunahe der onzentration eines Produtes (d[p]/) unter genau definierten Reationsbedingungen wie ph, Teperatur, Ionenonzentration usw. Die Geschwindigeit einer enzyatalysierten Reation ist on der onzentration des Substrates abhängig. Erhöhung der Substratonzentration steigert die Reationsgeschwindigeit bis zu eine Maxialwert ( ). Die Atiität eines Enzys wird in der Regel bei ialer Geschwindigeit, d. h. i Bereich der Substratsättigung, bei optialen Cosubstrat- und Effetoronzentrationen, bei optiale ph und bei einer willürlich festgesetzten Teperatur bestit. Die Wechselzahl (engl. turnoer frequency) gibt die Frequenz also die Anzahl der Usetzungen pro Zeiteinheit an, it der das Enzy einen Reationsschritt atalysiert. ugesetzte turnoer Ausgangssubstanz [ol] frequency Zeit [s]. [s ] (3.) Stoffenge Enzy [ol] I Vergleich zur Wechselzahl gibt die diensionslose iale Zyluszahl (engl. total turnoer nuber) das Verhältnis zwischen der Menge Produt bezogen auf die Menge des eingesetzten Enzys wieder. Die Wechselzahl ist ein Maß für die Effizienz des Enzys. inasen, Dehydrogenasen und Ainotransferasen haben Wechselzahlen in der Größenordnung on 3. Enzye

3 3. Reationsechanisen enzyatischer Ein-Substrat-Reationen 69 3 wie z. B. die Superoxiddisutase haben Wechselzahlen on bis zu 6. Weiterhin ann die iale Zyluszahl auch auf die eingesetzte Menge an Cofator bezogen werden: Stoffenge total Produt [ol] turnoer r [ ] (3.3) nuber Stoffenge Enzy oder Cofator [ol] Die iale Zyluszahl ist soit ein Maß für die Stabilität on Enzyen und erlaubt dait Vergleiche erschiedener Enzye bezüglich ihrer Stabilität und Anwendbareit. Zu beachten ist, dass die unit of actiity die Einheit [μol/ in] besitzt, wohingegen die Einheit der Wechselzahl [s ] beträgt: U turnoer frequency ol s ol (3.4) Für industrielle Biotransforationen uss die Wechselzahl hoch sein, besonders dann, wenn teure atalysatoren eingesetzt werden, u die finalen Produtionsosten zu senen. Anstelle der Wechselzahl ann alternati auch die Desatiierungsrate und der Enzyerbrauch angegeben werden. 3. Reationsechanisen enzyatischer Ein-Substrat- Reationen Enzye önnen sowohl Ein-Substrat- wie auch Mehr-Substrat-Reationen atalysieren. In den folgenden Abschnitten werden a Beispiel einer Ein-Substrat-Reation die grundlegenden Prinzipien der Reationsechanisen und die Herleitung der Geschwindigeitsgleichungen erläutert. Abschnitt 3.9 behandelt den oplexeren Fall der Mehr-Substrat-Reationen. Allgeein ann jede cheische Reation und dait auch jede enzyatalysierte Reation durch folgende Gleichung dargestellt werden: ν A A ν B B ν C C ν D D (3.5) Wobei die i die stöchioetrischen Fatoren sind. Für einen differenziellen Usatz gilt dann ν A dna ν B dnb ν C dnc ν D dnd dξξ (3.6) Da die stöchioetrischen Fatoren der Edute negati, die der Produte positi sind, ergeben sich autoatisch die richtigen Vorzeichen. Durch die Beschreibung des Fortgangs der Reation ithilfe der Stoffengen on A, B, C oder D, also it dn A, dn B, dn C oder dn D werden, entsprechend den stöchioetrischen Fatoren, zahlenäßig unterschiedliche Ergebnisse erhalten. Die Definition der Reationslaufzahl ξ erlaubt eine eindeutige Beschreibung des Reationsfortgangs. Unter der Reationsgeschwindigeit wird die Geschwindigeit dξ/ der Zunahe der Reationslaufzahl erstanden, die über dξ dn j ν j (3.7) it der Geschwindigeit der Änderung der Stoffenge n j der oponente j ernüpft ist. Die Definition der Reationsgeschwindigeit dξ/ ist unabhängig on der Wahl der Substanz und der Reationsbedingungen. 3.. Matheatische Herleitung der Michaelis-Menten-Gleichung Die Geschwindigeit einer einfachen enzyatischen Usetzung eines Substrates S in ein Produt P ann durch die Michaelis-Menten- ineti beschrieben werden. Zur Herleitung der Reationsgeschwindigeit einer enzyatalysierten Reation wird on der folgenden, einfachen Reationssequenz ausgegangen, bei der das Substrat S in das Produt P ugewandelt wird: E S ES E P (3.8) wobei E das Enzy, S das Substrat, P das Produt und ES den Enzy-Substrat-oplex darstellt. Zunächst bindet das Substrat an das Enzy und bildet den Enzy-Substrat-oplex, und dieser oplex zerfällt dann in das Produt und freies

4 3 7 3 Enzyineti Enzy. Die zentrale Bedeutung, die der Enzy-Substrat-oplex für die Seletiität und die atalytische Wirung der Enzye besitzt, wurde bereits ausführlich in apitel erläutert (Abb..4 und.5). Gleichung (3.8) beschreibt eine irreersible Reation, d. h. aus de freien Enzy E und de Produt P soll ein Substrat entstehen önnen. Die zu Gleichung (3.8) gehörigen Massenbilanzen lauten: d d[ P] E] E E [ E] E] ES d d[ E ( ) ] ( ) ] E] ES (3.9a) (3.9b) (3.9c) (3.9d) Die Geschwindigeitsonstanten i der Einzelreationen in Gleichung (3.9) besitzen positie Indizes i Falle on Hinreationen und negatie Indizes bei Rücreationen. Da das Enzy entweder in freier For oder als oplex orliegt, gilt nach de Gesetz der Massenerhaltung: [E] [E] [E [ [P] [E [ (3.9e) (3.9f) wobei [E] die Enzyonzentration zur Zeit t und [ die anfängliche Substratonzentration ist. Dieses Gleichungssyste ann nicht analytisch gelöst werden. U zu einer geschlossenen Lösung zu gelangen, wird sich der sogenannten Steady-State-Annahe bedient, die häufig in der cheischen Reationstechni erwendet wird und erstals 94 on Max Bodenstein foruliert wurde. Diese Annahe besagt, dass sich nach einer i Vergleich zur gesaten Reationsdauer urzen Anlaufzeit die onzentration der Reations-Zwischenprodute nicht ehr wesentlich ändert. Angewendet auf die Reationsgleichung (3.8) ergibt sich für die onzentration des Enzy-Substrat-oplexes: d[ [ ] (3.a) Mit Gleichung (3.9e) folgt für die onzentration des freien Enzys: d[ [ ] (3.b) Es uss herorgehoben werden, dass durch die Steady-State-Annahe ein sogenanntes Fließgleichgewicht beschrieben wird, das nicht it de Gleichgewicht der Reation A B s C gleichzusetzen ist. Der Unterschied zwischen diesen beiden Gleichgewichten ist in Abbildung 3. dargestellt. Das therodynaische Gleichgewicht einer Reation in Abbildung 3. ist die Reation A B sc dargestellt stellt sich in eine geschlossenen Syste ein, wenn die Zeit t geht und die Reation unter den gewählten Bedingungen ablaufen ann. Ein geschlossenes Syste ist dadurch charaterisiert, dass es it seiner Ugebung eine Materie austauscht, während ein offenes Syste Materie it seiner Ugebung austauschen ann. In eine offenen Syste stellen sich zeitlich onstante Substrat- und Produtonzentrationen ein. Dieses Fließgleichgewicht wird on der Reationsineti, der Durchströung des Systes und de cheischen Gleichgewicht bestit. [E und [E] aus Gleichung (3.9c) bzw. (3.9d) lassen sich it Gleichung (3.9e) und Gleichung (3.a) bzw. (3.b) als Funtion on [ und [E] ausdrücen. [ E] [ ES ] [ E] ( ) [ E] (3.a) (3.b) Abb. 3. Darstellung (a) eines geschlossenen und (b) eines offenen Systes

5 3. Reationsechanisen enzyatischer Ein-Substrat-Reationen 7 3 Die zeitliche Änderung der onzentration on ES ist gegeben durch: d[ [ ] ( [ ] [ ]) [ ] [ ] [ ] (3.) I quasi-stationären Zustand ist d[e/, es gilt also: ( [ ] [ ] )[ ] [ ] st [ ] st (3.3a) [ ] [ ] [ ] ) [ ] st (3.3b) Die zusaenfassende onstante heißt Michaelis-onstante. Mit ihr lässt sich die onzentration an Zwischenerbindungen i quasistationären Zustand als Funtion der Substratonzentration ausdrücen: [ ] st [ ] [ ] [ ] (3.4) Mit Gleichung (3.a) und (3.b) önnen [E] und [E aus Gleichung (3.9b) eliiniert werden. Es entsteht eine Gleichung, die außer den Geschwindigeitsonstanten nur die eingesetzte Enzyonzentration [E] sowie die Substratonzentration [ enthält. Für die Reationsgeschwindigeit gilt dann: d[ P] d[ [ [ E] (3.5) Dies ist die on Briggs und Haldane i Jahre 95 hergeleitete Beziehung. Durch Zusaenfassen der onstanten wird die übliche For der Briggs-Haldane-Gleichungg erhalten, die auch als Michaelis-Menten-Gleichung bezeichnet wird: d[ P] d (3.6a) it ; [E] (3.6b) ist die Maxialgeschwindigeit der Hinreation, und wird allgeein als Michaelis- onstante bezeichnet. Dies ist nicht ganz orret, denn in der ursprünglichen Herleitung on Michaelis und Menten i Jahre 93 wurde die Geschwindigeitsonstante in der Definition on nicht berücsichtigt. Michaelis und Menten hatten nicht die Steady-State-Annahe erwendet, sondern die sogenannte Rapid- Equilibriu-Annahe. Auf diese Annahe wird ausführlicher i Abschnitt über allosterische Enzye eingegangen. Sie besagt, dass die Geschwindigeitsonstanten und, die für die Ausbildung des Enzy-Substrat-oplexes erantwortlich sind, wesentlich größer sind als die Geschwindigeitsonstante, die für die Produtbildung erantwortlich ist. Dadurch ereinfacht sich die Beziehung für zu: (3.7a) >>> ; >>> (3.7b) In dieser For stellt die wahre Dissoziationsonstante des Enzy-Substrat-oplexes dar. Gleichung (3.6a) wird dennoch (aus historischen Gründen) als Michaelis-Menten- und nicht als Briggs-Haldane-Gleichung bezeichnet. Unabhängig daon, ob die Steady-State-Annahe oder die Rapid-Equilibriu-Annahe getroffen wird, ergibt sich Gleichung (3.6a). In Gleichung (3.8) ist eine weitere häufig erwendete Größe eingeführt: cat entspricht in der hier erwendeten Noenlatur. [E] o cat [E] o (3.8) cat ist die Geschwindigeitsonstante für die Uwandlung des Enzy-Substrat-oplexes in das Produt. Je höher der Wert on cat, uso größer ist der Usatz der Reation. Die Michaelis-Menten-onstante erlaubt hingegen nur eine Aussage über die Bindungsaffinität des Substrats zu Enzy. Beide Werte für sich haben einen nicht allzu großen Inforationsgehalt. Ein hoher Wert für cat bedeutet eine hohe Arbeitsgeschwindigeit des Enzys, aber über die notwendige feste Bindung zur Usetzung des Substrats wird eine Aussage geacht. Ein hoher Wert für steht für diese feste Bindung des Substrats an das Enzy, doch die Quantität der Usetzung bleibt außen or. Nur eine obination beider Werte gibt nützliche Inforationen über die Reation.

6 3 7 3 Enzyineti Abb. 3.3 Grafische Darstellung der Michaelis-Menten- Gleichung (3.6a) und der Paraeter und In Abbildung 3.3 ist die Michaelis-Menten- Gleichung (3.6a) grafisch wiedergegeben. Die Funtion ist hyperbolisch und strebt it zunehender Substratonzentration der ialen Reationsgeschwindigeit zu. hat die Einheit einer onzentration und gibt diejenige Substratonzentration an, bei der die Reationsgeschwindigeit der halben Maxialgeschwindigeit entspricht. Matheatisch lässt sich x dies leicht nachollziehen, inde in Gleichung (3.6a) [ gesetzt wird. Die zeitliche Änderung der onzentration einer oponente sei gegeben durch die Beziehung: dx b [ ] [ ]... (3.9) Wobei es sich bei u die Geschwindigeitsonstante handelt. Die Exponenten a, b, werden die Ordnung der Reation in Bezug auf die oponenten A, B, genannt. Die Sue: n a b... (3.) bezeichnet die Ordnung der gesaten Reation. Bei hohen Substratonzentrationen ([ >> ) ist die Reation ter Ordnung, d. h. eine Erhöhung der Substratonzentration bewirt eine weitere Zunahe der Reationsgeschwindigeit, da alle atien Zentren (engl. actie sites) der Enzye besetzt sind. Bei niedrigen Substratonzentrationen ([ << ) hingegen ist die Reationsgeschwindigeit diret proportional zur Substratonzentration, es liegt also eine Reation ter Ordnung or. In atheatischer For lauten diese beiden Feststellungen: li [ S ] li [ S ] (3.a) (3.b) Als weitere Folgerung aus Gleichung (3.6a) ergibt sich, dass eine Verdopplung der Enzyonzentration zu einer Verdopplung der Reationsgeschwindigeit führt, da ja die iale Reationsgeschwindigeit das Produt aus der Geschwindigeitsonstante und der Enzyonzentration [E] ist (Abb. 3.4). Gleichung (3.6a) wurde unter der Annahe hergeleitet, dass der Enzy-Substrat-oplex diret in Produt und freies Enzy zerfällt. In ielen Fällen stellt diese Annahe eine Vereinfachung der realen Situation dar, in der erschiedene Ulagerungen des Enzy-Substrat-oplexes auftreten, beor das Produt entlassen wird (Abb..5): E S ES EX EX... EX i... E P (3.)

7 3.3 Einfluss der Ugebungsbedingungen 73 3 Abb. 3.4 Rot: Bei hohen Substratonzentrationen ([ >> ) ist die Reation ter Ordnung: ([ t [ ). Schwarz: Bei niedrigen Substratonzentrationen ([ << ) hingegen ist die Reationsgeschwindigeit diret proportional zur Substratonzentration, es liegt also eine Reation ter Ordnung or: ([ [ exp( t)) Diese Zwischenoplexe achen sich jedoch in der Regel in der Geschwindigeitsgleichung nicht beerbar, da sie nicht geschwindigeitsbestiend sind. 3.3 Einfluss der Ugebungsbedingungen Enzye erhalten ihre Spezifität aufgrund ihrer räulichen Strutur, wobei diese Anordnung i Wesentlichen auf Wechselwirungen wie oalente, ionische, Van-der-Waals-, hydrophobe und hydrophile Bindungen innerhalb des Moleüls beruht. Diese erzeugen die Seundär- und Tertiärstrutur, wohingegen Interationen zwischen den Moleülen die Quartärstrutur ausbilden. Viele der einzelnen Wechselwirungen sind schwach, und erst durch die Vielzahl der schwachen Bindungen erhält das Moleül seine Stabilität. Eine Veränderung der Ugebungsbedingungen, beispielsweise die Veränderung der Teperatur, der Ionenstäre, des ph-wertes oder des Drucs, ann dieses Gleichgewicht stören und dait die räuliche Strutur und die Atiität des Enzys beeinflussen. Außerde ist eine Veränderung der onforation des Enzys durch Atiatoren und Inhibitoren zu beobachten, die die Enzyatiität ittels Veränderung der Strutur des Enzys beeinflussen. In der Regel haben Enzye ihre größte Stabilität unter den Bedingungen, die denen ihrer natürlichen Ugebung entsprechen. Heutzutage werden erstärt Enzyreationen unter extreen Bedingungen untersucht und genutzt. Dies önnen hohe Teperaturen und hohe Drüce sein, aber auch Reationen in wasseraren Ugebungen bzw. in organischen Lösungsitteln. Die PCR (polyerase chain reaction) ist ein solches Verfahren, bei de als therophiles Enzy eine DNA-Polyerase zu Einsatz ot. Reationen unter wasseraren Bedingungen sind hingegen on große Interesse, wenn wasserunlösliche Substrate ugesetzt werden sollen oder Substrate, die unter Reationsbedingungen instabil sind. Weiterhin önnen Reationen, die aus therodynaischen Gründen nur unollständig in Wasser ablaufen, wie beispielsweise ondensationsreationen it de Produt Wasser, in organischen Lösungsitteln durchgeführt werden. Diese andersartige Ugebung führt bei ielen Enzyen zu neuartigen atalytischen Eigenschaften: Neue Substrate werden azeptiert, und die Geschwindigeitsonstanten ändern sich. Für einen Überblic s. apitel, für eine detailliertere Beschreibung wird auf die Fachliteratur erwiesen (Carrea und Ria 8; Bisswanger 8). Bei der Verwendung on Enzyen in organischen Lösungsitteln ist es on großer Bedeutung, für einen optialen Wassergehalt in der organischen Phase zu sorgen. I Allgeeinen gilt, dass bei zu geringe Wassergehalt die Reationsrate der Enzye geringer ist oder die Atiität sogar ganz erlischt. Ist hingegen zuiel Wasser i organischen Mediu orhanden, so ann ein Absinen der Reationsrate aufgrund der Bildung on Hydrolyseproduten beobachtet werden. Die Wasseratiität a w ist in Relati- on zu reine Wasser definiert; bei onstanter Teperatur und onstante Druc ist sie also in Wasser gleich gesetzt. In der Gasphase ist die Wasseratiität annähernd gleichbedeutend it der relatien Feuchtigeit. Diese spiegelt das Verhältnis des Partialdrucs des Wasserdapfes über de organischen Mediu zu Partialdruc über reine Wasser bei onstante Druc und

8 Enzyineti onstanter Teperatur wider. Aufgrund der Tatsache, dass es sich u eine therodynaische Atiität handelt, ist sie in allen Phasen nach Einstellung des Gleichgewichts per definitione gleich, was eine einfache Bestiung der orhandenen Wasserenge eröglicht (Boarius und Riebel 4; Vulfson et al. ) Teperaturabhängigeit der Reationsgeschwindigeit In Abschnitt..5. wurde bereits qualitati die Veränderung der Enzyatiität als Funtion der Teperatur beschrieben (Abb..9). U die Teperaturabhängigeit der Reationsgeschwindigeit zu bestien, wird die Geschwindigeitsonstante einer Reation it der Teperatur über die Arrhenius-Gleichung in Beziehung gebracht: Ea b exp RT (3.3a) wobei E a die Atiierungsenergie, R die ideale Gasonstante, T die absolute Teperatur und b einen Häufigeitsfator darstellt. Durch Logarithieren ergibt sich: Ea ln lnb (3.3b) R T Zur Bestiung der Atiierungsenergie wird ln gegen /T T aufgetragen und aus der Steigung der resultierenden Geraden dieses sogenannten Arrhenius-Diagras die Atiierungsenergie erittelt. In der Praxis wird nicht, sondern erwendet. Die Arrhenius-Gleichung hat einen weiten Geltungsbereich. Sinnoll ist ihre Anwendung jedoch nur bei einfachen Reationsschritten, zual wenn weitergehende Schlüsse gezogen werden sollen. Es gibt zahlreiche Fälle, in denen eine öllig andere Teperaturabhängigeit beobachtet wird, als sie aus der Arrhenius-Gleichung folgt (Abb. 3.5a). Diese wird bei Enzyreationen (Abb. 3.5b) und bei heterogenen atalytischen Reationen sowie bei Anwesenheit orgelagerter Gleichgewichte (Abb. 3.5c) beobachtet ph-wert und Ionenstäre Enzye bestehen aus Ainosäuren, on denen einige neben den zur Ausbildung der Peptidbindung benötigten Aino- und Carboxylgruppen weitere geladene Gruppen besitzen (gl. Abb..7 und.8), d. h. Enzye sind Polyeletrolyte. Die geladenen Gruppen önnen i atien Zentru loalisiert und diret an der atalyse beteiligt sein, sie önnen aber auch an anderen Stellen des Enzys auftreten und durch ionische Wechselwirungen zur Ausbildung der Tertiärstrutur beitragen. Veränderungen des ph-wertes oder der Ionenstäre önnen deshalb graierende Auswirungen auf die Atiität und Stabilität eines Enzys haben. Diese Veränderungen önnen reersibel oder irreersibel sein. I Allgeeinen gilt, dass leine Abweichungen o Optiu des ph-wertes bzw. der Ionenstäre reersibel sind, während große Änderungen zu irreersiblen Denaturierungen führen önnen. a b c Abb. 3.5 Verschiedene Typen der Teperaturabhängigeit der Geschwindigeitsonstanten. (a) Arrhenius- Gleichung; (b) enzyatische Reation; (c) heterogen atalysierte Reation

9 3.3 Einfluss der Ugebungsbedingungen 75 3 Abb. 3.6 Die Enzyatiität als Funtion des ph-wertes für erschiedene Enzye (nach Fruton und Sionds 953) Wenn nur eine ionische Gruppe die Enzyatiität bestit, dann gleicht die Atiitätsure als Funtion des ph-wertes einer Titrationsure (gl. Abb..7). Für iele Enzye ergeben sich jedoch glocenförige Atiitätsuren (Abb. 3.6), was auf ehrere ionische Gruppen schließen lässt. I allgeeinen Fall zweier geladener Gruppen lässt sich das Verhalten durch das folgende einfache Schea beschreiben: E -H H E - -H H E - (3.4a) Hier wurde daon ausgegangen, dass nur die einfach geladene For E enzyatisch ati ist und dass die drei unterschiedlich geladenen Enzyforen iteinander i Gleichgewicht stehen. Für die Gleichgewichtsonstanten und gilt: [ H ][ E ] ; [ E] [ H ][ E [ E ] Zusaen it der Massenerhaltung ] (3.4b) [E] [E] [E - ] [E - ] (3.5) ergibt sich dait: [E ] [E] [ H ] (3.6) [ H ] wobei [E ]/[E] o der atie Anteil der gesaten Enzyenge ist. Ausgehend daon, dass nur die enzyatisch atie For [E ] Substrat binden ann, ergibt sich der Einfluss des ph-wertes auf dadurch, dass nicht it der gesaten Enzyonzentration [E] o, sondern it [E ] ultipliziert wird: E [ E] ] [ H ] [ H ] (3.7) Wenn der ph-wert nicht nur, sondern auch beeinflusst, dann uss Schea 3.4 erweitert werden. Eine Veränderung des -Wertes tritt i Allgeeinen jedoch nur dann auf, wenn das Substrat und/oder das Produt geladen sind. Die Ionenstäre I gibt die effetie onzentration der eletrischen Ladungen in der Lösung an und hängt also on der Eletrolytonzentration ab. Die Ionenstäre ergibt sich zu: I M i z i (3.8) i wobei M i die Molarität der Ionen und z i deren absolute Wertigeit ist.

10 Enzyineti Abb. 3.7 Abhängigeit der Enzyatiität on der Ionenstäre. Die Atiität beider Enzye wurde in Phosphatpuffer geessen. MDH Mannitol-Dehydrogenase, GDH Glucose-Dehydrogenase (nach Howal 988) Abb. 3.8 Abnahe der Enzyatiität als Folge unterschiedlicher Scherbeanspruchung (nach Char und Wong 97 sowie Tirrell und Middlean 975). In Abbildung 3.7 ist der Einfluss der Ionenstäre a Beispiel zweier Dehydrogenasen dargestellt. Für beide Enzye steigt die Atiität it zunehender Ionenstäre zunächst an, u nach de Durchlaufen eines Maxius bei weiterer Erhöhung der Ionenstäre wieder abzunehen. Die optiale Ionenstäre ann für unterschiedliche Enzye star ariieren und uss in der Regel experientell bestit werden Stabilität der Enzye Für die technische Anwendung on Enzyen ist deren Stabilität on Bedeutung. Dies ist besonders wichtig bei Langzeiteinsatz wie z. B. in ontinuierlichen Reatoren it Enzyrüchaltung. In eine solchen Fall ann die Wirtschaftlicheit eines Prozesses on der Lebensdauer des Enzys abhängen. In den orhergehenden Abschnitten sind bereits erschiedene Paraeter disutiert worden, die die Enzyatiität beeinflussen. Neben den bereits erwähnten Einflussgrößen önnen auch echanische räfte (Schub-, Noralund Grenzflächenspannungen), cheische Substanzen und Bestrahlung (Licht, Schall, ionisierte Strahlen) die Enzystabilität beeinflussen. In Tabelle 3. sind eine Reihe physialischer und cheischer Paraeter aufgelistet, die zu einer Proteindenaturierung führen önnen. Dabei ist zu berücsichtigen, dass nicht die genannten Einzelfatoren, sondern deren obination die Geschwindigeit der Enzyinatiierung bestien. Mechanische räfte önnen die cheische Strutur des Enzyoleüls in eine solchen Ausaß ändern, dass das Enzy inatiiert wird. Derartige räfte önnen beispielsweise durch ströende Flüssigeiten erzeugt werden. Der Einfluss on Schereffeten auf die Enzyatiität wurde in apillar- und Couette-Visosietern untersucht. Abbildung 3.8 zeigt, dass die obination on Scherintensität und Einwirungsdauer das Maß der Inatiierung bestien. Weitere Experiente deuten darauf hin, dass nicht die Schergeschwindigeit, sondern die Schubspannung die Inatiierung bestit. Diese Epfindlicheit der Enzye gegenüber echanischer Beanspruchung ist bei der Auslegung on Bioreatoren (s. ap. 7) und den nachfolgenden Produtaufarbeitungsschritten zu berücsichtigen. Rühr-, Wirbelbett- und Mebranreatoren besitzen z. B. Orte besonders hoher Schubspannung (Propellerspitzen, Wirbelörper, Mebranporen), wie z. B. in Abb. 7.7 gezeigt, bei denen die zulässigen Werte nicht überschritten werden dürfen. Eine andere echanische raft, die häufig Proteindenaturierung und dait Enzyinatiierung

11 3.3 Einfluss der Ugebungsbedingungen 77 3 Tabelle 3. Auflistung on Paraetern, die zur Proteindenaturierung führen önnen (nach Schid 979) Physialische Einwirung Hitze Wasserstoffbrücen Zunahe denaturierter onforationen aufgrund erhöhter therischer Bewegung und erringerter Lösungsittelstrutur. Irreersible oalente Modifiation (z. B. on Disulfidgruppen) älte echan. räfte Strahlung Cheische Einwirung Säuren Alali organ. wasserstoffbrücenbildende Substanzen Salze hydrophobe Bindungen solatisierte Gruppen solatisierte Gruppen eingeschlossene Voluina funtionelle Gruppen (z. B. cysh, Peptidbindungen) erborgene ungeladene Gruppen (z. B. his, Peptidbindungen) erborgene ungeladene Gruppen (z. B. tyr, cysh, cysh ) Wasserstoffbrücen polare und nicht-polare Gruppen geänderte Lösungsittelstrutur Dehydratisierung Änderung der Solatisierung und des Einschlussoluens; Scherräfte Abnahe der struturbildenden Wechselwirungen nach Fotooxidation oder Angriff durch Radiale Abnahe der struturbildenden ionischen Wechselwirungen Abnahe der struturbildenden ionischen Wechselwirungen Abnahe der struturbildenden Wasserstoffbrücen zwischen Wasser und natier onforation Veränderung des Einsalz- und Aussalzerhaltens on polaren und nicht-polaren Gruppen in Lösungsitteln it erhöhter Dieletrizitätsonstante Lösungsittel unpolare Gruppen Solatisierung nicht-polarer Gruppen Detergenzien Oxidantien Schweretalle Chelatbildner Biologische Einwirung hydrophobe Bereiche (alle Detergenzien) und geladene Gruppen (ionische Detergenzien) funtionelle Gruppen (z. B. cysh, et, try u. a.) funtionelle Gruppen (z. B. cysh, his u. a.) ationen, die für Strutur und Funtion wichtig sind Bildung partiell aufgefalteter Unterstruturen einschließlich icellärer Bereiche Verringerung der struturbildenden und/oder der funtionalen Wechselwirungen Masierung on Gruppen, die für Strutur und Funtion erforderlich sind Ligandensubstitution oder ationenabspaltung Proteasen Peptidbindung Hydrolyse endständiger oder anderer Peptidbindungen HU Aggregate Aggregate, inatie Monoere HU, inatie Monoere Aggregate RC RC RC HU hochgeordnete Peptidetten it großen helialen Bereichen UU; große heliale Bereiche inatiiertes Enzy: anchal ungeordnete Strutur inatiiertes Enzy inatiiertes Enzy Oligopeptide, Ainosäuren HU onforation hochgradig ungeordnet; UU unollständig ungeordnete onforation; RC rando coil (ollständig denaturiert)

12 Enzyineti erursacht, ist die Oberflächenspannung. An der Grenzfläche zwischen Luft und Wasser treten Grenzflächenspannungen bis 8 N/ auf. Bei der Schaufrationierung (Abschn..3.) einer der öglichen Produtaufarbeitungstechnien sind die Grenzflächenspannungen allerdings wegen der hohen Proteinonzentration erheblich niedriger. Weitere Fatoren, die zur Denaturierung führen önnen, sind Adsorption an festen Oberflächen, Dehnströungen und aitation. Als allgeeine Regel ann gelten, dass ein Enzy dann in itro a wenigsten an Atiität erliert, wenn die ugebenden Bedingungen denen in io a nächsten oen. In den orhergehenden Abschnitten ist bereits der Einfluss der Teperatur, der Ionenstäre und des ph-wertes auf die Enzyatiität disutiert worden. Eine stare Abweichung on den idealen Bedingungen ann zu reersiblen oder irreersiblen Inatiierungen führen, da die Strutur der Enzye erändert wird. Dies ann sowohl die Quartär- als auch die Tertiärstrutur, seltener die Priär- oder Seundärstrutur betreffen. Beispielsweise hängt die Sensitiität eines Proteins für Denaturierung durch erhöhte Teperaturen star o ph-wert ab und ugeehrt (Abb. 3.9). Abb. 3.9 Teperatur- und ph-abhängigeit der Inatiierung on Ricin (nach Ley und Benaglia 95) 3.4 Bestiung der inetischen onstanten Nach de heutigen Stand der enntnis ist es nicht öglich, die inetischen onstanten eines Enzys aus seine oleularen Aufbau orherzusagen. Die onstanten üssen daher experientell über inetische Messungen bestit werden. U die - und -Werte zu eritteln, bieten sich zwei unterschiedliche Verfahren an: die direte Bestiung der Geschwindigeitsonstanten, aus denen die -Werte analog zu Gleichung (3.6b) berechnet werden, oder die Bestiung der - und -Werte unter Verwendung der Steady-State-Annahe. I Folgenden werden die Verfahren zur Erittlung der Geschwindigeitsonstanten scheatisch erläutert und der Schwerpunt der Herleitung auf die direte Bestiung der - und -Werte aus den Messwerten gelegt Die Geschwindigeitsonstanten der Eleentarreationen U die Differenzialgleichungen (3.9) nuerisch lösen zu önnen, üssen die Geschwindigeitsonstanten der Eleentarreationen beannt sein. Zur Erittlung dieser onstanten werden a häufigsten Relaxationserfahren eingesetzt, die aßgeblich on de Nobelpreisträger Manfred Eigen und seinen Mitarbeitern entwicelt wurden. Dieses Verfahren beruht darauf, dass ein i Gleichgewicht befindliches Syste durch eine plötzliche Änderung der Reationsbedingungen aus de Gleichgewicht gebracht wird. Die daraus resultierende Antwort des Systes wird aufgezeichnet, u daraus Rücschlüsse auf die Geschwindigeitsonstanten zu ziehen. A gebräuchlichsten sind Änderungen der Teperatur, des Drucs oder der Feldstäre. Die beste Zeitauflösung on ns wird bei Änderungen der Feldstäre erzielt, darauf folgen die Teperaturethode it μs und die Drucsprungethode it μs. Bei biologischen Systeen werden die stärsten Effete it der Teperatursprungethode erzielt. Die erfor-

13 3.4 Bestiung der inetischen onstanten 79 3 derlichen urzen Aufheizzeiten werden durch die Entladung eines Hocholtondensators über eine Funenstrece erreicht. Für eine ausführliche Darstellung des Verfahrens wird auf die Fachliteratur erwiesen (Bisswanger 8) Experientelle Bestiung der Reationsgeschwindigeit Häufig wird die Reationsgeschwindigeit über die Messung der Anfangsreationsgeschwindigeit bestit. Dazu werden Enzy und Substrat(e) intensi und schnell iteinander geischt und dann die Veränderung der Substratoder Produtonzentration erfolgt. Die Reationsgeschwindigeit wird als Differenzenquotient Δ [/Δ t erittelt und sollte idealerweise über die Dauer der Messung onstant sein. I Bereich hoher Substratonzentrationen ([ >> ) ist diese Forderung leicht zu erfüllen, da die Reationsgeschwindigeit nur unwesentlich on der Substratonzentration beeinflusst wird. Wenn die Substratonzentrationen i Bereich des - Wertes und darunter liegen, ann eine onstante Reationsgeschwindigeit nur dadurch erreicht werden, dass sich die Substratonzentration während der Messung nur geringfügig ändert, d. h. Δ [/ [ (Abb. 3.3). Falls diese Bedingung nicht erfüllt ist d. h. die Reationsgeschwindigeit ändert sich über die Dauer der inetischen Messung dann wird die Geschwindigeit auf die Zeit t extrapoliert, inde die Tangente an die ure gelegt wird. Zur Bestiung der Anfangsreationsgeschwindigeit wird idealerweise die Zunahe der entstehenden Produtonzentration oder die Abnahe der Substratonzentration diret geessen. Falls die Substratonzentration geessen wird, ist insbesondere bei höheren onzentrationen die Auflösung schlecht, da leine Änderungen or eine hohen Hintergrundwert geessen werden üssen. Deshalb ist die Messung der Produtonzentration orzuziehen, da hier die Änderung on der onzentration null auf einen endlichen Wert beobachtet wird. In der Praxis werden beorzugt optische Methoden, wie die Messung der Extintion i Spetralphotoeter, der Fluoreszenz i Fluoreszenzphotoeter oder der Veränderung des Drehwinels i Polarieter eingesetzt, da diese Verfahren urze Ansprechzeiten aufweisen und der Messwert der onzentration diret proportional ist. Eine häufig erwendete diret essbare Substanz ist das Coenzy NADH, das spezifisch bei 334 n Licht absorbiert, während die oxidierte For NAD bei dieser Wellenlänge eine Absorption aufweist. Dait önnen alle durch Dehydrogenasen atalysierten Reationen diret i Photoeter erfolgt werden, da Dehydrogenasen NAD(H) als Cosubstrat benötigen und es in stöchioetrischen Mengen it de Substrat usetzen. Wenn das Produt nicht on-line essbar ist, ann die Reation it einer zweiten Reation geoppelt werden, bei der die onzentration des zweiten Produts diret erfolgt werden ann: S E > P E > P (3.9) Die zweite Reation uss so schnell ablaufen, dass nahezu alles Produt P ohne Zeiterzögerung in Produt P ugesetzt wird. In der Praxis wird dies dadurch erreicht, dass das Enzy E i Überschuss zugegeben wird und dass die zweite Reation so gewählt wird, dass das Gleichgewicht weit auf der Produtseite P liegt. Falls weder die on-line-messung der Reatanden noch die opplung it einer zweiten Reation öglich ist, dann ann die Reationsgeschwindigeit auch aus einer Usatzure als Funtion der Zeit erittelt werden (Abb. 3.). Dazu werden nach de Start der Reation zu definierten Zeitinterallen Proben genoen, die anschließend in eine separaten Test analysiert werden. Aus der Usatzure wird die Reationsgeschwindigeit dadurch bestit, dass die Steigung der ure zu erschiedenen Zeiten erittelt wird. Wenn genügend Messpunte orhanden sind, geschieht dies a besten durch nuerische Differenziation. Bei der Verwendung der Usatzure zur Bestiung der Reationsgeschwindigeit ist eine isolierte Betrachtung des Einflusses der Substrate und Produte nur it Einschränungen öglich, da it fortschreitender Reation ier ehr Produt entsteht und entsprechend ier weniger Substrat orliegt. Die Usatzure ann auch diret zur Erittlung der inetischen onstanten herangezogen werden, inde die integrierte For der

14 3 8 3 Enzyineti Die Ausbeute des Produts [P] bezogen auf das Substrat [ ist deentsprechend definiert durch den Ausdruc: [ P] [ P] η P ν S ν P (3.34) In Gleichung (3.3) wird die Substratonzentration als Funtion der Zeit angegeben. Es werden also genau die Messgrößen erwendet, die bei der Erittlung der Usatzure orliegen. Abb. 3. Abnahe der Substratonzentration in einer enzyatisch atalysierten Reation als Funtion der Zeit Geschwindigeitsgleichung eingesetzt und die onstanten über eine nicht-lineare Regression erittelt werden. Für die einfache Michaelis-Menten-Gleichung (3.6a) ergibt die Integration: t ln ( ( ) [ S χ ln ] wobei der Usatz als [) (3.3) χ S (3.3) definiert ist. Der Usatz allein ist aber nicht entscheidend für die Beurteilung einer Reation. Viel wichtiger ist die Ausbeute eines Produtes [P], welche das Produt aus Seletiität und Usatz ist: η P χ A σ SP (3.3) Die Seletiität σ SP einer Reation it de Produt [P] bezogen auf das Substrat [ wird durch folgende Gleichung beschrieben: σ SP [ P] [ P] ν S [ ν P (3.33) Wobei ν S,P die stöchioetrischen Fatoren der Edute bzw. Produte darstellen Grafische Erittlung der - und -Werte Bei der in diese Abschnitt beschriebenen Auswertung wird daon ausgegangen, dass die experientellen Daten als Wertepaare Reationsgeschwindigeit-Substratonzentration orliegen. Die Michaelis-Menten-Gleichung in ihrer ursprünglichen For (Gleichung (3.6a)) eignet sich nur schlecht, u aus experientellen Werten die inetiparaeter und über eine grafische Auswertung zu bestien. Wie Abbildung 3.3 zeigt, önnen und nicht aurat aus de Diagra gegen [ bestit werden. Durch eine einfache Uforung der Gleichung (3.6a) entstehen Ausdrüce, die sich besser für die grafische Auswertung eignen. Durch Auftragung des ehrwertes on Gleichung (3.6a) ergibt sich die Darstellung nach Lineweaer-Bur: (3.35) [ S ] Aus der Auftragung on / gegen /[ (Abb. 3.) resultiert eine Gerade it der Steigung / und de Ordinatenabschnitt /. Die Multipliation der Gleichung (3.35) it [ ergibt eine weitere lineare Beziehung: (3.36) Der Auftrag on [/ gegen [ wird als Hanes- Woolf-Darstellung bezeichnet (Abb. 3.). Hier ist die Steigung durch / und der Ordinaten- abschnitt durch / gegeben.

15 3.5 Lineare und nicht-lineare Regression 8 3 Durch Multipliation on Gleichung (3.35) it und Auflösen nach ergibt sich: (3.37) Der Auftrag on gegen /[ wird als Eadie- Hofstee-Darstellung bezeichnet (Abb. 3.3) und ergibt ebenfalls eine Gerade, deren Ordinatenabschnitt und deren Steigung entspricht. Abb. 3. Lineweaer-Bur-Darstellung der Michaelis-Menten-Gleichung Abb. 3. Hanes-Woolf-Darstellung der Michaelis- Menten-Gleichung Jede der Gleichungen (3.35) bis (3.37) beschreibt einen linearen Zusaenhang, sodass die Paraeter über eine lineare Regression bestit werden önnen. Bei der Benutzung derartiger grafischer Darstellungen zur Bestiung der inetischen Paraeter des Modells üssen jedoch eine Reihe on Punten beachtet werden. Bei der Lineweaer-Bur-Darstellung sind abhängige und unabhängige Variablen getrennt. Allerdings fallen die genauesten Messpunte große - und [-Werte alle in die Nähe des Ursprungs, während die ungenauesten Messpaare leine - und [-Werte den größten Einfluss auf die Steigung der Geraden haben. Bei der Hanes-Woolf-Gleichung ann zwar die Steigung / genau bestit werden, jedoch fällt der Schnittpunt it der y-achse eist in die Nähe des Ursprungs, sodass die Erittlung on it großen Ungenauigeiten behaftet ist. Bei Eadie-Hofstee-Plot werden ebenso wie bei Hanes-Woolf-Plot abhängige und unabhängige Variablen erischt. Wenn grafische Methoden zur Erittlung der inetischen onstanten und ange- wendet werden, so sollten die onstanten zuindest nicht nur aus eine Plot bestit werden. Eine ögliche Alternatie ist die Bestiung on über einen Hanes-Woolf-Plot und die Bestiung des -Wertes über den noralen Michaelis-Menten-Auftrag über [. Besser als die Erittlung der inetischen onstanten über diese linearisierten Auftragungen ist die Bestiung über nicht-lineare Regressionserfahren, auf die i folgenden Abschnitt eingegangen wird. 3.5 Lineare und nicht-lineare Regression Abb. 3.3 Eadie-Hofstee-Darstellung der Michaelis- Menten-Gleichung Seit den Anfängen der Enzyineti werden die i origen Abschnitt dargestellten Verfahren angewendet, u aus Messwerten die inetischen onstanten entweder durch grafische Auswertung oder durch lineare Regression zu bestien. Diese Verfahren haben den Vorteil, dass sie Rücschlüsse auf den Reationsechanisus und die Art der Inhibierung erlauben. Aller-

16 3 8 3 Enzyineti dings entstehen Ungenauigeiten beispielsweise durch eine ungleichäßige Wichtung der Messwerte oder durch eine Aufhebung der Trennung on unabhängigen und abhängigen Variablen. Bei den linearen Verfahren werden die onstanten suzessie bestit, sodass sich die Fehler fortpflanzen und eine optialen Paraeter erittelt werden, was ein weiterer graierender Nachteil der Linearisierung ist. Bei Zuhilfenahe on Coputern bietet sich die Bestiung der inetischen Paraeter it der Methode der nicht-linearen Regression an. Hier ann die ursprüngliche Reationsgleichung erwendet werden, d. h. es ist eine Transforation der Messwerte erforderlich. Die Bestiung unbeannter onstanten oder Paraeter A, B, C, in einer als beannt orausgesetzten Funtion, die zwei oder ehrere geessene und dait fehlerbehaftete Größen iteinander ernüpft, soll hier aufgezeigt werden. Aus einer Theorie oder einer zu prüfenden Hypothese ist ein funtionaler Zusaenhang f beannt. Es wird nun angenoen, dass n Sätze der Messgrößen: L, x, y, z, bestit worden sind (3.38). Die Zahl der Unbeannten sei u. L f (A, B, C,..., x, y, z,...) (3.38) Für den Fall, dass gerade n u Sätze on Messungen ausgeführt worden sind, ist es öglich, die Funtion f n-al zu forulieren. Da die Un- beannten nun eindeutig bestibar sind, lässt sich das Gleichungssyste lösen, wobei sich die Messfehler der geessenen Größen geäß de Fortpflanzungsgesetz auf die Unbeannten übertragen. Diese Messfehler önnen aber angels Daten nicht ausgeglichen werden. Bei der Analyse einer inetischen Messung tritt jedoch der nicht triiale Fall ein, dass ehr Sätze on Messgrößen als Unbeannte (n > u) bestit worden sind. Folglich wird ein überbestites Gleichungssyste erhalten, das aufgrund der Messfehler widersprüchlich ist. Das Prinzip der leinsten Fehlerquadrate (partial least square) eröglicht es, statistische Bestwerte der Unbeannten zu berechnen und aus der Widersprüchlicheit der Gleichungen die ittleren Fehler (Standardabweichung) der durch Ausgleichung erhaltenen Unbeannten zu bestien. Die zugrunde liegende Beziehung ann oft derart ugefort werden, dass eine lineare Auftragung resultiert. Die dafür notwendige Transforation einer oder beider Messgrößen führt in den eisten Fällen zu einer einfach- oder doppeltlogarithischen Auftragung: y A B. x oder A B. x y (3.39) Der i-te Satz der Messgrößen x und y wird it x i und y i bezeichnet, wobei der Index i über alle n Sätze on Messungen läuft. Ziel der Regressionsrechnung ist die Bestiung der ausgeglichenen Werte der beiden Unbeannten A und B. Diese Ausgleichung ann nur dann stattfinden, wenn das Gleichungssyste überbestit ist (n > u; hier: n > ). Weiterhin wird on einer Noralerteilung der Zufallsfehler on x und y ausgegangen. Gleichung (3.39) wird aufgrund der Messfehler der Messgrößen i Allgeeinen nicht exat erfüllt, wobei die Abweichungen o Wert Null it ε bezeichnet werden und in der Ausgleichsrechnung Fehler genannt werden. Die n geessenen Wertepaare x i, y i führen soit auf n Fehlergleichungen: A B. x i y i ε i it i,,... n (3.4) U it leineren Zahlen rechnen zu önnen, ann es sich lohnen Näherungswerte A und B für die Unbeannte einzuführen, die beispielsweise ithilfe grafischer Verfahren erhalten wurden (Abschnitt 3.3.3). Aus den Definitionen: A A ξ; B B η ; y i (A B. x i ) (3.4) l i folgen n reduzierte Fehlergleichungen: ξ η. x i l i ε i (3.4) Das Prinzip der leinsten Quadrate erlangt nun, dass n i ε [ ] (3.43) i ein Miniu ist. Diese Bedingung wird dadurch erfüllt, dass Gleichung (3.43) nach jeder Unbeannten partiell differenziert wird und i einfachsten Fall die beiden (u ) Gleichungen gleich null gesetzt werden. Mit der Gauß schen Schreibweise für Suen über i bis n erhält an die folgenden Gleichungen, welche Noralerteilungen genannt werden:

17 3.5 Lineare und nicht-lineare Regression 83 3 [ε] η ξ [x] η [l] (3.44a) [ε x] [x] ξ [xx] η [xl] (3.44b) Durch Auflösen dieser Noralgleichungen nach den gesuchten Ausgleichswerten der beiden Unbeannten werden folgende Gleichungen erhalten: ξ η [ l][ ] [x[ ][ ] n[ [ ] [ ] n[ ] [ ][] n[ [ ] [ ] l[ [ ] x[ [ ] [ ( ) ] ( ) ) [ ( ) ] n A A B B (3.45a) (3.45b) Mithilfe der orrelationsrechnung ist es nun öglich zu prüfen, ob die noralerteilten stochastischen Größen l i und x i gesetzäßig iteinander in Beziehung stehen. Es wird so eine Wahrscheinlicheitsaussage erhalten, ob zwischen den Messwerten eine orrelation besteht. I einfachen Fall einigeraßen genau geessener x i -Werte ist eine grafische Darstellung in der Lage, eine Gesetzäßigeit nachzuweisen. Die orrelationsrechnung erweist sich jedoch gerade dann als nützlich, wenn die Streuung der l i wegen zufälliger Fehler groß ist. In derartigen Fällen wird der systeatische Gang l(x) durch die Streuung der Messwerte erschleiert. U die Frage zu lären, ob zwischen den Größen l i und x i eine lineare Beziehung besteht, ob sich also eine Regressionsgerade eritteln lässt, wird on i n geessenen Wertepaaren (l i, x i ) ausgegangen. U ertiale Abweichungen, also Abweichungen in l, der Messpunte zu inialisieren, wird eine Ausgleichsgerade l η x ξ gesucht, wobei die x-werte als genau angenoen werden. Falls zwischen x und l eine orrelation besteht, d. h. falls l unabhängig on x ist, inialisiert eine horizontale Gerade die ertiale Abweichung a besten. Also ist dann η. Alternati wird, u horizontale Abweichungen, also Abweichungen in x, zu iniieren, eine Ausgleichsgerade x η' xξ' gesucht, wobei jetzt die l-werte als genau angenoen werden. Bei fehlender orrelation, also wenn x unabhängig on l ist, inialisiert eine ertiale Gerade die horizontalen Abweichungen a besten. Es gilt in diese Fall η'. [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] n η (3.46) n [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] n η ' (3.47) n n [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] n [ ] [ ] r (3.48) n Für den Fall einer olloenen linearen orrelation, d. h. die Messpunte liegen exat auf einer Geraden, fallen die beiden zuor bestiten Ausgleichsgeraden zusaen, und es gilt η / η', d. h.: r η η' (3.49) Der orrelationsoeffizient r η η' nit also i Fall der linearen orrelation die Werte oder an und bei ölligen Fehlen on orrelation den Wert. Das Vorzeichen on r ist unbestit, da die Zuordnung on x und l willürlich ist. Infolge der unereidlichen Messfehler ist in der Realität r auch bei ölliger orrelation etwas on und bei öllig fehlender orrelation etwas on erschieden. Falls zwischen x und l ein funtionaler, aber nicht linearer Zusaenhang besteht bzw. überprüft werden soll, ist der lineare orrelationsoeffizient r ein brauchbares Instruent (r ). Derartige nicht lineare Zusaenhänge önnen jedoch in analoger Weise it der Methode der leinsten Quadrate behandelt werden. Es werden dann die onstanten oplizierterer Funtionen in gleicher Weise berechnet und ein orrelationsoeffizient gebildet, der sich o bisherigen linearen orrelationsoeffizienten r unterscheidet. Idealerweise sollten lineare und nicht-lineare Verfahren geeinsa eingesetzt werden. So sollten die linearen Verfahren erwendet werden, u zwischen unterschiedlichen Reationsechanisen bei Zwei-Substrat-Reationen oder unterschiedlichen Inhibierungsechanisen bei Ein-Substrat-Reationen zu unterscheiden. Sobald der Mechanisus gefunden ist, sollten die Paraeter über eine nicht-lineare Regression bestit werden. Daraufhin wird eine der transforierten linearen Gleichungen herangezogen und der angenoene Mechanisus durch ei-

18 Enzyineti nen Auftrag der Messwerte und der durch die Gleichung berechneten Werte überprüft (Marangoni 3; Gränicher 996). 3.6 Effetorineti Enzye treten häufig it Substanzen in Wechselwirung, die die Reationsgeschwindigeit beeinflussen. Diese Substanzen Effetoren genannt sind eist niederoleulare Verbindungen. Atiatoren erhöhen die Reationsgeschwindigeit, während Inhibitoren sie erniedrigen Inhibitoren Irreersible Inhibitoren bilden i Allgeeinen eine oalente Bindung it de Enzy. Es wird zwischen unspezifischen Inhibierungen, bei denen die Wechselwirung außerhalb des atalytischen Zentrus stattfindet, und spezifischen Inhibierungen, bei denen der Inhibitor eine Affinität zu atien Zentru besitzt und dezufolge die oalente Bindung i atalytischen Zentru stattfindet, unterschieden. I Folgenden werden nur reersible Inhibierungen dargestellt. Bei den durch Inhibitoren herorgerufenen reersiblen Atiitätsänderungen werden i Wesentlichen ier Typen unterschieden: die opetitie, die nicht-opetitie, die unopetitie und die partiell-opetitie oder geischte Inhibierung. Die folgenden Gleichungen sind für die einfache Briggs-Haldane- bzw. Michaelis- Menten-Gleichung (3.6a) abgeleitet, die nur für Anfangsgeschwindigeitsbedingungen gültig ist und die Rücreation ernachlässigt. opetitie Heungen treten auf, wenn Substrat (S) und Inhibitor (I) iteinander u das atie Zentru onurrieren. Sie werden eist bei Substanzen ähnlicher Strutur beobachtet. In Abbildung 3.4 sind erschiedene Möglicheiten, wie eine opetitie Heung entstehen ann, bildlich dargestellt.. Möglicheit: S und I onurrieren u die gleiche Bindungsstelle.. Möglicheit: Nur S oder I önnen binden, da sie sich gegenseitig sterisch behindern. 3. Möglicheit: S und I haben eine zusätzliche, geeinsae Bindungsstelle. All diese Möglicheiten lassen sich durch folgende Reationsgleichung beschreiben: I E S I ES EP 3 3 (3.5a) EI Durch Aufstellen der Massenbilanzen und Anwenden der Steady-State-Annahe wird folgende Gleichung erhalten: [ [ I] (3.5b) 3 Abb. 3.4 Bildliche Darstellung unterschiedlicher Möglicheiten der opetitien Inhibierung

19 3.6 Effetorineti 85 3 ist wie in Gleichung (3.6b) definiert und 3 ist die Dissoziationsonstante des Enzy-Inhibitor-oplexes EI. Die Definition für 3 ergibt sich aus der Massenbilanz für EI: d[ EI] 3 E] I] 3EI] (3.5c) Die Steady-State-Annahe liefert d[ei]/, sodass sich die folgenden, gleichwertigen Definitionen für 3 ergeben: 3 3 [ E][ I] [ EI] 3 (3.5d) Eine opetitie Heung bewirt foral eine Vergrößerung des -Wertes. Abbildung 3.5 eranschaulicht diesen Effet. Für S ergibt sich jedoch der gleiche -Wert wie bei der Michaelis-Menten-ineti ohne Heung. Eine zwangsläufige onsequenz aus der Reersibilität einer Reation ist die Heung jeder enzyatalysierten Reation durch ihr Produt: Das noch a Enzy haftende Produt sowie die einsetzende Rücreation schließen eine siultane Bindung bzw. einen weiteren Usatz des Substrates aus. Für eine ernachlässigbar geringe Geschwindigeit der Rücreation sind die Gleichungen (3.5b) und (3.58a) identisch (Abschnitt 3.7). Die Inhibitoronstante 3 entspricht in diese Fall de Quotienten P / aus den Michaelis-onstanten der Rücund der Hinreation. Obwohl die grafischen Methoden nicht sonderlich gut geeignet sind, u die inetischen onstanten zu bestien, sind sie doch sehr nützlich, u zwischen unterschiedlichen Inhibierungsechanisen zu unterscheiden. In Abbildung 3.6 ist eine Lineweaer-Bur-Darstellung on Gleichung (3.5b) wiedergegeben. Die orrespondierende Gleichung lautet: [ ] I [ S 3 ] (3.5e) Aus der Steigung der Geraden ann also 3 bestit werden, wenn und beannt sind. Abb. 3.6 Lineweaer-Bur-Auftragung bei der opetitien Heung. Schwarz: Michaelis-Menten-Gleichung. Rot: opetitie Heung it 3/ ; [I]/ 3 Nicht-opetitie Heungen treten auf, wenn der Hestoff sowohl an das freie Enzy als auch an den Enzy-Substrat-oplex bindet. Abbildung 3.7 zeigt bildlich eine solche Heung. Abb. 3.5 Scheinbare Vergrößerung des -Wertes bei der opetitien Heung. Schwarz: Michaelis-Menten-Gleichung. Rot: opetitie Heung it 3 / ; [I]/ 3 Abb. 3.7 Scheatische Darstellung der nicht-opetitien Inhibierung

20 Enzyineti Diese Heung lässt sich durch folgende Reationsgleichung beschreiben: E S ES E P I I I I EI S EIS (3.5a) Der Inhibitor onurriert nicht diret u die Bindungsstelle des Substrates, erhindert durch seine Bindung aber den Usatz (Dead-End- oplex). Foreläßig lässt sich dieser Hetyp durch die Einführung zweier Inhibitoronstanten beschreiben, die sowohl den -Wert als auch den Substratter ergrößern: [ [ I] [ I] (3.5b) 3 5 wobei geäß Gleichung (3.7b) definiert ist und weiterhin gilt: 5 ; (3.5c) Die dritte Dissoziationsonstante 4 4 / 4 ist abhängig on den anderen drei onstanten, 3 und 5 und taucht deshalb nicht in Gleichung (3.5b) auf. Abbildung 3.8 eranschaulicht die Veränderung des - und des -Wertes bei der nicht-opetitien Heung. In der Lineweaer-Bur-For lautet Gleichung (3.5b): [ I] [ I] 3 [ 5 (3.5d) Aus der entsprechenden Lineweaer-Bur-Auftragung ergibt sich die Steigung der Geraden, die bei unterschiedlichen Inhibitoronzentrationen resultieren, zu / ( [I] / 3 ) und der Ordinatenabschnitt zu / ( [I] / 5 ) (Abb. 3.9). Bei partiell-opetitien Heungen bindet der Hestoff ebenfalls an das freie Enzy und an den Enzy-Substrat-oplex. I Abb. 3.8 Scheinbare Vergrößerung des -Wertes und Verringerung des -Wertes bei der nichtopetitien Heung. Schwarz: Michaelis-Menten-Gleichung. Rot: nicht-opetitie Heung it 3 / ; [I]/ 3 ; 3 / 5,5 Abb. 3.9 Lineweaer-Bur-Auftragung bei der nicht-opetitien Heung. Schwarz: Michaelis- Menten-Gleichung. Rot: nicht-opetitie Heung it 3/ ; [I]/ 3 ; 3 / 5,5 Unterschied zur nicht-opetitien Heung beeinflusst der Hestoff die atalyse nicht (Abb. 3.), d. h. auch der Enzy-Substrat-Inhibitor-oplex ist atalytisch ati und spaltet Produt ab: I E S 3 3 EI S I 4 4 I ES 5 5 EIS EP E P (3.5a) Foreläßig wird die partiell-opetitie Heung durch Gleichung (3.5b) beschrieben, wo- I

21 3.6 Effetorineti 87 3 bei die Dissoziationsonstanten die gleichen sind wie bei der nicht-opetitien Heung: [ I] 5 (3.5b) [ I] [ I] 3 5 In der Lineweaer-Bur-For lautet Gleichung (3.5b): [ I] 3 [ I] 5 (3.5c) Eine Besonderheit dieses Hetyps liegt darin, dass nur für 3 < 5 eine Heung auftritt. Wenn gilt 3 5, dann ürzen sich die Inhibierungstere, und es resultiert die einfache Michaelis-Menten-ineti. Für den Fall 3 > 5 tritt it steigender Inhibitoronzentration jedoch eine Atiierung auf, die sich in einer scheinbaren Verringerung des -Wertes äußert. I Lineweaer-Bur-Diagra (Abb. 3.) önnen opetitie und partiell-opetitie Heungen nicht oneinander unterschieden werden. Hier bietet sich das Dixon-Diagra an, bei de der ehrwert der Reationsgeschwindigeit gegen die Inhibitoronzentration aufgetragen wird. In Abbildung 3. ist diese Auftragung für die opetitie und die partiellopetitie Heung dargestellt. Abb. 3. Lineweaer-Bur-Auftragung bei der partiell-opetitien Heung. Schwarz: Michaelis- Menten-Gleichung. Rot: partiell-opetitie Heung it 3 / ; [I]/ 3 ; 3 / 5,5. Rot, gestrichelt: partiell-opetitie Heung it 3 / ; [I]/ 3 ; 3 / 5,5 Abb. 3. Dixon-Auftragung bei der opetitien (a) und bei der partiell-opetitien Heung (b). 3 / ; 3 / 5,5. [/,,,5, Bei unopetitien Heungen inatiiert der Hestoff den Enzy-Substrat-oplex, inde er an eine zweite Bindungsstelle a Enzy angreift. Abbildung 3.3 zeigt bildlich diese Heung. Abb. 3. Scheinbare Veränderung des -Wertes bei der partiell-opetitien Heung. Schwarz: Michaelis-Menten-Gleichung. Rot: partiell-opetitie Heung it 3/ ; [I]/ 3 ; 3/ 5,5 Abb. 3.3 Scheatische Darstellung der unopetitien Inhibierung