Dissertation. zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der

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1 Identifizierung und Charakterisierung von Hyperakkumulationsfaktoren bzw. schwermetallregulierten Genen in Arabidopsis halleri und Arabidopsis thaliana Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät (mathematisch-naturwissenschaftlicher Bereich) der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg von Herrn Michael Weber geboren am in Kulmbach 14. März 2005 urn:nbn:de:gbv: [

2 1. Gutachter Prof. Dr. Klaus Humbeck, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Institut für Pflanzenphysiologie 2. Gutachter PD Dr. Stephan Clemens, Leibniz-Institut für Pflanzenbiochemie, Halle (Saale), Abteilung Streß- und Entwicklungsbiologie

3 Inhalt I INHALTSVERZEICHNIS 1 Einleitung Die Eigenschaften und biologische Relevanz von Zink und Kupfer als essentielle Schwermetalle Bedeutung des nicht-essentiellen Schwermetalls Cadmium in der Natur Metallhomöostase-Netzwerk Mobilisierung Aufnahme und Sequestrierung Aufnahmetransporter Chelatoren Metallothioneine (MTs) Organische Säuren und Aminosäuren Nicotianamin Phytochelatine (PCs) Xylembeladung Xylementladung und Verteilung im Gewebe Intrazelluläre Verteilung Verteilungstransporter Chaperone Signaltransduktionsprozesse als Antworten auf veränderte Schwermetall versorgung Schwermetalltoleranz und Hyperakkumulation Phytoremediation Arabidopsis halleri als Modellpflanze Zielsetzung dieser Arbeit Material und Methoden Material Chemikalien, Enzyme, Radioisotope und Oligonukleotide Nährmedien Mikroorganismen und Plasmide Kultivierung von Bakterien und Hefen Escherichia coli Agrobacterium tumefaciens Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe Pflanzenanzucht und Streßbehandlung Oberflächensterilisation Kultivierung in Erde Arabidopsis thaliana (L.) Heynh Arabidopsis halleri (L.) O`Kane & Al-Shehbaz Kultivierung in Flüssigmedium (= Schüttelkultur) Kultivierung im hydroponischen System Arabidopsis thaliana (L.) Heynh Arabidopsis halleri (L.) O`Kane & Al-Shehbaz detached leaves -Experimente (verändert nach Ichimura et al., 2000) Streßbehandlung von hydroponischen Kulturen...22

4 Inhalt II 2.4 Molekularbiologische Methoden Standardmethoden Polymerasekettenreaktion (PCR) RNA-Isolation Isolation genomischer DNA aus Pflanzen für PCR-Reaktionen Isolation genomischer DNA für Southern-Blot Analysen Northern-Transfer Southern-Transfer Radioaktive Markierung von DNA Fragmenten Radioaktive Hybridisierung RT-PCR RACE (Rapid Amplification of CDNA Ends) Quantitative real-time PCR Agrobakterien-Transformation Pflanzentransformation Transformation von Saccharomyces cerevisiae Hefe-Wachstums-Test cdna-aflp (Amplified Fragment Length Polymorphism) Gesamt- und m-rna Isolation cdna Synthese Restriktionsverdau und Adapterligation Präamplifikation Radioaktive Markierung der ApoI+2-Primer Selektive Amplifikation Klonierung von AFLP-Fragmenten Affymetrix-Microarray RNA Isolation cdna-synthese In vitro Transkription Fragmentierung der crna Hybridisierung und Färben der Microarrays Scannen und Standardisierung der Microarrays Auswertung der Microarrays Proteinbiochemische Methoden D-Gelelektrophorese Proteinisolation Bestimmung der Proteinkonzentration Isoelektrische Fokussierung (1. Dimension) SDS-PAGE (2. Dimension) Silberfärbung Analytische Methoden Atomabsorptionsspektrometrie Waschen der Proben Aufschluß und Analyse der Proben Ergebnisse Identifizierung potentieller Hyperakkumulationsfaktoren in A. halleri Konstitutiver Vergleich zwischen A. thaliana und A. halleri Bestätigung der Microarrayergebnisse mittels RT-PCR Weniger stringente Auswertung der Affymetrixdaten...38

5 Inhalt III Nähere Charakterisierung einzelner Kandidatengene Zinkabhängige Expression von NAS2 und ZIP ZIP9 (ZRT IRT-like Protein 9) Nicotianamin-Synthase Identifikation der molekularen Mechanismen der erhöhten AhNAS2- Expression Southern-Blot Analyse Heterologe Expression von AhNAS2 in A. thaliana O-Acetylserin-(thiol)-Lyase 2 (= OAS A2) Identifizierung und Charakterisierung metallregulierter Gene cdna-aflp Statistische Auswertung Überprüfung des Expressionsmusters mittels RT-PCR Analyse von Knockout-Pflanzen Wurzelwachstumsversuche Microarray Evaluierung der Streßbehandlung mittels AAS (Atomabsorptionsspektrometrie) Transkriptomanalyse mittels Affymetrix-Microarrays Datenauswertung Identifizierung induzierter (bzw. reprimierter) Gene Niedrig-Cadmium (N-Cd) und hoch-cadmium (H-Cd) bei A. thaliana Kupfer bei A. thaliana Niedrig-Cadmium (N-Cd) und hoch-cadmium (H-Cd) bei A. halleri Kupfer bei A. halleri Unabhängige Bestätigung der Microarray-Ergebnisse mittels quantitativer realtime-pcr Vergleich zwischen A. thaliana und A. halleri Charakterisierung einiger Gene der Kernantwort D-Gelelektrophorese Diskussion Konstitutiver Vergleich zwischen A. thaliana und A. halleri mittels Affymetrix- Microarrays Identifikation potentieller Hyperakkumulationsfaktoren Detaillierte Charakterisierung von NAS2 und ZIP AtZIP9 und AhZIP AtNAS2 und AhNAS Molekulare Mechanismen der erhöhten AhNAS2-Expression Identifizierung und Charakterisierung schwermetallregulierter Gene cdna AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Microarray Cadmiumstreß A. thaliana A. halleri und Vergleich beider Arten Kupfer (A. thaliana und A. halleri) Weiterführende Vergleiche aller Microarrays beider Arten Metallische Kernantwort Cd 2+ -spezifische Gene...102

6 Inhalt IV 5 Zusammenfassung Identifikation potentieller Hyperakkumulationsfaktoren in A. halleri Identifikation und Charakterisierung metallregulierter Gene Literaturverzeichnis Anhang... i Anhang A: verwendete Oligonukleotide... i Anhang B: spezielle PCR-Programme... iii Anhang C: cdna-aflp-klonliste... iv Anhang D: zusätzliche Microarray-Listen...ix

7 Abkürzungen V Abkürzungen: AAS AFLP AGI APS AS ATP bp BSA CDF cdna CHAPS Col-0 crna datp DCdI dctp dgtp DNase DTT dttp dutp EDTA EST GFP GSH HA HBED H-Cd HEPES HMA HSP IK IRT kb kpa LB MES MOPS MS MT MTs NAS N-Cd NCdI NRAMP OD PC PCs PCR Atomabsorptionsspektrometrie amplified fragment length polymorphism Arabidopsis thaliana Gene Index Ammoniumpersulfat Aminosäure Adenosin-5 -Triphosphat base pair (Basenpaar) bovine serum albumine (Rinderserumalbumin) cation diffusion facilitator complementary DNA (komplementäre DNA) 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat Columbia- 0 (Wildtyp: A. thaliana) complementary RNA (komplementäre RNA) 2 -Deoxyadenosin-5 -Triphosphat dosisabhängig Cadmium-induziert 2 -Deoxycytidin-5 -Triphosphat 2 -Deoxyguanosin-5 -Triphosphat Desoxyribonuklease Dithiothreitol 2 -Deoxythymidin-5 -Triphosphat 2 -Deoxyuridin-5 -Triphosphat Ethylendiamintetraacetat expressed sequence tag green fluorescent protein Glutathion Hämagglutinin N,N -di-(2-hydroxybenzoyl)-ethylendiamin-n,n -diacetat hoch-cadmium N-2-(Hydroxyethyl)piperazin-N-2-Ethansulfonsäure heavy metal ATPase heat shock protein (Hitzeschockprotein) Induktionskoeffizient iron regulated transporter (Eisen regulierter Transporter) kilo base (kilo Base) Kilopascal left border Morpholinoethansulonsäure Morpholinopropansulfonsäure Murrashig-Skoog Metallothionein Metallothioneine Nicotianamin-Synthase niedrig-cadmium niedrig-cadmium-induziert natural resistance associated macrophage proteins optische Dichte Phytochelatin Phytochelatine polymerase chain reaction

8 Abkürzungen VI P-M PMSF PS I PS II PVP RACE r RB RNase RT RT-PCR ROS RUBISCO s-hsp SDS ssp. T-DNA TEMED TG U U/min ura UV (v/v) (w/v) (w/w) YS ZAP ZIP ZNT ZRT Σ Protein-Mißfaltung Phenylmethylsulfonylfluorid Photosystem I Photosystem II Polyvinylpyrrolidon rapid amplification of cdna ends Pearsonscher Korrelationskoeffizient right border Ribonuklease Raumtemperatur reverse transcriptase polymerase chain reaction reactive oxygen species (reaktive Sauerstoffspezies) Ribulose -1,5 bisphosphatcarboxylase small heat shock protein (kleines Hitzeschockprotein) sodiumdodecylsulfate (Natriumdodecylsulfat) Subspezies Transfer-DNA N,N,N,N -Tetramethylenthylendiamin Trockengewicht unit Umdrehungen pro Minute Uracil ultraviolett volume per volume weight per volume weight per weight Yellow Stripe zinc-responsive activator protein ZRT, IRT-like protein zinc transporter zinc regulated transporter Summe