Skalare Kopplungen und das COSY Experiment

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1 Skalare Kopplungen und das COSY Experimen n diesem Kapiel wird der Begriff der skalaren Kopplung n J(A,B) zwischen zwei Kernen A und B, die über n Bindungen mieinander verknüpf sind, eingeführ. Es wird gezeig, welche srukurellen nformaionen sich insbesondere aus 3 J(A,B) ableien lassen. Schließlich ende das Kapiel mi einer Darsellung des wohl einfachsen zweidimensionalen Experimens, dem COSY- Experimen, das eine Korrelaionen zwischen Spins durch skalare Kopplungen hersell. Skalare Kopplung Wie schon in der Einleiung beschrieben, is die skalare Kopplung veranworlich für die Feinaufspalung von Signalen. Sie ri zwischen benachbaren Spins auf, die über kovalene Bindungen verknüpf sind. Ursache der skalaren Kopplung is der Zusand des benachbaren Spins. Befinde sich der Nachbarspin im -Zusand versärk sich das lokal wirkende Magnefeld. So ergib sich die Roaionsfrequenz des beobacheen Spins aus seiner chemischen Verschiebung plus den Frequenzaneil der skalaren Kopplung. Der Effek is genau umgekehr befinde sich der Nachbarspin im β-zusand. Die Resonanzfrequenz ergib sich so aus der chemischen Verschiebung minus dem Aneil der skalaren Kopplung. ungekoppeles Spinsysem gekoppeles Spinsysem J J ν A ν B ν A ν B B B β A A β Gedankenexperimen Ω A = 0 A πj πj A β ν A n einem Gedankenexperimen ergib sich in einem Sysem aus zwei gekoppelen Spins (Sysem A - B mi J ), für einen beobacheen Spin A mi der chemische Verschiebung Ω A =0ppm ein

2 Signal besehend aus zwei Linien. Der Schwerpunk beider Linien lieg bei δ A =0ppm und ihr Absand beräg πj. Berache man sich das zugehörige Vekormodell, so liegen dor zu Beginn der Evoluionszei zwei Vekoren parallel in ransversaler Ebene. Auf beide wirk nun gleichermaßen der Operaor der chemischen Verschiebung (is in unserem Gedankenexperimen aber null!!). Es wirk aber zusäzlich noch ein Operaor der skalaren Kopplung, aber nich gleichförmig auf beide Vekoren, sondern auf einen in Form einer Bewegung im Uhrzeigersinn und im anderen Fall engegen dem Uhrzeigersinn. Erser Vekor repräsenier alle Spins A, die einen benachbaren Spin B im - Zusand besizen, der zweie Vekor seh für alle Spins A, die einen benachbaren Spin B im β- Zusand besizen. y B πj y x πj -x x y nerakion der Kopplung πj Az B β -y ungekoppel Ω = 0 x gekoppel Ω = 0 Nach einer gewissen Zei lassen sich die beiden Spins durch folgende Operaoren beschreiben: πj Az B β B cosπj cosπj + Ay B β Ay B sinπj sinπj Dabei beschreib die Gleichung der Evoluion der Kohärenz uner dem (Hamilon)Operaor πj der skalaren Kopplung. Die Särke der skalaren Kopplung is J. Um die Az Formulierung und β zu umgehen und sadessen mi bekannen Operaoren x, y, z arbeien zu können, müssen folgende Transformaionsregeln angewende werden: + β = β = z

3 Die erse Gleichung besag, dass ein Spin enweder im - oder im β-zusand sich befinden kann und dass die Summe dieser beiden Zusände gleich is. Die zweie Gleichung besag, dass die Differenz zwischen - oder im β-zusand gerade gleich der Magneisierung z is. Der Fakor zwei is ein Normierungsfakor, der späer erklär wird. Form man nun obigen Term um, der die Evoluion der skalaren Kopplung beschreib, so erhäl man: Ay ( B β ) = Ay ( + β ) B B = B Diese Ableiung is allgemeingülig und somi resulieren folgende Rechenregeln für die Beschreibung von skalarer Kopplung im Produkoperaorformalismus: Az Ay πj πj Az πj Az πj Az Ay Ay cos πj + cosπj Ay sinπj sinπj cosπj + sinπj Ay cosπj sinπj Ay Skalare Kopplungen sind wichige Parameer zur Srukurbesimmung, sie eignen sich zur Feslegung der lokalen Konformaion. So häng die 3 J-Kopplung außer von Subsiueneneinflüssen wesenlich vom Molekülbau ab (Bindungslängen, Bindungswinkel und Torsionswinkel). Bei vicinalen Kopplungen 3 J an frei drehbaren (C-C)-Bindungen änder sich die Größe der Kopplungskonsane mi dem Torsionswinkel θ. Diese Abhängigkei wird graphisch in der Karpluskurve dargesell:

4 Obwohl die Parameer, die die jeweilige Karplus-Kurve spezifizieren, von Fall zu Fall verschieden sind, simm der Verlauf dieser Kurve bei fas alle Kernkombinaionen qualiaiv überein: - lokales Maximum für θ = 0 - globales Maximum für θ = 80 - globale Minima für θ = 90 bzw. 70 Der Verlauf der Kurve wird durch die Karplus-Gleichung beschrieben J = A cos θ + B cos θ + C A, B und C sind empirische Konsanen mi ungefähren Weren von 4 Hz, -0,5Hz und 4,5 Hz. Sie werden je nach Kernkombinaionen und Molekülen variier. Zusammenhang zwischen der Karplusbeziehung und Sekundärsrukurelemenen in Proeinen Aufgrund des Doppelbindungscharakers der Pepidbindung is diese sarr. Deshalb sind die Torsionswinkel φ (Torsionswinkelsequenz C(=O)-N-C -C(=O) )und ψ (N-C -C(=O)-N) die enscheidenden Parameer, um die Konformaion des Pepidrückgras, speziell jeder einzelnen konformaionellen Repeiereinhei einer Polypepidkee, zu beschreiben. Die enscheidende Teilsrukur bei Polypepidkeen

5 Anhand des Ramachandran-Plos erkenn man, dass nur besimme Were für den Winkel φ und ψ erlaub, d.h. energeisch günsig, sind. Die beiden Torsionswinkel φ und ψ sehen nach Karplus in direker Beziehung zu den ensprechenden Kopplungskonsanen. Aufgrund der Karplusbeziehung kann man ausgehend von Kopplungskonsanen Sekundärsrukurelemene (über Torsionswinkel) voraussagen. Uner Ausnuzung dieser Beziehung is es ebenfalls möglich, anhand von Torsionswinkeln, die über Röngensrukuranalyse ermiel wurden, die Kopplungskonsanen zu errechnen. links: Karplusbeziehung zwischen dem Torsionswinkeln φ bzw. ψ und 3 J NH rechs: Gemessene φ und ψ Winkel aus hochaufgelösen Röngenkrisallsrukuren (Auflösung >,0 A und R > 0,0 ) von 85 Proeinen Besimme Were des Winkels φ sind mi besimmen Sekundärsrukurelemenen verknüpf. Theoreische Were: Durchschniswere aus Bild 5 -Helix: φ = -57 φ = -64, Helix φ = -49 φ = -6,8 Paralleles β-falbla: φ = -9 φ = -,6 Aniparalleles ß-Falbla: φ = -39

6 φ und ψ-winkel bilden ein breies Spekrum in allen drei Sekundärsrukurelemenen. Serische Krierien und Arakionskräfe können auch bei irregulären Srukuren ausreichend erfüll werden, beispielsweise geknicke oder gekrümme -Helix, da jede Aminosäure eine unerschiedliche lokale Umgebung ha. Diese Abweichungen sind insbesondere für die Aminosäuren am Anfang oder Ende eines Sekundärsrukurelemens groß. 3 J(H N,H )-Kopplungskonsanen in Sekundärsrukurelemenen a) berechne aus den φ Winkeln von 85 Röngenkrisallsrukuren, b) gemessen bei 9 Proeinen, c) berechne aus den φ Winkeln der Srukurberechnung dieser 9 Proeine Terminale Rese, die nich charakerisisch für Sekundärsrukuren sind, wurden nich in die Berchnung mieinbezogen. Der Vergleich zwischen den gemessenen und berechneen Kopplungskonsanen bei den gleichen Proeinen (b und c) zeig, dass die Berechnung von J mi der Karplus-Gleichung und den hier verwendeen empirischen Parameern rech zuverlässig is. Es zeig sich auch, dass anhand des Weres der Kopplungskonsane zwischen dem Amid- und C -Proons rech gu zwischen -Helix, ß-Falbla und Coil-Srukuren unerschieden werden kann.

7 Die dafür normalerweise verwendeen Parameer führen zu einer richigen denifikaion von ca % der Sekundärsrukuren im Falle von -Helices und ß-Falbläern. 3 J(H N,H ) < 6 Hz Helix 3 J(H N,H ) > 8 Hz ß Falbla 6Hz < 3 J(H N,H ) > 8 Hz Coil Srukuren Wegen des großen Bereichs an φ Winkeln und somi auch 3 J(H N,H )-Kopplungen, die in einer 3 0 -Helix vorkommen, kann man dieses Sekundärsrukurelemen nur schwer anhand von 3 J(H N,H )-Kopplungen idenifizieren (58 %). Dies spiegel sich auch in den Kopplungskonsanen berechne aus 85 Proeinkrisallsrukuren und aus heoreischen, idealisieren Sekundärsrukurelemenen wider: Aus 85 Proeinen ermiel aus idealisieren Elemenen ermiel -Helix 4,8 Hz 3,9 Hz 3 0 -Helix 5,6 Hz 3,0 Hz ß-Falbla 8,5 Hz 8,9 Hz (aniparallel) bzw. 9,7 Hz (parallel) Diese Were unerscheiden sich signifikan, simmen aber gu mi erhalenen NMR-Daen von den 9 Proeinen überein. Generell kann man die Kopplungskonsane als Basis für die Analyse von Sekundärsrukuren naiver und ungeordneer Proein verwenden. Lieraur: Lorna J. Smih, Kimberly A. Bolin, Harald Schwalbe, Malcolm W. MacArhur, Jane M. Thornon, and Chrisopher M. Dobson, "Analysis of Main Chain Torsion Angles in Proeins. Predicions of NMR Coupling Consans for Naive and Denaured Conformaions", J.Mol.Biol. 55, (995).

8 COSY Ein einfaches zweidimensionales Experimen, dass Kerne miels ihrer skalaren Kopplung korrelier is das in den siebziger Jahren von J.Jeener und R.Erns implemeniere COSY Experimen. COSY is das Acronym für correlaion specroscopy. m Experimen werden magneische Wechselwirkungen beobache bzw. zum Magneisierungsransfer ausgenuz. Anders gesag evolvier die Kohärenz uner den Hamilonoperaoren der chemischen Verschiebung H CS und der skalaren Kopplung H J.. chemische Verschiebung; H = Ω + Ω. skalare Kopplung n J nn ; H J = πj Az CS Az H H H 3 J 3 Absrakion J H H 3 3 J 3 H 3 AMX-Spinsysem Das Experimen is, den Aufbau der Pulssequenz bereffend, eines der einfachsen D Experimene. 90 y 90 y!c!wn a b c d m Folgenden werden nun die Spins zu den indizieren Zeipunken berache. n der Beschreibung wird ab Punk b nur der Spin weier verfolg. Nichs deso roz gil die gleiche Enwicklung auch für Spin!!! a) Sar mi Gleichgewichsmagnesierung z + z b) Überführung in ransversale Magneisierung miels 90 -Puls x + x

9 c) Enwicklung von chemischer Verschiebung und skalarer Kopplung während Ω z x cosω + y sin Ω cosω ( ) π x cosπj + y z sinπj sin Ω ( cosπj sinπj ) J z z y x z Wir können die Reihenfolge, in der wir die Enwicklung der chemischen Verschiebung und der skalaren Kopplung berachen, frei wählen, da die Hamilonoperaoren der beiden Wechselwirkungen mieinander verauschen: [ H, ] = 0. d) Anwendung des zweien 90 -Pulses: y J H CS cosω ( ) 90 z cosπj + y x sinπj sin Ω ( cosπj + sinπj ) y z x An dieser Selle is es sinnvoll die einzelnen Terme zu beweren, um möglichs Operaoren, die in nich deekierbarer Magneisierung resulieren, nich weier zu verfolgen. A. - z longiudinale Magneisierung, führ zu keinem Signal, da nur ransversale Magneisierung von der Spule aufgenommen werden kann. B. y x DQ-ZQ-Term: nich deekierbar. Die Frage, weshalb dieser Doppelquanenerm nich deekier werden kann, wird ers späer klar, und kann an diesem Punk nur phänomenologisch erklär werden: Eine Kohärenz y sell den kohärenen Übergang eines Quans zwischen - und β-zusand eines Spins dar. Eine Kohärenz y y sell eine kohärenen Übergang zwischen - und β-zusand zweier Spins dar. Solche Terme zwischen zwei oder noch mehreren Spins sind miels NMR-Spekroskopie zwar anregbar, aber nich deekierbar. C. y deekierbar: wird zu Diagonalpeak (nphaseerm) D. z x deekierbar: wird zu Kreuzpeak (Aniphaseerm) Es werden im Weieren nur die Terme C. und D. berache, da nur diese zu einer deekierbaren Magneisierung führen:

10 sin Ω ( cosπ J + πj ) y z x sin Auf diese Operaoren wirk während nun zum einen die chemische Verschiebung der jeweiligen Kerne und naürlich auch die skalare Kopplung: Ω z sin ( ) y cosπj cosω x cosπj sin Ω Ω ( sinπj cosω + sinπj sin Ω ) z x z y πj z z sin Ω a b ( y cosπj cosω cosπj x z cosπj cosω sinπj ) ( x cosπj sin Ω cosπj + y z cosπj sin Ω sinπj ) ( z x sinπj cosω cosπj + y sinπj cosω sinπj ) ( sinπj sin Ω cosπj sinπj sin Ω sinπj ) z y y c d Berache man die nphaseerme (in blau und grün), so erkenn man, dass man nach Addiion von a und b, sowie von c und d ein komplexes Signal in generieren kann: a + b: sin i Ω cosπ J e Ω cosπ J c + d: sin i Ω sinπ J e Ω sinπ J Um nun auch noch ein komplexes Signal in zu erhalen, muß man nach Ruben-Saes- Haberkorn die Phasen der Pulse schieben, d.h. in einem zweien Experimen werden die Pulse aus +x und +y angewende (vormalig +y/+y). Es ergib sich so folgende Beschreibung der Magneisierung: i e Ω i cosπ J e Ω cosπ J i e Ω i sinπ J e Ω sinπ J Hierbei beschreib der erse Term den Diagonal- und der zweie Term den Kreuzpeak des Spekrums. Da sich das gleiche auch für den Spin ergib (siehe Punk b in der Pulssequenz und der Beschreibung) ergib sich ein zweidimensionales Spekrum mi folgender Grobsrukur:

11 CP DP ω π DP CP ω π Berache man nun nochmals die resulierenden Terme, so is zu erkennen, dass der Diagonalpeak sowohl in als auch in mi cosπ J modulier is und der Crosspeak in beiden Zeidimensionen eine Modulaion mi sinπ J aufweis. So ergib sich folgende Feinsrukur der Peaks: DP CP J Ω Ω J J J Ω Ω

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