S Untersuchungen zur Pharmakokinetik, Pharmakodynamik und Immunogenität des thrombinspezifischen Blutegelwirkstoffes Hirudin bei Tier (Pavian, Schwein) und Mensch Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde am Fachbereich Biologie der Freien Universität Berlin vorgelegt von Johann Bichler aus Tegernsee
INHALTSVERZEICHNIS Seite EINLEITUNG 1 MATERIAL UND METHODEN 13 1 Methoden zum Nachweis von Hirudin 13 1.1 Thrombin-Henunaktivität im Chromozym TH-Test 13 1.2 Radioimmunbioassy (RIBA) 14 1.3 Kompetetiver ELISA 18 2 Methoden zur Erfassung von Hirudin-AntikSrpern 20 2.1 Indirekter ELISA 20 2.2 "Capture-Test"-ELISA 21 2.3 Direkter Haut-Test (DHT) 22 2.4 Histamin-Release-Test (HRT) 23 2.5 Prick-Test 25 3 Jodierung von Hirudin 26 4 Aminosäureanalyse 26 5 Konjugation von Hirudin und Peroxidase 27 6 Hirudin-Präparate und Hirudin-Injektionslosungen 2B 7 Durchführung der Versuche am Menschen 29 7.1 Versuchspersonen 29 7.2 Versuchsablauf 29 7.3 Gewinnung und Lagerung von Probenmaterial 30 8 Experimentelle Durchführung der Versuche am 31 Pavian 8.1 Versuchstiere 31 8.2 Versuchsablauf 33 8.3 Gewinnung und Lagerung von Probenmaterial 33 9 Experimentelle Durchführung der Versuche am 34 Schwein 9.1 Versuchsgestaltung 35
9.2 Probenmaterial 35 10 Hämatologische Untersuchungen 10.1 10.2 10.3 10.4 10.5 10.6 10.7 Leukozyten Thrombozyten Hämoglobin Hämatokrit Partielle Thromboplastinzeit Thrombinzeit Quick-Test (PTT) 37 37 11 11.1 Pharmakokinetische Berechnungen Svmbole. Definitionen und Dimensic makokinetischen Parameter 39 39 11.2 Berechnung der pharmakokinetisehen Parameter 40 für Hirudin aus den Plasma- und Urinkonzentrationen 11.3 Gleichungen für die Berechnung der pharmakoki- 44 netischen Parameter 12 Geräte 45 13 Substanzen. 46 C ERGEBNISSE UND DISKUSSION 48 I Vorversuche 48 1 Aufbau eines kompetitiven ELISA für Hirudin 48 1.1 Einführung 48 1.2 Optimierung des Testsystems. 48 1.3 Vergleich mit dem RIBA 49 1.4 Einfluß von Thrombin auf den kompetitiven ELISA 49 2 Entwicklung von ELISA Methoden zum Nachweis von 52 Hirudin-Antikörpern 2.1 Optimierung des indirekten ELISA 52 2.2 Nachweis von Affen IgM mit anti-human IgM- 54 Peroxidase
2.3 Vergleich der Nachweisgrenzen für Hirudin- 54 Antikörper im indirekten ELISA und im "Capture- Test"-ELISA 3 Gerinnungshemmende Aktivität des Hirudin in 57 vitro 3.1 Einfluß des Hirudins auf globale Gerinnungstests 57 beim Human-Citratplasma 3.2 Einfluß des Hirudins auf globale Gerinnungstests 57 beim Schweine-Citratplasma 4 Hemmung der Hirudinaktivität durch Hirudin- 60 Antikörper in vitro 4.1 Einfluß von Hirudin und Hirudin-Antikörpern auf 60 PTT und Thrombinzeit im Human-Citratplasma 4.2 Einfluß von Hirudin-Antikörpern auf die Hiru- 60 din-hemmaktivität-im Chromozym TH-Test II Pharmakokinetik und Pharmakodynamik des Hirudins 63 (aus Blutegeln) nach intravenöser und subcutarier Injektion beim Menschen 1 Einführung 63 2 Ergebnisse 64 2.1 Hirudin-Plasmakonzentrationen 64 - Subcutane Injektion 64 - Intravenöse Injektion 65 2.2 Renale Hirudinausscheidung 67 - Subcutane Injektion 67 - Intravenöse Injektion 67 3 Pharmakokinetik 73 3.1 Pharmakokinetische Parameter des Hirudins nach 73 intravenöser Injektion
- Halbwertszeiten 73 - Geschwindigkeitskonstanten 73 - Verteilungsvolumina 73 - Clearance 76 - Fläche unter der Hirudin-Plasmakonzentration- 76 Zeit-Kurve - Renale Eliminationshalbwertszeit. 77 - Renale Clearance 77 3.2 Pharmakokinetische Parameter des Hirudins nach 78 subcutaner Injektion - Halbwertszeiten 78 - Verteilungsvolumina 78 - Clearance. 78 - Fläche unter der Hirudin-Plasmakonzentration- 78 Zeit-Kurve - absorbierter Anteil der subcutanen Dosis 79 - Renale Eliminationshalbwertszeit 79 - Renale Clearance 79 3.3 Kumulative Hirudinausscheidung im Urin 84 3.4 Zusammenhang zwischen pharmakokinetischen Para- 84 metern und Applikationsmodus 3.5 Zusammenhang zwischen pharmakokinetischen Para- 85 metern und Dosis nach subcutaner Injektion 3.6 Zusammenhang zwischen pharmakokinetischen Para- 85 metern und dem Geschlecht der Versuchspersonen 4 Pharmakodynamik 87 4.1 Gerinnungsparameter 87 - PTT 87 - Thrombinzeit 87 - Quick-Test 88 4.2 Einfluß der Hirudininjektion auf das Blutbild 96 - Leukozyten 96
- Thrombozyten 96 - Hämoglobin 96 - Hämatokrit 96 4.3 Nebenwirkungen 96 4.4 Immunologische Nachuntersuchungen 97 5 Bewertung 99 III Versuche zum Nachweis einer Sensibilisierung 102 (Immunisierung) von Pavianen durch natürliches und rekombinantes Hirudin 1 Einführung 102 2 Renale Hirudinausscheidung 104 3 Serum-Untersuchung auf Hirudin-Antikörper 109 4 Histamin-Release-Test 111 5 Direkter Haut-Test 113 6 Leukozyten- und Thrombozytenzahl 116 7 Bewertung 119 IV Applikation von Hirudin beim Schwein 120 1 Einführung 120 1. Versuchsreihe: Versuche zum pharmakologi- 120 sehen Verhalten von Blutegel-Hirudin beim Schwein 2 Ergebnisse 120 2.1 Hirudin-Plasmakonzentrationen 120 2.2 Gerinnungsparameter 122 2.3 Renale Hirudinausscheidung 123
3 Pharmakokinetik des Hirudins beim Schwein 124 4 Vergleich der pharmakokinetisehen Parameter 124 von Hirudin bei Mensch und Schwein 2. Versuchsreihe: Wirkung von rekombinantem 127 Hirudin bei experimentell erzeugter Sepsis 1 Einführung 127 2 Ergebnisse 127 2.1 Hirudin-Plasmakonzentrationen 127 2.2 Renale Hirudinausscheidung 129 3 Bewertung 132 D ZUSAMMENFASSUNG 133 E ANHANG 137 I Hirudingehalt in den Urinproben, gesammelt nach 137 Injektion beim Menschen II Pharmakokinetische Parameter des Hirudins nach 141 intravenöser Gabe (Einzelwerte) III Hirudin-Plasmakonzentration-Zeit-Kurven nach 142 intravenöser Injektion IV Pharmakokinetische Parameter des Hirudins nach 143 subcutaner Gabe (Einzelwerte) V Hirudin-Plasmakonzentration-Zeit-Kurven nach 146 subcutaner Gabe ' VI Zusammenhang zwischen Hirudin-Plasmakonzentration 149 und.gerinnungsparametern beim Menschen nach subcutaner und intravenöser Gabe VII Blutbild beim Menschen nach der Hirudinapplika- 157 tion VIII Hirudingehalt in den Urinprbben beim Pavian, ge- 169 sammelt nach intravenöser Injektion
F LITERATURVERZEICHNIS 174 G ABKÖRZUNGSVERZEICHNIS 182 Lebenslauf