Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Ludwig-Maximilians-Universität München Synthese von eukaryotischen RNA-Modifikationen und Quantifizierung nicht kanonischer Nukleoside sowie Untersuchungen zu deren Biosynthese Veronika Reiter geb. Welzmiller aus Tegernsee 2013
Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung V Summary XI 1. Einleitung 1 1.1 Modifikationen der Nukleinsäuren 1 1.2 Die Isopentenyl-Modifikationen 6 1.2.1 Vorkommen 6 1.2.2 Biosynthese 8 1.2.3 Funktion 12 1.2.3.1 In der Translation 12 1.2.3.2 Modifikationen und die Entstehung von Krankheiten 13 1.2.3.3 Als Mitglied dercytokinin Familie 14 1.2.3.4 Einfluss auf die Proliferation 16 1.3 Methylthiotransferasen 18 2. Aufgabenstellung 21 3. Quantifizierung von RNA-Modifikationen 23 3.1 Allgemeine Methode 23 3.1.1 Isolierung verschiedener RNA Spezies 24 3.1.2 Enzymatischer Verdau 28 3.1.3 Synthese und Verwendung isotopenmarkierter Standards 28 3.1.3.1 (cf)-3-methyluridin 29 3.1.3.2 (tf^z-o-dimethyluridin 30 3.1.4 ESI-LC/MS Analytik 31 3.1.4.1 Eichgeraden 31 3.1.4.2 ESI-LC/MS Methode 33 3.1.4.3 Datenevaluierung 33 3.2 Quantifizierungsstudie 34 3.2.1 Modifikationen der gesamt-rna 34 3.2.2 Modifikationen der polya-rna 35 3.2.3 Modifikationen der rrna 37 3.2.4 Modifikationen der IwRNA 38 3.2.5 Modifikationen der trna 40
3.2.6 Diskussion 40 4. Charakterisierung der Isopentenyl-Modifikationen 43 4.1 Synthese der Adenosin-Modifikationen 43 4.1.1 Synthese des Isopentenyl-Restes 43 4.1.2 2-Methylthio-/V6-isopentenyladenosin Phosphoramidit 44 4.1.3 A^-Isopentenyladenosin Phosphoramidit 45 4.1.4 2-Methylthio-N5-isopentenyladenosin Monophosphat 47 4.2 Einbau der Adenosin-Modifikationen in RNA 49 4.2.1 Grundlagen der RNA Festphasensynthese 49 4.2.2 Synthese der RNA Oligonukleotide 51 4.3 Eigenschaften der modifizierten Oligonukleotide 58 4.3.1 Reverse Transkription 58 4.3.2 Schmelzverhalten der modifizierten Oligonukleotide 61 4.4. Lokalisation und Derivatisierung 65 4.4.1 Versuche zur Lokalisation von ms2i6a 65 4.4.1.1 Antikörperherstellung und Immunopräzipitation 65 4.4.1.2 Enzymatischer Teilverdau 68 4.4.1.3 Größenbestimmung und Kombinationsaufreinigung 69 4.4.2 Versuche zur Derivatisierung von ms2i6a 70 4.4.2.1 Ozonolyse 70 4.4.2.2 Oxidative Spaltung 71 4.4.2.3 Cycloaddition an ein Tetrazin-Derivat 71 4.5 Einfluss auf das Zellwachstum 72 5. Humanes Homolog der Methylthiotransferase MiaB 75 5.1 Bioinformatische Analyse 75 5.2 Subzellulare Lokalisation der CDK5RAP1 -Varianten 77 5.3 Komplementationsassay 78 5.4 sirna Knockdown 82 5.5 Einfluss auf das Zellwachstum 85 5.6 Diskussion 86 6. Ausblick 87 7. Experimenteller Teil. 89
7.1 Biochemische Methoden 89 7.1.1 Material und allgemeine Methoden 89 7.1.1.1 Medien, Lösungen und Puffer 89 7.1.1.2 Zelllinien, Bakterienstämme und Enzyme 91 7.1.1.3 Geräteliste 92 7.1.1.4 Gelelektrophorese 93 7.1.1.5 Bradford Assay 94 7.1.2 Zellkultur 94 7.1.3 RNA Isolationen 95 7.1.3.1 Isolation von polya-rna 95 7.1.3.2 Isolation von rrna 96 7.1.3.3 Isolation von trna 96 7.1.3.4 Isolation von IwRNA 97 7.1.3.5 Isolation von gesamt-rna 98 7.1.4 Komplementationsassay 98 7.1.5 sirna Knockdown 99 7.1.6 Subzellulare Lokalisation der CDK5RAP1-Varianten 99 7.1.7 Oligonukleotidsynthese 99 7.1.7.1 RNA Festphasen Synthese 100 7.1.7.2 Abspaltung, Reinigung und Charakterisierung 100 7.1.7.3 Sequenzen der synthetisierten RNA Stränge 101 7.1.8 Reverse Transkription 102 7.1.9 Schmelzverhalten der Oligonukleotide 102 7.1.10 ESI-LC/MS Analytik 102 7.1.10.1 Enzymatischer Verdau 103 7.1.10.2 ESI-LC/MS Messungen 103 7.1.10.3 Eichgeraden 105 7.1.10.4 Auswertung 105 7.1.11 Antikörperherstellung und Verwendung 106 7.1.11.1 Monophosphatkopplung und Antikörperherstellung 106 7.1.11.2 Antikörperfunktionstest via Dotblot 106 7.1.11.3 Immunopräzipitation 107 7.1.12 Lokalisationsversuche von ms2i6a 107 7.1.12.1 Enzymatischer Teilverdau 107 7.1.12.2 RNA-Kombinationsaufreinigung 108 7.1.12.3 Größenfraktionierung 108 7.1.13 Derivatisierung von ms2i6a 109 7.1.13.1 Ozonolyse 109
7.1.13.2 oxidative Spaltung mit mcpba/nal04 oder fbooh/nal04 109 7.1.13.3 Cycloaddition an ein Tetrazin-Derivat 110 7.1.14 Wachstumsexperiment 110 7.2 Chemische Synthesen 111 7.2.1 Material und allgemeine Methoden 111 7.2.2 Durchführung der Synthesen 114 7.2.2.1 Synthese des Isopentenyl-Restes 114 7.2.2.2 2-Methylthio-/v6-isopentenyladenosin Phosphoramidit 116 7.2.2.3 A^-Isopentenyladenosin Phosphoramidit 123 7.2.2.4 2-Methylthio-/v6-isopentenyladenosin Monophosphat 129 7.2.2.5 (cfys-methyluridin 130 7.2.2.6 (crv3,2'-0-dirriethyluridin 132 Anhang 137 Abkürzungsverzeichnis 141 Literaturverzeichnis 145 Danksagung 159