Neue Methodenentwicklung in der Flüssigchromatografie durch Anwendung der Hochtemperaturtechnik mit subkritischen wässrigen mobilen Phasen

Transkript

1 Neue Methodenentwicklung in der Flüssigchromatografie durch Anwendung der Hochtemperaturtechnik mit subkritischen wässrigen mobilen Phasen - Konstruktive Aspekte eines speziellen Heizsystems Dissertation vorgelegt von Thorsten Teutenberg Ruhr-Universität Bochum Fakultät für Chemie 2004

2 Lebenslauf Persönliche Daten: Name: Thorsten Teutenberg Geburtsdatum: Geburtsort: Wickede-Wimbern Schulischer beruflicher Werdegang : Besuch der Petri-Grundschule in Werl : Besuch des städtischen Mariengymnasiums in Werl Abschluss: Allgemeine Hochschulreife 6/ : Leistung des Zivildienstes im Altenheim Haus Amadeus in Werl : Studium der Chemie an der Ruhr-Universität Bochum 5/1999: Diplom am Lehrstuhl für Analytische Chemie Thema der Arbeit: Untersuchungen zum Adsorptionsverhalten ausgewählter Zytostatika an Klärschlamm unter Anwendung der HPLC : Anfertigung der vorliegenden Dissertation am Lehrstuhl für Analytische Chemie 2004: Abschluss der Promotion

3 Die Welt wird immer klüger, vielleicht kommt noch einmal die Zeit, wo einer sich schämen muss, wenn er nicht auf dem Seil tanzen kann! Friedrich Hebbel, aus Maria Magdalena

4 Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum von August 1999 bis Dezember 2003 am Lehrstuhl für Analytische Chemie der Ruhr-Universität Bochum angefertigt. Tag der mündlichen Prüfung: Montag, 2. Februar 2004 Promotionskommission Referent: Prof. Dr. H.-J. Götze Korreferent: Prof. W. S. Sheldrick PhD 3. Prüfer: Priv. Doz. Dr. G. Witte Vorsitzender: Prof. Dr. M. Hollmann

5 Danksagung Ich bedanke mich bei Herrn Prof. Dr. H.-J. Götze für die interessante Themenstellung sowie für seine ständige Diskussionsbereitschaft, engagierte Unterstützung und den mir gewährten Freiraum bei der Anfertigung dieser Arbeit. Ich danke Herrn Prof. W. S. Sheldrick PhD für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes sowie für die Übernahme des Korreferats. Bei Herrn Priv. Doz. Dr. G. Witte bedanke ich mich für seine Bereitschaft, in der Disputation als Drittprüfer zu fungieren. Allen Mitgliedern des Lehrstuhls für Analytische Chemie und insbesondere der Arbeitsgruppe Chromatografie und Schwingungsspektroskopie möchte ich für die gute Zusammenarbeit und das ausgezeichnete Arbeitsklima danken.

6 Veröffentlichungen und Vorträge 1) Poster: T. Teutenberg, O. Lerch, H.-J. Götze, P. Zinn: Separation of Selected Anticancer Drugs using Superheated Water as the Mobile Phase, 30 th Annual International Symposium on Environmental Analytical Chemistry (ISEAC 30), Espoo, Helsinki Metropolitan Area Finland 2) Vortrag: T. Teutenberg: Continuous Local Resolved HPLC and On-line Enrichment of Cytostatics from Surface Water coupled with Electrochemical and UV Detection, 30 th Annual International Symposium on Environmental Analytical Chemistry (ISEAC 30), Espoo, Helsinki Metropolitan Area Finland 3) Vortrag: T. Teutenberg: Chromatographie einiger ausgewählter Zytostatika mit überhitztem Wasser als mobile Phase Eine Alternative zur konventionellen Reversed-Phase Chromatographie?, Umweltanalytiktage NRW 2000, Mülheim an der Ruhr, Deutschland 4) T. Teutenberg, O. Lerch, H.-J. Götze, P. Zinn: Separation of Selected Anticancer Drugs Using Superheated Water as the mobile Phase, Analytical Chemistry, 73 (2001), ) Poster: T. Teutenberg, H.-J. Götze, P. Zinn; Th. Kiffmeyer, K. G. Schmidt, G. Schöppe, H.-D. Jansen, W. gr. Kohorst: Einsparung organischer Lösemittel und Effizienzsteigerung in der Flüssigchromatografie durch Einsatz der Hochtemperaturtechnik, AiF-Innovationstag 2003, Berlin Projektanträge 1) T. Teutenberg, H.-J. Götze: Voruntersuchungen zur Möglichkeit des Ersatzes organischer Lösungsmittel in der Flüssigchromatografie durch subkritisches Wasser, Machbarkeitsstudie, Ministerium für Schule, Wissenschaft und Forschung des Landes NRW, Laufzeit: ) T. Teutenberg, H.-J. Götze, K. G. Schmidt, Th. Kiffmeyer, H.-D. Jansen, W. gr. Kohorst: Einsparung organischer Lösemittel und Effizienzsteigerung in der Flüssigchromatografie durch Einsatz der Hochtemperaturtechnik, Arbeitsgemeinschaft industrieller Forschungseinrichtungen (AiF) e. V., Laufzeit:

7 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Problemstellung Ziel der Arbeit Theoretische Grundlagen Temperaturabhängigkeit wichtiger physikalisch-chemischer Größen von flüssigem Wasser Temperaturabhängigkeit der Dielektrizitätskonstanten Temperaturabhängigkeit des Sättigungsdampfdrucks Temperaturabhängigkeit der Viskosität Einfluss der Temperatur auf den chromatografischen Prozess Temperaturabhängigkeit des Diffusionskoeffizienten Temperaturabhängigkeit der van Deemter-Gleichung Temperaturabhängigkeit des Eddy-Diffusionskoeffizienten Temperaturabhängigkeit des Longitudinaldiffusionskoeffizienten Temperaturabhängigkeit des Massenaustauschs Temperaturabhängigkeit des Retentionsfaktors Potenziale der Hochtemperatur-Flüssigchromatografie Niedriger Gesamtdruck Einsparung organischer Lösungsmittel Thermische Optimierung Bewertender Vergleich der Eigenschaften idealer und realer mobiler Phasen in der Umkehrphasen-Chromatografie Solvatation ionischer, polarer und unpolarer Substanzen Änderung der Elutionsstärke durch Variation von % B Viskosität Detektion Reinheitsgrad Brennbarkeit Toxizität Umweltfreundlichkeit Preis Zusammenfassung Auswahl temperaturstabiler stationärer Phasen Allgemeiner Aufbau und spezifische Kenndaten stationärer Phasen Chemisch modifiziertes Silikagel... 29

8 3.5.3 Polystyrol-Divinylbenzol (PS-DVB) Grafitisierter Kohlenstoff - Hypercarb Polybutadien-beschichtetes Zirkoniumdioxid - ZirChrom -PBD Auswahl der flüssigchromatografisch untersuchten Analyten Zytostatika - Eigenschaften Zytostatika - Struktur Endokrin disruptive Chemikalien - Eigenschaften Endokrin disruptive Chemikalien - Struktur Aufbau und Inbetriebnahme von Testsystem und Pilotanlage Komponenten des Testsystems und der Pilotanlage Lösungsmittelreservoir, Pumpe, Entgaser Injektionseinheit Vorheizkapillare und Fittings HPLC-Säule Heizsystem Beheizung mit einem GC-Ofen Beheizung mit einem Röhrenofen Kühlung Detektion Gegendruckregulator Steuerung und Auswertung Inbetriebnahme des Testsystems Überprüfung der Dichtigkeit Realisierung von Aufheiz- und Abkühlphasen mit einem GC-Ofen Inbetriebnahme der Pilotanlage Elutionsverhalten von Zytostatika mit subkritischem Wasser Auswahl der Säule Spezifikation und Kenndaten der ausgewählten Säule Verwendete Reagenzien Bestimmung von Retentionsfaktoren Bestimmung der Übergangsenthalpie durch einen van t Hoff-Plot Trennung eines 4-Komponentengemisches Zusammenfassung und Diskussion Untersuchungen der Temperaturstabilität ausgewählter HPLC-Säulen Methodenentwicklung zum Test von HPLC-Säulen bei hohen Temperaturen.. 69

9 6.2 Untersuchung der Temperaturstabilität einer C-18-modifizierten Silikagelphase Spezifikation und Kenndaten der Trennsäule Bestimmung des Testgemisches Bestimmung der Retentionsfaktoren in Abhängigkeit der Heizzeit Bestimmung des Gesamtsystemdrucks Untersuchung der Temperaturstabilität einer mit Polybutadien (PBD) beschichteten Phase auf Zirkoniumdioxidbasis Spezifikation und Kenndaten der Trennsäule Bestimmung des Testgemisches Bestimmung der Retentionsfaktoren in Abhängigkeit der Heizzeit Bestimmung des Gesamtsystemdrucks Untersuchung der Temperaturstabilität einer Phase aus grafitisiertem Kohlenstoff Spezifikation und Kenndaten der Trennsäule Bestimmung des Testgemisches Bestimmung der Retentionsfaktoren in Abhängigkeit der Heizzeit Bestimmung des Gesamtsystemdrucks Zusammenfassung Elutionsverhalten endokrin disruptiver Chemikalien mit subkritischem Wasser Auswahl der Säule Verwendete Reagenzien Bestimmung von Retentionsfaktoren Einfluss der mobilen Phase auf die Selektivität einer 6-Komponenten- Mischung Diskussion Konstruktive Aspekte eines speziellen Heizsystems Temperierung der Bauteile Temperierung der Bauteile vor dem Injektor Temperierung des Injektors Temperierung der Vorheizkapillaren Temperierung der Trennsäule Temperierung der Zuleitungskapillaren zum Detektor Definition der Zielparameter Aufbau und Dimensionierung des Heizsystems Maximale Heiztemperatur Maximale Flussrate...102

10 8.2.4 Diskussion und Bewertung der definierten Zielparameter Heiztemperatur und Flussrate Maximale Kapillarlänge zwischen Injektor und Detektor Abkühlung des Eluenten Generierung von Temperaturgradienten Umsetzung der Zielparameter Wärmeübertragung durch Luft Wärmeübertragung durch eine Flüssigkeit Wärmeübertragung durch einen Festkörper Entwicklung der Prinzipskizzen Heizsystem mit Flüssigkeitstemperierung Heizsystem mit indirekter Temperierung Vorteile und Nachteile der beschriebenen Heizsysteme Experimentelle Bestimmung der Temperatur von flüssigem Wasser in einer dünnen Edelstahlkapillaren Temperaturbestimmung außerhalb der Kapillaren Temperaturbestimmung innerhalb der Kapillaren Temperaturbestimmung bei konstanter Flussrate Bestimmung der Temperaturdifferenz zwischen Block- und Wassertemperatur Experimentelle Bestimmung der Temperatur von flüssigem Wasser in einer HPLC-Säule Zusammenfassung und Ausblick Anhang Verwendete Geräte für Methodenentwicklung Analytische HPLC-Anlage - Testsystem Analytische HPLC-Anlage - Pilotanlage Heizsystem für Testsystem - GC-Ofen, Sichromat 1, Siemens Heizsystem für Pilotanlage - Rohrofen mit Temperaturregler Verwendete Geräte für Temperaturmessungen Abkürzungsverzeichnis Literatur

11 1 Einleitung 1 1 EINLEITUNG Die Geburtsstunde der modernen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie liegt mehr als 100 Jahre zurück. Am 8. März 1903 hielt M. S. Tswett, damals Mitarbeiter an der Warschauer Universität, während der Zusammenkunft der Biologischen Abteilung der Warschauer Gesellschaft für Naturwissenschaften einen Vortrag mit dem Titel Eine neue Kategorie von Adsorptionsphänomenen und ihre Anwendung auf die biochemische Analyse. In diesem Vortrag diskutierte er die von ihm in den zurückliegenden Jahren durchgeführten Untersuchungen von Blattfarbstoffen. Diese Experimente führten zu der Entwicklung einer speziellen Adsorptionstechnik, die die Auftrennung der Blattfarbstoffe gestattete. In den folgenden Jahren verfeinerte er diese Technik, die schließlich unter dem Namen Chromatographie bekannt wurde. Die klassische Säulenchromatografie wurde zur qualitativen und quantitativen Analyse von Gemischen und auch zur präparativen Auftrennung eingesetzt. Die Strömung der mobilen Phase durch die Säulenpackung wurde durch die Schwerkraft bewirkt und gelegentlich durch hydrostatischen Druck beschleunigt. Wegen der großen Partikel, die einen Durchmesser von 100 µm aufwiesen, war die mit diesen Systemen erzielte Trennleistung allerdings sehr gering. In den frühen sechziger Jahren des 20. Jahrhunderts erlebte die Säulenchromatografie mit flüssiger mobiler Phase eine Renaissance, als eine Hand voll Wissenschaftler die Möglichkeiten erkundeten, die der klassischen Säulenchromatografie innewohnende Langsamkeit zu überwinden. Aber erst die Entwicklung reproduzierbar gefüllter Trennsäulen, die aus Teilchen mit einem Durchmesser von 5 µm bestehen, sowie eines immer leistungsfähigeren und speziellen Instrumentariums von Pumpen, Detektoren und automatischen Probenaufgabesystemen haben die Bedeutung der Flüssigkeitschromatografie beträchtlich gesteigert. Seit diesem Zeitpunkt spielen flüssigchromatografische Trennverfahren in den Bereichen Lebensmittel-, Umweltanalytik und medizinische Analytik, in der Qualitätskontrolle sowie bei der präparativen Trennung komplexer Substanzgemische eine herausragende Rolle und sind nicht mehr aus dem Routinealltag analytischer Laboratorien wegzudenken. Durch die Einführung der massenselektiven Detektion in der Hochdruckflüssigchromatografie hat dieses analytische Verfahren in den letzten Jahren noch einmal erheblich an Leistungsfähigkeit und Bedeutung gewonnen. Es ist dadurch zur am weitesten verbreiteten Technik in der instrumentellen Analytik und einem wichtigen Instrument in der Herstellung,

12 1 Einleitung 2 Reinigung und Charakterisierung von Feinchemikalien, Pharmazeutika und insbesondere Produkten der Biotechnologie geworden. Obwohl bislang eine scharfe Trennlinie zwischen den verschiedenen chromatografischen Techniken wie Flüssigchromatografie, Gaschromatografie und überkritischer Fluidchromatografie sowohl unter theoretischen als auch gerätetechnischen Aspekten gezogen wird, weisen die genannten Verfahren viele Gemeinsamkeiten auf. Ein Ansatz, der besonders in den letzten Jahren in der Flüssigchromatografie wieder verstärkt diskutiert wird, ist der Einfluss erhöhter Temperatur auf den chromatografischen Prozess. In diesem Zusammenhang wird häufig von einer subkritischen mobilen Phase gesprochen. Unter einer subkritischen mobilen Phase wird dabei eine über ihren normalen Siedepunkt hinaus erhitzte Flüssigkeit verstanden, wobei in Abgrenzung zu einem superkritischen Fluid die Temperatur dieser Flüssigkeit unterhalb der kritischen Temperatur liegt. Die Anwendung dieser Technik eröffnet neue Potenziale auf dem Gebiet der Flüssigchromatografie, die in der vorliegenden Arbeit näher untersucht werden sollen.

13 2 Problemstellung Ziel der Arbeit 3 2 PROBLEMSTELLUNG ZIEL DER ARBEIT Die traditionelle Form der Flüssigchromatografie bedient sich polarer stationärer Phasen wie z. B. reines Silikagel oder Aluminiumoxid und unpolarer mobiler Phasen wie z. B. Kohlenwasserstoffe. Diese Art der Flüssigchromatografie ist auch unter dem Namen Normalphasen-Chromatografie (normal-phase liquid-chromatography, NP-LC) bekannt. Die Normalphasen-Chromatografie hat allerdings in den letzten Jahrzehnten ihre ursprüngliche Bedeutung verloren und wurde dabei von der Umkehrphasen- Chromatografie (reversed-phase liquid-chromatography, RP-LC) weitestgehend ersetzt. In der Umkehrphasen-Chromatografie werden im Gegensatz zur Normalphasen- Chromatografie unpolare stationäre Phasen in Verbindung mit polaren, organischwässrigen mobilen Phasen verwendet. Die große Beliebtheit der RP-LC gegenüber der NP-LC ist dabei der Tatsache zuzuschreiben, dass die Änderung der Zusammensetzung der mobilen Phase ohne Probleme möglich ist und die Äquilibrierungszeit der Säule nach einem Lösungsmittelgradienten relativ kurz ist. Die der NP- bzw. RP-LC zugrunde liegenden Retentionsmechanismen sind bis heute nicht völlig verstanden. Es konnte gezeigt werden, dass die Retention der Analyten in der NP- LC eher durch einen Adsorptionsprozess charakterisiert werden kann, während die Retention in der RP-LC durch einen Verteilungsprozess erklärt werden kann [1,2]. Die Anforderungen an ein in der RP-LC Verwendung findendes Elutionsmittel sind breit gefächert. Ein ideales Elutionsmittel sollte ionische, polare und unpolare Verbindungen gleichermaßen solvatisieren können. Es sollte eine geringe Viskosität und hohe Diffusionsrate besitzen und die Fähigkeit aufweisen, die Elutionsstärke der mobilen Phase zu verändern, wobei die Detektion der Analyten nicht beeinträchtigt werden darf. Außerdem sollte es in hoher und definierter Reinheit preiswert zu beziehen sein. Es sollte nicht entflammbar oder toxisch sein [2,3,4]. Die meisten in Frage kommenden Lösungsmittel können nicht alle genannten Kriterien erfüllen. Acetonitril oder Methanol werden diesen Anforderungen in vielen Punkten nicht gerecht, spielen aber als organische Modifier in der klassischen RP-LC aufgrund ihrer Fähigkeit, selbst völlig unpolare Analyten zu eluieren, eine große Rolle. Wasser dagegen zeichnet sich in besonderem Maße durch seine Umweltverträglichkeit aus, gilt aber unter Normalbedingungen als das schwächste Lösungsmittel in der RP-LC. Wegen der ausgeprägten Assoziation der Wassermoleküle über Wasserstoffbrückenbindungen (WBB) ist Wasser unter Normalbedingungen für die Elution unpolarer Verbindungen wie z. B. Polyzyklische Aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) auf einer

14 2 Problemstellung Ziel der Arbeit 4 Umkehrphase nicht geeignet. Es stellt daher während der flüssigchromatografischen Methodenoptimierung die inerte Grundkomponente dar, dessen Funktion lediglich in der Verdünnung des aktiven organischen Modifiers besteht. Die Temperaturabhängigkeit einiger wichtiger physikalisch-chemischer Eigenschaften des Wassers wie z. B. der Dielektrizitätskonstanten ist jedoch einer der Hauptgründe, warum eine signifikante Reduzierung des Anteils an organischem Modifier in der mobilen Phase möglich ist [5-17]. [5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17] Die Einsparung organischer Lösungsmittel ist dabei nicht der einzige Vorteil, der sich aus der Anwendung erhöhter Temperatur ergibt. Weitere Vorzüge wie eine erniedrigte Viskosität des Lösungsmittels, ein erhöhter Massenaustausch, ein geringerer Gesamtsystemdruck und die Möglichkeit, höhere Flussraten anzuwenden, müssen zusätzlich berücksichtigt werden. Der Effekt erhöhter Eluententemperatur auf die Effizienz einer chromatografischen Trennung wurde bereits in den siebziger Jahren von Engelhardt diskutiert, der die Vorteile von temperaturprogrammierten Verfahren in der LC beschreibt [18]. Obwohl die genannten Vorzüge erhöhter Temperaturen in der LC also seit langem bekannt sind, hat eine breite Methodenentwicklung, die den Parameter Temperatur aktiv einbezieht, bis heute nicht stattgefunden. Zum Einen scheiterte dies am Fehlen geeigneter temperaturstabiler Säulenmaterialien, zum Anderen gibt es bislang keine technischen Gerätekomponenten, die ein präzises Beheizen der Säule und des Eluenten ermöglichen. So konnte Barka zeigen, dass einige der zur Zeit erhältlichen kommerziellen Säulenöfen den Eluenten in der Trennsäule nicht auf die am Gerät eingestellte Temperatur aufheizen [19]. Dies und die Tatsache, dass nur wenige Daten bezüglich der Temperaturstabilität kommerziell erhältlicher Trennmaterialien veröffentlicht wurden, begründen die Abneigung der mit der HPLC vertrauten Anwender, die Temperatur als Parameter zur Optimierung gegebener Trennprobleme in die Methodenentwicklung zu integrieren. Ziel dieser Arbeit ist es, anhand eines dem aktuellen Forschungsstand entsprechenden Testsystems eine allgemeine Methodenentwicklung einer Mischung mehrerer Zytostatika unter Anwendung subkritischer wässriger mobiler Phasen zu realisieren. Anhand der in der Arbeitsgruppe bereits durchgeführten Methodenentwicklung zur flüssigchromatografischen Trennung von Zytostatika unter herkömmlichen Bedingungen soll ein Vergleich und eine Diskussion beider Verfahren angestellt werden. Des weiteren soll, aufbauend auf den Erkenntnissen, die mit dem Testsystem gewonnen werden, eine Pilotanlage installiert werden, die sich vom Testsystem hauptsächlich durch das Heizsystem unterscheidet. Auf der Pilotanlage sollen dann Stabilitätstests kommer-

15 2 Problemstellung Ziel der Arbeit 5 ziell erhältlicher und für die Hochtemperatur-Flüssigchromatografie (high-temperature liquid-chromatography, HT-LC) geeignet erscheinender Trennphasen durchgeführt werden. Die auszuwählenden Materialien sollen sich dabei grundlegend durch die Art des Aufbaus der stationären Phase voneinander unterscheiden. Anhand 26 ausgewählter Verbindungen aus der Gruppe der endokrin disruptiven Chemikalien (EDC) soll untersucht werden, in welchem Umfang eine Einsparung teurer organischer Lösungsmittel in der RP-LC zu erwarten ist. Zwar ist bekannt, dass der organische Anteil in der mobilen Phase verringert werden kann, eine genaue Bezifferung des Einsparpotenzials erfolgt jedoch nicht. In den meisten Studien wird lediglich betont, dass eine Elution der verwendeten Analyten mit reinem subkritischen Wasser durchgeführt werden konnte. Die Experimente in dieser Arbeit sollen außerdem den Einfluss der erhöhten Temperatur auf die Stabilität der Analyten klären. Es soll ein kritischer Vergleich mit den bislang zu diesem Thema veröffentlichten Studien angestellt werden. Abschließend soll aufbauend auf den Ergebnissen der vorangegangenen Experimente ein Konzept zur Entwicklung eines speziell für hohe Temperaturen ausgelegten Heizsystems ausgearbeitet werden, das ein präzises und reproduzierbares Aufheizen des in die Säule einströmenden Eluenten sowie der Trennsäule selbst erlaubt. Das Heizsystem soll so ausgelegt sein, dass auch Temperaturgradienten realisiert werden können.

16 3 Theoretische Grundlagen 6 3 THEORETISCHE GRUNDLAGEN 3.1 Temperaturabhängigkeit wichtiger physikalisch-chemischer Größen von flüssigem Wasser Temperaturabhängigkeit der Dielektrizitätskonstanten Wird zwischen die Platten eines Kondensators ein Isolator, der auch als Dielektrikum bezeichnet wird, eingebracht, so ändert sich die Kapazität des Kondensators. Bewirkt wird diese Änderung durch die Polarisation des Dielektrikums. Dabei wird zwischen Orientierungspolarisation und Verschiebungspolarisation unterschieden. Besteht ein Dielektrikum aus Molekülen mit einem permanenten Dipolmoment, so sind diese Dipole normalerweise völlig zufällig orientiert. Das elektrische Feld des Kondensators übt jedoch auf die Dipole ein Drehmoment aus, das die Dipolachsen parallel zu den Feldlinien ausrichtet (Orientierungspolarisation). In welchem Maße sich die Dipole ausrichten, hängt von der Feldstärke des elektrischen Feldes, dem Druck und der Temperatur ab. Während sich im Inneren des Dielektrikums alle Dipolmomente kompensieren, entstehen an den Oberflächen des Dielektrikums Ladungen entgegengesetzten Vorzeichens. Diese Oberflächenladungen erzeugen ein elektrisches Feld, das dem äußeren Feld entgegengerichtet ist und es deshalb schwächt. Der konstante Faktor, um den sich die Kapazität des Kondensators erhöht, wird Dielektrizitätskonstante (DK) ε genannt. Meistens wird die auf die DK des Vakuums ε0 bezogene relative Dielektrizitätskonstante εr, auch Dielektrizitäts- oder Permittivitätszahl genannt, angegeben. Es handelt sich bei εr demzufolge um eine dimensionslose und stoffspezifische Größe. Tabelle 3.1 gibt u. a. einen Überblick über die Dielektrizitätszahlen von in der Flüssigchromatografie häufig eingesetzten Lösungsmitteln bei einer Temperatur von 20 C [4]. Da in allen aufgelisteten Fällen εr > 1 ist, wird das Potenzial gegenüber dem Wert im Vakuum verringert. In manchen Lösungsmitteln, insbesondere in Wasser, ist dieser Effekt ganz erheblich ausgeprägt. Das ist einer der Gründe, warum Wasser ein hervorragendes Lösungsmittel für polare und ionische Verbindungen ist: Die Coulomb- Wechselwirkungen werden so stark herabgesetzt, dass nur noch eine schwache Wechselwirkung zwischen den Ionen übrig bleibt und eine Kristallbildung nicht mehr erfolgt.

17 3 Theoretische Grundlagen 7 Tabelle 3.1: Dielektrizitätszahl, Siedepunkt und Viskosität einiger in der HPLC verwendeter Lösungsmittel. Die Werte für die Dielektrizitätszahl und Viskosität beziehen sich auf eine Temperatur von 20 C. Lösungsmittel Dielektrizitätszahl Siedepunkt [ C] Viskosität [µpa. s] n-pentan 1,8 36,1 230 n-hexan 1,9 68,7 310 Toluol 2,3 110,6 590 Diisopropylether 4,0 68,5 330 Diethylether 4,3 34,6 240 Ethylacetat 6,4 77,1 450 Tetrahydrofuran 7,6 66,0 550 Pyridin 12,4 115,3 983 n-butanol 17,8 117, Isopropanol 18,6 82, Aceton 21,5 56,3 360 Ethanol 25,3 78, Methanol 32,4 64,7 550 Dimethylformamid 36,7 153,0 920 Acetonitril 37,5 81,6 370 Dimethylsulfoxid 46,7 189, Wasser 80,2 100,0 1000

18 3 Theoretische Grundlagen 8 Die Dielektrizitätszahl von flüssigem Wasser weist bei 20 C einen Wert von 80,2 auf. Dieser recht hohe Wert verglichen mit einem εr von 32,4 für reines Methanol und von 37,5 für reines Acetonitril erklärt, warum reines Wasser unter Normalbedingungen in der RP-LC ein schlechtes Elutionsmittel für unpolare und mäßig polare Analyten darstellt. Die Polarität von Wasser bei Raumtemperatur ist zu hoch, um diese Analyten auf einer Umkehrphase mit vernünftigen k-werten zu eluieren. Abbildung 3.1 zeigt die Temperaturabhängigkeit der Dielektrizitätszahl von flüssigem Wasser im Temperaturbereich von 0,01 C bis 370 C [20]. Die relative Dielektrizitätskonstante bei Sättigungsdruck wurde dabei nach Formel 3.1 berechnet, wobei t die Temperatur in C ist und a bis d Konstanten sind mit a = 8, , b = -3, , c = 8, und d = -9, : 2 3 ε = a + b t + c t + d t (3.1) Dielektrizitätszahl Temperatur [ C] Abbildung 3.1: Temperaturabhängigkeit der Dielektrizitätszahl von flüssigem Wasser bei Sättigungsdampfdruck im Temperaturbereich von 0,01 bis 370 C. Die Tatsache, dass die relative DK von Wasser bei 200 C einen Wert von 34,6 erreicht, der in etwa dem von Methanol bei Raumtemperatur entspricht, verdeutlicht, dass dieser Effekt für die Umkehrphasen-Chromatografie prinzipiell nutzbar ist. Ebenso besteht eine Druckabhängigkeit der relativen DK von Wasser [21]. So bewirkt eine stetige Druckzunahme bei konstanter Temperatur eine Zunahme der DK. Dieser Effekt ist jedoch erst ab Temperaturen über 300 C stärker ausgeprägt.

19 3 Theoretische Grundlagen Temperaturabhängigkeit des Sättigungsdampfdrucks Die Flüssigchromatografie unterscheidet sich von der Gaschromatografie u. a. dadurch, dass die verwendete mobile Phase im flüssigen Aggregatzustand vorliegt. Die Siedetemperatur von reinem flüssigen Wasser beträgt unter Normalbedingungen 100 C. Der extrem hohe Siedepunkt des Wassers ist wie die meisten anderen Eigenschaften auch der ausgeprägten Assoziation der Wassermoleküle untereinander durch Wasserstoffbrückenbindungen zuzuschreiben. Verglichen mit den Siedepunkten der Hydride der Kohlenstoffgruppe liegt der Siedepunkt des Wassers um etwa 150 K über dem extrapolierten Siedepunkt der übrigen Hydride der Chalkogene. Die Siedetemperaturen einiger in der LC gebräuchlicher Lösungsmittel können der Tabelle 3.1 entnommen werden. Eine Flüssigkeit beginnt zu sieden, wenn der Dampfdruck der Flüssigkeit dem äußeren Druck entspricht. Um Wasser auch bei Temperaturen über 100 C im System flüssig zu halten, muss ein Gegendruck angelegt werden, der größer als der Sättigungsdampfdruck ist. Abbildung 3.2 zeigt die Temperaturabhängigkeit des Sättigungsdampfdrucks von reinem Wasser bei Temperaturen von 0,01 C bis 370 C []. Druck [bar] Temperatur [ C] Abbildung 3.2: Temperaturabhängigkeit des Sättigungsdampfdrucks von flüssigem Wasser im Temperaturbereich von 0,01 bis 370 C. Der Sättigungsdampfdruck wurde nach Formel 3.2 berechnet [20], wobei T die Temperatur in K, pr der reduzierte Druck und A bis F Konstanten sind mit A = 7, , B = 1, , C = -11, , D = 22, , E = -15, und F = 1, :

20 3 Theoretische Grundlagen 10 ln 7,5 [ ] 1,5 3 3,5 4 ( p ) ( 1T ) A ( 1 T ) + B ( 1 T ) + C ( 1 T ) + D ( 1 T ) + E ( 1 T ) + F ( 1 T ) r = (3.2) r r r r r r r Wie aus Abbildung 3.2 ersichtlich ist, erfolgt erst bei Temperaturen über 200 C ein starkes Ansteigen des Sättigungsdampfdrucks, bei 200 C beträgt dieser 15,5 bar Temperaturabhängigkeit der Viskosität Die Viskosität ist ein Maß für die Fließfähigkeit einer Flüssigkeit. Je größer die Viskosität ist, umso weniger beweglich ist die Flüssigkeit. Die Viskosität von Wasser bei 20 C ist, verglichen mit anderen in der LC eingesetzten Lösungsmitteln, relativ groß (siehe hierzu Tabelle 3.1). Auch dieser Effekt lässt sich durch die starke Bindung der Wassermoleküle durch Wasserstoffbrückenbindungen erklären, was eine verminderte Beweglichkeit der einzelnen Wassermoleküle innerhalb der Flüssigkeit zur Folge hat. Eine Temperaturzunahme bewirkt eine starke Abnahme der Viskosität. Während die dynamische Viskosität bei 20 C und Sättigungsdruck 1002 µpa s beträgt, fällt dieser Wert bei 200 C auf 134 µpa s ab. Abbildung 3.3 zeigt die Temperaturabhängigkeit der Viskosität im Temperaturintervall von 0,01 C bis 370 C []. Viskosität [µpa s] Temperatur [ C] Abbildung 3.3: Temperaturabhängigkeit der Viskosität von flüssigem Wasser bei Sättigungsdruck im Temperaturbereich von 0, C

21 3 Theoretische Grundlagen 11 Die dynamische Viskosität bei Sättigungsdruck wurde nach den Formeln 3.3 und 3.4 be- rechnet [20]: η log = η20 2 [( 20 t) ( t + e) ] [ a + b ( 20 t) + c ( 20 t) + d ( 20 t) ] 3 (3.3) sowie η = A T + B T + C T + D T + E T + F T (3.4) In Gleichung 3.3 sind t die Temperatur in C, η die Viskosität in µpa. s, η20 die Viskosität bei 20 C und a bis e Konstanten mit a = 1,5867, b = 1, , c = 3, , d = 3, , e = 1, In Gleichung 3.4 ist T die Temperatur in K und A bis F sind Konstanten mit A = 1, , B = -1, , C = 1, , D = -6, , E = 1, , F = -1, Formel 3.3 gilt im Temperaturintervall von 0 bis 40 C, Formel 3.4 im Temperaturintervall von 40 C bis zum kritischen Punkt bei 374,2 C. 3.2 Einfluss der Temperatur auf den chromatografischen Prozess Temperaturabhängigkeit des Diffusionskoeffizienten Der Diffusionskoeffizient DM der Analyten in der mobilen Phase ist in der Flüssigchromatografie signifikant kleiner als in der Gaschromatografie. Dies ist ein Nachteil, weil der Diffusionskoeffizient der wichtigste Faktor ist, der die Analysengeschwindigkeit bestimmt. Formel 3.5 ist der in der Literatur am häufigsten verwendete Ansatz zur Abschätzung von DM. Diese Formel ist als Wilke-Chang-Gleichung bekannt [22]: D M = 7, Ψ V M 2 2 0,6 1 η T (3.5) Hierbei ist T die Temperatur in K, M2 die Molmasse des Lösungsmittels, V1 das Molvolu- Ψ2 ist der Assoziationsfaktor des Lösungsmittels. men des Analyten und η die Viskosität. Für nicht assoziierte Lösungsmittel ist Ψ2 = 1, für Methanol 1,9 und für Wasser 2,6.

22 3 Theoretische Grundlagen 12 Der Diffusionskoeffizient ist somit direkt proportional zur Temperatur und umgekehrt proportional zur ebenfalls temperaturabhängigen Viskosität. Eine Temperaturzunahme bewirkt deshalb in doppelter Hinsicht eine Beschleunigung der Diffusion der in der mobilen Phase gelösten Analyten Temperaturabhängigkeit der van Deemter-Gleichung Die van Deemter-Gleichung beschreibt auf konzeptionell einfache Weise die Abhängigkeit der theoretischen Bodenhöhe H von der linearen Fließgeschwindigkeit u. Hierbei wird angenommen, dass sich der Wert der theoretischen Bodenhöhe H aus drei unterschiedlichen und voneinander unabhängigen Faktoren zusammensetzt []: B H = A + + Cu (3.6) u Temperaturabhängigkeit des Eddy-Diffusionskoeffizienten Der Eddy-Diffusionskoeffizient hängt nur von der Größe und Verteilung des Packungsmaterials der stationären Phase in der Säule ab und ist sowohl von der Fließgeschwindigkeit als auch von der Temperatur der mobilen Phase unabhängig. Der Koeffizient A ist der Eddy-Diffusion zugeordnet, der B-Term wird als Longitudinaldiffusionskoeffizient bezeichnet und der C-Term beinhaltet die reversiblen Massenaus- Phase und tauschphänomene, d. h. den Übergang des Analyten von der mobilen in die stationäre umgekehrt Temperaturabhängigkeit des Longitudinaldiffusionskoeffizienten Der Longitudinaldiffusionskoeffizient beschreibt die Diffusion der Analyten in axialer Richtung der mobilen Phase. Eine niedrigere Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase hat notwendigerweise eine längere Verweildauer der Analyten in der Trennsäule zur Folge. Dies bedeutet, dass die Bandenverbreiterung der Analyten durch Diffusion bei kleineren Fließgeschwindigkeiten stärker ausgeprägt ist als für den Fall einer höheren Fließge-

23 3 Theoretische Grundlagen 13 schwindigkeit. Die Definition des B-Terms leitet sich von der Einstein-Gleichung der Diffusion ab (Formel 3.7): B = 2γD M (3.7) Hierbei ist DM der bereits erwähnte Diffusionskoeffizient des Analyten in der mobilen Phase und γ ein Proportionalitätsfaktor, dessen Wert zwischen 0,5 und 1 liegt. Eine Temperaturerhöhung bewirkt, dass die longitudinale Diffusion beschleunigt wird und sich somit ungünstig auf die Bandenverbreiterung auswirkt. Dieser Effekt kann aber durch eine höhere Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase kompensiert werden Temperaturabhängigkeit des Massenaustauschs Generell können in der Flüssigchromatografie drei wichtige Massenaustauschphänomene unterschieden werden: Zunächst erfolgt der Transport des Analyten von der strömenden mobilen Phase an das Trägermaterial der stationären Phase. Im zweiten Schritt kann der Analyt von dort durch die in den Poren der stationären Phase befindliche stagnierende mobile Phase an die interne Oberfläche der stationären Phase gelangen. Anschließend erfolgt die direkte Wechselwirkung mit der stationären Phase. Eine allgemeine Form des Massenaustauschkoeffizienten C zeigt die folgende Proportionalitätsbeziehung (Formel 3.8), in der der Parameter d die Schichtdicke charakterisiert, über der der Massenaustausch stattfindet: 2 d C (3.8) D M Da eine inverse Proportionalität des Massenaustauschkoeffizienten C zum Diffusionskoeffizienten besteht, bedeutet eine Temperaturerhöhung eine Erniedrigung des Massenaustauschkoeffizienten. Ein kleinerer Wert für den Koeffizienten C schlägt sich deshalb e- benfalls in einer kleineren theoretischen Bodenhöhe H nieder.

24 3 Theoretische Grundlagen Temperaturabhängigkeit des Retentionsfaktors Der Retentionsfaktor k ist das Verhältnis der Aufenthaltszeit eines Analyten in der mobilen Phase zur Aufenthaltszeit in der stationären Phase. Um Retentionsfaktoren berechnen zu können, muss zunächst die Totzeit t0 für die verwendete Säule bekannt sein. Die Tot- ist die Retentionszeit einer Substanz, die mit der stationären Phase nicht in Wechsel- zeit wirkung tritt, und zwar unabhängig von der Zusammensetzung der mobilen Phase. Ist die Totzeit bekannt, so kann der Retentionsfaktor k berechnet werden, indem die Retentionszeiten t der Analyten gemessen werden. Der Retentionsfaktor berechnet sich dann nach Formel 3.9: r k t r 0 = (3.9) t 0 t Für Gleichung 3.9 lassen sich äquivalente Darstellungen finden, wenn unter isokratischen Bedingungen gearbeitet wird (Formel 3.10): k t = r t t 0 0 t = t s m = N N s m c = c s m V V s m (3.10) Hierbei bezeichnet Ns die Anzahl aller Moleküle, die sich zu einer bestimmten Zeit in oder auf der stationären Phase befinden, und Nm analog die Anzahl der Moleküle, die sich zu einer bestimmten Zeit in der mobilen Phase aufhalten. In der Verteilungschromatografie besteht ein Zusammenhang zwischen der Anzahl der Moleküle mit ihrer Konzentration cs und cm sowie dem Volumen von stationärer und mobiler Phase Vs und Vm. Der Quotient V = V s β (3.11) m wird auch Phasenverhältnis genannt, wobei Vs das Volumen der stationären Phase und Vm das Volumen der mobilen Phase darstellt.

25 3 Theoretische Grundlagen 15 Der Quotient c s K = (3.12) c m ist als Verteilungskoeffizient bekannt. Demzufolge ist der Retentionsfaktor das Produkt aus Phasenverhältnis und Verteilungskoeffizient (Formel 3.13): k = β K (3.13) Die Beziehung zwischen der Gleichgewichtskonstanten K und der freien Standard-Gibbs- Energiedifferenz ist gegeben durch: 0 G = RT ln K (3.14) Der Logarithmus von k ist daher eine Funktion der Freien Energie (Formel 3.15): G H S ln k = + ln β = + + ln β (3.15) RT RT R Gleichung 3.15 bildet die Grundlage für die Erklärung der Temperaturabhängigkeit der Retention. Dabei sind H 0 und S 0 die Übergangsenthalpie bzw. -entropie des Analyten von der mobilen in die stationäre Phase, R die Gaskonstante und T die absolute Temperatur. Anhand dieser Gleichung können Übergangsenthalpien berechnet werden, wenn in einer Versuchsreihe die Abhängigkeit von k von der Temperatur bestimmt wird. Ist ln k eine Funktion von 1/T und nicht von H 0, so wird für das betrachtete Temperaturintervall eine Gerade erhalten, aus deren Steigung H0 berechnet werden kann. Analog dazu kann S 0 aus dem Achsenabschnitt ermittelt werden, wenn das Phasenverhältnis der Säubekannt le ist.

26 3 Theoretische Grundlagen Potenziale der Hochtemperatur-Flüssigchromatografie Die Entwicklung temperaturstabiler stationärer Phasen stand bzw. steht nicht primär im Mittelpunkt der Forschung, wenn es um immer neue Modifikationen alt bewährter Pa- Schwerpunkt dieser Aktivitäten liegt vielmehr in der Entwick- ckungsmaterialien geht. Der lung ph-beständiger Phasen. Die ph-stabilität stationärer Phasen ist insbesondere bei Substanzen, deren Retention stark vom ph-wert abhängig ist, von großem Nutzen. Die ph-stabilität ist darüber hinaus von Vorteil, wenn eine mit stark retardierenden Verbindungen kontaminierte Säule mit Säure regeneriert bzw. mit Base sterilisiert werden kann. Da die ph-stabilität der untersuchten Packungsmaterialien nicht im Vordergrund der Arbeit steht, wird an dieser Stelle nicht weiter auf die sich hieraus ergebenden Vorteile eingegangen. Die Anwendung erhöhter Temperatur in der Flüssigchromatografie bietet eine Vielzahl von Vorteilen. Einzige Voraussetzung dafür ist eine im entsprechenden Temperaturinter- hinreichend stabile stationäre Phase. Apparative Aspekte spielen demgegenüber vall eine weitaus geringere Rolle, da herkömmliche in der HPLC zur Routineanalytik eingesetzte Geräte verwendet werden können. Abbildung 3.4 gibt einen schematischen Über- über die Potenziale der Hochtemperatur-Flüssigchromatografie, die im Folgenden blick näher erläutert werden. Phasenstabilität ph-stabilität Temperaturstabilität ph < 1 ph > 13 Geringerer Druckabfall Einsparung von organischem Lösemittel Thermische Optimierung (Selektivität) Reinigung mit Säure Ionenunterdrückung für Säuren Ionenunterdrückung für Amine Reinigung mit Base Geringerer Verschleiß Höherer Fluss Schnellere Analyse Robustere Analyse Leichtere Methodenentwicklung Abbildung 3.4: Schematische Darstellung der sich aus der Phasenstabilität der Trennsäule ergebenden Vorteile für die Hochtemperatur-Flüssigchromatografie.

27 3 Theoretische Grundlagen Niedriger Gesamtdruck Ein hoher Gegendruck ist nicht das primäre Ziel der HPLC, auch wenn sich die Abkürzung HP ursprünglich auf die Bedeutung High-Pressure bezog. Hohe Drücke sind deshalb unvermeidlich, weil die mobile Phase eine Flüssigkeit mit relativ hoher Viskosität ist, die durch eine dichte Packung kleiner Teilchen durchgepresst werden muss. Kleine Partikel mit einem Durchmesser von 5 bzw. 3 µm werden deshalb gegenüber größeren bevorzugt, weil Erstere kurze Diffusionswege haben. Eine Temperaturerhöhung bewirkt eine stetige Abnahme der Lösungsmittelviskosität. Dies gilt nicht nur für Wasser, sondern auch für die reinen Komponenten anderer organischer Lösungsmittel sowie für Lösungsmittelgemische. Eine Verminderung der Lösungsmittelviskosität infolge einer Temperaturerhöhung führt dazu, dass bei gleicher Flussrate der mobilen Phase ein geringerer Gegendruck entsteht, was die Lebensdauer von Verschleißteilen, insbesondere von Pumpen und Ventilen, aber auch der Säule selbst erhöht. Darüber hinaus ist es möglich, aufgrund eines geringeren Gesamtsystemdrucks höhere Flussraten einzustellen, um somit die Analysenzeit für ein gegebenes Trennproblem zu reduzieren und den Probendurchsatz zu erhöhen Einsparung organischer Lösungsmittel Aufgrund der Temperaturabhängigkeit der Dielektrizitätszahl von Wasser und der damit einhergehenden Abnahme der Lösungsmittelpolarität ist es möglich, organische Lösungsmittel einzusparen. Substanzen, die unter Normalbedingungen, insbesondere bei Raumtemperatur, nicht mit Wasser auf einer Umkehrphase eluiert werden können, lassen sich bei höherer Temperatur unter Verwendung rein wässriger mobiler Phasen eluieren [8,14]. Die Verwendung von reinem Wasser als Elutionsmittel bzw. die Reduzierung des organischen Anteils in der mobilen Phase bietet darüber hinaus eine Reihe von Vorteilen, auf die in Kapitel 3.4 noch ausführlich eingegangen wird Thermische Optimierung Die Retentionsfaktoren insbesondere ionischer bzw. ionisierbarer Substanzen sind stark temperaturabhängig. Aus diesem Grund ist es ratsam, die Säule zu thermostatisieren, auch wenn nicht explizit bei erhöhter Temperatur gearbeitet werden soll. Auf diese Wei- in nicht klimatisierten se wird erreicht, dass die Retentionsfaktoren nicht durch eine zufällige Änderung der Umgebungstemperatur beeinflusst werden. Gerade Laborräumen

28 3 Theoretische Grundlagen 18 kann die Extremtemperatur durchaus um bis zu 10 C von der durchschnittlichen Raum- durchgeführt, die einer automatischen temperatur abweichen. Werden Routineanalysen Auswertung unterworfen werden, so kann es passieren, dass die zu bestimmenden Substanzen deshalb nicht detektiert werden, weil diese aufgrund der Retentionszeitverschiebung aus dem fest definierten Retentionszeitfenster herausfallen. Die Tatsache, dass die erhöhte Temperatur einen starken Effekt auf die Retentionsfaktoren ionischer bzw. ionisierbarer Substanzen ausübt, kann deshalb genutzt werden, um die Selektivität einer chromatografischen Trennung zu verändern. 3.4 Bewertender Vergleich der Eigenschaften idealer und realer mobiler Phasen in der Umkehrphasen-Chromatografie In diesem Abschnitt werden die Eigenschaften einer idealen mobilen Phase für die Umkehrphasen-Chromatografie mit den Eigenschaften von realen mobilen Phasen verglichen. Reale mobile Phasen setzen sich in der Regel aus zwei Lösungsmitteln mit unter- Solvatationseigenschaften zusammen. In den meisten Fällen bildet reines schiedlichen bzw. gepuffertes Wasser die Basiskomponente. Durch das Hinzufügen eines organischen Modifiers können dann die Elutionseigenschaften der mobilen Phase gezielt verändert werden. Als organische Modifier kommen in der RP-LC hauptsächlich Acetonitril und Me- ihrer Zusammensetzung thanol in Frage, Tetrahydrofuran spielt aufgrund seiner chemischen Instabilität und Reaktivität eine weitaus geringere Rolle []. Aus diesem Grund werden nur die Modifier Acetonitril, Methanol und subkritisches Wasser mit den Eigenschaften einer idealen mobilen Phase verglichen. Um Missverständnissen entgegenzuwirken wird darauf hingewiesen, dass beim Vergleich der aufgeführten Elutionsmittel davon ausgegangen wird, dass sich die Eigenschaften von realen mobilen Phasen im Wesentlichen durch die Veränderung verändern lassen. Dies setzt voraus, dass nicht von festen Mischungsverhältnissen besteden aufgeführten Modifiern ausgegangen hend aus der Grundkomponente Wasser und wird, sondern dass durch die Gradiententechnik eine schrittweise Veränderung der Eigenschaften der mobilen Phase möglich wird. Für die Lösungsmittel Acetonitril und Me- thanol wird daher unter Gradientenelution die Veränderung der Zusammensetzung der mobilen Phase durch eine Änderung des Anteils an organischem Modifier zur Grundkomponente, nämlich reinem bzw. gepuffertem Wasser, unter Normalbedingungen verstanden. Für subkritisches Wasser ist unter Gradientenelution in diesem Fall die Veränderung der Temperatur im Bereich von 100 C bis zum kritischen Punkt bei 374,2 C und einem

29 3 Theoretische Grundlagen 19 korrespondierenden Druck von 214,8 bar im Vergleich zu reinem bzw. gepuffertem Wasser bei Raumtemperatur gemeint. Die Bewertung der Eigenschaften realer mobiler Phasen bezogen auf die Eigenschaften idealer mobiler Phasen erfolgt anhand einer dreistufigen Skala. Ein + bedeutet, dass die Eigenschaften der realen mobilen Phase mit den Eigenschaften einer idealen mobilen Phase vollständig übereinstimmen. Eine 0 bedeutet, dass die genannte Forderung nur partiell erfüllt wird, wohingegen ein - bedeutet, dass die Forderung nicht erfüllt wird. Tabelle 3.2: Bewertender Vergleich der Eigenschaften realer mobiler Phasen aus Acetonitril-Wasser, Me- thanol-wasser und subkritischem Wasser mit einer idealen mobilen Phase. Eigenschaften einer idealen mobilen Phase ACN MeOH H2Osub Solvatation ionischer, polarer und unpolarer Substanzen Änderung der Elutionsstärke durch Variation von % B Niedrige Viskosität Keine Störungen bezüglich Detektion Hoher Reinheitsgrad Nicht brennbar Nicht toxisch Umweltfreundlich Preiswert Solvatation ionischer, polarer und unpolarer Substanzen Die Voraussetzung für die Durchführung einer flüssigchromatografischen Analyse besteht in der Solvatation der Analyten in der mobilen Phase. Eine ideale mobile Phase sollte in der Lage sein, sowohl ionische und polare als auch unpolare Analyten gleichermaßen zu solvatisieren. Subkritisches Wasser besitzt aufgrund seiner weiterhin ausgeprägten Fähigkeit zur Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen die Eigenschaft, ionische und polare Verbindungen zu hydratisieren. Darüber hinaus nimmt auch die Löslichkeit

30 3 Theoretische Grundlagen 20 unpolarer Substanzen im Bereich um den kritischen Punkt stark zu []. Die Löslichkeit von Benzo(a)pyren steigt auf 10 wt % bei 350 C an, was einer 25-millionenfachen Zunah- zurückzuführen, dass sich der theoretisch mögliche Arbeitsbereich einer rein wässrigen me gegenüber der Löslichkeit unter Normalbedingungen entspricht []. Neuere Studien zeigen, dass eine Zunahme der Löslichkeit von 10 4 bis 10 5 bei einer Temperaturzunahme von 20 C auf 300 C für PCB [23,24], PAK [25] und andere umweltgefährdende Stoffe [26-32] typisch ist. [26,27,28,29,30,31,32] Die Tatsache, dass subkritisches Wasser in der Bewertung nur eine 0 erhält, ist darauf subkritischen mobilen Phase nicht über den gesamten subkritischen Bereich bis hin zum kritischen Punkt nutzen lässt. Zum Einen ist Wasser bei Temperaturen um den kritischen Punkt chemisch aggressiver als bei Temperaturen unter 200 C [33-36], zum Anderen beträgt der Dampfdruck nahe dem kritischen Punkt bei 370 C bereits 210 bar, vergli- mit 15 bar bei 200 C, was somit der Forderung nach einem möglichst geringen Gesamtsystemdruck widerspricht. [33,34,35,36] chen Demgegenüber ist eine aus Acetonitril bzw. Methanol bestehende mobile Phase in der Lage, auch völlig unpolare Verbindungen wie z. B. PAK zu solvatisieren. Die Löslichkeit ionischer Verbindungen, insbesondere von Puffersalzen, ist in diesen Lösungsmitteln allerd ings eingeschränkt. Aus diesem Grund darf der Gehalt an organischem Modifier nicht bis auf 100% erhöht werden, da in der mobilen Phase befindliche Puffersalze auskristallisieren und zu einer irreversiblen Schädigung der Trennsäule und anderer Gerätekomponenten führen können Änderung der Elutionsstärke durch Variation von % B Wasser ist bei fast allen RP-Trennungen die Grundkomponente, die zur Optimierung des Retentionsverhaltens der zu untersuchenden Analyten mit einem definierten Prozentsatz an organischem Modifier (% B) versetzt wird. Auf diese Weise ist es möglich, die Elutionsstärke der mobilen Phase zu beeinflussen. Reines Wasser stellt aufgrund der ausgeprägten Fähigkeit, Wasserstoffbrückenbindungen zu bilden, in der RP-Chromatografie das schwächste Lösungsmittel dar. Die einzige Möglichkeit, die Elutionsstärke von Wasser ohne den Zusatz organischer Modifier oder Puffersalze zu verändern besteht deshalb in der Temperaturerhöhung, die eine Abnahme der relativen DK zur Folge hat und die Polarität des Wassers verringert. Da in Tabelle 3.2 die Eigenschaften einer idealen mobilen Phase mit denen einer realen Phase aus subkritischem Wasser verglichen werden, bezieht sich die Angabe % B - wie bereits erwähnt - nicht auf den Zusatz eines or-

31 3 Theoretische Grundlagen 21 ganischen Modifiers, sondern auf die Temperatur als zu verändernden Parameter, wohingegen bei Acetonitril und Methanol davon ausgegangen wird, dass reines Wasser die Grundkomponente darstellt, die durch schrittweise Erhöhung des Gehalts an organischem Modifier verdünnt wird. Die Angabe % B bezieht sich für die Lösungsmittel Acetonitril und Methanol deshalb auf den Prozentsatz dieser Lösungsmittel in der mobilen Phase. Die Bewertung + für Acetonitril gibt an, dass eine Zunahme des Acetonitrilgehalts eine sehr gute Wirkung auf die Änderung der Elutionsstärke der mobilen Phase hat, während die Bewertung 0 für Methanol und subkritisches Wasser bedeutet, dass eine Änderung der Elutionsstärke durch eine Zunahme des Methanolgehalts bzw. durch eine Temperaturerhöhung eingeschränkt ist. Da sowohl Wasser und Methanol als auch Wasser und Acetonitril miteinander in jedem Verhältnis mischbar sind, kann der Anteil des organischen Modifiers bei der Gradientenelution in der RP-Chromatografie von 0% auf 100% erhöht werden, ohne dass es zur Ausbildung getrennter Phasen kommt. Aus diesem Grund ist es unter Anwendung der Gradiententechnik möglich, auch völlig unpolare Substanzen mit den genannten organischen Modifiern zu eluieren. Verglichen mit subkritischem Wasser ergeben sich für die klassische Gradiententechnik bessere Möglichkeiten, die Elutionsstärke der mobilen Phase über einen weiten Bereich zu verändern Viskosität Eine geringe Viskosität der mobilen Phase ist aus mehreren Gründen anzustreben. Zum Einen wird die chromatografische Effizienz durch eine Viskositätszunahme herabgesetzt [2,], zum Anderen zieht eine hohe Lösungsmittelviskosität auch einen entsprechend hohen Gegendruck nach sich. Eine Gradientenelution mit Acetonitril als organischem Modifier ist in den meisten Fällen relativ unproblematisch, da das zu durchlaufende Viskositätsmaximum der Acetonitril-Wasser-Mischung nur etwa 20% über der Viskosität von reinem Wasser liegt. Im Gegensatz hierzu erweisen sich Methanol-Wasser-Gradienten in den meisten Fällen als größeres praktisches Problem, da die Viskosität einer 45:55 Methanol- Wasser-Mischung bei 20 C etwa 1,8 Mal größer ist als die von reinem Wasser unter Normalbedingungen []. Dieser Effekt wirkt sich umso stärker aus, je länger die Säule ist und je kleiner die Partikel der stationären Phase sind. Die größten Probleme bei Anwendung der Gradientenelution treten immer dann auf, wenn hochviskose Lösungsmittel benutzt werden. Dies ist einer der Gründe, warum hauptsächlich Acetonitril-Wasser- Mischungen in der RP-Chromatografie verwendet werden, wenn Gradientenelution an-