ALCALIGENES EUTROPHUS CH34, EIN SCHWERMETALLRESISTENTES WASSERSTOFFBAKTERIUM

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1 ALCALIGENES EUTROPHUS CH34, EIN SCHWERMETALLRESISTENTES WASSERSTOFFBAKTERIUM Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fachbereiche der Georg-August-Universität zu Göttingen vorgelegt von Dietrich Nies aus Göttingen ÜB INNSBRUCK Göttingen 1985

2 Die Experimente zu dieser Arbeit wurden am Institut für Mikrobiologie der Universität Göttingen durchgeführt. Teile der Untersuchungen wurden mit Mitteln der Deutschen Forschungsgemeinschaft gefördert. D 7 Referent: Prof. Dr. H. G. Schlegel Korreferent: Prof. Dr. G. Gottschalk Tag der mündlichen Prüfung: 19. April 1985

3 Meinen Eltern und allen,- denen ich diesen Weg zu verdanken habe

4

5 Grobgliederung Einleitung Material und Methoden 4-39 Materialien (4) Physiologie (4) Enzymologie (14) Klassische Genetik (27) Molekulargenetik (32) Sonstige Methoden (39) Neue Affinitätsgele für die Reinigung der Schiüsselenzyrae des autotrophen Stoffwechsels Einleitung (40) Ergebnisse (40) Diskussion (45) Zusammenfassung (49) Schnellisolierung von Plasmid-DNA Einleitung (50) Ergebnisse (50) Diskussion (51) Zusammenfassung (53) Helfertransformation Einleitung (54 Ergebnisse (54 Diskussion (58 Zusammenfassung (61) 1 " ^u " " 3 53 " 61 Die Schwermetallresistenz von CH34 " 18 ' Einleitung (62) Ergebnisse (63) Diskussion (155) Charakterisierung des autotrophen Wachstums von CH Einleitung (188) Ergebnisse (189) Diskussion (259) Zusammenfassung ab 296 Literatur 62

6 Inhaltsverzeichnis EINLEITUNG MATERIAL UND METHODEN I) Materialien A) Bakterienstämme und deren Plasmide B) Chemikalien C) Enzyme II) Physiologie A) Stammhaltung B) Reinheitskontrollen C) Medien 1) Luria-Broth (LB) 2) Nutrient Broth (NB) 3) Schlegel-Gottschalk-Kaltwasser-Medium (SGK) 4) TRIS-Medium 5) Induktionsmedium 6) Zusätze a) Agar b) Schwermetalle c) Antibiotika d) Supplemente 7) Fermentermedien 8) Physiologische Puffer D) Anzuchten 1) Autotrophe Kultivierung a) Platten und geringvolumige Flüssigkulturen b) Flüssigkulturen im 100 ml-maßstab c) Wachstumsversuche d) Massenanzuchten 2) Massenanzuchten im Induktionsmedium 3) Ernte und Aufbewahrung der Zeilen III) Enzymologie A) Zellaufschluß 1) French-Presse 2) Ultraschall B) Ultrazentrifugation C) Säulenchromatographie mit Triazinfarbstoffen 1) Verwendete Farbstoffe 2) Kopplungsprozedur a) H-Farbstoffe b) MX-Farbstoffe D) Enzymtests 1) Laktat-Dehydrogenase 2) Katalase 3) Superoxid-Dismutase 4) Lösliche Hydrogenase 5) Partikuläre Hydrogenase 6) Ribulosebisphosphat-Carboxylase 7) Phosphoribulokinase a) Optischer Test b) Radiometrischer Test E) Proteinbestimmung

7 II III F) Enzymreinigungen 20 1) Lösliche Hydrogenase 20 2) Partikuläre Hydrogenase 21 3) CFX-Enzyme 22 G) Bestimmung des Molekulargewichts von Enzymen 23 1) Eichung der Sephacel S-300 Säule 23 2) Eichung von SDS-Gelen 23 3) Zentrifugation im lienearen Saccharosedichtegradienten 23 H) Bestimmung des isoelektrischen Punktes 24 I) Polyacrylamidgel-Elektrophoresen (PAGE) 24 1} Native PAGE 24 2) SDS-Gele 25 3) Färbungen 25 a) Unspezifische Proteinfärbungen 25 b) Aktivitätsfärbung für Hydrogenasen 26 0) Kinetik der löslichen Hydrogenase 27 IV) Klassische Genetik 27 A) Mutagenisierungen 27 1) Curingmethoden 27 a) Curing-Durchgang 1 27 b) Curing 2 28 c) Curing ) Erzeugung und Charakterisierung Aut-negativer Mutanten 28 a) Auslösung 28 i) Nitrit 28 ii) Ethylmethansulfonat (EMS) 29 iii) N-Methyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidin (NMG) 29 b) Selktion %l i) Prozedur 1 %l ii) Prozedur 2 f iii) Prozedur 3 t? c) Mutantencharakterisierung <* d) Reversionsanalyse ~, 3) Tn5-Mutagenese ~ 4) Genaustausch i. B) Transformation il c) Helfertransformation ii DJ Konjugationen 32 1) Plattenmating Z~ 2) Picktnating V) Molekulargenetik 33 A) Plasmidanalyse,, 1) Lyse II 2) Normalgele il 3) Minigele 34 B) Plasmidpräparation i 1) Hydroxylapatitmethode c 2) Eigene Methode il a) Reinigung von Plasmiden,, b) Isolierung der Gesamt-DNA C) Restriktionsanalysen, fi 1) Verdauung mit Restriktionsendonucleasen 2) Restriktionsgele

8 IV 3) Konzentrationsabschätzung 37 D) Dephosphorylierung 38 E) Ligierung 38 VI) Sonstige Methoden 39 A) Elektronenmikroskopie 39 B) Versuchsauswertung 39 C) Textbearbeitung 39 NEUE AFFINITÄTSGELE FÜR DIE REINIGUNG DER SCHLÜSSELENZYME DES AUTOTROPHEN STOFFWECHSELS 40 I) Einleitung 40 II) Ergebnisse A) Die drei löslichen Enzyme 40 1) Die lösliche Hydrogenase 41 2) Die COp-fixierenden Enzyme. 42 B) Die partikuläre Hydrogenase 43 III) Diskussion ' 45 IV) Zusammenfassung 49 SCHNELLISOLIERUNG VON PLASMID-DNA 50 I) Einleitung 50 II) Ergebnisse 50 III) Diskussion 51 IV) Zusammenfassung 53 HELFERTRANSFORMATION 54 I) Einleitung 54 II) Ergebnisse 54 III) Diskussion 58 IV) Zusammenfassung 61 DIE SCHWERMETALLRESISTENZ VON CH34 62 I) Einleitung. 62 II) Ergebnisse 63 A) Plasmidfreie Mutanten von CH34 63 B) Elektronenoptische Molekulargewichtsbestimmung der CH34-Plasmide 68 C) Restriktionsmuster der Plasmide aus CH34-Mutanten 71 1) Zuordnung der EcoRI-Fragmente zu pm0l28 und pm0l ) Nomenklatur der Fragmente 71 D) Tn5-Mutagenese 71 1) Zielsetzung 71 40

9 2) Vorversuche 73 3) Theoretischer Hintergrund 75 4) Ergebnisse 77 E) Die Resistenzgene von pmol ) Restriktionsmuster der Plasmide aus Defektmutanten 80 a) EcoRI-Muster der Plasmide aus 3BA'' und 15BA 1 80 b) EcoRI-Analyse von DNTM8 83 c) Analyse mit BamHI und Hindlll 85 d) Zusammenfassung 87 2) Klonierung und Kartierung von ae8::tn5mob 88 a) Klonierung 88 b) Kartierung von pdntm8a+b 89 c) Genaustausch mit pdntm8 93 3) Klonierung von ae8: Die primären Hybridplasmide 100 a) Klonierung 100 b) Kartierung der primären Hybridplasmide 107. c) Haelll-Analyse 113 d) Zusammenfassung und Analyse 119 4) Umklonierung von ae8 in prk290: Die sekundären Hybride 123 a) Klonierung mittels Helfertransformation 123 b) Physiologie der DN-Klone 123 c) Kartierung der sekundären Hybridplasmide 131 5) Transfer von pdn705 in andere Bakterien ) Zusammenfassung und Hypothese. 143 F) Die Resistenzgene von pm0l ) Restriktionsanalyse von Plasmiden aus Mutanten 145 a) Deletionsmutanten '45 b) Transposonmutanten ]48 2) Klonierung der Nickelresistenz 15 1 III) Diskussion ]55 A) Die Schwermetalle Kobalt, Cadmium, Zink und Nickel 155 1) Zink 155 2) Cadmium ) Kobalt und Nickel 1 f 4) Vergleich der vier Metalle '57 B) Die Aufnahme der Metalle in die Ze-lle 157 C) Die physiologische Wirkung '* D) Die toxische Wirkung ] 3 1) Allgemeine Bemerkungen ] J 2) Cadmium \\% 3) Zink 67 4) Kobalt \% 5) Nickel und Kobalt ] 6) Nickel 1 7) Zusammenfassung ] = E) Entgiftüngsmechanismen }? 1) Detoxifikation außerhalb der Zelle yv a) Maßnahmen der Zelle \' u b) Schutz durch Umweltbedingungen 'Jy 2) Verminderung der Aufnahme \'l 3) Entgiftung innerhalb der Zelle ''* 4) Effluxmechanismen '' 5) Andere Mechanismen 6) Mögliche Resistenzmechanismen für CH34 F) Genetik

10 VI CHARAKTERISIERUNG DES AUTOTROPHEN WACHSTUMS VON CH I) Einleitung 188 II) Ergebnisse 189 A) Physiologie 189 1) Der Wasserstoffeffekt 189 2) Wachstum auf verschiedenen Kohlenstoffquellen 196 3) Autotrophes Wachstum bei 37 C 199 4) Heterotrophe Induktion der Schlüsselenzyme für das autotrophe Wachstum 201 B) Enzymologie 204 1) Die lösliche Hydrogenase 204 a) Anreicherung der löslichen Hydrogenase aus CH b) Eigenschaften der löslichen Hydrogenase 211 c) Kinetische Untersuchungen 211 i) Untersuchungen an der reduzierten löslichen Hydrogenase 215 ii) Kinetik der oxidierten löslichen Hydrogenase 234 iii) Übergangsexperimente 236 iv) Hypothese und Modell 237 2) Anreicherung und Charakterisierung der partikulären Hydrogenase aus CH ) Versuche mit den CO,-fixierenden Enzymen aus CH L C) Genetik 251 1) Die autotrophen Fähigkeiten plasmidfreier Mutanten von CH ) Aut-negative Mutanten 253 3) Konjugationsexperimente 255 III) Diskussion 259 A) Hydrogenasen 259 B) Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylasen 281 C) Phosphoribulokinasen 284 D) Genetik und Regulation 285 ZUSAMMENFASSUNG 292 LITERATUR 296

11 VII Abkürzungen ADP Adenosinmonophosphat AGE Agarosegelelektrophorese Atnp Ampici Hin AMP Adenosinmonophosphat ATCC American Type Culture Collection ATP Adenosintriphosphat camp Cyclisches Adenosinmonophosphat CFX- C0 2 -fixierend(e) Cm Chroramphenicol CTAB Cety1tr imethy1ammon i umbrom i d DEAE Diethylaminoethyl DNAse Desoxyribonuclease DSM Deutsche Sammlung für Mikroorganismen E Extinktion EDTA Ethylendiaminotetraacetat EMS Ethylmethansulfonat FAD Flavin-adenin-dinucleotid FMN Flavinmononucleotid Glc Glucose Glo Gluconat Km Kanamycin LB Luria-Broth MB Methylenblau MG Molekulargewicht NADCP](H) NikotinamidadenindinucleotidCphosphat], (reduziert) NB Nutrient Broth NG Feuchtgewicht NMG N-methyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidin OD Optische Dichte pl Isoelektrischer Punkt PAGE Polyacrylamidgel-Elektrophorese PAS Protaminsulfat PHB Poly-3-hydroxybutanoat RNAse Ribonuclease SDS Natriumdodecylsulfat SGK Schlegel-Gottschalk-Kaltwasser-Mineralmedium SL Spurenelementlösung TCA Trichloressigsäure Tc Tetracyclin TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin TG Trockengewicht TRIS Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan ü überstand UE Untereinheit Upm Umdrehungen pro Minute

12 VIII Weitere Abkürzungen: a) Drei große Buchstaben kürzen einen Enzymnamen ab: CAX Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase HOP Partikuläre Hydrogenase HOS Lösliche Hydrogenase PRK Phosphoribulokinase b) Ein großer Buchstabe gefolgt von ein oder zwei kleinen und eventuell einem weiteren großen Buchstaben an der letzten Position kürzen einen Phänotyp ab. Beispiele (s.tabelle 3, Seite 10): Prk", Nic +. c) Drei kleine Buchstaben, eventuell gefolgt von einem vierten, großen Buchstaben, kürzen einen Genotyp ab. Beispiel: nie

13 Le.bzn an ilch lit zln e./ike.nntn.ligzuij.nne.nde.'i PA.oze/3 (Konrad Lorenz) Einleitung Ein System wird als "lebendig" bezeichnet, wenn es die drei Merkmale Stoffwechsel, Reduplikation und Mutation aufweist (Kaplan, 1975). Die Mutation ist Voraussetzung für die Evolution des Lebens, für die Darwin (Darwin, 1872) die grundlegende Theorie aufgestellt hat. Lange Zeit glaubte man, daß Evolution und Reduplikation als ordnungsschaffende Prozesse gegen den 2. Hauptsatz der Thermodynamik verstoßen, demzufolge niemals ein geordneter Zustand spontan aus einem ungeordneten hervorgehen kann. Erst Eigen (Eigen, 1971) raubte der "vis vitae" diesen letzten Zufluchtsort,- indem er zeigte, daß der Ordnungsgewinn des von der Umwelt abgegrenzten Systems Zelle durch ein Mehrfaches an OrdnungsVerlust der Umgebung erkauft werden muß. Ein lebendes System muß also ein korapartimentiertes Areal darstellen; der Stoffwechsel baut innere Ordnung auf Kosten der Außenwelt auf. Es ist nur ein kleiner Schritt von einem System, welches seine Ordnung lediglich erhält, zu demjenigen, welches seine innere Ordnung erhöht. Da Ordnung nur auf Ordnung fußen kann, führt dies zur Reduplikation des Systems. Und wiederum können bei der Reduplikation mehr- oder mindergeordnete Tochtersysteme resultieren; auf diese Heise folgt aus der Struktur des Lebens auch seine Fähigkeit zur Evolution. Die belebte und unbelebte Außenwelt läßt nur dem besseren der beiden Tochtersysteme die Chance, sich zu replizieren. Dieses besser angepaßte System ist das, welches dem Selektionsdruck der Umwelt den geringsten Widerstand entgegen-

14 setzt. Auf diese Weise bildet ein Organismus den Selektionsdruck im Verlauf seiner Evolution in sich ab, sammelt also Erkenntnis über seine Umwelt. Leben hat somit eine historische Dimension; diese kann dem Biologen eine tiefere Einsicht in den Prozeß "Leben" verschaffen. Das in dieser Arbeit untersuchte Bakterium, Alcaligenes eutrophus CH34, ist ein schwermetallresistentes Wasserstoffbakterium, besitzt also 2 interessante Merkmale. Isoliert wurde CH34 aus einem Zinkdekantationstank (Mergeay et al., 1978). Dieser Standort erklärt auch die Schwermetallresistenz gegenüber den Salzen von Zink, Cadmium, Kobalt und Nickel. Der Organismus, mit dem CH34 in dieser Arbeit oft verglichen werden wird und dem der Stamm morphologisch gleicht, ist das aerobe Wasserstoffbakterium Alcaligenes eutrophus H16. Für H16 wurden bereits die 4 Schlüsselenzyme für das autotrophe Wachstum isoliert und charakterisiert: Die lösliche, NAD-reduzierende (Schneider und Schlegel ) und die membrangebundene Hydrogenase (Schink und Schlegel, 1979), die D-Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase (Bowien et al., 1976) und die Phosphoribulokinase (Siebert et al., 1981). CH34 besitzt diese vier Enzyme ebenfalls. Außerdem wurde gezeigt, daß die Fähigkeit zum autotrophen Wachstum bei H16 von der Existenz des Megaplasmides phg1 abhängt (Andersen et al ; Friedrich et al ). Einzelne Genfunktionen konnten diesem Plasmid schon zugeordnet werden (Bogrefe et al., 1984). Wenn H16 schon so gut untersucht ist, warum dann Experimente mit CH34? Einmal können Probleme, die mit einem Organismus schwer oder gar nicht lösbar sind, sich bei einem anderen Organismus elegant auflösen. So erzielte Schneider (Schneider et al., 1984) mit der löslichen Hydrogenase aus Nocardia opaca 1b Ergebnisse, die in dieser Form bei dem H16-Enzym undenkbar waren, letztendlich aber zu einem Strukturmodell für alle löslichen Hydrogenasen führte. Zweitens läßt sich durch Vergleich verwandter Systeme etwas

15 über den Ahn dieser Systeme aussagen, wobei mit "System" sowohl ein Organismus als auch ein Enzym gemeint ist. Aus den Unterschieden zwischen den einzelnen Systemen untereinander und im Vergleich zum Ahn lassen sich aber die Wege erhellen, die diese Systeme gegangen sind; ihre historische Dimension wird zugänglich. Und was sollen dann Untersuchungen über die Schwermetallresistenz bei einem Wasserstoffbakterium? Diese Resistenzen sind nicht nur für sich genommen interessant, sie könnten auch aus drei Gründen Nutzen für Fragestellungen auf dem Gebiet der Autotrophie bringen: Erstens ist das autotrophe Wachstum eine komplizierte Angelegenheit, an der viele Gene mit ihren Produkten beteiligt sind, die Schwermetallresistenz vermutlich nicht. Dadurch bieten die Resistenzgene Studienobjekte, an denen man viel über die Genetik bei einem neuen Organismus lernen kann. Zweitens sind die Resistenzen gute Merkmale für alle Arten von genetischen Übertragungen. Drittens könnte speziell die Untersuchung der Nickelresistenz von CH34 zu Erkenntnissen über den Nickelstoffwechsel bei einem aeroben Wasserstoffbakterium führen. Die abwechselnde Betrachtung von Schwermetallresistenz und Autotrophie von CH34 erbrachte dann auch gute Hinweise für das jeweils andere Gebiet. Trotzdem werden die Experimente in dieser Arbeit nicht chronologisch geschildert, sondern nach den beiden Gebieten geordnet. Da viele Methoden, die bei der Arbeit mit H16 angewendet worden waren. bei CH34 nicht anwendbar oder in ihrer Komplexität unnötig waren, mußten neue Methoden entwickelt werden. Den beiden Hauptteilen dieser Arbeit über die Schwermetallresistenz und die Autotrophie von. CH34 gehen daher drei kleinere Kapitel voran. Das erste Kapitel schildert die Einführung neuer Triazinfarbstoffe für die Anreicherung der 4 Schlüsselenzyme des autotrophen Wachstums von CH34, das zweite die Entwicklung einer neuen Methode zur Plasmidreinigung, das dritte Kapitel schließlich widmet sich einem neuen Verfahren, um genetische Information in ein weites Spektrum Gram-negativer Bakterien zu bringen.

16 Material und Methoden I) MATERIALIEN A) Bakterienstämme und deren Plasmide Tabelle 1 faßt die Bakterienstämme zusammen, mit denen gearbeitet wurde. Tabelle 2 und 3 ergänzen sie, Tabelle 2 führt nochmals gesondert alle Plasmide auf, Tabelle 3 erklärt die Genotypen aus Tabelle 1. Drei der aufgelisteten Stämme wurden bereits in einer Veröffentlichung (Mergeay et al., 1985) beschrieben, jedoch unter anderen Bezeichnungen: HG2 als AE104, 3B als AE126 und M04 als AE128. B) Chemikalien La- Falls nicht anders vermerkt, wurden die handelsüblichen borchemikalien der Firma Merck, Darmstadt, benutzt. C) Enzyme Falls nicht anders vermerkt, wurden die Präparate der Boehringer, Mannheim, benutzt. Firma II)PHYSIOLOGIE A)Stammhaltung Alcaligenes-Stämme wurden auf NB gehalten, Escherichia coli- Stämme auf LB. Plasmidhaltige E.coli-Derivate wurden einem Selektionsdruck ausgesetzt, der einem Merkmal auf ihrem Plasmid entsprach. Die DNTM-Stämme wurden auf NB mit Kanamycin (1000 ug/ml) gehalten. Alle Stämme wurden im Monatsrythmus überimpft, um immer frisches Ausgangsmaterial zur Verfügung zu haben. Bis auf die Stämme der Genbänke wurden alle Stämme außerdem lyophilisiert und bei -70 C aufbewahrt.

17 Tabelle 1a) Wildstämme Stamm Bezeichnung/Quelle M.catige.nej> ewtitophat, CH34 M.caLlgznu e.utiophu6 H16 KtcatLgznu eiwiophwi N9A M.catLge.nte euxuophui JMP134 M.catige.nu hyda.og&nophmu BdchfUiichia coti K12 P6eudomonai iacjxu, Aqu.at>püüJLlum aatofiopklcum UivtocycZai aquaticua RenohacteM. vacuolatum SA32 Mergeay et al., 1978 ATCC17699, DSM428 DSM518 Don u. Pemberton, 1981 Ohi et al., 1979 ATCC23716, DSM498 ATCC11228, DSM649 DSM732 ATCC25396, DSM101 Nikitin, 1971 B) Reinheitskontrollen Versuche mit CH34 wurden durch Ausstrich auf NB auf Kontami- "ationsfreiheit kontrolliert. Bei wichtigen Versuchen oder Zweifelsfällen wurde noch auf folgende Tests zurückgegriffen, die je nach Problemstellung einzeln oder kombiniert eingesetzt wurden: Wachstum auf TRIS-Gluconat-Medium mit einem der vier Schwermetalle, autotrophes Wachstum, Unvermögen, auf Glucose oder Fruktose zu wachsen. l Medien 1) Luria-Broth (LB) pro 1 1 demineralisiertes Wasser: 10 g NaCl 5 g Hefeextrakt (Difco) 10 g Trypton (Difco) NaOH ad ph 7.5

18 2J_ Nutrient Broth (NB) pro 1 1 demineralisiertes Wasser: 8 g Nutrient Broth (Difco) 3) Schlegel-Gottschalk-Kaltwasser-Medium (SGK) (Schlegel et al., 1961 ) pro 1 1 demineralisiertes Wasser: 9.0 g Na 2 HPO 4 X 12H 2 O 1.5g KH 2 PO 4 1.5g NaHC g NH 4 C1 0.2 g MgSO 4 x 7H 2 O 0.02 g CaCl 2 x 2H 2 O 1.2 mg Eisen-ammonium-Citrat (12% Eisen) 0.1 ml SL6 10-fach nach Pfennig (1974) ph _)_ TRIS-Medium (Mergeay et al., 1985), ad 1 1 destilliertes Wasser: 6.06 g TRIS-HC1 ph g NaCl 1.49 g KC g NH 4 C g Na 2 SO g MgCl 2 x 6H 2 O 0.03 g CaCl 2 x 2H 2 O 1.2 mg Eisen-Ammonium-Citrat (12% Eisen) 0.23 g Na 2 HPO 4 X 12H 2 O 0.1 ml SL6 10-fach nach Pfennig (1974) 5) Induktionsmedium SGK mit folgenden Änderungen: 150 ug/1 Endkonzentration an ZnSO 4 x 7H 2 O statt 10 ug/1 45 ug/1 MnCl 2 x 4H 2 O statt 3 ug/1 21 ug/1 Na 2 Mo0 4 x 2H 2 O statt 3 ug/1 36 mg/1 Eisen-Ammonium-Citrat statt 1.2 rag/l 3 g/l NH 4 C1 statt 1 g/l Kohlenstoffquellen: 0.3% Glycerol (87%) und 0.9% Na-Gluconat.

19 Tabelle 1c) SichoMchia coll-stämme Stamm SK1592 S17/1 HB (RP4) CM214(pULB113) = MXR(pULB113) M15 Quelle Bolivar u. Backman, 1979 Simon et al., 1983a Bolivar u. Backman, 1979 Oohn Beringer, U.K. Lejeüne et al., 1983 Rüther et al., 1981 Merkmale thi, gal, hsdr4, enda", sbc15, T1' pro, thi, +RP4-tra-Funktionen hsd20 (r~ mk"), rela13, arah, proa2, lacy1, galk2, rpsl20 (Sm r ), xyl5, mth, supe44, X~ leu, thi F", lac, pro, thia, reca, gale, pulb113 A[ lac pro ], thi, $80, lacz", M15, ara, stra, reca Tabelle 2: Plasmid PSUP202 PSUP5011 PRK290 PULB113 RP4 pjp4 PBR322 Plasmide Resistenzen Tc +, Ap +, Cm + Km +, Ap +, Cm + Tc + Tc +, Ap +, Km + Tc +, Ap +, Km + Hg + Tc +, Ap + Quelle Simon et al., 1983a Simon et al., 1983b Ditta et al., 1980 Lejeune et al., 1983 John Beringer, U.K. Don u. Pemberton,1981 Bolivar et al., ) Zusätze a) Agar: 15 g/l routinemäßig 20 g/l für schwermetallhaltige TRIS-Medien b) Schwermetalle Von den Chloriden der vier Schwermetalle (ZnCl2, coci 2, NiCl CdCl 2 ) wurden sterile, 1 M Stammlösungen angesetzt.

20 10 Tabelle 3: Definition der Phänotypen für die CH34-Mutanten Phänotyp AutR" Cad" Cax" CobA" CobB" Glo" Hop" Hos" Nal + Nie" Nir + Km + Prk" Str + Zin" Xyz (-) Erklärung Sehr langsames autotrophes Wachstum und zugleich Hop Kein Wachstum nach 3d auf 1mM CdCl 2 Glo-TRIS-Medium Keine Carboxylase nach Anzucht im Induktionsmedium Kein Wachstum nach 3d auf 1mM CoClg Glo-TRIS-Medium Kein Wachstum nach 3d auf 5mM CoCl 2 Glo-TRIS-Medium Kein Wachstum auf Gluconat-Mineralmedien Keine part. Hydrogenase n. Anz. im Induktionsmedium Keine lösl. Hydrogenase n. Anz. im Induktionsmedium Resistent gegenüber 50ug/ml Nalidixinsäure Kein Wachstum nach 3d auf 1mM NiCl 2 Glo-TRIS-Medium Chromosomale Mutation, die Nic + vorspiegelt Resistent gegenüber 1000ug/ml Kanamycin in NB Keine Kinase nach Anzucht im Induktionsmedium Resistent gegenüber 150ug/ml Streptomycin Kein Wachstum nach 3d auf 2.5mM ZnCl 2 Glo-TRIS-Medium Wachstum erfolgte leaky Die gewünschte Menge wurde vor dem Plattengießen dem flüssigen Medium steril zugegeben. Tabelle 4 informiert über die verwendeten Konzentrationen. Die Auswertung von schwermetallhaltigen Platten erfolgte nach 3- bis 5-tägiger Inkubation bei 30 C. o) Antibiotika nach (Maniatis et al., 1982) Tetrazyklin: Stammlösung 12.5 mg/ml in 1:1 Ethanol:Wasser, Endkonzentration bei allen Stämmen 12.5 ug/ml. Kanamycin: wurde dem flüssigen Medium steril als Substanz zugegeben. Für E.coli wurden 50 ug/ml eingesetzt, für CH34 1 mg/ml.

21 11 Tabelle 4: Schwermetallkonzentrationen beim Plattentest Metallverbindung CdCl 2 CoCl, NiCl 2 ZnCl 2 Glo-TRIS-Medium 1.0 mm 5.0 mm 1.0 mm mm 2.5 mm NB 2.0 mm 2.0 mm mm 5.0 mm * Selektion auf Phänotyp CobB + Selektion auf Phänotyp CobA Chloramphenicol: Stammlösung 34 mg/ml in 96JS Ethanol. Für E^ coli betrug die Endkonzentration 34 ug/ml, bei CH ug/ml, hier wurde jedoch das feste Antibiotikum dem flüssigen Medium steril zugesetzt. Streptomycin: Stammlösung 20 mg/ml sterilfiltriert in Wasser. 25 ug/ml für E.coli, 150 ug/ml wurden für CH34 verwendet. Nalidixinsäure: Für CH34 wurden 50 ug/ml dem Medium steril vor dem Plattengießen zugesetzt. Ampicillin: Nur für E.coli verwendet, 50 ug/ml wurden als feste Substanz dem Medium steril zugesetzt. d) Supplemente Die verwendeten Supplemente sind in Tabelle 5 aufgeführt. 7) Fermentermedien Fermentermedien enthielten als Zusatz 2 ml/8 1 Polypropylenglykol P200, 20% in 96% Ethanol.

22 12 Tabelle 5: Supplemante Substanz Adenin Alanin Aminobenzoesäure,p Anthranilsäure Arginin Aspartat Biotin Cystein Cytosin Folsäure Glutaraat Glycin Guanin Histidin Homoserin Hypoxanthin Indol Isoleucin Leucin Lysin Methionin Nikotinsäure Ornithin Pantothensäure Phenylalanin Prolin Pyridoxin Riboflavin Serin Thiamin Threonin Thymin Tryptophan Tyrosin Uridin Valin D SA SF SE L Endkonz., ug/ml Max.Lösl., mg/ml g.i s.l g.l.in Ethanol g.l g.l. g.l Direkte Zugabe vor dem Autoklavieren Stammlösung, autoklavlerbar Stammlösung, muß sterilfiltriert werden Stammlösung in Ethanol Stammlösung muß lichtgeschützt aufbewahrt v/erden g.l. : gut löslich s.l. : schlecht löslich, nicht löslich Quelle für die Endkonzentrationen: Max Mergeay Quelle für die Löslichkeiten: Data for Biochemical Research Zugabemodus D O.SA S,F D D.SA D SF SF D SF D SA.D D SF SA,D D SE,L D D SA,D SF SA SA,D SF D SA.D SF SF.L SA,0 SF SA.D SA.D D DD SA.d

23 13 8) Physiologische Puffer KP50: 50 mm Kaliumphosphatpuffer ph mm MgCl 2 - A-Puffer: 0.02 M Imidazol-HCl-Puffer, ph 7.5 mit 10 mm MgCl 2 und 500 ym Dithioerythrol. D) Anzuchten 1) Autotrophe Kultivierung a) Platten und geringvolumige Flüssigkulturen wurden im Wittschen Topf unter Knallgas (80% H % C O 2 > inkubiert. b) Flüssigkulturen im 100 ml-maßstab wurden in 1 1-Schikanen- Langhalskolben mit dem gewünschten Volumen SGK gefüllt und langsam mit Knallgasgemisch durchperlt. Als Knallgasquelle diente eine Niveauflaschenapparatur. a,b) Die Optische Dichte wurde verfolgt, indem die Extinktion von Proben bei 436 nm gegen Medium bestimmt wurde. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (10 min üpm, Zeta 20) geerntet und in KP50 gewaschen. c) Wachstumsversuche wurden in Klettkolben mit Begasungsaufsatz durchgeführt. Die Kolben wurden in einem Wasserbad bei 30 C geschüttelt. Nach jeder Messung wurden die Kolben erneut mit Knallgas aus einer Niveauflaschenapparatur durchströmt. Die Zelldichten wurden durch Tübungsmessung in einem Klett-Summerson-Colorimeter bei nm (Filter 54) gegen H 2 0 bestimmt und als Kletteinheiten (AK) angegeben. d) Massenanzuchten wurden in einem 10 1-Fermenter (Braun, Melsungen) mit 8 1 SGK mit zusätzlichen 8 g NH 4 C1 durchgeführt. Das Gefäß wurde leer autoklaviert und über einen Salzfilter gefüllt. Die Temperatur wurde auf 30 C gehalten, der ph-wert durch Zugabe von NH 4 OH zwischen 6.9 und 7.4. Das

24 14 Begasungsgemisch wurde mit Gaspumpen (Wösthof, Bochum) hergestellt. Gerührt wurde mit 400 Upm, angeimpft mit 400 ml autotroph gezogener Vorkultur. 2) Massenanzuchten in Xnduktionsmedium Hier wurde ebenfalls ein 10 1-Fermenter mit 8 1 Inhalt verwendet. Auch dieses Gefäß wurde leer autoklaviert und über einen Salzfilter steril gefüllt. Das Medium wurde mit 400 ml Vorkultur (2 Tage alt,- 0.9% Gluconat in SGK) beimpft und bei 30 C und 10 l/h Luftbegasung 3 Tage bei 600 Upm gerührt. 3) Ernte und Aufbewahrung der geernteten Zellen Nach der Massenanzucht wurden die Zellen mit einer CEPA- Schnellzentrifuge (Carl Padberg, Baden) bei Upm und 2 l/h Durchflußgeschwindigkeit geerntet, mit KP50 gewaschen und bei -20 C eingefroren. Zellen/ die im Induktionsmedium angezogen worden waren,' waren auch nach mehreren Monaten in der Aktivität der autotrophen Schlüsselenzyme unverändert. Nach autotropher Anzucht wurden diese Enzyme jedoch ziemlich rasch inaktiviert, daher wurden autotroph gezogene Zellen bei -70 C aufbewahrt. III) ENZYMOLOGIE A) Zellaufschluß 1) French Presse Die French Presse wurde benutzt, um größere Proben für die Enzymanreicherung aufzuschließen. Dazu wurden die eingefrorenen Zellen derart in Puffer A resuspendiert, daß ein Endvolumen von 3 ml pro eingesetztes g Naßgewicht resultierte. 1 mg DNAse/10.0 ml wurde zugesetzt, dann wurde die Zellsuspension zweimal bei 1560 kp/cm 2 durch die French Presse (American Instruments Inc., Silver Springs, Maryland) geschickt. Durch Zentrifugation (Zeta 20, 10 min Upm) wurden die restlichen Zellen und grobe Zelltrümmer entfernt. Puffer A wurde verwendet, um die CO 2 ~fixierenden Enzyme zu

25 15 stabilisieren; auf die Hydrogenasen hat dieser Puffer keinen negativen Einfluß. ül Ultraschall Diese Methode wurde angewendet, um viele parallele Proben mit kleineren Volumina aufzuschließen. Im Standardtest wurden 20 ml Kulturbrühe abzentrifugiert (10 min Upm, Zeta 20), in KP50 gewaschen und in 2 ml KP50 resuspendiert. Aufgeschlossen wurde an einem MSE Ultrasonic Desintegrator MK2 (150 W), 3 min bei 12.5 u. unter starker Kühlung (Eis- Kochsalz-Mischung). Anschließend wurden die Zelltrümmer entfernt (10 min Upm, Zeta 20). B) Ultrazentrifugation Membranen wurden durch einstündige Zentrifugation bei Upm (Omicron, Christ, Osterode) sedimentiert. C)_ Säulenchromatographie mit Triazinfarbstoffen 1 ) Verwendete Farbstoffe Die Farbstoffe (Tabelle 6) wurden von Herrn Dr.A.Steinbüchel zur Verfügung gestellt. 2) Kopplungsprozedur (Atkinson et al., 1981) jü. H-Farbstoffe: Die gewünschte Menge Sepharose 4B (Pharmacia, Schweden) wurde abgenutscht, feucht gewogen und gründlich mit Wasser gewaschen. Sie wurde so in Hasser resuspendiert, daß pro g Sepharose 3.5 ml Endvolumen resultierten. 15 mg Farbstoff/g 4B wurden und in 1 ml Wasser/g 4B gelöst. Die Farbstofflösung wurde der Sepharosesuspension zugesetzt. Danach wurden 0.5 ml 4 M NaCl/g 4B und 0.05 ml 10 M NaOH/g 4B zugegeben und diese Mischung 48 h bei 30 C auf dem Rotationsschüttler inkubiert. Nach der Kopplung wurde das Gel gründlich in der angegebenen Reihenfolge auf einer Fritte gewaschen mit: (i) H,O,(ii) 1 M NaCl in H 2 0:Ethanol = 3:1,

26 16 Tabelle 6: Verwendete Procionfarbstoffe H-Farbstoffe Prociongelb -gelb -orange -braun -rot -rot -blau -blau -marin -türkis -grün HE6g HE4r HER H3r HE3b HE7b HEGN HERD HER HA HE4bd MX-Farbstoffe Prociongelb -gelb -orange -braun -rot -rot -blau -blau -marin -türkis -blau MX8g MX3r MX'2r MX5br MX5b MX8b MXG MXR MX4rd MXG MX2g Quelle für die Farbstoffe: Deutsche ICI, Frankfurt (iii) H O, (iv) 1 M NaCl in 100 mm Kaliumphospatpuffer, ph 7. 0, (v) 100 mm Kaliumphosphatpuffer, ph 7.0. b)_ MX-Farbstoffe: Im Unterschied zu der Methode für H-Farbstoffe wurden lediglich 6.25 yl 10 M NaOH/g 4B zugesetzt und nur 2 h inkubiert. Alle anderen Schritte entsprechen der unter a beschriebenen Methode. D) Enzymtests 1) Laktat-Dehydrogenase (nach Boehringer Biochemica Informationen) 50 ul NADH-Lösung (10 mg Na 2 -Salz/ml) und 100 ul Pyruvatlösung (2.5 mg Na-Salz/ml) wurden in 2.83 ml 50 mm Kaliumphosphatpuffer, ph 7.0, gegeben. Die Reaktion wurde mit 20 Ul Probe gestartet und die Extinktionsänderung bei 340 nm verfolgt. Die Aktivität wurde berechnet nach: Sei x die Extinktionsänderung/min, dann ist x die Aktivität in O/ml.

27 17 2) KataXase (Bergmeyer, 1955) Eine Meßprobe mit V y.1 wurde in 3 ml 50 mm Kaliumphosphat, ph 7.0, mit 12.5 mm H-O, gegeben, schnell durchmischt und die Extinktionsänderung x/min bei 240 nm gemessen. Die Aktivität in U/ml war dann gleich mal x/v. 3) Superoxid-Dismutase (Beauchamp und Fridovich, 1971) 25 ul Nitroblautetrazoliumchlorid (25 um in H 2 O), 25 ul Xanthin (400 um in H,O) und ca. 50 ul Xanthin-Oxidase (XOX, 40 ul des komerziellen Präparates in 1 ml des unten beschrxebenen Puffers) wurden zu 2.3 ml 50 mm Carbonatpuffer, ph 10.2, mit 100 um EDTA gegeben. Es wurde während eines Meßdurchgangs soviel XOX eingesetzt, daß die 1OOfo-Reaktion eine Extinktionsänderung/min von bei 560 nm bewirkte. Diese 100%-Reaktion wird durch Zusatz von Superoxid-Dismutase (SOD) zum Meßsystem verlangsamt, da der Farbstoff und die SOD um die von der XOX erzeugten Superoxidradikale konkurrieren. Es wurde daher für jede Meßreihe mit Blut-SOD eine Eichkurve hergestellt; die doppelt-logarithmische Auftragung ergab eine lineare Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der eingesetzten SOD-Aktivität. L sliche Hydrogenase (Schneider und Schlegel, 19 76) Der Meßpuffer, 50 mm TRIS-HC1, ph 8.0, wurde im 30 C-Wasserbad ständig mit H 2 durchperlt. 2.5 ml dieses Puffers wurden mit ul Probe versetzt, gestartet wurde mit 50 ul NAD" Lösung (48 mm in Meßpuffer), die NADH-Bildung wurde bei 365 nm verfolgt. Für die Auswertung wurde ein Extinktionskoeffizient NADH/NAD von 3.5 cm" 1 mm~ zugrunde gelegt. Anmerkung: Es ist nicht möglich, CH34 mit CTAB zu permeabilisieren und an einem solchen Präparat die Aktivität der löslichen Hydrogenase zu bestimmen. Ein Versuch, dieses Verfahren zu optimieren, zeigte bei Hl6 eine klare optimumskurve für den CTAB-Einsatz, bei CH34 jedoch führte bereits die