Anhang I. Verwendete Abkürzungen ANHANG I
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- Bernd Berger
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1 ANHANG I Anhang I Verwendete Abkürzungen A.D. Außendurchmesser A. dest. Aqua destillata APS Ammoniumpersulfat BSA Bovines Serumalbumin CG Choriongonadotropin CL Corpus luteum CSSE Cholesterin-Seitenketten-spaltendes Enzym CSTR Continuous Stirred Tank Bioreactor, kontinuierlich und turbulent durchmischter Rührkesselreaktor DABCO 1,4-Diazobicyclo-[2.2.2]-Oktan DHEA Dehydroepiandrosteron DMSO Dimethylsulfoxid D-MEM Minimal-Essential-Medium, Modifizierung nach Dulbecco EC Endothelial Cell, Endothelzelle EKV Extrakapilläres Volumen FITC Fluoreszeinisothiocyanat FSH Follikelstimulierndes Hormon Gn-RH Gonadotropin Releasing-Hormon hcg Humanes Choriongonadotropin HF-Modul Hohlfasermodul I.D. Innendurchmesser IKV Intrakapilläres Volumen KV Kulturvolumen LH Luteinisierendes Hormon LLC Large Luteal Cell, große Lutealzelle w/v weight per volume, Konzentration als Gewicht pro Volumen NBT Nitroblue-Tetrazolium MEM-E Minimal-Essential-Medium, Modifizierung nach Eagle PBS Phosphat Buffered Saline, isotonischer Phosphatpuffer PBS-Amph Amphotericin B-haltiger, isotonischer Phosphatpuffer PBS-Ca Isotonischer Phosphatpuffer mit Ca 2+ -Supplementierung PGF 2α REM SDS SLC Prostaglandin F 2α Raster-Elektronenmikroskopie Sodium Dodecylsulfate, Natriumdodecylsulfat Small Luteal Cell, kleine Lutealzelle 96
2 ANHANG I TCA Trichloricacetic acid, Trichloressigsäure TEM Transmissions-Elektronenmikroskopie TEMED N,N,N,N -Tetramethyl-Ethylendiamin (1,2-bis[Dimethylamino]ethan) TRIS-HCl-Puffer Trishydroxymethylaminomethan-Puffer (ph mit mit HCl eingestellt) UV Ultraviolettes Licht v/v volume per volume, Konzentration als Volumen pro Volumen WS-Modul Wirbelschichtmodul 97
![(1,2-bis[Dimethylamino]ethan) TRIS-HCl-Puffer Trishydroxymethylaminomethan-Puffer (ph mit](/docs-images/44/11929057/images/page_2.jpg "mit HCl eingestellt) UV Ultraviolettes Licht v/v volume per volume, Konzentration als")
3 ANHANG II Anhang II Rezepturen für Medien und Lösungen Verwendete Zellkulturmedien: (die angegebenen Konzentrationen beziehen sich auf das unsupplementierte Medium gemäß den Herstellerangaben) 98
4 ANHANG II Verwendete Puffer, Gele und Lösungen Phosphatpuffer (PBS): NaCl (8 g/l), Na 2 HPO 4 *7H 2 O (2,16 g/l), KCl (0,2 g/l), K 2 PO 4 (0,2 g/l), MgSO 4 *7H 2 O (0,1 g/l) Phosphatpuffer, Ca 2+ -haltig, mit erhöhter Mg 2+ -Konzentration (PBS-Ca): NaCl (6,68 g/l), NaHCO 3 (2,2 g/l), MgSO 4 *7H 2 O (0,2 g/l), NaH 2 PO 4 *H 2 O (0,14 g/l), KCl (0,04 g/l), CaCl 2 (0,02 g/l) Polyacrylamid-Sammelgel (5 %): 395 µl Acrylamid (40 % (w/v)), 380 µl TRIS-HCl-Puffer (ph 8,8), 15 µl SDS (10 %(w/v)), 30 µl APS, 3 µl TEMED, 2,2 ml A. dest. Polyacrylamid Trenngel 1 (13 %): 3,0 ml Acrylamid (40 % (w/v)) 3,0 ml TRIS-HCl-Puffer (ph 8,8), 82 µl SDS (10 % (w/v)), 80 µl APS, 5 µl TEMED, 3,9 ml A. dest. Polyacrylamid Trenngel 2 (14 %): 3,5 ml Acrylamid (40 % (w/v)), 3,0 ml TRIS-HCl-Puffer (ph 8,8), 82 µl SDS (10 % (w/v)), 80 µl APS, 5 µl TEMED, 3,4 ml A. dest. Coomassie-Färbelösung: Coomassie-blue 0,1 % (v/v), Essigsäure 7,5 % (v/v), Methanol 50 % (v/v) in A. dest. Coomassie-Entfärbelösung: Essigsäure 5 % (v/v), Methanol 20 % (v/v) in A. dest. Medium zur Kryokonservierung: 2,75 ml D-MEM, 1,25 ml FKS; 1 ml DMSO 99
5 ANHANG II Verwendete Geräte mit Produktbeschreibungen und Bezugsquellen Zellkultur Brutschrank, B 5060 Ek / CO 2 Sterilbank, Gelaire Bürker-Zählkammer Heraeus Instruments GmbH, Hanau Pall Gelman, Dreieich allg. Laborfachhandel Optik und Mikroskopie Inverses Mikroskop, Leitz-Diavert Leica Mikroskopie, Bensheim Konfokales Laser-Scan-Mikroskop: 1. Zeiss Axiovert 135 M mit Zeiss, Oberkochen 2. Argon-Ionen-Laser, Leistung max. 2 W, Emmision bei: 351, 363, 488 und 514 nm Coherent Enterprise, Santa Clara, USA 3. Spektral-Filtereinheit Bio-Rad MRC 1024 für Filterung von Anregungsund Fluoreszenzlicht (Filterblock NBHS) Bio-Rad Laboratories GmbH, München Mikroskop, Leitz-Dialux 20 Leica Mikroskopie, Bensheim Multiwellplatten-Photometer, iems Reader MT Labsystems GmbH, Frankfurt Photoautomat MPS 55 Wild, Heerbrugg / Schweiz Refraktometer Leica Mikroskopie, Bensheim Kritischer-Punkt-Trocknungsgerät, Critical Point Drying Device Polaron, Watford, Groß-Britannien Sputter-Gerät, Sputtering Device, Balzers Union Ltd., Wiesbaden Allgemeine Laborgeräte Elektrophoresekammer Elektrophorese-Spannungsversorgung, Pharmacia LKB 200/400 Festwinkelrotor 70 Ti Kühl-Tischzentrifuge, Biofuge fresco Kühl-Tischzentrifuge, Hettich Universal/K2S Pumpe, peristaltisch (Minipuls 3) Tischzentrifuge, Biofuge B Ultrazentrifuge Optima L-70 Bio-Rad Laboratories GmbH, München Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg Beckman Coulter GmbH, München Heraeus Instruments GmbH, Hanau Hettich-Zentrifugen, Tuttlingen Abimed Analysen-Technik GmbH, Langenfeld Heraeus Instruments GmbH, Hanau Beckman Coulter GmbH, München 100
6 ANHANG II UV-Betrachtungsmonitor, TFX-20M, Emission: 295 nm Wellenlänge Wasserbad, 2204 Multitemp Vilber-Lourmat, Torcy, Frankreich Pharmacia Amersham Biotech, Freiburg Reaktorbauteile, eingebundene Geräte und Software Abfallgefäß aus Glas, 1000 ml, GL 45 Schott Glaswerke, Mainz Ausgleichsgefäß aus Glas, 100 ml, GL 45 Schott Glaswerke, Mainz Cytodex 3, Microcarrier aus Dextran-Gel, Collagen-beschichtet, 60 µg/cm 2 Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg Reaktordeckel aus Teflon im Hause angefertigt, allg. Laborfachhandel Druckgase, technisch, Vordruck 1,5 bar, Messer Griesheim GmbH, Frankfurt Durchflußmeßzelle, Glas, Gewinde GL-32 Glasbläserei der Justus-Liebig Universität Gießen, FB Chemie Elektrodenfassung, Teflon, GL-32, GL-25 Bohlender, Lauda Edelstahlkanülen (A.D. 2 mm,), Luerlock Unimed SA, Lausanne / Schweiz Enzym-Automat (Epos Analyzer 5060) Eppendorf-Netheler-Hinz Hohlfasermodul Cell-Pharm BR poröse Hohlfasern (Cellulose) Faser I.D.: 210 µm, W.D. 25 µm, cutoff 10 kda, Gesamtoberfläche cm 2 KV 12 ml (EKV), Gehäuse aus Polycarbonat In-Vitro-Systems & Services GmbH, Osterode Grafische Programmierumgebung HP-VEE Version 5.0 Hewlett-Packard GmbH, Böblingen Magnetrührsystem, Ikamag Reo IKA-Labortechnik, Stauffen i. Br. Meßkarte, ME-300 ISA-Multi-I/O Meilhaus Elektronic GmbH, Puchheim O 2 -Elektrode, Typ 322 Mettler-Toledo GmbH, Prozeßanalytik, Steinbach Ts. O 2 -Meßumformer, Typ 170 % Air Mettler-Toledo GmbH, Prozeßanalytik, Steinbach Ts. PC (486 DX, 8 MB RAM Peacock AG, Wünnenberg-Haaren ph-elektrode InPro 3100 mit PT 1000 Mettler-Toledo GmbH, Prozeßanalytik, Steinbach Ts. ph-meter Mettler-Delta 350 Mettler-Toledo GmbH, Prozeßanalytik, Steinbach Ts. Pumpe, peristaltisch (Minipuls 2 bzw. 3) Abimed Analysen-Technik GmbH, Langenfeld 101
7 ANHANG II Pumpen-Schläuche, ID = 1 mm, Isoversinic Pumpen-Schläuche, ID = 1 mm, PVC Pumpen-Schläuche, ID = 3,16 mm, PVC Reaktorgefäß 0,1 l Schläuche, I.D. = 3 mm, W.D. = 1 mm, Teflon Schraubdeckel mit Doppelabgang, Teflon Spritzen für Probennahme (10 ml, 1 ml) Sterilfilter (cutoff 0,2 µm) Sterilfilter, Midisart 2000, cutoff 0,2 µm Temperatursensor PT 100 Versorgungsschläuche Rotilabo, Silikon I.D. = 3 mm, W.D. = 2 mm Wasserbad, Durchlaufthermostat D1 / L Zeitschaltuhr Zulaufgefäß aus Glas, 100 ml, GL 45 Abimed Analysen-Technik GmbH, Langenfeld Abimed Analysen-Technik GmbH, Langenfeld Abimed Analysen-Technik GmbH, Langenfeld HWS, Mainz Bohlender, Lauda Bohlender, Lauda Braun Melsungen Sartorius AG, Göttingen Sartorius AG, Göttingen Mettler-Toledo GmbH, Prozeßanalytik, Steinbach, Ts. Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe Haake, Karlsruhe Kleinfeld Labortechnik GmbH & Co, Hannover Schott Glaswerke, Mainz Verwendete Verbrauchsmaterialien mit Produktbeschreibungen und Bezugsquellen Deckgläser, rund allg. Laborfachhandel Edelstahlsieb, Maschenweite 150 µm im Hause angefertigt, allg. Laborfachhandel Kryokonservierungsgefäße (2 ml) Nalge-Nunc GmbH & Co KG, Wiesbaden Multiwell-Platten, 12-well (Nunclon) Nalge-Nunc GmbH & Co KG, Wiesbaden Objektträger allg. Laborfachhandel T-Flasche für Zellkultur, 25 cm 2 Costar, Integra Biosciences, Fernwald T-Flasche für Zellkultur, 75 cm 2 Costar, Integra Biosciences, Fernwald T-Flasche für Zellkultur, 80 cm 2 (Nunclon) Nalge Nunc GmbH & Co KG, Wiesbaden Zentrifugationsfilterhülsen, Omega Nanosep 3 kda Pall Gelman, Dreieich Zentrifugenrörchen, 28 ml Nalge-Nunc GmbH & Co KG, Wiesbaden 102
8 ANHANG II Verwendete Reagenzien mit Bezugsquellen A. dest. (Reinstwasseranlage Milli-Q) Millipore, Eschborn Acetamylester Acrylamid Serva Elektrophoresis GmbH Freiburg Amphotericin B - Gebrauchslösung Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen APS (Ammoniumpersulfat) Serva Elektrophoresis GmbH Freiburg Bio-Rad Protein Assay, nach Bradford Bio-Rad Laboratories GmbH, München CaCl 2 Cacodylsäure, Cacodylat Collagenase, Typ 1 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen Collagenlösung Typ 1, rat tail, 4,53 g/l Collaborative Biomedical Products, Bedford, USA Coomassie-Reagenz, Coomassie brillant blue G-250 Bio-Rad Laboratories GmbH, München DABCO, Diazobicyclo-Oktan, (1,4-Diazobicyclo-[2.2.2]-Oktan) Hoechst AG, Frankfurt Dabco/Moviol, 1mg/ml Hoechst AG, Frankfurt Dehydroepiandrosteron (DHEA) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen DMSO, Dimethylsulfoxid Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe Elektrophorese-Probenpuffer, Roti-Load 1 (reduzierend) Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe Essigsäure Ethanol Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe Fetales Kälberserum (PAA) PAA Laboratories GmbH, Cölbe Fetales Kälberserum (Sigma) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) Serva Elektrophoresis GmbH Freiburg Glucose Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen Glutardialdehyd Hexokinase Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen Humanes Choriongonadotropin (hcg), Ovogest 5000, 9 ku/mg Intervet GmbH, Tönisvorst Iliren C, Wirkstoff Tiaprost, (Prostaglandin F 2α -Derivat) Hoechst Roussel Vet GmbH, Wiesbaden Isopropanol K 2 PO 4 KCl Lactat Roche AG, Mannheim 103
9 ANHANG II LMW-Proteinmarker, ,4 kda Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg Methanol MgSO 4 *7H 2 O Mimalmedium nach Dulbecco, (Minimal-Essential-Medium, D-MEM) PAA Laboratories GmbH, Cölbe Minimalmedium nach Eagle, (Minimal-Essential-Medium, MEM-E) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen Molekulargewichtsmarker, LMW, ,4 kda, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg Molekulargewichtsmarker, RBM-low, ,5-14,3-6,5-3,4-2,35 kda Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg Moviol Hoechst AG, Frankfurt Na 2 HPO 4 *7H 2 O NaCl NAD Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen NADH Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen NADPH Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen NaH 2 PO 4 *H 2 O NaHCO 3 Nitroblue-Tetrazolium (NBT) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen Paraformaldehyd PBS selbst angesetzt, Reagenzien Merck KGaA, Darmstadt Penicillin/Streptomycin-Gebrauchslösung, 100 ku/l, bzw. 100 mg/l Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen Percoll, kolloidale Kieselsäure-Partikel, Polyvinylpyrrolidon beschichtet Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg Prostaglandin F 2α (siehe Iliren C) Proteinstandard-Reagenz, Lab-Tol 0,73-0,36-0,18-0,07-0,036 g/l Bio-Rad Laboratories GmbH, München Pyruvat Roche AG, Mannheim Rainbow-Marker, RBM-low, ,5-14,3-6,5-3,4-2,35 kda Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg SDS (Natriumdodecysulfat) Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe Sudan-III-Farbstoff TCA (Trichloressigsäure) Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe TEMED, N,N,N,N -Tetramethyl-Ethylendiamin Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe 104
10 ANHANG II TRIS-HCl-Puffer (Trishydroxymethylaminomethan) Trypsinlösung, 10x Stammlösung 25 g/l Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen 105
11 Anhang III Rohdaten und Tabellenkalkulationen zu allen im Ergebnisteil dargestellten Kulturexperimenten Zu Abb. 3.10: Untersuchung der Fähigkeit von Lutealzellen zur Progesteronproduktion 106
12 Zu Abb. 3.11, 3.12 und 3.13: Wachtumskurven der Lutealzellen in T-Flaschen-Kultur 107
13 Zu Abb und 3.13: Wachstumskurven der Lutealzellen und Progesteronkonzentrationen sowie Progestronproduktionsraten 108
14 Zu Abb und 3.15: In situ Gradientenbildung durch Ultrazentrifugation und Fraktionierung der Primärsuspension im Dichtegradienten 109
15 Zu Abb. 3.16: Einfluß der Pyruvatsupplementierung auf die Progesteronproduktion 110
16 Zu Abb. 3.17: Progesteronproduktion in Abhängigkeit des verwendeten Kulturmediums 111
17 Zu Abb. 3.18: Progesteronproduktion unter hormoneller Stimulation durch hcg 112
18 Zu Abb und 3.20: Langzeitkultur von Lutealzellen in Multiwell-Platten (LZT-1) 113
19 Zu Abb und 3.22: Langzeitkultur von Lutealzellen in Multiwell-Platten (LZT-2) 114
20 Zu Abb und 3.24: Langzeitkultur von Lutealzellen in Multiwell-Platten (LZT-3) 115
21 Zu Abb und 3.32: Verlauf der Konzentrationen an Glucose und Lactat in den Reaktorläufen mit der jeweils niedrigsten Verdünnungsrate 116
22 Zu Abb bis 3.30: Alle Reaktorläufe mit Hohlfasermodul, Progesteronkonzentrationen und Produktionsraten 117
23 118
24 119
25 Zu Abb bis 3.42: Alle Reaktorläufe mit Wirbelschichtmodul, Progesteronkonzentrationen und Produktionsraten 120
26 121
27 122
28 123
3,58 g 0,136 g. ad 100 ml
9 Anhang 9.1 Rezepturen der Puffer und Lösungen 9.1.1 Vorbereitung der Proben zur Extraktion Coon s-puffer (0,1 M, ph 7,2-7,6) Na 2 HPO 4 x 12 H 2 O KH 2 PO 4 Aqua dest. 3,58 g 0,136 g 8,77 g 9.1.2 Aufbereitung
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