Bestimmung der aktivierten Serum-Kreatin-Phosphokinase

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1 254 Rotthau we u. Kowalcwski: Bestimmung der Seriim-Kreatin-Phosphokinase Bestimmung der aktivierten Serum-Kreatin-Phosphokinase Von H. W. RÖTTHAÜWE und S. KowALEWSKi 1 ) Aus der Universitäts-Kinderklinik Bonn a. Rh. (Direktor: Prof. Dr. H. (Eingegangen am 6. Januar 1967) Hungerland) Die CPK im Serum verliert bei Aufbewahrung bei Zimmer- und Kühlschranktemperatur rasch an Aktivität. Diese Inaktivierung beruht auf der Oxydation von Sulfhydrylgruppen, da durch Zugabe von reduziertem Glutathion oder von Cystein eine Reaktivierung erzielt wird. Es wurde daher in der vorliegenden Arbeit die Brauchbarkeit verschiedener Methoden zur Bestimmung der aktivierten CPK geprüft. Die CPK kann entweder über die Vorwärtsreaktion (Übertragung der endständigen Phosphatgruppe des ATP auf Kreatin) oder über die Rückwärtsreaktion (Übertragung der Phosphatgruppe des Kreatinphosphates auf ADP) durch direkte Bestimmung des gebildeten Reaktionsproduktes (Kreatinphosphat bzw. Kreatin) oder indirekt mit Hilfe eines zusammengesetzten optischen Testes bestimmt werden. Die Untersuchungen ergaben, daß eine zuverlässige Bestimmung der CPK mittels der direkten Methoden lediglich bei sehr geringen Enzymaktivitäten möglich ist, da die Enzym-Umsatz-Kurve nur in einem sehr schmalen Bereich linear verläuft. Bei der Messung im optischen Test dagegen ließ sich in der Vorwärtsreaktion und in der empfindlicheren Rückwärtsreaktion innerhalb eines weiten Bereiches lineare Proportionalität zwischen Reaktionsgeschwindigkeit und Serummenge erzielen. Eine zuverlässige Bestimmung über die Rückwärtsreaktion wird dadurch erschwert, daß bei Zusatz von Sulfhydrylverbindungen wie reduziertem Glutathion oder Cystein störende Nebenreaktionen auftreten können. Von allen geprüften Methoden zeigte die Bestimmung im optischen Test über die Vorwärtsreaktion die geringste Störanfälligkeit. Bei optimaler Konzentration an ATP und Magnesium-Ionen erwies sich dieses Verfahren als weitgehend unabhängig von anderen Komponenten des Testansatzes. Zwar wurden bei dem verwendeten ph von 7,6 um etwa 30% geringere Aktivitäten gemessen als bei dem ph-optimum von 9,0, doch sind im alkalischen Milieu größere Mengen an Hufs- und Indikatorenzym erforderlich. Bei allen geprüften Methoden wurde durch Zugabe von reduziertem Glutathion oder Cystein die Aktivität der CPK schon in frischem Serum deutlich erhöht. The activity of serum CPK ( ATP: creatine phosphotransferase) decreases rapidly at room temperature and under refrigeration. This inactivation is due to the oxidation of sulphydryl groups, since the addition of reduced glutathione or cysteine causes reactivation. In the present work, the value of different methods for the determination of active CPK has been investigated. CPK can be determined either from the forward reaction (transfer of a terminal phosphate group from ATP to creatine) or from the backward reaction (transfer of the phosphate group of creatine phosphate to ADP), by measurement of the reaction product (creatine phosphate or creatine) directly, or indirectly with the aid of coupled reactions and a photometric test. It was shown that the direct methods for the determination of CPK were reliable only for very low enzyme activities, because the enzyme-response curve is linear only in a very narrow region. When the optical test is used, however, there is an extensive linear relationship between the reaction rate and the amount of serum for the forward reaction and for the more sensitive backward reaction. It is difficult to perform a reliable determination by the backward reaction, because the addition of sulphydryl compounds, like reduced glutathione or cysteine, can give rise to interfering side reactions. Of all the tested methods, the least susceptible to interference was the optical test on the forward reaction. At optimal concentrations of ATP and magnesium ions, the method is largely independent of other components of the.reaction mixture. At ph 7.6, which is used in.the test, the measured activity is about 30% less than at the optimum ph of 9.0, but in alkaline medium larger amountes of auxiliary and indicator enzymes are required. The activity of CPK was markedly increased in fresh serum by the addition of reduced glutathione or cysteine, irrespective of the method of measurement. Einleitung reverse reaction" (Rückwärtsreaktion). ENNOR und ROSENBERG rx- ^r»t^ /A* ^ "T" ^8 r - (15) gehen von der Phosphorylierung des ADP durch Kreatin- "* 8 * 8 > lasiert die re- p^*^ aus und ^^^ mit >)forwatd«. bzw. >>backward reluhcreatin ettra8ung enditsndl e en Phosphatgruppe des ATP ^^,. ^ entgegeagesetzten Abläufe. ^ der vori ie g enden Arbeit T,. ' _ f t... werden die Bezeichnungen Vorwärts- und Rückwärtsreaktion in KOBY und Mitarbeiter (24) bezeichnen die Phosphorylierung des der Definition yon KuBy und Mi tarbeiter (24) verwendet. Kreatins als forward reaction (Vorwärtsreaktion) und die Übertragung der Phosphatgruppe des Kreatin-Phosphates auf ADP als ** Eigenschaften des Rein-Enzyms liegen zahlreiche Untersuchungen vor. Das ph-optimum der Vorwärtsreaktion liegt bei x ) Technische Assistenz: H. HAMMANN. 9, das der Rückwärtsreaktion bei 7 (24). Die Rückwärtsreaktion Abkürzungen und Herkunft der Reagenzien läuft unter optimalen Bedingungen etwa sechsmal rascher als die CPK Kreatin-Phosphokinase, G-6-PDH Glucose-6-phosphat-De- Vorwärtsreaktion ab. Die CPK ist spezifisch für ATP und Kreatin hydrogenase, HK Hexokinase, LDH Lactat-Dehydrogenase, PK (27). Die Aktivität ist an die Gegenwart von Erdalkalimetall-Ionen Pyruvat-Kinase, NAD bzw. NADH oxydiertes bzw. reduziertes gebunden. Magnesium- und Mangan-Ionen sind etwa gleich, Nicotinamid-adenin-dinucleotid, NADP bzw. NADPH oxydiertes Calcium-Ionen nur etwa halb so wirksam (24). In der Vorwärtsbzw, reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat, AMP reaktion wird maximale Aktivität erzielt, wenn ATP und Mg 2 +- Adenosin-5-monophosphat, ADP Adenosin-5-diphosphat, ATP Ionen in äquimolaren Mengen vorliegen. Bei der Rückwärts- Adenosin-5-triphosphat, Cr Kreatin, CrP Kreatin-phosphat, reaktion liegt die optimale Mg 2+ -Konzentration etwas oberhalb G-6-P Glucose-6-phosphat, 6-GP 6-Phosphogluconat, GSH re- der ATP-Konzentration (24). Die Michaelis-Konstanten für die duziertes Glutathion, PEP Phosphoenol-pyruvat, TRAP Triätha- aus Kaninchenmuskel isolierte CPK betragen: In der Vorwärtsnolamin-HCl-NaOH-Puffer, TRIS Tris(Hydroxymethyl)-amino- reaktion (38 u. ph 9) für ATP 6 10~ 4, für Kreatin 1,9 10~ 2 methan-hcl-puffer, aqua dem. aqua demineralisata. Mol pro Liter; in der Rückwärtsreaktion (38 u. ph 7) für ADP NADH, NADP, GSH, PEP (tri-cyclohexyl-ammoniumsalz),. 1,3 10~ 3, für Kreatinphosphat 5 10~ 3 Mol pro Liter (24). SH- G-6-PDH, HK, LDH, PK, Triäthanolamin-HCl, Tris(Hydroxy- Verbindungen wie Cystein und GSH steigern unter bestimmten methyl)-aminomethan: Boehringer & Söhne, Mannheim. Voraussetzungen die Aktivität der CPK (2, 6,15). Diese Wirkung ADP (Natriumsalz), ATP (Natriumsalz), Kreatin-phosphat beruht auf der Aktivierung vor! Thiolgruppen im Enzymmolekül. (Natriumsalz): Sigma, St. Louis (USA). Durch quecksilberorganische Verbindungen wie p-chlormercuri- Kreatin: Hoffmann-La Roche, Basel (Schweiz). benzoat werden die SH-Gruppen blockiert, die Aktivität wird volli-cystein-hcl: Fluka, Buchs (Schweiz). ständig gehemmt. Ein starker Inhibitor der Vorwärtsreaktion ist Metol: Agfa, Leverkusen. ADP, andere Inhibitoren der CPK sind NAD, anorganische Übrige Reagenzien: Merck, Darmstadt. Anionen wie SO ~ und Cl" und Schwermetall-Ionen (24, 27)."

2 Rotthauwe tu Kowalewski: Bestimmung der Serum-Kreatin-Phosphokinase 255 CPK kommt beim Menschen in der Muskulatur und im Gehirn vor; die Aktivität nimmt in der Reihenfolge Skelettmuskel, Gehirn, Herz, glatte Muskulatur ab (7). Das Enzym tritt in verschiedenen molekularen Formen (Isoenzymen) auf (5, 9, 23, 30, 39). Der Hauptanteil der Aktivität findet sich im Cytoplasma, aber auch die Mitochondrien enthalten CPK (22). Im normalen menschlichen Serum ist die CPK-Aktivität bei Bestimmung ohne Aktivierung durch eine SH-Verbindung niedrig (7, 33). Starke körperliche Tätigkeit kann auch beim muskelgesunden Menschen eine Aktivitätszunahme hervorrufen (3). Ein diagnostisch wichtiger Befund ist die erhöhte CPK-Aktivität im Serum bei progressiver Muskeldystrophie (14) und beim Herzinfarkt (11). Auch bei einem Teil der Konduktorinnen der rezessiv x-chromosomal vererbten progressiven Muskcldystrophien werden erhöhte Aktivitäten im Serum gefunden (l, 10, 28, 34, 35), ebenso bei Hypo- und Athyreose (17,18,19, 20). Die verschiedenen Methoden 2ur Aktivitätsbestimmung der CPK lassen sich in direkte und indirekte Verfahren unterteilen. Bei den direkten Methoden wird ein innerhalb einer bestimmten Zeitspanne gebildetes Reaktionsprodukt mit einer Farbreaktion bestimmt. Bei den indirekten Methoden wird die CPK-Reaktion so mit einer Hilfsreaktion gekoppelt, daß in der anschließenden Indikatorreaktion eine Oxydation oder Reduktion pyridinnukleotidhaltiger Coensyme erfolgt, die sich nach den Prinzipien des optischen Testes durch Messen der Extinktionsänderung im UV-Licht verfolgen läßt. Direkte Bestlmmungsmetboden ENNOR und ROSENBERG (15) ermittelten die Aktivität gereinigter Enzympräparate in der Rückwärtsreaktion über eine Bestimmung des aus Kreatin-Phosphat gebildeten Kreatins in der a-naphthol-diacetyl-reaktion. Diese Methode wurde von DREYFUS und SCHAPIRA (12) durch Enteiweißen mit ZnSO 4 und Ba(OH) 2 modifiziert und in die klinische Chemie eingeführt. Der jetzt häufig verwendete Bestimmungsansatz nach HUGHES (21) enthält Cystein. Kürzlich wurde über eine Modifikation durch fluorometrische Bestimmung des Kreatins mit der Ninhydrin-Reaktion berichtet (8, 37). KUBY und Mitarbeiter (24) bestimmten die CPK-Aktivität über das aus Kreatin und ATP in der Vorwärtsreaktion gebildete Kreatin-Phosphat, indem sie das in molybdänsauref Lösung hydrolysierbare Phosphat nach FISKE und SUBBAROW (16) erfaßten. Diese Methode hat nur eine begrenzte klinische Anwendung gefunden. Indirekte Bestimmungsmethoden Einen optischen Test für die Bestimmung über die Rückwärtsreaktion gab erstmalig OLIVER (29) an. Folgende Reaktionen sind hintereinander geschaltet: CPK CrP + ADP Cr,, ATP -f Glucose HK ADP -f.g-6-p, G-6-PDH 1 G-6-P 1 + NADP+ ^=^ 6-PG + NADPH + H+ Der Ansatz wurde verschiedentlich modifiziert (17, 25, 26, 40); er wird aber bisher in der klinisch-chemischen Diagnostik nur wenig benutzt. Einen zusammengesetzten optischen Test für die Vorwärtsreaktion entwickelten TANZER und GILVARG (41). Folgende Reaktionen laufen nacheinander ab: CPK Cr ATP CrP PK ADP + PEP ATP LDH Pyruvat + NADH + H+- Lactat + NAD + Die Methode wurde mehrfach modifiziert (4, 7, 31, 33, 40); sie fand eine weite klinische Anwendung. Methodik /. Direkte Bestimmung über die Riickivärlsreaktion a) Zusammensetzung des Inkubationsgemisches (nach 21): TRIS 100 HIM ph 7,4, MgCl 2 4,2 mw, ADP 1,2 mm, CrP 3,5, Cystein 17,5 IHM. b) Reagenzien: Für das Inkubationsgemisch: TRIS 100 mm ph 7,4 mit MgCl 2 15 mm und Cystein 60 mm, TRIS 100 mm ph 7,4, CrP 12 mm, ADP 4 HIM. Zum Abstoppen der Enzymreaktion und Enteiweißen: p-chlormercuribenzoat 30 mm, Ba(OH) 2 0,3N, ZnSO 4 5proz. Die ZnSO 4 - Lösung wird so eingestellt, daß bei Titration mit Phenolphthalein als Indikator die Volumina an Ba(OH) 2 - und ZnSO 4 -Lösung einander entsprechen. Für die Farbreaktion: Alkalische Stammlösung (80 g Na 2 CO 3 u. 30 g NaOH in 500 m/ Aqua dem.), l proz. a-naphthol-lösung (unmittelbar vor Gebrauch mit alkalischer Stammlösung hergestellt), l proz. Diacetyl-Stammlösung (l m/ Diacetyl mit Aqua dem. auf 100 m/ aufgefüllt), Diacetyl-Gebrauchslösung (l m/ Diacetyl-Stammlösung unmittelbar vor Gebrauch mit Aqua dem. auf 25 m/ verdünnt), Kreatin-Standardlösung 2,5 mm. Das TRIS-MgCl 2 -Cystein-Gemisch wird wegen der schlechten Haltbarkeit des Cysteins unmittelbar vor Gebrauch hergestellt. CrP und ADP werden in Puffer gelöst (Nachstellen des ph mit IN NaOH). CrP- und ADP-Lösung sowie Kreatin-Standardlösung werden eingefroren aufbewahrt und wöchentlich frisch hergestellt. Die Diacetyl-Stammlösung ist bei -{-4 mehrere Wochen haltbar. In konisch zulaufende Zentrifugengläser werden 0,25 m/ TRIS- MgCl 2 -Cystein-Lösung, 0,25 m/ CrP-Lösung und 0,10 m/ Serum pipettiert. Bei kleineren Serummengen wird mit TRIS-PufFer aufgefüllt. Nach einer Vorinkubation von 5 Min. bei 37 wird mit 0,25 m/ ADP-Lösung gestartet. Genau 30 Min. später werden rasch nacheinander 0,5 m/ p-chlormercuribenzoat-lösung, 0,5 m/ Ba(OH) 2 - und 0,5 m/ ZnSO 4 -Lösung zugesetzt, wobei nach jeder Zugabe kräftig durchgemischt wird. Nach Zentrifugieren (3000 U./ Min., 10 Min.) werden 1,0 m/ des klaren Uberstandes mit 2,5 m/ Aqua dem., 1,0 m/ -Naphthol-Lösung und 0,5 m/ Diacetyl-Gebrauchslösung versetzt. Die Farbentwicklung erfolgt während 60 Min. bei 37 unter Lichtabschluß. Anschließend wird die Extinktion bei der Wellenlänge 546 nm in Küvetten der Schichtdicke d = l cm gegen den Reagenzienleerwert gemessen. Für jede Bestimmung wird außerdem ein Leerwert angesetzt, der statt der ADP-Lösung 0,25 m/ TRIS ph 7,4 enthält. Außerdem werden in jeder Bestimmungsserie ein Kreatin-Standard und ein Reagenzienleerwert mitgeführt. Diese Ansätze enthalten anstelle der Probe 0,1 m/ Kreatin-Standardlösung bzw. 0,1 m/ Puffer, sonst sind sie wie der Hauptversuch zusammengesetzt und werden wie dieser behandelt. 2. Direkte Bestimmung über die Vorwärtsreaktion a) Zusammensetzung des Inkubationsgemisches (modifiziert nach 24): TRIS 100 mm ph 9,0, MgCl 2 4mM, ATP 4mM, Kreatin 25 mm, GSH 5 mm. 33*

3 256 Rotthauwe u. Kowalewski: Bestimmung der Serum T Kreatin-Phosphokinase b) Reagenzien: Für das Inkubationsgemisch: TRIS 100 mm ph 9,0, MgQ 2 80 mm, ATP 800 mm, Kreatin 80 mm, GSH 200 mm. Für Entciweißen und Phosphatbcstimmung: 20 proz. Trichloressigsäure, Ammoniummolybdat-Lösung, Metol-Lösung, Natriumacetat-Lösung: hergestellt nach den Vorschriften für die Bestimmung des anorganischen Phosphates mit dem Photometer Eppendorf. Phosphat-Standardlösung: 0,67 mm KH 2 PO 4 aus 1/15 m KH 2 PO 4 -Lösung Merck hergestellt. MgQ 2, ATP, Kreatin und GSH werden in Puffer gelöst; das ph der ATP- und GSH- Lösung wird mit IN NaOH nachgestellt. ATP- und Kreatin- Lösung werden eingefroren aufbewahrt und wöchentlich neu angesetzt. Die GSH-Lösung wird täglich frisch hergestellt und im Eisbad aufbewahrt. In konisch zulaufende Zentrifugengläser werden pipettiert: 0,01 m/ MgQ 2 -Lösung, 0,62 m/ Kreatin-Lösung, 0,05 m/ GSH-Lösung, 0.20 m/ Serum, TRIS ad 1,90 ml. Bei kleineren Serummengen wird mit Puffer aufgefüllt. Nach 5 Min. Vorinkubatiön bei 37 wird mit 0,10 m/ ATP-Lösung gestartet. Genau 60 Min. später wird die Reaktion durch Zugabe von 2 m/ eiskalter Trichloressigsäure abgestoppt. Bis zum Zentrifugieren (3000 U./Min., 10 Min.) bleibt der Ansatz noch 10 Min. im Eisbad. 2,5 m/des Überstandes werden mit 7,5 m/ aqua dem. und 2 m/ Ammoniummolybdat-Lösung versetzt. Nach 30 Min, bei Zimmertemperatur werden 1,0 m/ Metol- Lösung, 10 Min. später 4,0 m/acetat-lösung zugesetzt, mit Aqua dem. wird auf 20,0 m/ aufgefüllt. Weitere 5 Min. später wird die Extinktion bei 578 nm in Küvetten der Schichtdicke d = 2 cm gegen den Reagenzienleerwert gemessen. Für jede Bestimmung wird ein Leerwert angesetzt, der anstelle der Kreatin-Lösung die entsprechende Menge Puffer enthält, sonst aber wie der Hauptversuch behandelt wird. Für den Phosphat-Standard werden 2,0 m/ Standardlösung mit 2,0 m/ Trichloressigsäure versetzt und hiervon 2,5 m/ zur Phosphatbestimmung verwendet. Beim Reagenzien T leerwert wird eine Phosphatbestimmung in l: l mit Aqua dem. verdünnter Trichloressigsäure durchgeführt. 3. Indirekte Bestimmung über die Rückwärtsreaktion a) Zusammensetzung des Inkubationsgemisches (in Anlehnung an 40): TRAP 50 mm ph 7,0, MgCl 2 5 mm, ADP 2 mm, Glucose 20 mm, CrP 10 mm. NADP 0,6 mm, GSH (bzw. Cystein) 5 mm, HK 2800 IE, G-6-PDH 1400 IE. b) Reagenzien: TRAP 50 mm ph 7,0, MgCl mm, ADP 40 mm, Glucose 400 mm, CrP 200 mm, NADP 12 mm, GSH (Cystein) 200 mm, HK 140 /mg, G-6-PDH 140 /mg. MgCl 2, ADP, Glucose, CrP und GSH (Cystein) werden in Puffer, NADP in Aqua dem. gelöst. Das ph der ADP- und GSH-Lösung wird mit IN NaOH nachgestellt. Die ADP-, Glucose-, CrP- und NADP-Lösung werden eingefroren aufbewahrt und wöchentlich frisch angesetzt. Die GSH- bzw. Cystein-Lösung wird täglich frisch hergesetllt und wie die ADP-, CrP-, NADP-Lösung und die Hilfsenzy-mö.auf "dem Arbeitsplatz im Eisbad aufbewahrt. Puffer und Glucose-Lösung werden im Wasserbad auf 37 erwärmt. Für jede Probe wird ein Haupt- und ein Leerversuch angesetzt. Der Leerversuch enthält anstelle der CrP-Lösung die entsprechende Menge Puffer. Gestartet wird nach 5 Min. Vorinkubation bei 37 mit CrP. Das Endvolumen beträgt 2,00 m/. Die Probenmenge richtet sich nach der Aktivität (bei.normalseren i. a. 0,20 m/). Auf das Endvolumen wird mit Puffer- aufgefüllt. Die Extinktionsänderung wird in Küvetten der Schichtdicke d = l cm im Photometer Eppendorf bei der Wellenlänge 366 nm gegen Luft gemessen, wobei die Extinktion mit einem linearisierenden Registriergerät (Hartmann & Braun) direkt geschrieben wird. Die Papierbreite, die einer Extinktionsänderung von 1,0 entspricht, beträgt 40 cm, die Geschwindigkeit des Papiertransportes l cm/min. Die Temperatur,, des Küvetteninhaltes wird mit Hilfe eines temperierbaren Küvetten-. halters auf 37±0,5 konstant gehalten. Zwecks Zeitersparnis wird die Extinktionsänderung in drei Ansätzen gleichzeitig bestimmt, indem die drei Küvetten durch Verschieben des Küvettenhalters etwa alle 30 Sek. in den Lichtweg des Photometers gebracht werden. 4. Indirekte Bestimmung über die Vorwärtsreaktion a) Zusammensetzung des Inkubationsgemisches (modifiziert nach 41): TRAP 50 mm ph 7,6, MgCl 2 4mM, ATP 4mM, Kreatin 25 HIM, PEP 0,8 mm, NADH 0,35 mm, GSH (bzw. Cystein) 5 mm, PK 1000 IE, LDH 2000 IE. b) Reagenzien: TRAP 50 mm ph 7,6, MgCl mm, ATP 80 mm, PEP 16 mm, Kreatin 80 mm, NADH 12 mm, GSH (Cystein) 200 mm, PK 125 /mg, LDH 360 IE/nig. MgCl 2, ATP, PEP, Kreatin, GSH (bzw. Cystein) werden in Puffer, NADH wird in l proz. NaHCO 3 -Lösung gelöst. Das ph der ATP- und GSH-Lösung wird mit IN NaOH nachgestellt. ATP-, PEP-, Kreatin- und NADH-Lösung werden eingefroren aufbewahrt und wöchentlich frisch angesetzt. Die GSH- bzw. Cystein-Lösung wird täglich frisch hergestellt und im Eisbad aufbewahrt. Bei der Durchführung der Bestimmung wird wie bei der Messung über die Rückwärtsreaktion vorgegangen..der Leerversuch enthält anstelle der Kreatin-Lösung die entsprechende Menge Puffer. Gestartet wird mit Kreatin-Lösung. 5. Berechnung der Enymaktiwtät Die Aktivität wurde nach den Richtlinien der International Union of Biochemistry" in Internationalen Einheiten (IE) berechnet. Eine Internationale Einheit ist als diejenige Enzymrhenge definiert, die in einer Min. l! Substrat umsetzt (nach Möglichkeit bei Substratsättigung und optimalem ph gemessen). Als Bezugsgröße wurden 1000 m/ gewählt. Die Meßtemperatur soll nach den Empfehlungen der Kommission aus dem Jahre , nach den Richtlinien aus dem Jahre 1964 dagegen 30 betragen. In den vorliegenden Untersuchungen wurde die Aktivität bei 37 gemessen, um die Empfindlichkeit der Bestimmung zu erhöhen. Bei den direkten Methoden wurde die Aktivität mit Hilfe eines Simultanstandards berechnet. Bei den Bestimmungen im optischen Test wurde die Aktivität entweder aus der Differenz der Extinktionsänderung in Haupt^ und Leerversuch mittels des molaren Extinktionskoeffizienten des NADH bzw. NAPPfl ermittelt oder mit einer graphischen Me^ thode (42) aus dem tang des Winkels zwischen der Abszisse und der direkt geschriebenen Meßgeraden berechnet. Ergebnisse und Diskussion 1. Direkte Bestimmung über die Rückwärtsreaktion In Vorversuchen wurde nachgewiesen, daß unter unseren Versuchsbedingungen mindestens bis zu einer Extinktion von 0,900 eine lineare Beziehung zwischen Kreatinmenge und Extinktion ( = 546 nm) besteht. In Abbildung l ist die im Testansatz nach HUGHES (21) gebildete Menge Kreatin in Abhängigkeit von der eingesetzten Serummenge wiedergegeben. Bei Versuch I wurde ein Serum mit einer Aktivität an der oberen Grenze der Norm (l 8 IE im optischen Test über die Vorwärtsreaktion), bei Versuch II ein Serum mit mäßig erhöhter Aktivität (114 IE im optischen Test über die, Vorwärtsreaktion) verwendet. Nur bei sehr niedrigen Enzymmengen wurde eine befriedigende Proportionalität zwischen Substratumsatz und Enzymkonzentration erzielt. Selbst bei Einsatz von nur 0,10m/ Normalserum einem Volumen, wie es* für diese Methode empföhlen wird ist eine Proportionalität nicht mehr gegeben. Weder durch Änderung der Konzentration Z. klift. 'Chem. u. klin. Biochem./5. Jahrg. 1967/Heft 5

4 Rotthauwe u. Kowalewski: Bestimmung der Serum-Kreatin-Phosphokinase M,0 Versuch v. 22.1K.6S x * Versuch y. 23.lf.65 / v. ^ 16 2l V* «72 U 0,02 0,0l 0,06 0,08 0,10ml Abb. l Beziehung zwischen Reaktionsgeschwindigkeit und Serummenge Rückwärtsreaktiofi, Kreatinbestimmung, Cysteinzusatz, t = 37, I = Serum mit normaler Aktivität, II = Serum mit erhöhter Aktivität. Abszisse: Serummenge pro Ansatz, Ordinate: Substratumsatz 0 0,05 0,10 0,15 0,30 0,25ml Abb. 2 Beziehung zwischen Reaktionsgeschwindigkeit und Serummenge Vorwärtsreaktion, Phosphatbestimmung, GSH-Zusatz, t = 37. Abszisse: Sertimmenge pro Ansatz, Ordinate: Substratumsatz 0 0,01 0,02 0,03 0,0l 0,05ml Abb. 3 Beziehung zwischen Reaktionsgeschwindigkeit und Serummenge Rückwärtsreaktion, optischer Test, GSH- Zusatz, t = 37. Abszisse: Serummenge pro Ansatz, Ordinate: Substratumsatz der einzelnen Komponenten des Inkubationsgemisches, Ersatz des Cysteins durch GSH oder Verwendung eines Puffers mit ph 7,0 konnte die Methode entscheidend verbessert werden. Bei der direkten Bestimmung über die Rückwärtsreaktion wurden an fünf Seren etwa dreimal höhere Aktivitäten als im optischen Test über die Vorwärtsreaktion gemessen. Eigene frühere Untersuchungen sprachen schon dafür, daß die CPK nach dem Prinzip von ENNOR und ROSENBERG (15) nur bei geringen Enzymkonzentrationen hinreichend zuverlässig bestimmt werden kann (31). ENNOR und ROSENBERG.(15) arbeiteten mit Inkubationszeiten von wenigen Minuten, da sich unter ihren Bedingungen bei der Rückwärtsreaktion schon nach 25 Min. ein Gleichgewicht eingestellt hatte. DREYFUS und SCHAPIRA (12,38), DUMAS und Mitarbeiter (13), HUGHES (21) und WILSON und Mitarbeiter (43), die diese Methode zur Bestimmung der CPK im Serum verwendeten, benutzten dagegen wesentlich längere Inkubationszeiten (meist 30 Min.). Nach HUGHES (21) soll bei seinem Ansatz bis zu einer Extinktion von 0,450 ( = 520 nm) eine linear mit der Serummenge ansteigende Reaktionsgeschwindigkeit bestehen. Er erzielte nur bei Zugabe von Cystein reproduzierbare Ergebnisse. Eine deutliche Aktivierung durch SM-Verbindungen, wie sie von ROTTHAUWE und Mitarbeiter (31) schon 1961 bei dieser Methode nachgewiesen wurde, wird von HUGHES (21) nicht erwähnt. DREYFUS und SCHAPIRA (11, 38) geben keine Dokumentation der Kinetik, empfehlen neuerdings (38) aber ebenfalls Cysteinzusatz. 2. Direkte Bestimmung über die Vonvärtsreaktion Die Abhängigkeit des Substratumsatzes von der eingesetzten Serummenge bei einstündiger Inkubationsdauer ist in Abbildung 2 wiedergegeben. Verwendet wurde ein Serum mit mäßig erhöhter Aktivität. Eine lineare Proportionalität wurde nur im Bereich kleiner Serummengen erzielt. Zu einem entsprechenden Ergebnis führte auch ein Zeit-Umsatz-Versuch, bei dem die eingesetzte Serummenge konstant gehalten wurde, die Inkubationsdauer aber von 15 bis 60 Min. variierte. Auf die rasche Abnahme der Reaktionsgeschwindigkeit mit der Inkubationsdauer wiesen schon KUBY und Mitarbeiter (24) hin. Sie bestimmten daher die Aktivität aus der Anfangsgeschwindigkeit, die sie durch mehrere Phosphat analysen innerhalb der ersten Minuten ermittelten. ROTTHAUWE und Mitarbeiter (31) wiesen schon in einer früheren Arbeit daraufhin, daß die Reaktionsgeschwindigkeit nur bei niedrigen Enzymkonzentrationen linear ansteigt. 3. Indirekte Bestimmung über die Rückwärtsreaktion Während der Vorinkubation (vor Zugabe des CrP) reagiert.das im ADP enthaltene ATP in weniger als 5 Min. quantitativ ab. Wird mit der Probe Adenylatkinase in den Ansatz gebracht (z. B. bei Seren von Patienten mit progressiver Muskeldystrophie), so wird aus dem ADP fortlaufend ATP gebildet und schon während der Vorinkubation eine kontinuierliche Extinktionszunahme hervorgerufen. Nach dem Start mit CrP läuft die Reaktion langsam an. Bei einer Reaktionstemperatur von 37 bleibt die Extinktionszunahme nach etwa 5 Min. für etwa 10 bis 12 Min. annähernd konstant. In den Ansätzen mit GSH- bzw. Cysteinzusatz macht sich dann eine kontinuierliche Abnahme der Extinktionsänderung bemerkbar, die in den Ansätzen ohne SH-Verbindung nicht nachweisbar ist. Die Konzentration an ADP, Glucose und NADP kann in relativ weiten Grenzen variiert werden, ohne daß sich die Reaktionsgeschwindigkeit deutlich ändert. Dagegen zeigt sich in den Ansätzen mit GSH und in einem geringeren Maße auch in denjenigen mit Cystein bei Steigerung der HK- wie der G-6-PDH-Menge eine deutliche Abnahme der NADPH-Bildung. Bei einer Verdoppelung der Hufs- bzw. Indikatorenzymmenge nimmt die Reduktionsgeschwindigkeit um 15 bis 30% ab. Wird darauf geachtet, daß in den Ansätzen stets die gleichen Mengen an Hufs- und Indikatorenzym eingesetzt werden, und wird stets der lineare Teil der Extinktionskurve ausgewertet, so läßt sich mit dieser Methode über einen weiten Bereich lineare Proportionalität zwischen Reaktionsgeschwindigkeit und Serumvolumen erzielen (Abb. 3). Wie bei den anderen Bestimmungsmethoden rufen SH-Verbindungen auch bei diesem Verfahren eine deutliche Aktivierung der Serum- CPK hervor. Bei vier Seren mit normaler oder leicht Z. klin. Chem. u. klin. Biochenx/5. Jahrg. 1967/Heft 5

5 258 Rotthauwe u. Köwalewski: Bestimmung der Serum-Kreatin-Phosphokinase erhöhter CPK-Aktivität wurden bei der Bestimmung im optischen Test über die Rückwärtsreaktion vierbis fünffach höhere Aktivitäten gemessen als in der Vorwärtsreaktion. 4. Indirekte Bestimmimg über die Vorwärtsreaktion Während der Vorinkubation (vor Zugabe des Kreatins) reagieren Verunreinigungen an Pyruvat und ADP unter NADH-Oxydation quantitativ ab. Enthalten Probe oder Hilfs- bzw. Indikatorenzym Adenylatkinase, so wird aus dem ATP stammendes AMP ebenfalls umgesetzt, da aus ATP und AMP in der Adenylatkinase-Reaktion ADP gebildet wird. Diese Umsetzungen sind bei 37 innerhalb 5 Min. beendet. Bei vielen Seren bleibt aber eine gleichmäßige Extinktionszunahme bestehen, die durch zwei im Serum vorkommende Enzyme bedingt ist. Durch die alkalische Phosphatase wird aus PEP Pyruvat abgespalten; die ATPase bildet ADP aus ATP. Pyruvat und ADP werden unter NADH-Oxydation fortlaufend umgesetzt. Der Anteil dieser Reaktionen an der Extinktionsabnahme wird für jedes Serum in einem Leerversuch ohne Kreatin ermittelt. Etwa 2 bis 3 Min. nach dem Start des Hauptversuches mit Kreatin ist eine konstante Reaktionsgeschwindigkeit erreicht. Um optimale Testbedingungen zu ermitteln, wurde der Einfluß der Konzentration an Substraten, Aktivatoren, Hilfs- und Indikatorenzym sowie die Abhängigkeit vom ph und von der Temperatur geprüft. Maximale Aktivität wird bei einer ATP- und MgCl 2 - Konzentration von 4mM erzielt. Diese Konzentration an Mg 2+ -Ionen reicht auch zur Aktivierung der PK aus. Zusatz von K + -Ionen zur Aktivierung der PK ist nicht erforderlich. Abbildung 4 zeigt die Beziehung 0,15 0,01 ^ Mol Min" 1 ' 1000 ml' 1 s - molar Km 1/0,057 = 17 0~ 2 molar 0,125 0,0163 0,0625 0,0103 0,0117 0, ,0313 0,0077 0,0250 0,007^1 0,06, 0,02 0 0,02 0,06 OftB 0,10 0,12 0,1t 1/\s\ Abb. 4 Bestimmung der Michaelis-Konstante der Serum-CPK für Kreatin nach LINEWEAVER und BURK Vorwärtsreaktion, optischer Test, GSH-Zusatz, t = 37 zwischen Substratumsatz und Kreatinkonzentration. Die Michaelis-Konstante für Kreatin wurde nach der graphischen Methode von LINEWEAVER und BURK zu 1, M bei 37 und ph 7,6 bestimmt. Wegen der relativ schlechten Löslichkeit des Kreatins wurde fürden Testansatz' mit 25 mm eine Konzentration gewählt, die außerhalb der Substratsättigung liegt. Die PEP- Konzentration von 0,8 mm kann als sicher optimal gelten. Weder bei der doppelten noch bei der halben PEP-Konzentration veränderte sich die Reaktionsgeschwindigkeit signifikant. Die NADH-Konzentration von 0,35 mm gewährleistet einen linearen Extinktionsablauf über einen weiten Bereich, obwohl ein Teil des NADH schon während der Vorinkubation oxydiert wird. Eine Hemmung der CPK-Reaktion durch das entstandene NAD wurde nicht festgestellt. GSH und Cystein haben in der geprüften Konzentration von 2 bis 20 mm praktisch die gleiche aktivitätssteigernde Wirkung (36). Für den Routineansatz wurde eine GSH- Konzentration von 5 mm gewählt. Die verwendeten Mengen an Hilfs- und Indikatorenzym gewährleisten einen linearen Reaktionsablauf, wenn die Extinktionsänderung 0,03 bis 0,04 pro Min. nicht überschreitet. Die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Temperatur ist in Abbildung 5 wiedergegeben. 3,2 3,3 W 3 /T 9 ph Abb. 5 Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Temperatur Vorwärtsreaktion, optischer Test, GS -Zusatz. Abszisse: 1000/T, Ordinate: log Aktivität Abb. 6 Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit vom ph Vorwärtsreaktion, optischer Test, GSH-Zusatz, t = 37. Abszisse: ph des Inkubationsgemisches. Ordinate: Aktivität in % 'des Maximalwertes Der Q 10 beträgt 1,80. Zur Prüfung des Einflusses des ph auf die Reaktionsgeschwindigkeit wurde ein TRIS- Puffer (100 mm) verwendet. Maximale Aktivität wird mit einem relativen breiten Optimum bei ph 9 erreicht (Abb. 6). Bei alkalischem ph ist allerdings bei den meisten Seren die Extinktionsabnahme im Leerversuch stärker als bei ph 7,6. Vier verschiedene Seren zeigten bei ph 9 (fünffache Menge an PK und LDH) eine 28 bis 36% höhere Aktivität als bei ph 7,6. Mit dem Ansatz kann innerhalb eines weiten Bereiches lineare Proportionalität zwischen Substratumsatz und Serummenge erzielt werden (Abb. 7). Bei Normalseren wird mit 0,20m/ Probenvolumen eine ausreichende Reaktionsgeschwindigkeit erreicht. Bei Seren mit erhöhter Akti- SO- 0 0,01 0,02 0,03 Oft* 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,10ml Abb. 7 Beziehung zwischen Reaktionsgeschwindigkeit und Serummenge Vorwärtsreaktion, optischer Test, GSH-Zusatz, t = 37. Abszisse: Serummenge pro Ansatz, Ordinate: Substratumsatz -

6 Rotthauwc u. Kowalewski: Bestimmung der Serum-Kreatin-Phosphokinase 259 vität wird bei einem Enzymwinkel" über 30 bis 40 die Bestimmung mit einer kleineren Serummenge wiederholt. Die obere Grenze des Normalbereiches (95%-Wert der prozentualen kumulativen Häufigkeit) bei muskelgesunden männlichen Erwachsenen (n = 50) Xvurde bei der Messung ohne GSH zu 4,5 IE, bei der Messung mit GSH zu 20,0 IE bestimmt. Der Mittelwert der nichtaktivierten CPK im frischen Serum betrug bei 35 Patienten mit gutartiger rezessiv x-chromosomaler Muskeldystrophie 84 IE, die der aktivierten CPK 293 IE. Abschließende Betrachtungen zu den verschiedenen Bestimmungsmethoden Die Bestimmung der Serum-CPK mit Hilfe der beiden direkten Methoden über die Vorwärts- oder die Rückwärtsreaktion liefert als Zwei-Punkt-Methode nur in einem sehr engen Bereich die erforderliche lineare Proportionalität zwischen Substratumsatz und Serumvolumen. Bei Aktivierung durch GSH oder Cystein ist selbst bei Normalseren diese Beziehung nicht gewährleistet, wenn die Bestimmung über die empfindlichere Rückwärtsreaktion durchgeführt wird und die von verschiedenen Autoren empfohlenen Serummengen eingesetzt werden. Für die Abnahme der Reaktionsgeschwindigkeit mit steigender Enzymmenge bzw. längeren Inkubationszeiten sind in erster Linie Aufbrauch des Substrates und Anstau hemmender Reaktionsprodukte verantwortlich. Bei Einsatz stark verdünnter Serumproben ist außerdem eine irreversible Enzyminaktivierung zu erwägen. Die direkten Bestimmungsmethoden erfordern stets mehrere getrennte Arbeitsgange (Ansetzen und Inkubation des Reaktionsgemisches, Abstoppen der Enzymreaktion und Enteiweißen, photometrische Bestimmung des gebildeten Kreatins bzw. Kreatinphosphates). Jede Bestimmung macht neben Haupt- und Leerversuch noch mindestens einen Reagenzienleerwert und einen Simultanstandard erforderlich. Bei falsch gewähltem.probenvolumen muß die Bestimmung wiederholt werden. Daher ziehen es verschiedene Autoren vor, von vornherein Inkubationen mit verschiedenen Serummengen durchzuführen, was allerdings einen weiteren Arbeits- und Zeitaufwand bedeutet. Trotz dieser Einwände lassen sich mit den beiden direkten Bestimmungsmethoden deutlich er^ höhte Aktivitäten sicher erkennen. Die Aufstellung verläßlicher Normalwerte und die Abgrenzung leicht pathologischer Aktivitäten dürfte aber schwierig sein. Beide indirekten Methoden liefern dagegen in einem großen Bereich lineare Proportionalität zwischen Serummenge und Reaktionsgeschwindigkeit. Ein Vorteil der Bestimmung im optischen Test ist der geringere Zeitaufwand. Bei gleichzeitiger Messung der Extinktionsänderung in drei Ansätzen werden bei Durchführung von Haupt- und Leerversuch für die Bestimmung in drei Seren etwa 30 Min. benötigt. Da sich der Reaktionsablauf direkt an der Lichtabsorption verfolgen läßt, kann bei zu schnellem oder zu langsamem Lauf die Bestimmung mit verändertem Probenvolumen sofort wiederholt werden. Bei der Bestimmung über die Rückwärtsreaktion tritt allerdings mit zunehmender Anhäufung von NADPH eine kontinuierliche Abnahme der Extinktionsänderung ein, die offensichtlich auf NADPH-verbrauchenden Nebenreaktionen beruht. Diese Methode macht daher eine kontinuierliche Extinktionsmessung durch Registrieren oder Ablesen in kurzen Zeitabständen erforderlich, damit die Aktivität aus dem linearen Teil der Extinktionskurve ermittelt werden kann. Ein weiterer Nachteil dieser Methode besteht darin, daß bei Zugabe von GSH oder Cystein die Aktivität der Serum-CPK zwar stark erhöht wird, gleichzeitig aber die Extinktionsänderung von der eingesetzten Menge an Hilfsund Indikatorenzym abhängig wird. Dieser Befund wird wahrscheinlich durch das Vorkommen von Fremdaktivitäten in Hilfs- und Indikatorenzym verursacht. Eine weitere Störung kann die Anwesenheit von ATPase hervorrufen. Bei hoher Aktivität ist mit einer Konkurrenz zwischen ATPase und Hexokinase um das ATP zu rechnen, das in der CPK-Reaktion gebildet wird. ]m Leerversuch läßt sich die ATPase nicht zuverlässig erfassen, da das "Substrat ATP nur bei Vorkommen von Adenylatkinase entsteht. Bei der Bestimmung über die Vorwärtsreaktion läuft die NADH-Oxydation praktisch bis zum völligen Verbrauch des reduzierten Coenzyms zeitlich linear ab, so daß hier eine Aktivitätsbestimmung gegebenenfalls auch aus einem Wertepaar erfolgen kann. Die Bestimmung im optischen Test über die Vorwärtsreaktion zeichnet sich durch eine geringe Störanfälligkeit aus. Der Einfluß anderer Enzyme wie der ATPase und der alkalischen Phosphatase läßt sich durch den Leerversuch zuverlässig eliminieren. Dadurch ist auch in hämolytischen Seren eine Bestimmung möglich. Während starke Veränderungen der PEP- und NADH- Konzentration die Reaktionsgeschwindigkeit nicht beeinflussen, besteht eine deutliche Abhängigkeit des Substratumsatzes von der ATP- und MgCl 2 -Konzentration. Da aber das in der CPK-Reaktion verbrauchte ATP in der Hilfsreaktion fortlaufend regeneriert wird, bleibt die ATP-Konzentration im Inkubationsgemisch konstant. Die in unserem Ansatz verwendete Kreatinkonzentration liegt mit 25 mm noch außerhalb der Substratsättigung, das gleiche gilt auch für die Inkubationsgemische anderer Untersucher. Der Einsatz höherer Konzentrationen wird durch die relativ schlechte Löslichkeit des Kreatins erschwert. Das ph-optimum der Vorwärtsreaktion beträgt 9,0. Aus folgenden Gründen erscheint es aber gerechtfertigt, von den Richtlinien der International Union of Biochemistry" abzuweichen, nach denen die Aktivitätsbestimmung bei optimalem ph durchgeführt werden soll: Bei ph 9 liegt das Gleichgewicht der LDH-Reaktion weit auf selten des Lactates; es ist daher der Einsatz größerer Mengen an Hilfs- und Indikatorenzym erforderlich. Außerdem ruft die alkalische Phosphatase bei ph 9 einen stärkeren Leerlauf hervor. Die Gefahr einer ph-verschiebung

7 260 Doss u. Mannheim: Bestimmung der Porphyrine im Urin bei unzureichender Pufferkapazität ist bei ph 9 größer als bei ph 7,6. Aufgrund der vorliegenden Untersuchungen kann die Bestimmung der durch GSH aktivierten Serum-CPK über die Vorwärtsreaktion im optischen Test als die am wenigsten störanfällige Methode mit einer auch für Normalseren ausreichenden Empfindlichkeit angesehen werden. Literatur 1. AEBI, U., R. RICHTERICH, J. P. COLOMBO und E. Rossi, Enzymol. biol. clin. /, 61 (1961/62). 2. ASKONAS, B. A., Biochem. J. 48,42 (1951). 3. BAUMANN, P., J. ESCHER und R. RICHTERICH, Schweiz. Zschr. Sportmed. 10, 33 (1962). 4. BERNT, E. und H. U. BERGMEYER, in: H.-U. BERGMEYER, Methoden der enzymatischen Analyse, S Verlag Chemie GmbH, Weinheim/Bergstraße (1962). 5. BURGER, A., R. RICH- TERICH und H. AEBI, Biochem. Z. 339, 305 (1964). 6. CHAPPELL, J. B. und S. V. PERRY, Biochem. J. 57, 421 (1954). 7. COLOMBO, J. P., R. RICHTERICH und E. Rossi, Klin. Wschr. 40, 37 (1962). 8. CONN, R. 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Januar 1967) Es wird eine quantitative Methode für die Analyse von Copro- und Uroporphyrin im Urin beschrieben. Sie besteht darin, daß nach Lyophilisierung des Urins Porphyrinmethylester hergestellt, dünnschichtchromatographisch isoliert und in Chloroform spektrophotometrisch gemessen werden. A quantitative method is reported for the analysis of copro- and uroporphyrin in urine. After lyophilisation of the urine, porphyrin methyl esters are prepared, isolated by thin layer chromatography and measured in chloroform solution. Porphyrine werden im allgemeinen als freie Säuren in wäßriger Salzsäure oder als Methylester in organischen Lösungsmitteln photo metrisch bestimmt (1=^5). Die Isolierung der freien Säuren erfolgt mit Adsorptionsund Extraktionsmethoden sowie mit säulenchromatographischen und papierelektrophoretischen Trennungsgängen (Zusammenstellung bei (1)). Die Porphyrinextrakte enthalten meist noch Verunreinigungen, so daß ihre quantitative Bestimmung durch Messung der Absorption in verschiedenen Wellenlängen und mit Hilfe von Korrekturfaktoren durchgeführt wird (6 S). Bei der Untersuchung des Porphyringehalts von Bakterienkulturfiltraten zeigte sich, daß kleinste Mengen von Protoporphyrin (< l nmol/rn/) nach direkter Ver 1 - esterung der Porphyrine im biologischen Material zu Methvlestern und anschließender dünnschichtchromato-