Optische Beobachtung von oberflächengebundenen und frei beweglichen Nanopartikeln

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1 Optische Beobachtung von oberflächengebundenen und frei beweglichen Nanopartikeln Von der Fakultät für Naturwissenschaften der Universität Duisburg-Essen (Campus Duisburg) zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation von Christiane Finder aus Berlin Duisburg 2005

2 Berichterstatter: Tag der mündlichen Prüfung: 06. April 2005 Prof. Dr. Christian Mayer Prof. Dr. Karl Molt

3 Danksagung Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. C. Mayer für die Überlassung des interessanten Themas sowie für seine fortwährende Diskussionsbereitschaft während der Erstellung dieser Arbeit. Herrn Prof. Dr. K. Molt danke ich herzlich für die Übernahme des Korreferates. Ich danke Herrn Dr. R. H. G. Müller für die große Hilfs- und Diskussionsbereitschaft bezüglich der digitalen Bildverarbeitung in den letzten Jahren. Für die Hilfe bei technischen Fragestellungen und der technischen Umsetzung bedanke ich mich bei Herrn U. Bachorski und den Mitarbeitern der Elektrowerkstatt. Herrn M. Zähres danke ich für die vielen praktischen Tipps bezüglich der Mikroskopie. Allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des EU-Projektes CHANIL danke ich für die gute Kooperation, insbesondere Dr. K. Pfeiffer und H. Schulz für den stetigen Informations- und Ideenaustausch. Besonderer Dank geht an die EU für die finanzielle Unterstützung. Den Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Fachgebietes Physikalische Chemie danke ich für die freundliche Arbeitsatmosphäre. Besonders gilt mein Dank Michael Wohlgemuth für die vielen anregenden Diskussionen. Alina Bauer danke ich für ihre Hilfsbereitschaft in den letzten Wochen. Ilka Broekmann und Natascha Emmerichs gilt ein ganz besonderer Dank für die tolle Zeit in unserem Büro. Meinen Freunden Frank und Corinna danke ich herzlichst für die aufopfernde Durchsicht des Manuskripts. Das größte Dankeschön widme ich meinen Eltern. Ihr habt mich auch über die große Entfernung während der ganzen Zeit konsequent unterstützt und an mich geglaubt.

4 Das Schönste, was wir entdecken können, ist das Geheimnisvolle. Albert Einstein

5 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Optische Methoden Fluoreszenzmikroskopie PhysikalischeundchemischeBetrachtungderFluoreszenz Auflicht-Fluoreszenzmikroskopie Dunkelfeldmikroskopie Bildentstehung im Mikroskop und das Auflösungsvermögen DigitaleBildverarbeitung Bildgewinnung mittels einer CCD-Kamera Digitalisierung Bildverarbeitungund-analyse Oberflächengebundene Nanopartikel Nanoimprintlithographie und deren Anwendung Herkömmliche Methoden zur Qualitätssicherung Rasterelektronenmikroskopie(SEM) Rasterkraftmikroskopie(AFM) Brownsche Bewegung von frei beweglichen Nanopartikeln Theoretische Grundlagen zur Brownschen Bewegung ExperimentelleBeobachtungderBrownschenBewegung i

6 ii INHALTSVERZEICHNIS 5 Experimenteller Teil MikroskopieunddigitaleBildverarbeitung Auflicht-Fluoreszenzmikroskopie Durchlicht-Dunkelfeldmikroskopie DigitaleBildverarbeitung Oberflächengebundene Nanopartikel FluoreszenzspektroskopischeUntersuchungen StabilitätsbestimmungdesFarbstoffes Bestimmung und Charakterisierung von Defekten auf den PrägungenunddenStempeln Qualitätssicherung während einer Serie von Nanoprägungen StempelundPolymer Prägeprozess und Qualitätssicherung mittels Fluoreszenzmikroskopie GrößenbestimmungvonfreibeweglichenNanopartikeln Polystyrolstandards Polystyrolstandards in der Durchlicht-Dunkelfeldmikroskopie Polystyrolstandards in der Auflicht-Fluoreszenzmikroskopie Probenvorbereitung Partikelkonzentrationen in der Dunkelfeldmikroskopie Partikelkonzentrationen in der Fluoreszenzmikroskopie MessungundDatenauswertung Größenbestimmung mittels der Dunkelfeldmikroskopie Größenbestimmung mittels der Fluoreszenzmikroskopie 73 6 Ergebnisse und Diskussion Oberflächengebundene Nanopartikel CharakterisierungdesFluoreszenzmarkers... 76

7 INHALTSVERZEICHNIS iii Fluoreszenzspektroskopische Untersuchungen des Farbstoffes Bestimmung der minimalen Farbstoffkonzentration Bestimmung der StabilitätdesFarbstoffes QualitätssicherunginderNanoimprintlithographie Charakterisierung der auftretenden Defekte in der Prägung Detektion von Defekten auf dem Stempel und auf der Prägung Bestimmung der Qualität einer Nanoprägung QualitätssicherunganeinemStempel FreibeweglicheNanopartikel Bildverarbeitung und -analyse zur Größenbestimmung von frei beweglichennanopartikeln GrößenbestimmungmittelsderDunkelfeldmikroskopie GrößenbestimmungmittelsderFluoreszenzmikroskopie VergleichdermikroskopischenMethoden Zusammenfassung 137 A Bildverarbeitungsprogramme 139 A.1 MathematicaProgramm A.2 MakrozurBildverarbeitungund-analyse A.3 Excel Makro zur Spurenanalyse von frei beweglichen Nanopartikeln A.4 Excel Makro zur Erstellung der Histogramme der Größenverteilungen. 154 Literaturverzeichnis 161

8 iv INHALTSVERZEICHNIS

9 Kapitel 1 Einleitung Die Nanotechnologie wird als die Schlüsseltechnologie des 21. Jahrhunderts bezeichnet. Der Begriff Nano kommt aus dem Griechischen (nanos) und bedeutet Zwerg. Die Nanotechnologie bewegt sich in einem Größenbereich unter 100 nm. Als Erfinder dieser Technologie gilt der amerikanische Physiker Robert Feynman, der 1959 auf einem Treffen der Amerikanischen Physikalischen Gesellschaft die visionäre Rede mit dem Titel There s plenty of room at the bottom hält [1]. Das Wort Nanotechnologie prägt 1974 der Japaner Norio Taniguchi. Seine Definition umfasst alle Verfahrenstechniken, die zu Dimensionen unter 100 nm führen oder mit einer Genauigkeit im Nanometerbereich arbeiten [2]. Die Nanotechnologie beschäftigt sich mit der Entwicklung von Materialien im Nanometerbereich und der Erforschung der Eigenschaften dieser Materialien, um diese Aspekte in technische Entwicklungen umzusetzen. Dieses interdisziplinäre Forschungsgebiet vereint Wissenschaftler unterschiedlichster Fachrichtungen, wie Chemiker, Physiker, Materialwissenschaftler, Elektrotechniker, Biologen und Mediziner, um nur einige zu nennen. Daraus leitet sich auch die Vielzahl der Anwendungsmöglichkeiten ab, die in Nanochemie, Nanomaterialien, Nanoelektronik, Nanooptik oder Nanoanalytik unterteilt werden können [2]. Diese Arbeit befasst sich mit der Nanoanalytik, das heißt der Untersuchung von Eigen- 1

10 2 1. Einleitung schaften von Materialien und Bauelementen im Nanometerbereich. Die Grundlage der hier vorgestellten Analysemethoden bildet die optische Mikroskopie in Verbindung mit der digitalen Bildverarbeitung. Es ist zwischen zwei Analysemethoden zu unterscheiden: Der Beobachtung von oberflächengebundenen Nanopartikeln und der Beobachtung von frei beweglichen Nanopartikeln. Die Analysemethode zur Beobachtung und Untersuchung von oberflächengebundenen Nanopartikeln kann u. a. im Bereich der Qualitätssicherung in der Nanoimprintlithographie angewendet werden (vgl. Kapitel 6.1.2). Hierbei handelt es sich um eine neue Methode zur Herstellung nanostrukturierter Oberflächen, z. B. in der Halbleiterindustrie (siehe Kapitel 3). Mittels der Fluoreszenzmikroskopie und der digitalen Bildverarbeitung können Defekte in den Prägungen charakterisiert und die Einheitlichkeit der Prägungen bestimmt werden. Ferner ist eine quantitative Qualitätskontrolle an dem Prägestempel möglich. Die Analysemethode zur Beobachtung frei beweglicher Nanopartikel dient u. a. zur Größenbestimmung von in Wasser suspendierten Nanopartikeln (Kapitel 6.2). In Abhängigkeit von den Eigenschaften der Nanopartikel können verschiedene mikroskopische Methoden eingesetzt werden. Die Auswertung basiert auf der von Einstein und Smoluchowksi entwickelten Gleichung zur Beschreibung der Brownschen Bewegung sowie den darauf folgenden mikroskopischen Untersuchungen verschiedener Wissenschaftler Anfang des 20. Jahrhunderts [3, 4, 5, 6, 7]. Die Entwicklung dieser Analysemethoden hat das Ziel, im Vergleich zu den herkömmlich angewendeten Methoden kosteneffizientere Möglichkeiten aufzuzeigen, die ferner durch eine hohe Benutzerfreundlichkeit und eine sehr gute Reproduzierbarkeit charakterisiert sind.

11 Kapitel 2 Optische Methoden Obwohl die Geschichte der Naturwissenschaft in engem Zusammenhang mit der Geschichte der Mikroskopie steht, gilt das Mikroskop erst seit Beginn des 20. Jahrhunderts als Symbol der Wissenschaft. Heute wird das Mikroskop als Forschungsinstrument in einer großen Anzahl von unterschiedlichen Anwendungsgebieten genutzt, wie im Bereich der Biologie und der Medizin, der Nahrungsmittelindustrie, der Textiltechnik, im Bereich der Mineralogie und der Geologie oder der Elektroindustrie, zum Beispiel zur Untersuchung von Werkstoffeigenschaften [8, 9]. Die Erfindung des Mikroskops steht in engem Zusammenhang mit der Erfindung des Fernrohres Anfang des 17. Jahrhunderts. Als Erfinder werden sowohl Hans und Zacharias Jansen aus Holland als auch Johannes Kepler, der das astronomische Fernrohr entwickelt hat, genannt. Auch Galileo Galilei nutzt das Fernrohr durch einen veränderten Abstand zwischen Objektiv und Okularlinse als Vergrößerungsglas für mikroskopische Beobachtungen. Der Begriff Mikroskop stammt von den Mitgliedern der Academia dei Lincei (Luchsäugige) in Rom, zu denen auch Galilei gehört. Schon in der ersten Hälfte des 17. Jahrhunderts wird das einfache, aus nur einer Linse bestehende Mikroskop entwickelt. Der Niederländer Anthony van Leuwenhoek, der erste Mikroskopiker von Weltruf, baut um 1665 zum ersten Mal ein Mikroskop mit einem Abbildungsmaßstab von 200 : 1. Zu seinen Entdeckungen gehören u. a. die Faserstruktur der Augenlinse, die Querstreifung der Muskelfaser sowie die ersten Beobachtungen von Bakterien. 3

12 4 2. Optische Methoden Aus dieser Zeit stammt auch die Entdeckung des Aufbaus der Zelle durch den englischen Physiker und Naturforscher Robert Hooke, der den Begriff Zelle prägt stellt Isaac Newton die Emanationstheorie auf. Er postuliert, dass das Licht eine Teilchenstrahlung ist, der er zur Erklärung der Lichterscheinung bestimmte Eigenschaften zuschreiben kann. Im Jahre 1677 stellt Christian Huygens die Undulationstheorie auf, die die Lichtausbreitung als Wellenbewegung beschreibt. Diese Theorie wird erst 1802 von Thomas Young durch Interferenzversuche bestätigt. Im 18. Jahrhundert stagniert die Entwicklung der Mikroskope, da die störenden Farbfehler der Linsen nicht beseitigt werden können. Erst zu Beginn des 19. Jahrhunderts kommt es durch J. von Fraunhofer zu einer neuen Ära der technischen Optik. Er entdeckt bei der Zerlegung des Sonnenlichts im Spektrum mehrere schwarze Linien, wohingegen das Licht von ganz bestimmten Farbtönen im Spektrum fehlt. Aufgrund der Lage und der Verteilung der Linien können diese den chemischen Elementen im äußeren Teil der Sonne zugeordnet werden. Auf seinen Arbeiten basiert die Berechnung von Okularen und Objektiven [8, 9]. Ende des 19. Jahrhunderts gelingt es, optisches Glas zu schmelzen. Zuvor entwickelt E. Abbe seine Theorie zur Bildentstehung im Mikroskop, die die Berechnung der Wirkung eines abbildenden optischen Systems ermöglicht. Auf der Basis dieser Berechnungen stellt O. Schott in Jena 1879 die ersten optischen Gläser her. Seit 1886 vertreibt C. Zeiss auf den Berechnungen von Abbe basierende apochromatische Objektive, die im Vergleich zu den Achromaten für drei anstelle von zwei Farben des Spektrums korrigiert sind. Damit tritt zunächst ein Abschluss in der Entwicklung der Mikroskopoptik ein. Man hat mit den zur Verfügung stehenden Mitteln die theoretisch mögliche Auflösungsgrenze erreicht. Eine Steigerung der Auflösungsgrenze ist nur durch Verwendung kürzerer Wellenlängen möglich [9, 10].

13 2.1 Fluoreszenzmikroskopie Fluoreszenzmikroskopie Zur Erhöhung der Auflösung bei der mikroskopischen Abbildung empfiehlt E. Abbe 1878 die Anwendung von ultraviolettem Licht entwickelt A. Köhler die Ultraviolettmikroskopie. Durch die Nutzung einer Lichtquelle mit einer Wellenlänge von 260 nm kann das Doppelte des bisherigen Auflösungsvermögens erreicht werden. Aus der unbedeutenden Ultraviolettmikroskopie leitet sich die Fluoreszenzmikroskopie ab. Die ersten handelsüblichen, mit Kohlebogenlampen ausgestatteten Fluoreszenzmikroskope bieten C. Reichert und O. Heimstädt 1911 in Wien und 1913 C. Zeiss und H. Lehmann an. Die Untersuchungen beschränken sich auf pflanzliche Zellen und Gewebe, die Primärfluoreszenz aufweisen. In der 1929 von P. Ellinger eingeführten Vitalmikroskopie wird das Präparat zum ersten Mal mit einem Fluorochrom behandelt entwickelt M. Haitinger die Sekundärfluoreszenz, in der das zu untersuchende Objekt mit einem Fluorochrom eingefärbt wird. Bei Bestrahlung mit UV-Licht emittiert dieses Fluoreszenzlicht. Der als Fluorochromierung bezeichnete Vorgang macht die Fluoreszenzmikroskopie auch für die Zoologie interessant. Basierend auf dem Fluorochrom Fluoresceinisothiocyanat (FITC), das N. H. Kaplan und A. H. Coon zusammen entwickeln, wird 1941 die Immunofluoreszenz-Mikroskopie, eine spezielle Methode zur Fluorochromierung von Antikörpern, eingeführt, die heute zu den Standardmethoden gehört. Weitere Einflüsse auf die Fluoreszenzmikroskopie haben E. M. Brumberg und J. S. Ploem. Brumberg rüstet das Fluoreszenzmikroskop mit Interferenzfiltern, so genannten dichromatischen Teilerspiegeln, aus. Ploem entwickelt die nach ihm benannte epi-beleuchtungseinrichtung (Ploemopak 1 und Ploemopak 2) mit austauschbaren dielektrischen Teilerspiegeln und Interferenzfiltern für einfache sowie Mehrwellenlängen- Fluoreszenzmikroskopie werden die Kohlebogenlampen durch die heute üblichen Quecksilber-Hochdrucklampen ersetzt [9, 11, 12, 13].

14 6 2. Optische Methoden Physikalische und chemische Betrachtung der Fluoreszenz Die Fluoreszenz ist eine Art der möglichen Lichterscheinungen, die unter dem Oberbegriff Lumineszenz zusammengefasst werden. Die Lumineszenz beschreibt die Emission von Licht im sichtbaren, im UV- und im IR-Spektralbereich basierend auf dem Elektronenübergang von einem energetisch höheren Zustand auf einen energetisch niedrigeren Zustand. Die Art der Lumineszenz ist dabei von der Art der Anregung der Elektronen eines Moleküls abhängig. Wird die zur Anregung notwendige Energie durch die Absorption von Photonen, z. B. in Form von ultraviolettem oder blauem Licht, erhalten, spricht man von Photolumineszenz. Diese wird unterteilt in Fluoreszenz und Phosphoreszenz. Der Rahmen dieser Arbeit beschränkt sich auf die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Fluoreszenz. Weitere bekannte Arten der Lumineszenz, die nicht behandelt werden, sind Chemo-, Bio-, Radio-, Mechano-, Thermo- oder Elektrolumineszenz [13, 14]. Ein Molekül kann durch Absorption von Photonen von dem Singulett-Grundzustand (S 0 ) in eines der Schwingungsniveaus der angeregten Zustände (S 1 oder S 2 ) übergehen. Der Übergang eines Elektrons in ein energetisch höheres Orbital führt zu einer veränderten Ladungsverteilung in dem Molekül. Die Zeit der Absorption liegt innerhalb von Sekunden, wobei sich gemäß dem Franck-Condon-Prinzip die Kernabstände nicht wesentlich ändern. Die Übergänge zwischen dem S 0 -Zustand und den Singulettund Triplettzuständen sind schematisch in dem Jablonski-Diagramm in Abbildung 2.1 dargestellt. Die Rückkehr des Elektrons in den S 0 -Zustand kann durch verschiedene Desaktivierungsprozesse, z. B. über Emissionsmechanismen oder strahlungslose Mechanismen, erfolgen, in denen die zusätzliche Energie an die Umgebung abgegeben wird. Zu den Emissionsmechanismen zählen die Fluoreszenz und die Phosphoreszenz, während die innere Umwandlung (engl.: internal conversion (IC)), die Schwingungsrelaxation (engl.: vibrational relaxation (VR)) und der Interkombinationsübergang (engl.: intersystem crossing (ISC)) zu den strahlungslosen Mechanismen gehören [13, 15, 16].

15 2.1 Fluoreszenzmikroskopie A HC EA ) HA C K C D ) D ) 8 4. K HA I A 6 2 D I F D HA I A Abbildung 2.1: Jablonski Diagramm. VR = Schwingungsrelaxation; IC = Innere Umwandlung; ISC = Interkombinationsübergang [15, 16]. Bei dem Interkombinationsübergang wechselt das Molekül von einem angeregten Singulettzustand unter Spinumkehr in einen angeregten Triplettzustand. Unter Schwingungsrelaxation fällt das Molekül auf das geringste Schwingungsniveau des T 1 -Zustands, von dem aus die Rückkehr in den Grundzustand unter Emission eines Photons möglich ist. Die Rückkehr von dem T 1 -Zustand in den Grundzustand wird Phosphoreszenz genannt. Diese Art der Photolumineszenz soll hier jedoch nicht näher erläutert werden [13]. Bei der inneren Umwandlung erfolgt der strahlungslose Übergang von einem höheren elektronischen Zustand in einen energetisch niedrigeren Zustand ohne Veränderung der Spinmultiplizität. Durch Kollision mit anderen Molekülen, z. B. den Lösemittelmolekülen, wird bei der Schwingungsrelaxation die Schwingungsenergie in Wärme umgewandelt. Dabei relaxiert das angeregte Molekül in ungefähr Sekunden auf das kleinste Schwingungsniveau des ersten angeregten Zustands bzw. auf das Schwingungsniveau, das nach der Boltzmann-Verteilung dem thermischen Gleichgewicht entspricht. Die Schwingungsrelaxation kann auch von dem S 1 (ν = 0)-Zustand in den Grundzustand

16 8 2. Optische Methoden erfolgen. Dieser Übergang ist jedoch aufgrund der relativ großen Energiedifferenz zwischen dem S 1 - und dem S 0 -Zustand wesentlich langsamer. Die Geschwindigkeit dieses Prozesses liegt in der Größenordnung der Geschwindigkeit der Fluoreszenz [13, 16, 17]. Das Phänomen der Fluoreszenz entsteht durch den Übergang eines Moleküls von dem angeregten Singulettzustand S 1 (ν = 0) unter Emission eines Photons in den S 0 - Zustand. Die Lebensdauer des angeregten S 1 -Zustands und damit auch die Abklingzeit der Fluoreszenz beträgt ungefähr 10 9 bis 10 8 Sekunden. Nach dem Gesetz von Stokes ist die Wellenlänge der Emission aufgrund der geringeren Energie des emittierten Photons länger als die der Anregung. Die Wellenlänge der Emission und somit die Quantenenergie des emittierten Photons hängt ausschließlich von dem Energieunterschied zwischen dem S 1 - und dem S 0 -Zustand und nicht von der Quantenenergie des absorbierten Photons ab (Stokes-Fluoreszenz). Die Anti-Stokes-Fluoreszenz stellt eine Ausnahme dar, in der die Energie der Emission höher ist als die der Anregung. Das Molekül ist bereits in einem höheren Schwingungsenergieniveau, bevor es das Photon absorbiert, oder die zusätzlich benötigte Energie wird durch thermische Energie zugeführt. Die Emission von Photonen mit der gleichen Energie wie der der absorbierten Photonen heißt Resonanz-Fluoreszenz. Diese wird jedoch nur in Festkörpern oder Gasen, aber niemals in Flüssigkeiten beobachtet [13]. Substanzen, die Fluoreszenzlicht ausstrahlen können, werden Fluorochrome oder Fluorophore genannt. Fluorochrome sind alle Farbstoffe, die ein nicht fluoreszierendes Objekt fluoreszieren lassen, während Fluorophore lediglich Atomgruppierungen organischer Verbindungen sind, die die Fluoreszenz ermöglichen. Die Fluoreszenz wird in zwei Erscheinungen unterteilt, der Primärfluoreszenz und der Sekundärfluoreszenz. Primärfluoreszenz ist die Eigenschaft einiger Substanzen, von sich aus bei Anregung mit kurzwelliger Strahlung Fluoreszenzlicht zu emittieren. Diese Art der Fluoreszenz wird auch als Eigen- oder Autofluoreszenz bezeichnet. Bei der Autofluoreszenz handelt es sich um eine ungewollte Fluoreszenzerscheinung, die z. B. bei mikroskopischen Objektiven auftreten kann. Da die meisten zu untersuchenden Objekte keine Primärfluoreszenz

17 2.1 Fluoreszenzmikroskopie 9 aufweisen, werden Fluorochrome zum Färben bestimmter Objektstrukturen verwendet. Dieser Färbeprozess wird Fluorochromierung genannt und die so auftretende Fluoreszenz wird als Sekundärfluoreszenz bezeichnet [12]. 5! 5 "! 5 J A I 8 A HI? D EA > K C HA = JEL A 1 JA I EJ J 5 F EA C A A > A A ) > I HF JE - EI I E 9 A A C A Abbildung 2.2: Schematische Darstellung eines typischen Absorptions- und Emissionsspektrums. Das Absorptions- und Emissionsspektrum lässt sich aus dem entsprechenden Jablonski-Energiediagramm ableiten [18, 19]. Die unterschiedlichen Elektronenkonfigurationen der Fluorophore ergeben ein substanzspezifisches Absorptions- und Emissionsspektrum, das schematisch in der Abbildung 2.2 dargestellt ist [14, 18, 19]. In dem Absorptionsspektrum ist die zur Anregung benötigte Wellenlänge λ gegen die Gesamtintensität der emittierten Fluoreszenz aufgetragen. Zur Aufnahme des Spektrums wird die Probe mit unterschiedlichen Wellenlängen angeregt und für jede Wellenlänge die Intensität der Fluoreszenzemission gemessen. Die Form des Spektrums stellt den Energieunterschied zwischen dem S 0 -Zustand des Fluorophors und den bevorzugten Schwingungsniveaus des S 1 -Zustands dar. Hin zu längeren Wellenlängen ist die Energie der Photonen zu gering, um das Fluorophor in den ersten angeregten Zustand (S 1 ) anzuregen. Im Bereich kürzerer Wellenlängen hat das Absorptionsspektrum einen langen Rest mit möglichen zusätzlichen Peaks entsprechend dem S 2 -Zustand oder noch höheren Zuständen [13, 15].

18 10 2. Optische Methoden In dem Emissionsspektrum ist die relative Intensität des emittierten Lichtes zu dessen Wellenlänge aufgetragen. Es zeigt die Fluoreszenzintensitätsverteilung bei der Anregung mit einer bestimmten Wellenlänge. Nach dem Stokesschen Gesetz sind die Wellenlängen der Emission länger als die der Anregung. Der Höchstwert entspricht dem Übergang von dem geringsten Schwingungsniveau des S 1 -Zustands in das bevorzugte Schwingungsniveau des S 0 -Zustands. Hin zu kürzeren Wellenlängen fällt das Spektrum steil ab, da die Energie der emittierten Photonen nicht höher sein kann als die Differenz zwischen den geringsten Schwingungsniveaus von S 1 und S 0.Imlängerwelligen Bereich hat das Spektrum einen langen Rest, da die Fluoreszenz fast immer durch den Übergang des geringsten Schwingungsniveaus von S 1 zu dem geringsten Schwingungsniveaus von S 0 entsteht. Beide Spektren entsprechen Wahrscheinlichkeitsverteilungen. Das Absorptionsspektrum gibt die Wahrscheinlichkeit wieder, mit der ein Photon einer bestimmten Quantenenergie absorbiert wird und Fluoreszenz erzeugt. Das Emissionsspektrum stellt die Wahrscheinlichkeit dar, mit der ein Photon einer bestimmten Quantenenergie emittiert wird. Der Spiegelbildcharakter der Spektren resultiert aus der Verknüpfung der Wahrscheinlichkeit, mit der ein Elektron in ein bestimmtes Schwingungsenergieniveau des S 0 -Zustands zurückfällt, mit der Wahrscheinlichkeit, mit der sich das Elektron vor der Anregung in einer bestimmten Position des S 0 -Zustands aufgehalten hat. Die Differenz zwischen den beiden Intensitätsmaxima wird Stokes Verschiebung genannt. Dieser Unterschied in den Wellenlängen ist die Grundlage für die Beobachtung von Fluoreszenz mittels der Fluoreszenzmikroskopie [13, 15, 19] Auflicht-Fluoreszenzmikroskopie Es gibt zwei Arten der Fluoreszenzmikroskopie, die Durchlicht-(dia)- und die Auflicht- (epi)-fluoreszenzmikroskopie, die sich nur durch die Anordnung der Lichtquelle unterscheiden [14]. Bei der hier vorgestellten Methode handelt es sich um die Auflicht- Fluoreszenzmikroskopie. In Abbildung 2.3 sind die Komponenten eines Auflicht-Fluoreszenzmikroskops inklusive des Beleuchtungsstrahlengangs und des Abbildungsstrahlen-

19 2.1 Fluoreszenzmikroskopie 11 gangs dargestellt. Die Anordnung der Komponenten entspricht der von A. Köhler entwickelten Beleuchtungsanordnung, bei der ein optisch erzeugtes homogenes Lichtfeld entscheidend ist. " #! ' & & ' = > " %! # $ % Abbildung 2.3: Schematische Darstellung eines Auflicht-Fluoreszenzmikroskops nach dem Köhlerschen Beleuchtungsverfahren [14, 13]. 1 Universal-Mikroskop; 2 Objekttisch mit Probenträger; 3 Objektivrevolver mit Objektiv; 4 Lampenhaus; 5 Fluoreszenzilluminator mit Filterblock; 6 Trinokular; 7 Anschlussmöglichkeit für weitere Beleuchtung; 8 Hilfsspiegel; 9 Quecksilber- Hochdrucklampe; 10 Kollektorlinse; 11 Hilfslinsen; 12 Leuchtfeldblende; 13 Erregerfilter; 14 Sperrfilter; 15 Dichromatischer Teilerspiegel; 16 Objektivlinse; 17 Probe; 18 Sehfeldblende mit Zwischenbildebene; 19 Okularlinse; 20 Auge oder Kamera; grün: Abbildungsstrahlengang; blau: Beleuchtungsstrahlengang. Das von der Lichtquelle ausgesandte kurzwellige Licht wird zunächst von einer Kollektorlinse (10) auf die Leuchtfeldblende (12) gelenkt, die die Größe des Beleuchtungsfeldes

20 12 2. Optische Methoden bestimmt. Dadurch entspricht das Beobachtungsfeld dem Beleuchtungsfeld, so dass die Belichtung außerhalb dieses Bereichs liegender Teile durch Streulicht verhindert und der Kontrast verbessert wird. Von der Leuchtfeldblende wird das Licht auf das Erregerfilter (13) gelenkt. Es trifft dann auf einen dichromatischen Teilerspiegel (15), der das Licht zu dem Objektiv (16) lenkt. Das Objektiv dient hierbei zusätzlich als Kondensor, der die Anregungsstrahlung im Objektfeld zentriert, die zum Teil vom Objekt absorbiert und als längerwelliges Fluoreszenzlicht emittiert wird. Das emittierte Licht wird im Objektiv gesammelt und wieder auf den dichromatischen Teilerspiegel geleitet. Da in der Fluoreszenzmikroskopie die Probe selbst als neue Lichtquelle fungiert, ist nur die Apertur des Objektivs für die Köhlersche Beleuchtung von Bedeutung, so dass die maximale Auflösung von dem verwendeten Objektiv abhängig ist. Der dichromatische Teilerspiegel lässt das Fluoreszenzlicht durch, das anschließend auf ein Sperrfilter (14) trifft. Dieses absorbiert gegebenenfalls das restliche vom Objekt reflektierte Anregungslicht, so dass ausschließlich das emittierte Licht zum Okular (19) geleitet wird. Auf diese Weise ergibt sich ein farbiges Bild auf dunklem Untergrund, wobei die Farbe von der Art der Fluoreszenz abhängig ist [12, 14, 20]. Im Vergleich zu der Durchlicht-Fluoreszenzmikroskopie besteht durch die gleichzeitige Nutzung des Objektivs als Kondensor bei der Auflicht-Fluoreszenzmikroskopie der Vorteil nur einer optischen Achse. Das erleichtert die Handhabung beim Fokussieren des Lichtes auf die Probe und verhindert ein Ausbleichen der Probe durch Streulicht. Der Einsatz hochaperturiger Immersionsobjektive führt zu helleren Fluoreszenzbildern als bei der Durchlicht-Methode. Außerdem lässt sich die Auflicht-Fluoreszenzmikroskopie mit anderen Methoden, wie zum Beispiel mit der Phasenkontrast-, Dunkelfeld- oder Hellfeld-Mikroskopie, zu Simultan- oder Alternativverfahren kombinieren. Bei der Verwendung von Auflicht ist es ferner möglich, auch lichtundurchlässige Proben, wie zum Beispiel Si-Wafer, zu untersuchen. Die Nachteile der Auflicht-Fluoreszenzmikroskopie beschränken sich auf die höheren Kosten, z. B. für die notwendige Beleuchtungseinrichtung, die zu der kostenintensiveren Mikroskopieausstattung zählt, und für die Objektive mit einer hohen numerischen Apertur und einem geringen Arbeitsabstand [13, 14, 20].

21 2.1 Fluoreszenzmikroskopie 13 Wie aus der Abbildung 2.3 hervorgeht, zählen die Lichtquelle, die verschiedenen Filter im Strahlengang und die verwendeten Objektive zu den wichtigsten Komponenten der Auflicht-Fluoreszenzmikroskopie. Im Nachfolgenden wird daher kurz auf die charakteristischen Eigenschaften einiger dieser Komponenten eingegangen. Abbildung 2.4: Emissionsspektrum einer Quecksilber-Hochdrucklampe [20]. Die Wahl der Lichtquelle ist abhängig von dem Absorptionsspektrum des Fluorochroms, da die Strahlungsintensität ausreichen muss, um die Fluoreszenz anzuregen. Die erhaltene Fluoreszenzintensität ist abhängig von der Emissionsintensität der gewählten Lichtquelle und der Absorptionsintensität des Fluorochroms für die emittierte Wellenlänge. Im Allgemeinen werden in der Fluoreszenzmikroskopie heutzutage Quecksilberoder Xenon-Hochdrucklampen eingesetzt. Diese gehören zu den Gasentladungslampen, die aus zwei Elektroden in einem mit dem entsprechenden Gas gefüllten Glaskolben bestehen [13, 20, 21]. Durch Anlegen eines starken elektrischen Feldes wird eine geringe Anzahl von Elektronen beschleunigt. Wenn ihre Energie größer ist als die Ionisierungsenergie des Gases, kommt es durch Stöße mit neutralen Gasmolekülen zu der so genannten Stoßionisation, die sich lawinenartig fortsetzt. Das Auftreffen auf diese Weise erzeugter energiereicher Ionen auf die Kathode führt dort zum Herauslösen von Elektronen und somit zur ständigen Bildung neuer elektrischer Ladungsträger. Sehr

22 14 2. Optische Methoden große Entladungsströme bewirken eine so starke Erhitzung der Elektroden, dass die Elektronen aus der Kathode durch Glühemission herausgelöst werden, woraus die Bogenentladung resultiert [22, 23]. Das Emissionsspektrum einer herkömmlichen Quecksilber-Hochdrucklampe ist in der Abbildung 2.4 wiedergegeben. Es besteht aus einem Grundkontinuum, das im ultravioletten, sichtbaren und infraroten Spektralbereich etwa die gleiche Stärke aufweist. Die charakteristischen Spektrallinien sind in der Tabelle 2.1 wiedergegeben. Tabelle 2.1: Die charakteristischen Spektrallinien einer Quecksilber-Hochdrucklampe mit ihren relativen Intensitäten bezogen auf die Linie bei 546,1 nm [13]. Wellenlänge [nm] rel. Intensität [%] Wellenlänge [nm] rel. Intensität [%] 365,0 ultraviolett 0,74 435,8 blau 1,40 365,5 ultraviolett 0,17 546,1 grün 1,00 366,3 ultraviolett 0,12 577,0 gelb 0,14 404,7 violett 0,74 579,0 gelb 0,15 Aufgrund der großen Strahlungsintensität im ultravioletten, violetten sowie blauen Spektralbereich werden Quecksilberlampen als Universallampe für die Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt, während Xenonlampen nur bei Blau- oder Grünanregung verwendet werden [13, 14, 20]. Neben den spektralen Eigenschaften des Fluorochroms und der gewählten Lichtquelle ist die Verwendung der passenden Filter zur Trennung bestimmter Wellenlängen des Lichtes für die Güte der Fluoreszenzmikroskopie entscheidend. Wie aus der Abbildung 2.5 hervorgeht, umfasst weißes Licht alle Spektralfarben. Diese können mit Hilfe eines Prismas sichtbar gemacht und entsprechend ihrer Wellenlängen (in Nanometer) unterteilt werden.

23 2.1 Fluoreszenzmikroskopie 15 M A E A I E? D J 2 HEI = H J H= C A C A > C H > = K L E A JJ K I E? D J> = H I E? D J> = H K I E? D J> = H K JH= L E A JJ L E A JJ > = K C H C A > H= C A H J E BH= H J! " # $ % & Abbildung 2.5: Dispersion des Lichtes [14]. Der Farbbereich erstreckt sich von violett über blau, grün, gelb, orange bis rot. Der ultraviolette Bereich liegt kurzwellig vom violetten Bereich und ist genau wie der infrarote Bereich, der langwellig vom roten Bereich liegt, für das menschliche Auge nicht sichtbar [14]. In der Fluoreszenzmikroskopie wird eine Vielzahl von unterschiedlichen Filtern eingesetzt, die durch ihre Durchlässigkeitskurve (Abbildung 2.6) charakterisiert werden. Die Durchlässigkeit τ ist definiert als das Verhältnis der Lichtintensität I t, nachdem das Licht das Filter passiert hat, zu der Intensität I des einfallenden Lichtes: τ = I t I. (2.1) Für das Absorptionsvermögen D eines Filters, das auch als optische Dichte bezeichnet wird, gilt: D =log 1 τ = log τ. (2.2) In der Abbildung 2.6 sind die Durchlässigkeitskurven eines Erregerfilters und eines Sperrfilters wiedergegeben. Die gepunktete Kurve repräsentiert das Emissionsspektrum des Fluoreszenzlichtes, das im Bereich der Durchlässigkeitskurve des Sperrfilters liegen muss. Im Idealfall sollten die Kurven des Erreger- und des Sperrfilters nicht überlappen, da eine Überlappung aus folgenden Gründen in der Praxis zu Problemen führen kann:

24 16 2. Optische Methoden - HHA C A HBE JA H 5 F A HHBE JA H, K H? D I I EC A EJJ - EI I E A. K HA I A A EI I E ). 9 A A C A Abbildung 2.6: Durchlässigkeitskurve eines Erreger- und Sperrfilters [12]. - Viele fluoreszierende Substanzen haben die Emissionsbanden in dem Spektralbereich, der zum Teil mit dem wirksamsten Anregungsbereich überlappt. - Das Emissionszentrum vieler Fluorochrome liegt sehr nah an dem Anregungsmaximum [12]. Aus der Form der Durchlässigkeitskurve ergeben sich die Bezeichnungen der eingesetzten Filter wie Kurzpass, Langpass, Breitband oder Schmalband. Um bei einem Filter eine selektive Durchlässigkeit von einem bestimmten Wellenlängenbereich zu gewährleisten, stehen verschiedene optische Instrumente als Bausteine zu Verfügung: Farbgläser, Gelantine- oder Flüssigkeitsfilter, Interferenzfilter oder Teilerspiegel oder verschiedene Prismen [13]. Farbgläser, deren Farbe durch den Zusatz von Ionen mit einer homogenen Verteilung im Glas zustande kommt, eignen sich gut als Erregerfilter. Sie lassen bevorzugt Licht in einem bestimmten, sehr schmalen Wellenlängenbereich durch. Hingegen werden Farbgläser, deren Farbe durch submikroskopische Kristalle von Sulfiden und Seleniden entsteht, aufgrund der hohen Durchlässigkeit im langwelligen Bereich und einer geringen Durchlässigkeit im kurzwelligen Bereich als Sperrfilter eingesetzt [13, 20].

25 2.1 Fluoreszenzmikroskopie 17 Interferenzfilter bestehen aus zwei semitransparenten Spiegeloberflächen, die durch eine dünne Schicht eines Dielektrikums getrennt sind. Die Interferenz des einfallenden Lichtes kommt durch mehrfache Reflexion an den Spiegeloberflächen zustande. Das führt zu der Durchlässigkeit von Licht der gewünschten Wellenlänge und dem ganzzahligen Vielfachen der Wellenlänge erster Ordnung, während andere Wellenlängen reflektiert werden. Die Dicke und der Brechungsindex der dielektrischen Schicht, die Anzahl der Schichten sowie ihre Anordnung bestimmen die Eigenschaften des Durchlässigkeitsbereiches und die Menge an Hintergrunddurchlässigkeit. Die Bandbreite und der maximale Wert der Durchlässigkeit hängen größtenteils von den optischen Eigenschaften der reflektierenden Schichten ab. In der Praxis werden Interferenzfilter typischerweise als dichromatischer Teilerspiegel eingesetzt [13, 20]. Der dichromatische Teilerspiegel, der auch als Reflexions-Kurzpassfilter, Farbteiler oder Reflektor bezeichnet wird, spielt eine Schlüsselrolle in der Auflicht-Fluoreszenzmikroskopie. Die Eigenschaften dieses Interferenzfilters werden gewöhnlich für Auflicht bei 45 angegeben. Die Filter sind in den Filterblöcken so eingesetzt, dass sie im Anregungslicht als Spiegel dienen und somit das Licht unter 45 -Einfall in Richtung des Präparates lenken, während sie bei Beobachtung der Fluoreszenz als Durchlassfilter verwendet werden [14, 20, 24]. Kurzpassfilter sind Interferenzfilter mit einer steilen Kante in einem bestimmten Spektralbereich, wobei die Sperrung im langwelligen Licht erfolgt, d. h., sie weisen eine Durchlässigkeit im kurzwelligen Bereich auf. Sie werden als Erregerfilter benutzt. Langpassfilter haben ebenfalls eine steile Kante in einem bestimmten Spektralbereich, allerdings erfolgt die Sperrung im kurzwelligen Bereich. Sie haben somit eine hohe Durchlässigkeit im langwelligen Bereich und werden bevorzugt als Sperrfilter eingesetzt [13, 20]. Die Kombination aus Kurzpass- und Langpassfilter ergibt einen Bandpassfilter, wie in Abbildung 2.7 dargestellt. Die Verteilung der Durchlässigkeit dieses Filters entspricht einer Gaußschen Glockenkurve mit der höchsten Durchlässigkeit τ max bei einer

26 18 2. Optische Methoden, K H? D I I EC A EJJ J = N $ K H F = I I BE JA H * = C F = I I BE JA H = 9 A A C A Abbildung 2.7: Durchlässigkeitskurve eines Bandpassfilters als Kombination eines Kurzpass- und eines Langpassfilters [13]. bestimmten Wellenlänge λ max. Der Bereich, in dem das Filter das Licht durchlässt, wird Band genannt. Als Bandpassfilter können Farbfilter oder Interferenzfilter dienen [13, 20]. Das Rot-Absorptionsfilter BG38 ist ein Farbglasfilter, das in allen Auflicht-Fluoreszenzbeleuchtungseinrichtungen eingebaut ist. Es soll die Nebendurchlässigkeit der Erregerfilter im roten Spektralbereich unterdrücken, was zur Aufhellung des Bilduntergrundes führt. Auch das Wärmeschutzfilter ist ein fester Bestandteil eines Auflicht- Fluoreszenzmikroskops. Es unterdrückt die infrarote Strahlung aus dem Anregungslicht. Dadurch werden die optischen Komponenten des Mikroskops und das Objekt vor Überhitzung geschützt. Des Weiteren wird so die Löschung der Fluoreszenz durch rote und infrarote Wellen reduziert, die teilweise durch die Erregerfilter transmittieren [20]. Die letzte entscheidende Komponente eines Auflicht-Fluoreszenzmikroskops ist das richtige Objektiv. Allgemein gibt es für die Objektive zwei Qualitätsmerkmale, den Korrektionszustand des auftretenden Ablesungsfehlers und das Auflösungsvermögen. Da in der Auflicht-Fluoreszenzmikroskopie das Objektiv gleichzeitig auch als Kondensor dient, ist vor allem das von der numerischen Apertur abhängige Auflösungsvermögen von Bedeutung. Im Allgemeinen können hellere Fluoreszenzbilder mit Objektiven

27 2.2 Dunkelfeldmikroskopie 19 höherer numerischer Apertur erreicht werden, durch die viel Anregungslicht auf dem Präparat konzentriert wird. In der Auflicht-Fluoreszenzmikroskopie sind nicht nur die Lichtstärke und die Anregungsstärke, sondern auch die Helligkeit der Objektfluoreszenz und dadurch die Helligkeit des Fluoreszenzbildes proportional zur vierten Potenz der Objektivapertur, wodurch auch schwächere Vergrößerungen hellere Bilder ergeben. Ein weiteres wichtiges Kriterium der in der Auflicht-Fluoreszenzmikroskopie eingesetzten Objektive ist, dass sie frei von Autofluoreszenz sind [14, 20]. 2.2 Dunkelfeldmikroskopie Die Methode der Dunkelfeldmikroskopie ist bereits seit Beginn des 19. Jahrhunderts bekannt macht J. B. Reade auf sie aufmerksam. Er spricht von einer Hintergrundbeleuchtung. Im Jahre 1850 baut F. H. Wenham den ersten konzentrischen parabolischen Dunkelfeldkondensor. Zu Beginn des 20. Jahrhunderts entwickeln Siedentopf und Zsigmondy die Spaltultramikroskopie, die einen Spezialfall der Dunkelfeldmikroskopie darstellt. Hierbei wird das Beobachtungslicht senkrecht zur Beobachtungsrichtung auf die Probe eingestrahlt. Siedentopf konstruiert 1910 bei Zeiss in Jena den heute bekannten Kardioidkondensor [25]. Die Dunkelfeldmikroskopie gehört zu den Methoden der Kontrastmikroskopie, die eine Vergrößerung des Unterschiedes in der Lichtintensität zwischen dem Objekt und seiner Umgebung ermöglichen. Die Differenz zwischen den Lichtintensitäten kleiner, dicht beieinander liegender Objektstrukturen, die gerade noch von einem Lichtempfänger, wie zum Beispiel dem Auge oder einer CCD-Kamera, wahrnehmbar ist, wird als Unterschiedsschwelle bezeichnet. Die Differenz der Lichtintensitäten I oberhalb dieses Schwellenwertes ist der Kontrast K, der durch die Gleichung 2.3 beschrieben werden kann: K = I Umfeld I Objekt I Umfeld + I Objekt. (2.3)

28 20 2. Optische Methoden = > A J =, A? C = I > A JJH C A H 5 F 5 F 5 F E? D JG K A A Abbildung 2.8: Strahlengang eines Kardioidkondensors [12]. Charakteristisch für die Dunkelfeldmikroskopie sind ein dunkles Umfeld und helle Objekte. Im Idealfall ist daher die Intensität des Umfeldes Null oder nahe Null, wodurch sich ein Wert von 1 für den Kontrast ergibt. Dieses charakteristische Dunkelfeldbild entsteht nicht durch Einstrahlung von direktem Licht auf die Probe, sondern durch indirektes Licht, das durch Brechung, Beugung oder Reflexion an dem Objekt in das Objektiv gelangt. Hierfür werden spezielle Dunkelfeldkondensoren verwendet. Zu diesen gehören in der Durchlicht-Dunkelfeldmikroskopie der Paraboloidkondensor und der Kardioidkondensor, die sich in der Art der Strahlenführung unterscheiden. Die größere Bedeutung hat der Kardioidkondensor, dessen Strahlengang in Abbildung 2.8 dargestellt ist [12, 21]. Er besteht aus zwei Glasspiegeln, von denen der erste eine sphärische Oberfläche besitzt und der zweite eine Kardioide. Dadurch tritt das vom Kondensor kommende Licht in Form eines Kegelmantels mit einer inneren und einer äußeren Begrenzung hervor, woraus eine innere und eine äußere Kondensorapertur resultiert [12, 26] Bildentstehung im Mikroskop und das Auflösungsvermögen Airy berücksichtigt als Ausgangsbasis für die Bildentstehung im Mikroskop nicht mehr nur die geometrische Optik, sondern vielmehr die Wellentheorie des Lichtes, so dass

29 2.2 Dunkelfeldmikroskopie 21 das mikroskopische Bild als das Ergebnis von Interferenzvorgängen zu betrachten ist. Dafür zerlegt er das Objekt in seine einzelnen Punkte und untersucht deren Abbildung. Das Gesamtbild ergibt sich durch Zusammensetzen der einzelnen Bilder unter Berücksichtigung der Kohärenzverhältnisse. Die Airysche Betrachtungsweise setzt die Unterscheidung der Objekte in Selbstleuchter und Nichtselbstleuchter voraus [21, 27]. > = 5 5 ) 1 ) ) 2 2 A > A ) A Abbildung 2.9: Das Airysche Beugungsscheibchen. a) Die Entstehung des Beugungsscheibchens eines selbst leuchtenden Punktes nach Airy. b) Das Bild des Beugungsscheibchens und dessen Intensitätsverteilung [21]. Σ Elementarwelle, Σ Wellenfront, Oe Objektebene, Ob Objektiv, Ze Zwischenbildebene, Ok Okular, I Intensität. Das Bild eines selbst leuchtenden Punktes erscheint als eine flächenhaft ausgebreitete Lichtverteilung, die durch Lichtbeugung und Interferenzvorgänge entsteht, dem Beugungsscheibchen (siehe Abbildung 2.9). Die von einem selbst leuchtenden Punkt ausgehende Wellenfront Σ sollte idealerweise bei einem aberrationsfreien Objektiv als entsprechende Kugelfläche Σ im Bildraum erscheinen. Nach dem Huygensschen Prinzip kann jeder Punkt dieser Wellenfront das

30 22 2. Optische Methoden Ausgangszentrum einer neuen Elementarwelle sein. In der Zwischenbildebene Ze können die Elementarwellen aufgrund ihrer Kohärenz interferieren. A 0 ist das Bild des Mittelpunktes der ursprünglichen Wellenfront Σ. Die Lichtamplitude in diesem Punkt ist die Summe der Amplituden aller dort ankommenden Elementarwellen. Die entsprechende Lichtintensität ist proportional zum Quadrat der Amplitude. Die Elementarwellen, die in jedem anderen beliebigen Punkt A 1 in der Zwischenbildebene zusammenkommen, haben unterschiedliche Phasen. Zum Beispiel kommt es bei entgegengesetzten Phasen, wie es in der Abbildung 2.9 dargestellt ist, zur Auslöschung. Das Beugungsscheibchen ergibt sich aus den Beträgen der Intensitäten aller Punkte in der Zwischenbildebene. Die von den einzelnen Punkten eines Selbstleuchters ausgesandten Elementarwellen sind untereinander nicht kohärent, so dass es nicht zur Interferenz kommt. Folglich ergibt sich das Gesamtbild eines Selbstleuchters nach der Airyschen Betrachtungsweise aus der Summation der einzelnen Beugungsfiguren. Die Intensität entspricht der Summe der Amplitudenquadrate [21, 27]. Selbstleuchter kommen in der Mikroskopie eher selten vor. Die meisten mikroskopischen Objekte sind Nichtselbstleuchter, die zur Sichtbarmachung im Mikroskop mit einer fremden Lichtquelle bestrahlt werden müssen. Die Bildentstehung bei Nichtselbstleuchtern ist wesentlich komplizierter als bei den Selbstleuchtern. Zur Vereinfachung wird angenommen, dass ein nicht selbst leuchtendes Objekt aus einer sehr großen Entfernung von einer punktförmigen Lichtquelle beleuchtet wird, so dass die von der Lichtquelle ausgehende Elementarwelle senkrecht auf das Objekt trifft. Somit sind alle von dem Objekt ausgehenden Elementarwellen untereinander kohärent. In der Abbildung 2.10 ist die Entstehung des Bildes eines nicht selbst leuchtenden Objektes dargestellt. Die in der Zwischenbildebene ankommenden Elementarwellen erzeugen aufgrund der Kohärenz für jeden Punkt die gleiche Amplitudenverteilung. Somit erzeugt jeder Punkt des Objektes ein Beugungsscheibchen, welche in der Zwischenbildebene miteinander interferieren. Die Intensität des daraus resultierenden Beugungsscheibchens ist dem Quadrat der Summe aller Amplituden proportional [27].

31 2.2 Dunkelfeldmikroskopie 23 N O ) EHO I? D A * A K C K C I I? D A E>? D A ) F A 1 JA I EJ J A > 2 2 A E? D JG K A A Abbildung 2.10: Strahlengang und Bildentstehung bei einem Nichtselbstleuchter [27]. Oe Objektebene, Ob Objektiv, Ze Zwischenbildebene, R 1,R 2 Amplituden, I Intensität. Im Gegensatz zu Airy geht E. Abbe in seiner Theorie zur Bildentstehung im Mikroskop davon aus, dass das Bild durch die Beugung des Lichtes an dem Objekt bestimmt wird. Seine Betrachtungsweise bezieht sich nur auf nicht selbst leuchtende Objekte, da die Beleuchtung mittels einer punktförmigen Lichtquelle vorausgesetzt wird. Die von der Lichtquelle ausgehenden Elementarwellen werden an dem Objekt gebeugt und im Objektiv gebündelt, so dass es in der hinteren Brennebene zur Interferenz kommt. Das entstehende Beugungsbild wird primäres Interferenzbild genannt. Dieses ist entscheidend für das in der Zwischenbildebene entstehende sekundäre Interferenzbild, das durch Interferenz der von dem primären Interferenzbild kommenden Elementarwellen entsteht. Das sekundäre Interferenzbild entspricht nur bei vollständiger Beteiligung aller Elementarwellen des primären Interferenzbildes absolut dem Objekt [21, 26, 27].

32 24 2. Optische Methoden = >!! I I Abbildung 2.11: Die Auflösung eines Objektes bei unterschiedlichen Öffnungswinkeln 2σ eines Objektivs [26]. a) Eintritt des Haupt- und des ersten Nebenmaxima bei kleinem Öffnungswinkel. b) Eintritt weiterer Nebenmaxima bei größerem Öffnungswinkel. Nach der Theorie von Abbe ist zur Auflösung eines Objektes die Interferenz von mindestens zwei Beugungsmaxima in der Zwischenbildebene erforderlich, wie es in Abbildung 2.11 a) dargestellt ist. Diese ist gegeben, wenn der halbe Öffnungswinkel des Objektivs σ beträgt. Mit zunehmendem Öffnungswinkel 2σ erhöht sich die Zahl der in das Objektiv eintretenden Maxima (Abbildung 2.11 b)), wodurch die Schärfe der Abbildung erhöht wird. Das Auflösungsvermögen eines Mikroskops definiert einen Grenzwert, der den minimalen Abstand d zwischen zwei Objekteinzelheiten angibt, bei dem diese gerade noch zu unterscheiden sind. Definitionsgemäß gelten zwei Punkte immer dann als eindeutig aufgelöst, wenn zwischen den Hauptmaxima der beiden Beugungsfiguren ein vollständiges Minimum auftritt. Da die Auflösung eines Bildes zusätzlich von der Wahrnehmung des Betrachters, wie z. B. durch das menschliche Auge oder durch eine Kamera, abhängig ist, wird von einem so genannten kritischen Bereich der Auflösung gesprochen, also einem Grenzbereich, in dem die Deutlichkeit der Auflösung langsam abnimmt [27]. Nach den Theorien von Airy und Abbe lässt sich die theoretische Auflösungsgrenze, unterhalb derer zwei Objektpunkte nicht mehr klar voneinander getrennt werden können, wie folgt berechnen: d min = λ A Obj. (2.4) Der Grenzwert für die noch auflösbare Gitterkonstante bzw. den noch auflösbaren Abstand zweier Objektpunkte d min ist demnach von der Wellenlänge des Lichtes λ und

33 2.2 Dunkelfeldmikroskopie 25 von der Apertur des Objektivs A Obj abhängig. Die numerische Apertur A eines optischen Systems entspricht dem Produkt aus der Brechzahl n des zwischen dem Objekt und dem Objektiv befindlichen Mediums und dem Sinus des halben Öffnungswinkels σ im Objektraum [21]: A = n sin σ. (2.5) Nach der Abbeschen Theorie stellt der oben genannte Grenzwert den Fall dar, dass bei der Betrachtung eines Gitters genau zwei Hauptmaxima (0. und 1. Ordnung) an der Bildentstehung beteiligt sind. Bei der Betrachtung zweier Objektpunkte eines Nichtselbstleuchters nach Airy existiert zwischen den beiden Hauptmaxima ein eindeutiges Minimum. Aus der Praxis ist bekannt, dass selbst bei Überlagerung zweier Beugungsscheibchen noch eine eindeutige Auflösung möglich ist, sofern für den Abstand zwischen den Objektpunkten gilt: d min = 3 4 λ. (2.6) A Obj Bei den bisherigen Betrachtungen des Auflösungsvermögens wird von einer punktförmigen Lichtquelle ausgegangen, deren Lichtwellen senkrecht auf das Objekt treffen. Der Einfallswinkel α beträgt somit Null. Das Auflösungsvermögen kann durch eine schiefe Beleuchtung, wie sie z. B. in der Dunkelfeldmikroskopie verwendet wird, gesteigert werden (s. Abbildung 2.12). Entsprechend der Darstellung in der Abbildung 2.12 a) ist der Einfallswinkel des Lichtes dann größer Null. Die vom Licht ausgehenden Elementarwellen treffen mit einem Gangunterschied δ auf das Objekt, der von der Gitterkonstanten d und von dem Sinus des Einfallswinkels abhängig ist: δ = d sin α. (2.7) Die von den einzelnen Objektpunkten erzeugten Beugungsscheibchen interferieren in der Zwischenbildebene. Bei der Summation der einzelnen Bilder der Amplituden muss der Phasenwinkel φ berücksichtigt werden. In der Abbildung 2.12 b) beträgt der Gangunterschied δ zwischen den Amplituden eine halbe Wellenlänge. Für den Grenzwert der Auflösung bei schiefer Beleuchtung ergibt sich damit: d min = λ 2 A Obj. (2.8)

34 26 2. Optische Methoden = > ) F A 4 1 JA I EJ J Abbildung 2.12: Die Bildentstehung bei einem Nichtselbstleuchter mit schiefer Beleuchtung [26]. a) Der Gangunterschied δ der Lichtwellen bei schiefer Beleuchtung. b) Die Verteilung der Beleuchtungsintensität im Bild eines Nichtselbstleuchters bei schiefer Beleuchtung. Somit ist die Auflösungsgrenze bei schiefer Beleuchtung wesentlich kleiner als bei gerader Beleuchtung. Die Dunkelfeldmikroskopie unterscheidet sich von der schiefen Hellfeldbeleuchtung dadurch, dass bei ihr der Einfallswinkel des beleuchtenden Lichtes größer ist als der halbe Öffnungswinkel des Objektivs. Dadurch kann das nullte Hauptmaximum nicht in das Objektiv eintreten. 2.3 Digitale Bildverarbeitung Bis zum Anfang des 20. Jahrhunderts ist es Wissenschaftlern vorbehalten, ihre Ergebnisse verbal oder grafisch zu dokumentieren. Anfang des 20. Jahrhunderts nutzen immer mehr Wissenschaftler die Fotografie, um ihre Entdeckungen festzuhalten. Diese Möglichkeit bringt der Mikroskopie einen enormen Aufschwung, vor allem bei der Untersuchung der Brownschen Bewegung von suspendierten Teilchen [28]. Einen erneuten Aufschwung bekommt die Mikroskopie gegen Ende des 20. Jahrhunderts mit der Einführung der digitalen Bildverarbeitung. Besonders in der Kolloidchemie wie auch bei der Qualitätssicherung stellen mikroskopische Methoden verbunden mit der digitalen Bildverarbeitung interessante Untersuchungsmöglichkeiten dar.