GENEXPRESSION BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN

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1 37 GENEXPRESSION BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN Bakterien besitzen die Fähigkeit, auf Veränderungen ihrer Umgebung sehr flexibel zu reagieren. Besonders ausgeprägt ist dabei die Anpassung von Enzymaktivitäten kataboler Stoffwechselwege an die jeweils zur Verfügung stehenden Substrate. So nutzt das Enterobakterium Escherichia coli Glucose als bevorzugte Kohlenstoffquelle. In Abwesenheit von Glucose können aber auch andere Zucker verwertet werden, unter anderem -Galactoside wie z. B. das Disaccharid Lactose. Die Proteine, die für die Aufnahme und Spaltung der Lactose in Galactose und Glucose erforderlich sind, nämlich die Lactosepermease und die -Galactosidase, werden nur gebildet, wenn -Galactoside als Substrat im Nährmedium vorhanden sind. Bei gleichzeitiger Anwesenheit von Glucose jedoch werden diese Proteine, die zur Verwertung von -Galactosiden erforderlich sind, nur noch in einem sehr geringen Umfang gebildet, selbst wenn ein geeignetes Substrat vorhanden ist. Die Regulation von Enzymaktivitäten durch An- und Abschalten der Proteinsynthese, die sich auf der Ebene der Transkriptionskontrolle abspielt, wird als Induktion bzw. Repression bezeichnet. Eine Substanz, die die Synthese von bestimmten Proteinen induziert, nennt man Induktor. Durch Analyse der DNA-Sequenzen und der Funktionsweise der für das -Galactosidasesystem codierenden Genabschnitte war es möglich, die Mechanismen, die dieser Regulation zugrunde liegen, sehr detailliert zu beschreiben. Wird in einer Kultur von E. coli die Bildung der -Galactosidase durch Zugabe eines geeigneten Induktors induziert, so beobachtet man gleichzeitig nicht nur eine vermehrte Synthese von Lactosepermease, einem Transportprotein, das die Aufnahme der Lactose und anderer -Galactoside in das Zellinnere überhaupt erst ermöglicht, sondern auch den Aktivitätsanstieg eines Enzyms, das als Transacetylase bezeichnet wird. Dieses Protein katalysiert die Übertragung der Acetylgruppe von AcetylCoA auf -Galactoside, die durch -Galactosidase nicht hydrolysiert werden können und sich daher in der Zelle anhäufen würden (z. B. -Thiogalactoside). Da die acetylierte Verbindung von den Bakterien wieder ausgeschieden wird, verhindert die Transacetylase eine Schädigung der Zelle durch Akkumulation nicht spaltbarer -Galactoside. Die genetische Information für diese drei Proteine liegt auf einem zusammenhängenden DNA-Abschnitt. Die Expression dieser drei Strukturgene, deren Transkription eine einzige, polycistronische mrna ergibt, wird durch ein gemeinsames genetisches Kontrollelement reguliert. Dieses besteht aus dem Promotor und dem Operator und bildet zusammen mit den drei Strukturgenen eine Funktionseinheit, die als lac-operon bezeichnet wird (Abb. 1a und b).

2 38 Abb. 1 Regulation des lac-operons in E. coli a) reprimiertes lac-operon b) aktives lac-operon

3 39 Das lac-operon besteht aus dem Promotor (P lac), den beiden Operatorsequenzen O 1 und O 2 und den Strukturgenen für -Galactosidase (lac Z), Lactosepermease (lac Y) und Transacetylase (lac A). Der Funktionszustand des Operons wird durch den Repressor bestimmt, ein regulatorisches Protein, dessen Strukturgen als Regulatorgen (lac I) bezeichnet wird. Der Repressor liegt in seiner aktiven Form als Tetramer vor und bindet mit hoher Affinität an die beiden DNA-Sequenzen des Operators. Dadurch wird der Teil des lac Z-Gens, der unmittelbar stromabwärts vom Promotor, der Bindungsstelle der RNA-Polymerase liegt, blockiert. Das Operon ist reprimiert, d. h. es findet keine Synthese der entsprechenden mrna statt. Die durch den Repressor verursachte Hemmung der Transkription lässt sich durch einen geeigneten Induktor aufheben. Induktoren des lac-operons sind allosterische Effektoren, die durch Bindung an den Repressor diesen von einer aktiven in eine inaktive Konformation überführen. Da der Repressor in der inaktiven Form nur eine sehr niedrige Affinität zum Operator aufweist, wird die Blockierung des lac Z-Gens aufgehoben. Die an die DNA der Promotorregion gebundene RNA-Polymerase kann nun das gesamte Operon transkribieren (Abb. 1b). Die Information der drei Strukturgene lac Z, lac Y und lac A wird dabei auf ein einziges mrna-molekül übertragen. Diese polycistronische mrna dient nun bei der Translation als Matritze, wobei die entsprechenden Proteine gleichzeitig an einem einzigen mrna-molekül gebildet werden. Biologisch bedeutsame Induktoren des lac-operons in E. coli sind in der Natur vorkommende -Galactoside wie -Galactoglycerin, welches aus dem Abbau von Galactolipiden stammt, und Allolactose (Abb. 3). Letztere wird in geringem Umfang aus der von den Bakterienzellen aufgenommenen Lactose gebildet. Diese Reaktion wird ebenfalls durch die -Galactosidase katalysiert, die daher, zusammen mit der Lactosepermease, mit einer niedrigen Basalaktivität vorhanden sein muss. Für biochemische Untersuchungen der Induktion des lac-operons eignen sich besonders gut synthetische Analoga von -Galactosiden wie z.b. Isopropyl--thiogalactosid (Abb. 3), weil diese Verbindungen zwar ausgeprägte Induktoreigenschaften besitzen, aber von der -Galactosidase selbst nicht abgebaut werden. Der bereits zuvor erwähnte Einfluss von Glucose auf die Induzierbarkeit der ß-Galactosidase lässt allerdings einen komplexeren als den hier beschriebenen Regulationsmechanismus vermuten. Tatsächlich wird die negative Kontrolle des lac-operons, die durch den Repressor ausgeübt wird, ergänzt durch eine positive Kontrolle der Transkription, bei der die Signalsubstanz 3',5'-cyclisches Adenosinmonophosphat (camp) eine Schlüsselrolle spielt. Die intrazelluläre camp-konzentration ihrerseits ist abhängig von der im Nährmedium vorhandenen Glucose: Bei Glucosemangel ist der camp-spiegel in der Zelle hoch und sinkt nach Glucosezugabe wieder sehr rasch ab. Ein hoher camp-gehalt der Zelle stimuliert die Initiation der Transkription, ein Effekt, der durch ein weiteres regulatorisches Protein, das camp-rezep-

4 40 tor-protein (CRP), vermittelt wird. Dieses Protein wird häufig auch als CAP (catabolite gene activator protein) bezeichnet. Wachsen E. coli-zellen auf Glucose, ist der camp-spiegel niedrig, und CRP liegt in einer inaktiven Form vor. Ist die Glucose im Medium jedoch aufgebraucht, steigt die Konzentration an camp, und es bildet sich ein aktiver CRP: camp-komplex. Dieser bindet sowohl an eine spezifische DNA-Sequenz in der Nähe des Promotors als auch an die RNA-Polymerase und erhöht dadurch deren Bindungskonstante für den lac- Promotor, was zu einer erheblichen Steigerung der Transkriptionsrate des lac-operons führt (Abb. 1b). Der molekulare Mechanismus der Regulation des camp-spiegels in der Bakterienzelle unterscheidet sich grundsätzlich von demjenigen in eukaryotischen Zellen. Während die Aktivität der Adenylatcyclase in Eukaryonten hormonell gesteuert wird, ist die Kontrolle ihrer Aktivität bei dem Prokaryonten E. coli eng an den mit einer Phosphorylierung verbundenen Transport von Glucose durch die Zellmembran gekoppelt. Dieser Transport erfolgt über das komplexe Phosphotransferasesystem, dessen Komponente Enzym III bei der Regulation des Kohlenhydratstoffwechsels eine Schlüsselfunktion besitzt. Katalysiert durch das Phosphotransferasesystem entsteht aus Enzym III (EIII glc ) in mehreren Reaktionsschritten die phosphorylierte Form von Enzym III (EIII glc ~ P), wobei eine Phosphorylgruppe von Phosphoenolpyruvat in einer mehrstufigen Reaktionskaskade auf EIII glc übertragen wird. Beim Glucosetransport durch die Zellmembran überträgt EIII glc ~ P die Phosphorylgruppe auf den Zucker. Bei dieser Reaktion wird aus EIII glc ~ P wieder EIIIglc zurückgebildet, welches dann in einem weiteren Reaktionszyklus unter Verbrauch von Phosphoenolpyruvat rephosphoryliert wird. Diese Interkonversion der beiden unterschiedlichen Formen von Enzym III geht einher mit einer Konzentrationsänderung von phosphorylierter und nicht phosphorylierter Form, die ihrerseits vom Umfang des Glucosetransportes abhängig ist. In Abwesenheit von Glucose im Kulturmedium liegt Enzym III weitgehend als EIII glc ~ P vor, wohingegen bei der Aufnahme von Glucose aus dem Nährmedium die dephosphorylierte Form EIII glc überwiegt. Beide Formen von Enzym III besitzen, wie in Abb. 2 skizziert, unterschiedliche regulatorische Eigenschaften.

5 41 Abb. 2 Einfluss von Glucose auf die Aktivität von Adenylatcyclase und Lactosepermease E. coli-zellen, die auf glucosefreiem Kulturmedium wachsen, zeigen einen hohen camp- Spiegel, weil die Adenylatcyclase durch EIII glc ~ P, der unter Glucosemangel vorherrschenden Form von Enzym III, aktiviert wird. Bei gleichzeitiger Anwesenheit eines geeigneten Induktors der -Galactosidase liegen somit Bedingungen vor, die eine maximale Transkription des lac- Operons ermöglichen (Abb. 1b). Die Zugabe von Glucose zur Kultur verursacht einen drastischen Abfall der Konzentration von EIII glc ~ P, und folglich sinkt auch der Spiegel von camp. Dieser inhibitorische Glucoseeffekt, der schließlich über eine Inaktivierung des camp-rezeptor-proteins zur Herabsetzung der Transkriptionsrate des lac-operons führt, wird als Katabolitrepression bezeichnet. Katabolitrepression wird nicht nur bei den Enzymen, die durch das lac-operon codiert werden, sondern auch bei einer Reihe von Enzymen aus anderen katabolen Stoffwechselwegen in Bakterien beobachtet. Von diesem Mechanismus jedoch muss die Katabolithemmung unterschieden werden. Dabei handelt es sich um eine Hemmung der Lactosepermease durch das dephosphorylierte Enzym EIII glc, welches in Gegenwart von Glucose überwiegt. Dieser Effekt verhindert die Aufnahme von Lactose durch das Bakterium; somit gelangt kein Induktor in die Zelle, und das lac-operon wird lediglich entsprechend seiner Basalaktivität exprimiert. Beide Regulationswege ergänzen sich gegenseitig und stellen sicher, dass Glucose als bevorzugtes Substrat genutzt wird. Die Katabolithemmung verhindert die Aufnahme des Induktors, wenn die Bakterien bei Zugabe des Induktors bereits Glucose als Kohlenstoffquelle verwerten. Unter diesen Bedingungen wird das lac-operon nicht induziert, da in der Zelle kein Induktor zur Verfügung steht. Im

6 42 umgekehrten Fall, wenn zu einer bereits induzierten Kultur Glucose zugegeben wird, wie es bei dem hier durchzuführenden Versuch geschieht, bewirkt die Katabolitrepression ein Absinken des camp-spiegels, was seinerseits zu einer schnell eintretenden Herabsetzung der Expressionsrate des lac-operons führt. Das Beispiel des lac-operons von E. coli zeigt, dass Bakterien zu einer optimalen Anpassung an ihre Umgebung befähigt sind. Durch ein Zusammenspiel von drei verschiedenen Regulationsmechanismen, nämlich Induktion, Katabolitrepression und Katabolithemmung, wird die Bildung der Enzyme, die zur Verwertung von Lactose und anderen -Galactosiden erforderlich sind, sehr genau dem jeweiligen Bedarf der Zelle angepasst.

7 43 Abb. 3 Substrate und Substratanaloga der ß-Galactosidase

8 44 ZIELSETZUNG DER EXPERIMENTE Wachsende Kulturen von E. coli zeigen nur eine geringe Aktivität der -Galactosidase. Durch Zugabe des Induktors Isopropyl--thiogalactosid (IPTG) wird die Synthese von -Galactosidase induziert, die Aktivität des Enzyms nimmt in Abhängigkeit von der Zeit zu (Versuchsreihe A). Bei Zugabe von Glucose zur bereits induzierten Kultur steigt die -Galactosidase-Aktivität nicht weiter an (Versuchsreihe B). Die Bestimmung der Enzymaktivität von -Galactosidase erfolgt durch Hydrolyse des synthetischen Substrates o-nitrophenyl--galactosid ( 0 NPG) zu Galactose und o-nitrophenol. Die Konzentration an o-nitrophenol, das im alkalischen Bereich gelb gefärbt ist, wird photometrisch bestimmt ( = 400 nm). Der Proteingehalt der jeweiligen Proben wird durch Trübungsmessung der Kultur ermittelt. Aus der Konzentration von o-nitrophenol und aus dem Proteingehalt wird die spezifische Aktivität der -Galactosidase berechnet. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG UND VERSUCHSPROTOKOLL Mitbringliste: Kittel, Lineal, Taschenrechner 1. Induktion und Probenentnahme Vorbereitung der Reaktionsgefäße (Eppis) a) 28 Reaktionsgefäße (Eppis) werden auf dem Deckel folgendermaßen beschriftet: 7 Eppis mit A0 T ; A5 T; A10 T; A15 T; A20 T; A25 T; A30 T (Proben aus Ansatz A zum Zeitpunkt t = 0 bis t = 30 Minuten), 7 Eppis mit A0; A5; A10; A15; A20; A25; A30 (Proben aus Ansatz A zum Zeitpunkt t = 0 bis t = 30 Minuten) 7 Eppis mit B0 T; B5 T; B10 T; B15 T; B20T; B25 T; B30 T (Proben aus Ansatz B zum Zeitpunkt t = 0 bis t = 30 Minuten) 7 Eppis mit B0; B5; B10; B15; B20; B25; B30 (Proben aus Ansatz B zum Zeitpunkt t = 0 bis t = 30 Minuten) b) Eppis mit Toluol und Formaldehyd behandeln In die mit T beschrifteten Eppis wird jeweils1 Tropfen Toluol (steht unterm Abzug, Schutzbrille, Handschuhe) pipettiert In die mit A0 bis B30 beschrifteten Eppis wird jeweils 1 Tropfen Formaldehyd (steht unterm Abzug, Schutzbrille, Handschuhe) pipettiert

9 45 c) Vorbereitung der Bakterienkultur Jede Gruppe hat an seinem Platz zwei Erlenmeyerkolben (Ansatz A und B) mit je 40 ml einer Kultur von E. coli, Stamm H Die am Platz befindlichen weißen Plastikschüsseln werden nun zur Hälfte mit Wasser, aus der Vorratswanne aufgefüllt (Ablagebank an der Spüle!!). Die Kolben mit den enthaltenen Bakterien werden nun in die Schüsseln gesetzt und bei 37 C temperiert und zur Belüftung mit einem Magnetrührer (250rpm) gerührt. Nach einer Vorinkubationszeit von 5 min wird in beiden Kolben die Bildung von - Galactosidase durch Zugabe von je 1 ml 5 mm IPTG-Lösung (I) induziert (t = 0). Sofort nach Zugabe des Induktors und weiterhin im Abstand von jeweils 5 Minuten werden aus beiden Kolben Proben von 1 ml entnommen und in die vorbereiteten Eppigefäße (AOT und AO. B0T und B0, A5T etc.) pipettiert. Die Gefäße werden verschlossen und 10 sec lang kräftig geschüttelt. 15 min nach der Induktion mit IPTG vor der Entnahme der Probe zum Zeitpunkt t = 15 min wird der Kolben B zusätzlich mit 1 ml 20 mm Glucoselösung (G) versetzt, um den Einfluss von Glucose auf die Expression des Lac Z Gens zu untersuchen.bis zur letzten Probenentnahme zum Zeitpunkt t = 30 min bleiben die Toluolproben im Eppiständer und die Formaldehydproben auf Eis aufbewahrt. Die Trübungsmessung der Formaldehydproben (im Eis), können dann sofort oder auch zu einem späteren Zeitpunkt erfolgen. Die Messung erfolgt gegen eine mit Wasser gefüllte Leerwertküvette. Photometrische Bestimmung- Die Extinktionen werden bei der Wellenlänge = 400 nm gegen den Leerwert, gemessen und in die Tabelle 1 eingetragen.

10 46 Der Versuchsablauf ist im folgenden Zeitplan nochmals zusammengefasst: Reagenzzugabe Probenentnahme ß-Galaktosidase- Aktivität Toluolprobe Probenentnahme Proteinbestimmung/ Zelldichte Formaldehydprobe Eis Zeit (min) Kolben A Kolben B Kolben A jeweils Kolben B jeweils 1ml Kolben A jeweils 1ml Kolben B jeweils 1ml 1ml 0 1ml IPTG 1ml IPTG A0T B0T A0 B0 5 A5T B5T A5 B5 10 A10T B10T A10 B ml A15T B15T A15 B15 Glucoselösung 20 A20T B20T A20 B20 25 A25T B25T A25 B25 30 A30T B30T A30 B30

11 47 2. Bestimmung des Proteingehalts der Bakteriensuspension Die Proteinkonzentration der Bakteriensuspension wird mit Hilfe der Zelldichte ermittelt. Dazu wird die Trübung von 1ml der Proben, die nach Abschnitt 1 entnommen und mit Formaldehyd abgestoppt wurden, bei der Wellenlänge = 400 nm im Photometer gegen eine mit Wasser gefüllte Leerwertküvette gemessen. Die gemessenen Werte werden in die nachfolgende Tabelle (Tabelle 1) eingetragen. Tabelle 1: Messwerte für Proteinbestimmung Formaldehydproben Bei diesem Versuch wird ein Bakterienstamm verwendet, für den gilt: E 400 = Proteinkonzentration Reihe A Probe A0 A5 A10 A15 A20 A25 A30 Protein- Konzentration mg Protein/ml Reihe B Probe B0 B5 B10 B15 B20 B25 B30 Protein- Konzentration mg Protein/ml

12 Galactosidasetest (Toluolproben) Die Reaktionsgefäße mit den Proben A0T bis A30T und B0T bis B30T werden nochmals kräftig geschüttelt. Zum Zellaufschluss werden die Proben für 40 min bei 37 C inkubiert. Anschließend wird in dem so gewonnenen Lysat die -Galactosidase-Aktivität bestimmt. Dazu werden zunächst folgende Ansätze vorbereitet: Pipettierplan: In der Zwischenzeit können die Ansätze in Eppis - bis auf das inkubierte Lysat (40 min Inkubation) - vorbereitet werden. Achtung: Eppis vor der Entnahme des entsprechenden Aliquots kräftig schütteln! Reihe A Ansatz Nr Probe A0T A5T A10T A15T A20T A25T A30T L Enzympuffer (ml) 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 LB-Medium (ml) ,3 0,3 0,4 0,5 Inkubiertes und frisch 0,5 0,5 0,5 0,5 0,2 0,2 0,1 - geschütteltes Lysat (ml) L = Leerwert Reihe B Ansatz Nr Probe B0T B5T B10T B15T B20T B25T B30T L Enzympuffer (ml) 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 LB-Medium (ml) ,3 0,3 0,3 0,5 inkubiertes und frisch 0,5 0,5 0,5 0,5 0,2 0,2 0,2 - geschütteltes Lysat Lysat (ml) L = Leerwert

13 49 Die Ansätze werden dann 5 min bei 37 C mit dem Lysat im Wasserbad inkubiert. Dasselbe macht man mit den Leerwertproben Proben aus dem Wasserbad nehmen und die Enzymreaktion durch Zugabe von 0,1 ml onpg-lösung (O) starten. Hier ist es wichtig, dass die Zugabe in 15 Sekundentakt erfolgen muss: Dazu in Eppis A t=0und B t=0 onpg Lösung geben, schütteln, dann in A t=5 und B t=5 onpg-lösung geben, schütteln usw. Die Proben wieder ins Wasserbad stellen, für 10 min orientierend am Start der Reaktion in Eppi A bzw. B t=0 Proben aus dem Wasserbad entnehmen, Enzymreaktion durch Zugabe von 1,0 ml 1 M Na 2 CO 3 -Lösung stoppen: auch hier die Zugabe in 15 Sekundentakt nach dem gleichen Prinzip wie oben Die Proben werden in der Mikroliterzentrifuge für 5 min zentrifugiert und vorsichtig herausgenommen. Photometrische Bestimmung- Die Extinktionen werden bei der Wellenlänge = 400 nm gegen den Leerwert, gemessen und in die Tabelle 2 eingetragen. Tabelle 2: Messwerte des -Galactosidasetests (Toluolproben) Reihe A Probe A0T A5T A10T A15T A20T A25T A30T E 400 Reihe B Probe B0T B5T B10T B15T B20T B25T B30T E 400

14 50 AUSWERTUNG UND FEHLERDISKUSSION Berechnen Sie die spezifische Aktivität der -Galactosidase in den Proben von Reihe A und B. Stellen Sie die gefundenen Werte in Abhängigkeit von der Zeit nach Induktorzugabe graphisch dar. Rechenbeispiel In einen Testansatz mit dem Gesamtvolumen V T = 2 ml wurden 0,2 ml Lysat (= V L ) eingesetzt. Nach einer Inkubationszeit t = 10 min wurde bei der Wellenlänge = 400 nm und mit einer Schichtdicke d = 1 cm die Extinktionsdifferenz E 400 = 0,375 gemessen. Die Proteinkonzentration des Lysates betrug 0,9 mg/ml. Für p-nitrophenolat gilt: , mol cm Nach dem Lambert-Beer'schen Gesetz lässt sich die Konzentration von p-nitrophenolat im Testansatz bestimmen: c E d 0,375 c 24, mol mol mol ml 1 Nach Berücksichtigung von Verdünnungsfaktor und Inkubationsdauer erhält man die Aktivität der -Galactosidase im Lysat: c V Aktivität t V T L Aktivität mol 600 0,2 ml s 0, mol s 1 ml 1 Die spezifische Aktivität ist dann Spezifische Aktivität Aktivität mg Protein

15 51 Spez. Aktivität 0, ,9 mol s mg 0,28 nkatal mg 1 Die Zusammenfassung der vorhergehenden Rechenschritte ergibt folgende Gleichung: Spez. Aktivität L 3 E 10 VT katal mg d t V mg Protein 1 Vereinfachte Berechnung siehe Anhang Reihe A Probe A0 A5 A10 A15 A20 A25 A30 Aktivität IU/ml*mg Reihe B Probe B0 B5 B10 B15 B20 B25 B30 Aktivität IU/ml*mg

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17 SCHLUSSFOLGERUNGEN 53

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