INHALTSVERZEICHNIS. Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen

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1 2 INHALTSVERZEICHNIS Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen EINLEITUNG 1.1 Die Dipeptidylpeptidase IV Substratspezifität der DP IV Inhibitoren der DP IV Biologische Bedeutung der DP IV Das Inkretinkonzept Glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP) Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) Inkretine und Diabetes Mellitus Typ Zielstellung der vorliegenden Arbeit 24 SYNTHESE DER UNTERSUCHTEN VERBINDUNGEN 2.1 Aminosäurepyrrolidide und thiazolidide Isoleucinderivate Aminosäurepyrrolidinomethylketone N-terminal verlängerte Aminosäurethiazolidide prodrugs Seitenkettenmodifizierte Glutaminsäurethiazolidide Darstellung des O-Benzoyl, N-Glycylphenyl-Hydroxylamins 30 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 3.1 Enzymkinetische Untersuchungen Inhibierung der DP IV und POP mit Aminosäurethiazolididen und pyrrolididen sowie Isoleucinderivaten Inhibierung der DP IV und POP mit Aminosäurepyrrolidinomethylketonen Inhibierung der DP IV und POP mit N-terminal verlängerten Aminosäurethiazolididen prodrugs N-terminal verlängerte Aminosäurethiazolidide als maskierte Inhibitoren der DP IV N-terminal verlängerte Aminosäurethiazolidide als Inhibitoren der POP Inhibierung der DP IV und POP mit seitenkettenmodifizierten Glutaminsäurethiazolididen Selektivität von Isoleucinthiazolidid Stabilitätsuntersuchungen Stabilität der Aminosäurethiazolidide Nichtenzymatischer Zerfall der Aminosäurepyrrolidinomethylketone Nichtenzymatischer Zerfall des O-Benzoyl, N-Glycylphenyl-Hydroxylamins 54

2 3 3.3 Transportstudien an PepT Inhibitionsstudien mit den synthetisierten Verbindungen an PepT1 exprimierenden Pichia pastoris-zellen Elektrophysiologische Analyse des Transportverhaltens ausgewählter Verbindungen in PepT1 exprimierenden Xenopus leavis Oozyten Tierexperimentelle Untersuchungen Ile-Thia-Konzentrationsbestimmung in Plasma Indirekte Bestimmung der Ile-Thia-Konzentration in Plasma über die DP IV- Restaktivität Versuch der Entwicklung eines verdünnungsunabhängigen DP IV-Aktivitätstests Direkte Bestimmung der Ile-Thia-Konzentration in Plasma mittels MS Dosis-Wirkungskurve für die orale Applikation von Ile-Thia Reaktivierung der DP IV im Plasma nach einmaliger oraler Gabe von Ile-Thia Orale Gabe von Ile-Thia an Wistar-Ratten - Einfluß auf die Glukosetoleranz Die Zucker-Ratte ein Tiermodell für den Diabetes Typ 2 des Menschen Orale Gabe von Ile-Thia an schlanke Zucker-Ratten - Einfluß auf die Glukosetoleranz Orale Gabe von Ile-Thia an adipöse Zucker-Ratten - Einfluß auf die Glukosetoleranz Orale Gabe der prodrugs PIThia und GPITh an Zucker-Ratten - Einfluß auf die Glukosetoleranz Orale Bioverfügbarkeit von Ile-Thia aus GPIThia und PIThia in Zucker Ratten Einfluß der prodrugs auf die Glukosetoleranz nach OGTT in Zucker Ratten Inhibierung der Dipeptidylpeptidase I mit einer Verbindung aus der Klasse der O-Acyl, N-Peptidyl-Hydroxylamine Bestimmung der 2. Ordnungsgeschwindigkeitskonstanten der Inaktivierung der DP I durch GF-NHO-Bz Nachweis der Irreversibilität der Inaktivierung der DP I durch GF-NHO-Bz Bestimmung der Partitionierungskonstanten von GF-NHO-Bz für die DP I Bestimmung der 2. Ordnungsgeschwindigkeitskonstanten der Inaktivierung der DP I durch verschiedene N-terminal geschützte und ungeschützte O-Acyl, N-Peptidyl-Hydroxylamine Selektivität von GF-NHO-Bz 85 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK EXPERIMENTELLER TEIL 5.1 Synthese Analytische Methoden Allgemeine Synthesevorschriften Synthese der Aminosäurepyrrolidide und thiazolidide Boc-Aminosäurepyrrolidide und thiazolidide Aminosäurepyrrolidide und thiazolidide Synthese der Isoleucinderivate Synthese der Aminosäurepyrrolidinomethylketone Synthese der N-terminal verlängerten Aminosäurethiazolidide Synthese der seitenkettensubstituierten Glutaminsäurethiazolidide 99

3 Seitenkettensubstituierte Boc-Glutaminsäurethiazolidide Seitenkettenmodifizierte Glutaminsäurethiazolidide Synthese des H-GF-NHO-Bz Enzymkinetische Methoden Bestimmung der kinetischen Konstanten der enzymkatalysierten Hydrolyse von Substraten Untersuchung der Hemmung der DP IV und POP durch klassische kompetitive Inhibierung Untersuchung der Freisetzung des Ile-Thia und His-Thia aus den prodrugs in Serum bzw. Heparin-Blut Untersuchung der Hydrolyse der prodrugs Pyr-Ile-Thia, Pyr-His-Thia und Pro-Ile-Thia durch die PAP bzw. LAP Untersuchung der Inaktivierung der DP I durch H-GF-NHO-Bz Untersuchung der Inaktivierung der Cathepsine durch O-Acyl, N-Peptidyl- Hydroxylamine Reversibilitätstest der Inaktivierung Bestimmung der Partitionierungskonstanten der Inaktivierung der DP I durch H-GF-NHO-Bz Stabilitätsuntersuchungen Untersuchung des nichtenzymatischen Zerfalls der Aminosäurethiazolidide Untersuchung der Stabilität der Aminosäurethiazolidide in biologischen Medien Nichtenzymatischer Zerfall der Aminosäurepyrrolidiniummethylketone Nichtenzymatischer Zerfall des H-GF-NHO-Bz Tierexperimente Tiere Durchführung des OGTT und der Inhibitorapplikation Blutentnahme DP IV-Aktivitätsbestimmung in Plasma Glukosebestimmung in Plasma Insulinbestimmung in Plasma Statistische Analyse 110 LITERATUR 111 ANHANG 129

4 5 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen α 20 D ACE ACN ADA APM APP AUC Boc Bz CAIBE Drehwert Acethylcholinesterase Acetonitril Adenosindeaminase Aminopeptidase M Aminopeptidase P integrierte Fläche unter der Kurve t-butyloxycarbonyl- Benzyl- Chlorameisensäureisobutylester CD26 (45, 4) Cluster of differentiation 26 (45, 4) d Duplett DC Dünnschichtchromatografie DCC Dicyclohexylcarbodiimid DCM Dichlormethan dd doppeltes Duplett DFP Diisopropylfluorphosphat DHAP 2,6 -Dihydroxyacetophenon DHB 2,5-Dihydroxybenzoesäure DIPEA N,N-Diisopropylethylamin DMF N,N-Dimethylformamid DNA Desoxyribonukleinsäure DP I Dipeptidylpeptidase I DP II Dipeptidylpeptidase II DP IV Dipeptidylpeptidase IV DTE 1,4-Dithiothreitol EC 50 EDTA EE EE EG effektive Konzentration bei halbmaximaler Wirkung Ethylendiamintetraacetat Essigsäureethylester Essigsäureethylester Enteroglukagon

5 6 ESI-MS Elektrospray-Massenspektrometrie F p GABA G-AUC GIP GLP-1 GLP-2 Schmelzpunkt γ-aminobuttersäure AUC der Glukosekonzentration Glucose-dependent insulinotropic polypeptide Glucagon-like peptide-1 Glucagon-like peptide-2 gp120 Glykoprotein 120 GRF Growth hormone-releasing factor HBTU 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphat HEPES N-(2-Hydroxyethyl)Piperazine-N'-(2-Ethansulfonsäure) HIV-1 Human immuno deficience virus HOSu N-Hydroxysuccinimid HPLC Hochleistungsflüssigchromatographie Hyp Hydroxyprolin I Inhibitor i. Vak. im Vakuum I-AUC AUC der Insulinkonzentration IE Internationale Einheiten k, k obs, k app Geschwindigkeitskonstante k cat KG K i k inact K m LAP LC-MS LM m MALDI-TOF MS MDC MES Geschwindigkeitskonstante enzymatischer Reaktion Körpergewicht Dissoziationskonstante des Enzym-Inhibitor-Komplexes Geschwindigkeitskonstante der Inaktivierung Michaelis-Menten-Konstante Leucinaminopeptidase Flüssigchromatografie-Massenspektrometrie Lösungsmittel Multiplett Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry Macrophage-derived chemokine 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure

6 7 MPGF Major proglucagon fragment M r MW relative Molekülmasse Molekulargewicht n. b. nicht bestimmt NK-Zellen Natural killer-zellen NMM N-Methylmorpholin NP Y Neuropeptid Y OGTT oraler Glukosetoleranztest PAP Pyroglutamylaminopeptidase PBS Phosphate buffered salt PEG Polyethylenglycol PG Proglukagon PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid pna p-nitroanilin POP Prolyloligopeptidase PP Pancreatic polypeptide Pyr Pyroglutaminsäure Pyrr Pyrrolidin PYY Peptid YY r Partitionierungskonstante RANTES Regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted RT Raumtemperatur R t R f s SDF t 1/2 t R TBTU tbu TEA TFA TGF THF Retentionszeit Retentionsfaktor Singulett Stromal derived factor Halbwertszeit Migrationszeit 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborat t-butyl- Triethylamin Trifluoressigsäure Tumor growth factor Tetrahydrofuran

7 8 Thia TMS TRH Tris TXA2 v v i v o λ Xaa, Yaa Z Thiazolidin Trimethylsilan Thyreotropin releasing hormone Tris(hydroxymethyl)aminomethan Thromboxan A2-Rezeptor Geschwindigkeit Geschwindigkeit bei Anwesenheit eines Inhibitors Initialgeschwindigkeit Wellenlänge beliebige proteinogene Aminosäure Benzyloxycarbonyl