Enzymreaktion (Hydrolyse von Harnstoff)

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1 Enzymreation (ydrolyse von arnstoff) Ziel des Versuches: Kennenlernen des Michaelis-Menten-Mechanismus enzymatischer Reationen Messung der Enzymativität (aus der Abhängigeit der anfänglichen Reationsgeschwindigeit von der Substratonzentration (arnstoffonzentration)) Theoretische Grundlagen Mit ilfe von Enzymen ist es möglich, die Ativierungsenergie von chemischen Reationen so weit herabzusetzen, dass die Reationsgeschwindigeit um Größenordnungen erhöht wird. Dabei wirt das Enzym wie ein Katalysator. Als Beispiel betrachten wir die ydrolyse von arnstoff mit dem Enzym rease []: O C N + O N rease (N 4 ) CO 3 () Obwohl in der Bruttoreationsgleichung das Enzym nicht erscheint, hängt die gemessene Reationsgeschwindigeit von der Enzymonzentration ab. Das ann durch einen Reationsmechanismus mit zwei Reationsschritten erlärt werden. Im ersten Schritt lagert sich ein arnstoffmoleül () an ein reasemoleül () an, wobei der Enzym-Substrat-Komplex () gebildet wird. Dabei wird das leine arnstoffmoleül (Molmasse = 6 g/mol) an einer "passenden" Stelle des vergleichsweise riesigen Eiweißmoleüls (Molmasse = 49 g/mol) adsorbiert. Wegen der Ähnlicheit dieses Schrittes mit der Adsorption auf der festen Katalysatoroberfläche bei der heterogenen Katalyse wird die Enzymreation gelegentlich als "miroheterogene Katalyse" bezeichnet. Entweder wird der adsorbierte arnstoff unverändert in die Lösung zurücehren (Zerfall des Enzym-Substrat-Komplexes) oder im adsorbierten Zustand mit Wasser zum Reationsprodut () weiterreagieren. Da das rodut in Lösung geht, erscheint die rease nach Ablauf der Reation unverändert. Der Reationsmechanismus ist also + () - + O ' + (3) Für die Bildungsgeschwindigeiten der Reatanten gilt im einzelnen: d c = c c + c (4) = c c + c + c c (5) ', O

2 = c c c c c (6) ', O = c c (7) '. O Da sich c O im Laufe der Reation pratisch nicht ändert, ann das rodut ' c O in einer neuen Konstanten zusammengefasst werden : = ' c O. nter der reaseonzentration c u ist die Menge der "ativen", für eine arnstoffanlagerung geeigneten lätze auf der rease pro Volumeneinheit der Lösung zu verstehen. Da auf einem reasemoleül abhängig von der Enzymqualität unterschiedlich viele "ative Zentren" vorhanden sein önnen, ann c u nicht einfach aus reasemasse /(Molmasse Volumen der Lösung) berechnet werden. Die Enzymqualität ann jedoch umgeehrt über die Reationsgeschwindigeit charaterisiert werden, die mit einer bestimmten Enzymeinwaage erreichbar ist. m diesen Zusammenhang zu erfassen, wird das Differentialgleichungssystem näherungsweise unter Verwendung des Bodensteinschen Stationaritätsprinzips gelöst: Nach einer urzen Anlaufphase stellt sich eine solche Konzentration des Enzym-Substrat- Komplexes ein, bei der pro Zeiteinheit gerade soviel gebildet wird, wie auch zerfällt. Damit wird / =. Aus Gl.(6) ann dann die stationäre Konzentration von errechnet und in Gl.(7) eingesetzt werden. Es ergibt sich so die Geschwindigeit /, mit der das Reationsprodut gebildet wird, als Funtion der arnstoff- und der reaseonzentration: = c c c, + ( + ) (8) Bei der Ableitung dieser Gleichung wurde die rease-bilanz c = c, c verwendet, um die unbeannte augenblicliche Konzentration c durch die beannte Anfangsonzentration c o auszudrücen. Diese Gleichung nennt man Michaelis-Menten- Gleichung; die Größe K M + = bezeichnet man als Michaelis-Menten-Konstante. (9) Durch Messen der Anfangsgeschwindigeit v c c,, = = t= c, + KM ann man K M und ermitteln. ()

3 3 Dazu führt man die Reation mit verschieden großen Anfangsonzentrationen c,o aus und bestimmt jeweils v. Solange c, lein gegen K M ist, sollte v nach () linear mit c, ansteigen (c, << K M ). Ist c,o >> K M, dann wird nach () v unabhängig von c,o, weil gemäß () pratisch alle rease in den Komplex überführt worden ist. Die Konzentration von ann dann durch weitere Zunahme der arnstoffonzentration nicht mehr gesteigert werden. Reationsgeschwindigeit v v MAX v MAX K M Substratonzentration [] Für sehr große arnstoffonzentrationen (c, >> K M ) erreicht die Reationsgeschwindigeit nach G.() den maximalen Wert v = c, (),max, der nur von der rease- und nicht von der arnstoffonzentration abhängt. Diese Maximalgeschwindigeit ann deshalb als Maß für die "enzymatische Ativität" A der rease verwendet werden, die als die Stoffmenge arnstoff definiert ist, die (bei T = 5 C und p = 7) pro Zeiteinheit und Masseneinheit rease maximal umgesetzt werden ann (siehe auch "Anmerung" am Ende der Anleitung): dn A = m rease. Wegen n = c V (V = Volumen der Reationslösung) ergibt sich die gesuchte Enzymativität aus der maximalen Reationsgeschwindigeit v,max und der reaseeinwaage m zu: v.max V A =. () m Üblicherweise wird die Ativität in der Einheit µmol/(min mg) oder nit /mg angegeben. m den Grenzwert v,max der anfänglichen Reationsgeschwindigeit zu ermitteln, wird v für eine Reihe von arnstoffonzentrationen gemessen und auf unendlich hohe arnstoffonzentration extrapoliert. Dazu trägt man /v als Funtion von /c, auf. Man erhält aus Gl.() eine Gerade mit der Steigung K M / v,max und dem Achsenabschnitt /v. Daraus ann man K M und berechnen (Ausgleichsrechnung): KM = +. (3) v v v c,max,max,

4 4 Aufgaben. Man verfolge die ydrolyse von arnstoff durch Messung der eletrischen Leitfähigeit. Das Endprodut ((N 4 ) CO 3 ) dissoziiert in wässriger Lösung in N 4 +, CO 3 - und O -. Die Reation ann deshalb durch Messung der eletrischen Leitfähigeit κ der Lösung verfolgt werden. κ ist proportional zur Konzentration von. m sich die Wirung der rease zu verdeutlichen wird die ydrolyse bei jeder arnstoffonzentration zunächst unatalysiert durchgeführt. Nach Ablauf einer Minute wird reaselösung zugegeben. Die Reationsgeschwindigeit muss drastisch steigen. Die Messung wird bei onstanter reaseonzentration und onstanter Temperatur (5 C) bei arnstoffonzentrationen im Bereich mol/l durchgeführt.. Den Messurven ist die anfängliche Reationsgeschwindigeit v = [ p /) t zu entnehmen und gegen die anfängliche arnstoffonzentration aufzutragen. Schätzwerte für v,max und K M sind diesem Diagramm zu entnehmen. 3. Berechnung der Michaelis-Menten-Konstanten K M und der Maximalgeschwindigeit v,max einschließlich der Streuungen. Benutzen Sie zur Regression sowohl die linearisierte Form (Gl.(3)) als auch die ursprüngliche Michaelis-Menten-Gleichung (Gl.(), nichtlineare Regression, Regressionsfuntion "yperbel"). Die Ergebnisse beider Regressionsverfahren sind zu disutieren. Aus v,max ist die Enzymativität zu berechnen und mit den erstellerangaben (Flaschenetiett) zu vergleichen. Durchführung erstellung einer wässrigen reaselösung nach Arbeitsplatzanweisung erstellung einer wässrigen. m arnstofflösung (Stammlösung), 5 ml erstellung einer Verdünnungsreihe c, =.;.;.3;.4;.5;.;. und.5 mol/l (jeweils ml) erstellung einer wässrigen. m (N 4 ) CO 3 -Lösung, ml Messung der anfänglichen Reationsgeschwindigeit: Beginnend mit der niedrigsten arnstoffonzentration jeweils ml arnstofflösung in die temperierte Messzelle geben. Rührfisch einlegen, Leitfähigeitssonde einsetzen, Magnetrührer so einstellen, dass zwar intensiv gerührt wird, die Leitfähigeitsmessung aber nicht durch Gasblasen oder den Rührtrichter beeinflusst wird (ausprobieren). Schreiber starten ("pen" und "start"), Leitfähigeit s registrieren. Danach vorgegebenes Volumen der reaselösung (siehe Arbeitsplatzanweisung) mit einer Kolbenpipette einspritzen. o Messbereich (Kondutometer) µs/cm o Schreiberempfindlicheit mv/cm o Schreibergeschwindigeit s/cm o Temperatur 5 C

5 5 Die Messung wird abgebrochen, wenn ein zur Bestimmung des Leitfähigeitsanstiegs ausreichendes Kurvenstüc registriert worden ist (etwa min). Kalibrierung des y-kanals des Schreibers in Konzentrationseinheiten (Zwei Kalibrierungen vornehmen und den Mittelwert aus den Schreiberauslenungen bilden.) Registrierung der Leitfähigeit von ml dest. Wasser mit unveränderter Schreibereinstellung. Zugabe von ml der. m (N 4 ) CO 3 -Lösung. Berechnung des Kalibrierfators aus den beannten Konzentrationen der Messlösung und dem Mittelwert der Schreiberauslenungen. Anzugebende Werte a) anfängliche msatzgeschwindigeit v für c, = mol/l (T = 5 C) (Tabelle und Diagramm), Schätzung von v max und K M aus der Grafi. b) K M und v,max einschließlich ihrer Streuungen aus Ausgleichsrechnung mit Gleichung (Gl.(3), Computerausdruce. c) Enzymatische Ativität A der rease in µmol/mg min einschließlich ihrer Streuung. Vergleich mit erstellerangaben! Anmerung Für die Enzymativitäten sind zwei unterschiedliche Definitionen gebräuchlich, deren Zusammenhang am deutlichsten wird, wenn die Bruttoreation () in der folgenden Form geschrieben wird: O C N + O N rease N 3 + CO + O Die Reationsgeschwindigeit v dieser Reation ist N = =+ 3 v, Definiert man die Enzymativität A N3 als Stoffmenge N 3, die pro Zeiteinheit und Masseneinheit rease gebildet wird, ergibt sich deshalb ein Wert, der doppelt so groß ist wie die auf den Abbau von arnstoff bezogene Ativität A. A N3 = V = V, m m u A = A N 3