Ruhr- Universität Bochum Prof. Dr. med. A. Bufe Abteilung für Experimentelle Pneumologie

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1 Ruhr- Universität Bochum Prof. Dr. med. A. Bufe Abteilung für Experimentelle Pneumologie Genexpressionsanalysen in mononukleären Zellen des peripheren Blutes nach Stimulation mit Bakterienlysaten und Lipopolysaccharid des probiotischen E. coli Nissle 1917 und seines pathologischen Wildtyps E. coli W536 Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr- Universität Bochum Vorgelegt von Anne- Katrin Güttsches aus Meerbusch 2007

2 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Prof. Dr. med. A. Bufe Koreferent: Prof. Dr. med. S. Hahn Tag der Mündlichen Prüfung:

3 Abstract Problem: Der probiotische Bakterienstamm E. coli Nissle 1917 wird therapeutisch bei akuten und chronischen Entzündungen des Darmes eingesetzt. Die probiotische Wirkung von E. coli Nissle 1917 ist seit fast 100 Jahren bekannt, unbekannt sind jedoch die molekularen Wirkmechanismen seiner immunmodulatorisch aktiven Substanzen insbesondere auf Genexpressionsebene. Daher wurde in dieser Arbeit vergleichend der Einfluss von hochaufgereinigtem Lipopolysaccharid (LPS) und Bakterienrohlysat des probiotischen E. coli Nissle 1917 gegenüber seinem pathogenen Wildtyp E. coli W536 auf das Genexpressionsmuster von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMZ) untersucht. E. coli Nissle 1917 weist gegenüber seinem Wildtyp E. coli W536 strukturelle Unterschiede wie z.b. eine verkürzte O- spezifische Kette des LPS auf. Im Rahmen der Untersuchungen wurde u.a. der Frage nachgegangen, inwieweit diese strukturellen Unterschiede mit seiner probiotischen Wirkung zusammen hängt. Methode: Für die Analyse der Genexpressionsmuster in PBMZ wurde die Methode der Mikroarray- Hybridisierung für das in- vitro- System adaptiert, eine selektive Verifizierung der Ergebnisse erfolgte mittels real- time PCR. Immunologisch relevante Gene, die in der Mikroarray- Hybridisierung eine signifikante Änderung des Expressionsverhaltens zeigten, wurden mittels ELISA einer genaueren Analyse unterzogen. Die Kombination von Mikroarray- Hybridisierung und Proteinbestimmung mittels ELISA ließ Aussagen über die Induktion und Repression einzelner Gene durch die verwendeten Stimuli zu. Ergebnis: Im Genexpressionsmuster der PBMZ und in der Proteinfreisetzung wurden bei Stimulation mit hochaufgereinigtem LPS W536 im Vergleich zu dem mit einer verkürzten O- spezifischen Kette versehenen hochaufgereinigten LPS Nissle keine Unterschiede gemessen. Wurde Nissle- Lysat statt LPS Nissle zur Stimulation verwendet zeigte sich, dass Nissle- Lysat ein breiteres Spektrum an Genen reguliert als LPS Nissle. Dabei konnte für Nissle- Lysat eine höhere IL-10 Freisetzung sowohl auf Genexpressions- als auch auf Proteinebene nachgewiesen werden als für das W536- Lysat. Diskussion: Die Ergebnisse legten den Schluss nahe, dass das verkürzte LPS in vitro keinen direkten Einfluss auf die probiotische Wirkung von E. coli Nissle 1917 hat. Die Verwendung des Rohlysates von E. coli Nissle 1917 bewirkte eine breitere Genregulation und zeichnete sich darüber hinaus durch eine höhere Induktionskapazität für IL-10 gegenüber dem Rohlysat von E. coli W536 aus. E. coli Nissle 1917 ist also in der Lage, sich durch seine Apathogenität und Konkurrenzfähigkeit gegenüber pathogenen Darmbakterien im menschlichen Darm anzusiedeln. Gleichzeitig verfügt er über eine höhere in- vitro- Induktionskapazität für IL- 10 in Zellen des Immunsystems als E. coli W536. Diese wird über Faktoren vermittelt, die entweder für E. coli Nissle 1917 spezifisch oder in höherer Konzentration als in anderen Bakterien vorhanden sind, vermittelt und kann seine antiinflammatorische und probiotische Wirksamkeit erklären.

4 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Verzeichnis der Abkürzungen Einleitung Probiotika Definition und Historisches Klinische Bedeutung probiotisch wirksamer Bakterienstämme Eigenschaften probiotisch wirksamer Bakterienstämme Das Probiotikum E. coli Nissle Besonderheiten des Stammes E. coli Nissle Lipopolysaccharid (LPS) Allgemeine Merkmale des bakteriellen LPS Wirkung des LPS Molekulare Struktur des LPS am Beispiel von E. coli Nissle Mikroarrays Methodisches Prinzip der Mikroarray- Hybridisierung Methodik Material

5 Inhaltsverzeichnis Verwendete Chemikalien Verwendete Kits und Enzyme Verwendete Bakterienstämme Verwendete Lipopolysaccharide (LPS) Verwendetes Spenderblut Verwendete Fluoreszenzfarbstoffe zur cdns- Markierung Verwendete Mikroarrays Medien und Lösungen Methoden Herstellung der Bakterienrohlysate Vergleichende Wachstumskurvenanalyse der Bakterienstämme E. coli Nissle 1917 und E. coli W Herstellung von Bakterienlysaten durch Ultraschallbehandlung Bestimmung der Proteinkonzentration im Bakterienlysat nach Bradford Zellpräparation Gewinnung von venösem Vollblut und autologem Plasma Isolation von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMZ) Zellzahlbestimmung der PBMZ Inkulturnahme und Stimulation der PBMZ PBMZ- Kulturen PBMZ- Kulturen für die Zytokin- Konzentrationsbestimmung mittels ELISA Vitalitätsprüfung der PBMZ RNS- Präparation Isolation von Gesamt- RNS aus kultivierten PBMZ Denaturierende RNS- Gelelektrophorese mrns- Isolierung aus Gesamt- RNS Bestimmung der Konzentration und Reinheit der mrns

6 Inhaltsverzeichnis Synthese und Markierung von cdns Quantifizierung der in cdns integrierten Menge an Cy-3 bzw. Cy Hybridisierung der Mikroarrays Kompetetive Hybridisierung von Cy-3- und Cy-5- markierter cdns auf Mikroarrays Auslesen der hybridisierten Mikroarrays Auswertung der Mikroarray- Daten Normalisierung der im Mikroarray gemessenen Daten Quantitative real- time PCR Reverse Transkription von mrns in cdns Amplifikation und relative Quantifizierung genspezifischer cdns durch real- time PCR Quantitative Zytokinbestimmung mittels ELISA IL-6- ELISA IL- 10- ELISA IL-12p40- ELISA Ergebnisse Vergleichende Analyse des Wachstumsverhaltens der Bakterienstämme E. coli Nissle 1917 und E. coli W Etablierungsschritte der Mikroarraymethodik zur Analyse von Genexpressionsprofilen humaner PBMZ nach Stimulation mit bakteriellen Komponenten Ermittlung der benötigten PBMZ- und daraus gewonnener Gesamtbzw. mrns- Menge Bestimmung und Ausgleich unterschiedlicher Markierungsraten von Cy-3 und Cy-5 in cdns für die Mikroarray- Hybridisierung Überprüfung der Angleichung der unterschiedlichen Markierungsraten 3

7 Inhaltsverzeichnis von Cy-3 und Cy-5 durch Mikroarray- Hybridisierung Kontrolle der Spezifität der Mikroarray- Hybridisierung durch den Nachweis stimulus- spezifischer Genexpressionsmuster in PBMZ Genexpressionsanalysen mittels 10K- Mikroarrays Vergleichende Analyse der Genexpressionsmuster in PBMZ induziert durch LPS Nissle, LPS W536 oder LPS S. min Analyse des in PBMZ durch LPS Nissle induzierten Genexpressionsmusters Analyse des Genexpressionsmusters nach Stimulation mit LPS Nissle im Vergleich zu LPS W Vergleich der Genexpressionsmuster von PBMZ nach Stimulation mit LPS S.min. und LPS Nissle Vergleichende Analyse der Genexpressionsmuster von Nissleund W536- Lysat Analyse des in PBMZ durch Nissle- Lysat induzierten Genexpressionsmusters Vergleich der Genexpressionsmuster von PBMZ nach Stimulation mit LPS Nissle im Gegensatz zur Stimulation mit Nissle- Lysat Analyse des durch Nissle- Lysat induzierten Genexpressionsmusters im direkten Vergleich zu W536- Lysat real- time PCR ausgewählter Gene zur genaueren Bestimmung der Genexpression von IL-10, IL-12p40 und CCL Quantifizierungen der Zytokinproduktion nach Stimulation der PBMZ aus Zellkulturüberständen mittels ELISA IL-6- Freisetzung aus PBMZ nach Stimulation mit LPS oder Lysat IL-10- Freisetzung nach Stimulation mit LPS oder Lysat

8 Inhaltsverzeichnis IL-12p40- Freisetzung nach Stimulation mit LPS oder Bakterienlysat Quotient aus den Konzentrationen für IL-12p40 und IL Einfluss einer Hitzebehandlung von LPS und Bakterienlysat auf die Freisetzung von IL-12p40 und IL-10 aus PBMZ Zusammenfassung der Ergebnisse Diskussion Genexpressionsanalyse mittels Mikroarray Einfluss der verkürzten O- spezifischen Kette von LPS Nissle auf die Genexpression von PBMZ Vergleichende Analyse der Rohlysate von E. coli Nissle 1917 und E. coli W Quantitative Analyse der CCL24-, und IL-12p40- Expression Quantitative Analyse der IL-10- Freisetzung Literatur Anhang

9 Abkürzungen Verzeichnis der Abkürzungen Abb. Abbildung A. dest. Aqua destillata AREBP adenosine- uridine- rich element (ARE) binding protein AUC area under curve BAC bacterial artificial chromosome bp Basenpaar BSA Rinderserumalbumin bzgl. bezüglich bzw. beziehungsweise ca. circa CCL24 Chemokin (C-C- Motiv) Ligand 24 CD cluster of differentiation cdns komplementäre Desoxyribonukleinsäure Ct threshold cycle datp Desoxy- Adenin- 5'- Triphosphat dctp Desoxy- Cytosin- 5'- Triphosphat dgtp Desoxy- Guanin- 5'- Triphosphat dttp Desoxy- Thymin- 5'- Triphosphat dutp Desoxy- Uracil- 5'- Triphosphat d.h. das heißt DNS Desoxyribonukleinsäure DZ dendritische Zelle EDTA Ethylendiamintetraacetat ELISA enzyme linked immunosorbent assay FBS fötales Kälberserum GALT gut associated lymphatic tissue GUS ß- Glucuronidase h Stunde HA hämagglutinierende Einheiten 6

10 Abkürzungen HBSS Hanks Balanced Salt Solution HPI high- pathogenicity island IFN Interferon IL Interleukin IL-12p40 Interleukin 12, Untereinheit p40 IκB Inhibitor des nukleären Faktors kappa B IKK I kappa B- Kinase IRAK Interleukin-1- Rezeptor- assoziierte Kinase kb Kilobasen konz. konzentriert LBP LPS- bindendes Protein LPS Lipopolysaccharid MALT mucosa associated lymphatic tissue MAP3K Mitogen- aktivierte Proteinkinase- kinase- kinase Mb Megabasen MIF Migrationsinhibitionsfaktor min Minute MOPS 3- (N- Morpholino)- propan- sulfonsäure mrns messenger- Ribonukleinsäure MyD88 myeloid differentiation factor 88 NFκB nukleärer Faktor kappa B NCBI National Center for Biotechnology Information NDV Newcastle Disease Virus OD optische Dichte PAMP pathogen associated molecular pattern PBMZ mononukleäre Zellen des peripheren Blutes PBS phosphate buffered saline PCR Polymerase- Kettenreaktion PMV photomultiplier- Verstärkung Rn normalisiertes Reportersignal RNS Ribonukleinsäure rpm Umdrehungen pro Minute 7

11 Abkürzungen rrns ribosomale Ribonukleinsäure RT Raumtemperatur R- Typ- LPS rough- Typ- LPS s. siehe sec Sekunde S. min. Salmonella minnesota SNP small nucleotide polymorphism spp. species scd14 soluble CD14 ssrns einzelsträngige Ribonukleinsäure STAT signal transducer and activator of transcription S- Typ- LPS smooth- Typ- LPS Tab. Tabelle TGF transforming growth factor T H 1- Zelle, T H 2- Zelle T- Helferzelle Typ 1 bzw. Typ 2 Tr- Zelle regulatorische T- Helferzelle TLR toll- like- Rezeptor TNF Tumor- Nekrose- Faktor TRAF Tumor- Nekrose- Faktor- assoziierter Faktor TRAIL tumor- necrosis- factor- related apoptosis inducing ligand TRIS Tri- (hydroxymethyl-) aminomethan u.a. unter anderem vgl. vergleiche vs. versus WH Wiederholungen yop yersinia outer proteins 8

12 Einleitung 1. Einleitung 1.1 Probiotika Definition und Historisches Der Begriff probiotisch kommt aus der lateinischen bzw. altgriechischen Sprache (pro (lat.) = für und bios (gr.) = das Leben) und bedeutet so viel wie für das Leben. Er wurde erstmals im Bereich der Nutztierhaltung verwendet, wo Mitte des vorigen Jahrhunderts Alternativen zum verbreiteten präventiven Antibiotikaeinsatz gesucht wurden. Die Theorie einer gesundheitsfördernden Wirkung von Mikroorganismen auf die menschliche Gesundheit wurde jedoch schon Anfang des letzten Jahrhunderts von dem Immunologen Elie Metchnikoff beschrieben: Er erklärte die Gesundheit und Langlebigkeit der bulgarischen Bevölkerung damit, dass sie täglich fermentierte Milchprodukte zu sich nahmen, die nichtfäulniserregende Bakterien enthielten. Auf Grund dieser Beobachtungen schloss er, dass der Schlüssel zu einem langen gesunden Leben die Aufrechterhaltung einer gesunden Darmflora durch den täglichen Verzehr gesundheitsfördernder Bakterien ist (Metchnikoff, 1907). Als Probiotika werden heute demzufolge lebende, mikrobielle Nahrungsmittelzusätze bezeichnet, die nicht pathogen sind und zusätzlich einen fördernden Effekt auf die Gesundheit ausüben. Dazu zählen vor allem anaerobe Bakterien wie Lactobacillus und Bifidobacterium spp. (Noverr und Huffnagle, 2004) sowie der E. coli- Stamm Nissle 1917 (Blum et al., 1995) Klinische Bedeutung probiotisch wirksamer Bakterienstämme Probiotische Bakterienstämme eignen sich auf Grund ihrer immunmodulatorischen und opportunistischen Eigenschaften gegenüber potentiell pathogenen Bakterien 9

13 Einleitung gut zur Rekolonialisierung des Darmes nach Antibiotikatherapie (Malchow et al., 1995). Auch in der Therapie infektiöser und nicht- infektiöser entzündlicher Darmerkrankungen werden probiotisch wirksame Bakterienstämme zunehmend eingesetzt. So führt die Gabe von Lactobacillus rhamnosus GG, L. reuteri, L. casei oder Bifidobacterium lactis Bb12 zu einer Verkürzung der Dauer von Rotavirusbedingten Diarrhöen (Isolauri et al., 2002, Szajewska und Mrukowicz, 2001). Auch in der Therapie chronisch entzündlicher Darmerkrankungen gewinnen Probiotika an Bedeutung. E. coli Nissle 1917, Saccharomyces boulardii und eine Kombination aus Bifidobacterium, Lactobacillus und Streptococcus salivarius subsp. thermophilus erwiesen sich in der Therapie der Colitis ulcerosa oder des M. Crohn als genauso effektiv in Bezug auf eine Senkung der Remissionsrate wie die Standardtherapie mit Mesalazin bei Colitis ulcerosa- bzw. 5- amino- Salizylsäure (Mesalamin) bei M. Crohn- Patienten (Guslandi et al., 2000, Rembacken et al.,1999, Kruis et al.,1997). Im Darm angesiedelte probiotische Bakterienstämme beeinflussen jedoch nicht nur das Immunsystem des Darmes, sondern haben auch eine systemische immunmodulatorische Wirkung. Daher erstreckt sich ein weiteres potentielles Anwendungsgebiet von Probiotika auf die Prophylaxe und Therapie allergischer Erkrankungen außerhalb des Gastrointestinaltraktes, z.b. der Neurodermitis, häufig eine der ersten Manifestationen einer allergischen Erkrankung im frühen Kindesalter. Die Gabe von Lactobacillus rhamnosus GG konnte die Inzidenz der Neurodermitis bei neugeborenen Hochrisikopatienten (genetische Disposition für Neurodermitis und allergische Rhinitis) gesenkt werden (Kalliomaki et al., 2001). Des Weiteren gibt es Hinweise darauf, dass die so behandelten Neugeborenen vor der Entwicklung einer allergischen Erkrankung auch nach der Neugeborenenperiode geschützt waren (Kalliomaki et al., 2003). Bei Kindern, die bereits eine Neurodermitis entwickelt hatten, konnte die Gabe von Probiotika die Symptomatik verbessern (Viljanen et al., 2005, Isolauri et al., 2000). Eine Linderung der Symptomatik durch Probiotika wurde auch für die Nahrungsmittelallergie beschrieben (Miraglia und De Luca, 2004). 10

14 Einleitung Insgesamt verdichten sich die Hinweise darauf, dass Probiotika für die Prävention und Therapie allergischer Erkrankungen von Bedeutung sind. Ungeklärt ist hingegen die genaue Ursache für die Wirksamkeit probiotischer Keime. Wahrscheinlich spielen dabei die Fähigkeit, die Anlagerung potentiell pathogener Bakterien an die Darmepithelzellen zu verhindern und so Infektionen zu vermeiden sowie eine antiallergische Wirkung auf das Immunsystem (sowohl intra- als auch extraintestinal) eine große Rolle (Viljanen et al., 2005, Boudeau et al., 2003) Eigenschaften probiotisch wirksamer Bakterienstämme Wie bereits erwähnt ist der genaue Wirkmechanismus der verschiedenen probiotischen Bakterien noch nicht abschließend geklärt. Verschiedene Studien haben jedoch gezeigt, dass die gesundheitsfördernde Wirkung probiotischer Bakterienstämme wie Lactobacillus spp. oder E. coli Nissle 1917 zum einen darauf zurückzuführen ist, dass eine Besiedlung des Darmes mit probiotischen Bakterienstämmen eine Ansiedlung von potentiell pathogenen Mikroorganismen verhindert und das Verhältnis von pathogenen zu apathogenen Keimen zugunsten der apathogenen Bakterienstämme verschiebt (Noverr und Huffnagle, 2004). Zum anderen gibt es Hinweise darauf, dass Probiotika in der Lage sind, das Immunsystem der Darmmukosa zu beeinflussen und in die Regulation des Verhältnisses von T H 1-, T H 2- und insbesondere Tr- Zellen der Darmmukosa einzugreifen (von der Weid et al., 2001). Unreife dendritische Zellen sind in der Lage, zwischen verschiedenen Pathogenen (z.b. E. coli, Candida albicans und das Influenzavirus) zu unterscheiden, was dadurch deutlich wird, dass nach Kontakt der unreifen dendritischen Zellen zu E. coli, Candida albicans oder Influenzavirus stimulusspezifische Gene für Chemokine, Zytokine und Rezeptoren induziert bzw. reprimiert werden (Huang et al., 2001). Diese Diskrimination erfolgt mittels eines speziellen Musters an Rezeptoren des angeborenen Immunsystems, vor allem toll- like- Rezeptoren (TLR) und C- Typ- Lektinen auf der Oberfläche von dendritischen Zellen, die 11

15 Einleitung spezifisch pathogenassoziierte Molekülstrukturen (PAMPs) erkennen können (Bilsborough und Viney, 2004). Bakterielles LPS wird von den toll- like- Rezeptoren der unreifen dendritischen Zellen erkannt (genauer Mechanismus s. u.). Wird eine unreife dendritische Zelle von E. coli- LPS aktiviert, reift sie zu einer DZ1- Zelle aus und sezerniert infolgedessen proinflammatorische Moleküle wie TNF-α, MIP-1α und IL-12. Letzteres ist ein Wachstumsfaktor für T- Helferzellen, die so zu T H 1- Zellen programmiert werden (Granucci et al., 2003). Mit der Ausreifung der dendritischen Zellen geht auch eine Erhöhung kostimulatorischer Moleküle wie CD40 oder CD86 an deren Oberfläche einher, die ebenfalls an der Aktivierung von T- Helferzellen beteiligt sind (Banchereau und Steinman, 1998). Die unter Einwirkung von IL-12 ausreifenden T H -1- Zellen sind bei der adaptiven, zellvermittelten Immunantwort gegen Viren und Bakterien beteiligt. Sie produzieren vor allem IFN-γ, IL-2 und TNF-β und aktivieren Makrophagen. Gleichzeitig hemmt TNF-β die antikörpervermittelte Immunität. Eine übermäßige T H 1- Antwort ist mit der Entwicklung chronisch inflammatorischer Erkrankungen (z.b. Morbus Crohn (Romagnani, 1999)) assoziiert. Phagozytose von parasitenspezifischen Proteinen (z.b. von Filarien) durch unreife dendritische Zellen induziert die Ausreifung zu einer DZ2- Zelle mit Sekretion von IFN-γ und IL-4; letzteres bewirkt, dass sich T- Helferzellen zu T H 2- Zellen entwickeln (Whelan et al., 2000). T H 2- Zellen produzieren IL-4, IL-5, IL-10 und IL- 13. Sie sind daher verantwortlich für eine starke Antikörperproduktion durch B- Lymphozyten, die Aktivierung von eosinophilen Granulozyten aber auch für die Hemmung der Makrophagenaktivität durch Sekretion von IL-10. Eine übermäßige T H 2- Reaktion induziert via IL-4 und IL-5 eine allergische Reaktion auf spezifische Antigene bei entsprechend genetisch prädisponierten Personen durch Aktivierung von antikörperproduzierenden B- Lymphozyten (Romagnani, 1999). Eine weitere Gruppe der T- Helferzellen werden als regulatorische T- Zellen (Tr) bezeichnet. Durch repetetive Stimulation von naiven T- Helferzellen durch dendritische Zellen mittels IL-10, TGF-β und IFN-α werden Tr- Zellen generiert, die wenig proliferieren und hohe Mengen an antiinflammatorischem IL-10 sezernieren (Bilsborough und Viney, 2004). Sie verhindern möglicherweise eine infekt- 12

16 Einleitung induzierte Immunpathologie und können als Reaktion des Immunsystems auf bakterielle, virale oder parasitäre Antigene aktiviert werden (McGuirk und Mills, 2002). Es gibt Hinweise darauf, dass die Induktion von Tr- Zellen für die Wirksamkeit von probiotisch wirksamen Bakterienstämmen eine nennenswerte Rolle spielt. So kann die Applikation von Lactobacillus reuteri in vitro eine Induktion der antiinflammatorisch wirksamen Mediatoren IL-10 und TNF-β sowie eine Repression proinflammatorischer Zytokine wie IL-12 und IL-6 in unreifen Maus- Splenozyten bewirken (von der Weid et al., 2001). Eine wesentliche Rolle in der Repression proinflammatorischer Zytokine wie IL-12 kommt dabei dem IL-10 selbst zu, da IL-10 neben seiner Fähigkeit zur Differenzierung von Tr- Zellen beizutragen in der Lage ist, die Produktion proinflammatorischer Zytokine und Interleukine zu supprimieren. Des Weiteren reguliert IL-10 das Wachstum und die Differenzierung z.b. von B- Lymphozyten, dendritischen Zellen, Mastzellen, zytotoxischen- und T- Helferzellen. Werden T- Helferzellen in Anwesenheit von IL- 10 aktiviert, kann dies zu dessen Anergie führen, die nicht durch IL-2 oder eine Stimulation mit anti-cd3 bzw. anti-cd28 rückgängig gemacht werden kann (Moore et al., 2001, Groux et al., 1996). Probiotika verhindern also einerseits die Ansiedlung von potentiell pathogenen Organismen im Darm, andererseits vermitteln sie eine immunmodulatorische Wirkung auf das Immunsystem durch die Induktion von Tr- Zellen, die das immunmodulatorische IL-10 sezernieren. 1.2 Das Probiotikum E. coli Nissle 1917 Der probiotische Bakterienstamm E. coli Nissle 1917 (Serotyp 06:K5:H1) ist ein apathogener Darmbakterienstamm, der als Probiotikum hauptsächlich zur Therapie verschiedener gastrointestinaler Erkrankungen eingesetzt wird. (Rembacken et al., 1999, Kruis et al., 1997, Malchow, 1997, Möllenbrink und Bruckschen, 1994). E. coli Nissle 1917 wurde erstmals im ersten Weltkrieg von A. Nissle aus den Fäzes eines Soldaten isoliert, der als einziger seiner Gruppe nicht an einer Durchfallerkrankung erkrankt war. Nissle nahm an, dass dieser E. coli- 13

17 Einleitung Stamm dafür verantwortlich gewesen ist, seinen Träger durch die Aufrechterhaltung eines gesunden Milieus vor einer infektiösen Durchfallerkrankung zu bewahren. E. coli Nissle 1917 gehört zum Serotyp 06, zu dem sowohl apathogene als auch pathogene E. coli- Stämme zählen. Die Wildtyp- Mutante von E. coli Nissle 1917, der uropathogene E. coli- Stamm W536, gehört ebenfalls dem Serotyp 06 an (Grozdanov et al., 2004) Besonderheiten des Stammes E. coli Nissle 1917 Sowohl pathogene als auch apathogene E. coli- Stämme sind in der Lage, den menschlichen Darm zu besiedeln. Die Besonderheit von E. coli Nissle 1917 besteht einerseits darin, dass der Stamm weder Pathogenitätsfaktoren wie α- Hämolysin, S- und P- Fimbrien- Adhesine noch Toxine produziert (Grozdanov et al., 2002, Blum et al., 1995). Die fehlende Expression von Pathogenitätsfaktoren bzw. Toxinen (z.b. α- Hämolysin und P- Fimbrien) ist auf Deletionen und Punktmutationen der entsprechenden Genloci von E. coli Nissle 1917 während seiner Evolution zurückzuführen (Grozdanov et al., 2004). Im Gegensatz zu E. coli Nissle 1917 weist sein Wildtypstamm E. coli W536 verschiedene Pathogenitätsfaktoren wie α- Hämolysin und P- Fimbrien auf (Grozdanov et al., 2004). Zum anderen verfügt E. coli Nissle 1917 über spezifische Faktoren, die sein Überleben im Darm ermöglichen. Dazu zählen Typ1- und F1C- Fimbrien (Blum et al., 1995) und zwei bakterizid wirksame Mikrozine (Mikrozin H47 und Mikrozin M), die gegen die Eisenaufnahmerezeptoren FepA, Cir, Fiu und iron bestimmter anderer Enterobactericeae (insbesondere andere E. coli) gerichtet sind (Patzer et al., 2003) und E. coli Nissle 1917 so einen Selektionsvorteil gegenüber Enterobactericeae verschaffen, da sie diese in ihrem Wachstum hemmen. Des Weiteren exprimiert E. coli Nissle 1917 im Gegensatz zu E. coli W536 sechs Eisen- Aufnahme- Systeme (Enterobactin, Yersiniabactin, Aerobactin, Salmochelin, Eisen- Dizitrat- Transportsystem und chu Häm- Transportlocus), die eben- 14

18 Einleitung falls einen Wachstumsvorteil für E. coli Nissle 1917 gegenüber anderen Enterobakterien bedeuten (Grozdanov et al., 2004). Eine weitere Besonderheit bezieht sich auf das LPS von E. coli Nissle Gegenüber dem Wildtypstamm E. coli W536 exprimiert E. coli Nissle 1917 ein verkürztes LPS, welches für seine Serumsensibilität verantwortlich ist und makroskopisch zu einem semirauen Wachstum von E. coli Nissle 1917 führt (Grozdanov et al., 2002). Die Abwesenheit von Pathogenitätsfaktoren und das Vorhandensein spezifischer Faktoren, die das Überleben von E. coli Nissle 1917 im menschlichen Darm ermöglichen, als auch die Serumsensibilität von E. coli Nissle 1917 tragen höchstwahrscheinlich zu seiner probiotischen Wirkung bei (Grozdanov et al., 2004). Eine Übersicht über die Eigenschaften von E. coli Nissle 1917 und E. coli W536 zeigt Tab

19 Einleitung Tab. 1.1: Zusammenfassung der Eigenschaften von E. coli Nissle 1917 und E. coli W536 im Vergleich (nach Grozdanov et al., 2004, Schneider et al., 2004, Hacker et al., 2003) Eigenschaften E. coli Nissle 1917 E. coli W536 Wachstum semirau (semirough) glatt (smooth) Pathogenität apathogen, probiotisch uropathogen Serumsensitivität Serumsensitivität durch verkürztes LPS (eine Wiederholungseinheit in der O- spezifischen Kette, s.u.) Serumresistenz durch langes LPS (ca. 40 Wiederholungseinheiten in der O- spezifischen Kette, s.u.) Pathogenitätsfaktoren keine α- Hämolysin P- Fimbrien K15- Kapselantigen Adhäsine Typ-1- Fimbrien F1C- Fimbrien Hek- Adhäsin S- Fimbrien Sap- Adhäsin Mikrozine Mikrozin H47 keine Mikrozin M Eisenaufnahmesysteme Enterobactin Yersiniabactin Yersiniabactin iro Siderophore- System Aerobactin Salmochelin Eisen-Dizitrat- Transportsystem chu Häm-Transportlokus sonstiges Exprimiert temperaturunabhängig Zellulose und curli 16

20 Einleitung 1.3 Lipopolysaccharid (LPS) Allgemeine Merkmale des bakteriellen LPS LPS ist ein essentieller Zellwandbestandteil Gram- negativer Bakterien und gehört zu den aktivsten Immunstimulatoren die bis heute bekannt sind. Die extrem hitzestabilen, amphiphilen LPS- Moleküle weisen eine gemeinsame Grundstruktur auf, die vom Immunsystem anhand des Lipid A, einer stark konservierten Struktur des LPS, spezifisch erkannt wird (Grozdanov et al., 2002) Wirkung des LPS Die Erkennung der Lipid A- Komponente des LPS erfolgt über den TLR4- MD2- CD14- Rezeptorkomplex. Zunächst wird das LPS vom LBP (LPS- bindendes Protein), einem Akut- Phase- Protein im Plasma, gebunden. Der LPS- LBP- Komplex lagert sich an den membrangebundenen CD14- Rezeptor auf der Oberfläche von immunologisch bedeutsamen Zellen wie Monozyten, Makrophagen, pdz1- Prekursorzellen und B- Zellen an (Shortman und Liu, 2002, Medzhitov und Janeway Jr., 2000). Die Bindung des LPS- LBP- Komplexes an CD14 führt zur Assoziation von CD14 mit dem TLR4- MD2- Komplex und zur Dimerisierung und Aktivierung von TLR4 (s. Abb. 1.1). Der aktivierte TLR4 bindet das Adapterprotein MyD88, welches IRAK4 aus der IRAK- (Interleukin 1- Rezeptor- assoziierte Kinase) Proteinfamilie rekrutiert. IRAK4 phosphoryliert IRAK1 und IRAK2, und dieser Komplex führt zur Bindung von TRAF-6 (Tumor- Nekrose- Faktor- assoziierter Faktor 6). TRAF6 bewirkt über MAP3K (Mitogenaktivierte Proteinkinase- kinase- kinase), IKK1 und IKK2 die Phosphorylierung von IκB (Inhibitor von NFκB) und führt so zur Freisetzung von NFκB, der in den Zellkern transloziert. NFκB induziert dort die Transkription einer Reihe von Genen, die von großer Bedeutung für die Inflammation und Immunantwort sind (Beutler, 2004, Alexander und Rietschel, 2001, Medzhitov und Janeway Jr., 2000). Dazu zählen die Gene von proinflammatorischen Zytokinen (z.b. TNF-α und Migrations- 17

21 Einleitung inhibitionsfaktor MIF), Interleukinen (z.b. IL-1β, IL-6, IL-8 und IL-12) (Alexander und Rietschel, 2001, Rietschel et al., 1996)) sowie Chemokinen (z.b. CCL24 (Watanabe et al., 2002)). Abb. 1.1: LPS- Detektion durch Monozyten und Makrophagen Bakterielles LPS wird vom LBP gebunden und lagert sich an den CD14- Rezeptor an. Der LPS- LBP- CD14- Komplex assoziiert mit dem TLR4- MD2- Komplex, was zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB im Zellkern führt. Die Aktivierung von NFκB bewirkt eine vermehrte Expression verschiedener Zytokine und Chemokine (Medzhitov und Janeway Jr., 2000). 18

22 Einleitung Molekulare Struktur des LPS am Beispiel von E. coli Nissle 1917 Das LPS Gram- negativer Bakterien setzt sich aus drei Struktureinheiten zusammen: dem Lipid A, der Kernregion und der O- spezifischen Kette (s. Abb. 1.2). Das hydrophobe Lipid A ist mittels seiner Fettsäurereste in der bakteriellen Zellwand verankert und bindet kovalent an die hydrophile Oligosaccharid- Kernregion. Den äußeren Teil des LPS bildet die O- spezifische Kette, welche sich wie die Kernregion aus Oligosacchariden zusammensetzt und unter den verschiedenen Bakterienstämmen die höchste Variabilität der drei LPS- Komponenten aufweist (Alexander and Rietschel, 2001, Rietschel et al., 1996). O-spezifische Kette (O6) von E. coli Kernoligosaccharid (R1) (R1) von von E. E. coli coli Lipid A von E. coli Lipid A von E. coli Abb. 1.2: LPS des Stammes E. coli Nissle 1917 Das LPS setzt sich aus Lipid A, Kernoligosaccharid und O- spezifischer Kette zusammen (nach Grozdanov et al., 2002) 19

23 Einleitung Lipid A und Kernoligosaccharid Das in der bakteriellen Zellwand verankerte Lipid A ist der am meisten konservierte Teil des LPS. Wie bei allen anderen Gram- negativen Bakterien weist das Lipid A von E. coli Nissle 1917 eine charakteristische Hexaacyl- Struktur auf (s. Abb. 1.2), die für die immunologische Wirkung des LPS von großer Bedeutung ist (Grozdanov et al., 2002, Zähringer et al., 1994). Änderungen in dieser Molekülstruktur führen zur Abschwächung bzw. zum Verlust der immunologischen Aktivität des LPS (Flad et al., 1993). Das Lipid A bildet also das primäre immunmodulatorische Aktivitätszentrum des LPS, welches spezifisch durch zelluläre (CD14- MD2- TLR4- Komplex) und humorale (LBP, scd14) Komponenten der angeborenen Immunität des Säugerorganismus erkannt wird (Medzhitov und Janeway Jr., 2000, Wright, 1995). Somit bildet der Lipid A- Anteil des LPS ein Pathogen- assoziiertes molekulares Muster (kurz: PAMP), durch welches dem Wirtsorganismus eine Infektion mit Gram- negative Bakterien angezeigt wird (Medzhitov und Janeway Jr., 2000). An das Lipid A ist das Kernoligosaccharid gebunden (s. Abb. 1.2), welches bei E. coli fünf verschiedene Strukturen (R1- R4, K12) annehmen kann. Am häufigsten kommt das R1- Typ- Kernoligosaccharid vor, welches auch bei E. coli Nissle 1917 sowie bei seinem Wildtyp E. coli W536 vorliegt und aus einem Tetradecasaccharid besteht (Grozdanov et al., 2002, Amor et al., 2000, Vinogradov et al., 1999). Auf Grund dieses R1- Typ- Kernoligosaccharid werden die beiden E. coli- Stämme dem Serotyp 06 zugeteilt. Enteropathogene E. coli- Stämme weisen hingegen häufiger ein R3- Typ- Kernoligosaccharid auf (Gibbs et al., 2004, Amor et al., 2000). O- spezifische Kette Die O- spezifische Kette (s. Abb. 1.2) besteht aus einer variablen Anzahl (z.b. n = 1 bei E. coli Nissle 1917 und n = 40 bei E. coli W536) von repetetiv angeordneten Oligosaccharidstrukturen (Todar, 2006, Hacker et al., 2003), den Wiederholungseinheiten, und ist der Teil des LPS, der die größte Strukturvariabilität innerhalb der Gram- negativen Bakterienspezies aufweist. An der Biosynthese der O- spezifischen Kette sind zwei Enzymsysteme beteiligt, die von unterschiedlichen Genen 20

24 Einleitung kodiert werden. Die erste Wiederholungseinheit der O- spezifischen Kette, die direkt an das Kernoligosaccharid bindet, wird durch die O- Antigen- Ligase an die Kernoligosaccharidregion gebunden. Die Polymerisation der O- spezifischen Kette erfolgt durch die O- Antigen- Polymerase, die durch das wzy- Gen kodiert wird (Grozdanov et al., 2002). Die Anzahl der Wiederholungseinheiten sowie deren molekulare Struktur sind spezifisch für den jeweiligen Gram- negativen Bakterienstamm. Morphologisch werden die Stämme unterschieden in S- (smooth: glatt) Typ-, R- (rough: rau) Typ und semirough- LPS. Weist ein Bakterienstamm eine lange O- spezifische Kette mit vielen Wiederholungseinheiten (wie z.b. E. coli W536 mit 40 Wiederholungseinheiten) auf, wird sein LPS gemäß der makroskopisch morphologischen Erscheinung der entsprechenden Bakterienkolonie als S- Typ- LPS bezeichnet. S- Typ- LPS besteht aus bis zu 50 repetetiven Oligosaccharideinheiten von meist 2-8 Monomeren. Durch genetische Mutationen im wzy- Gen kann die Ausbildung einer O- spezifischen Kette unterbleiben; das LPS solcher Bakterienstämme wird als R- Typ- LPS bezeichnet (Alexander und Rietschel, 2001, Rietschel et al., 1996). Des Weiteren werden Mischformen gefunden, die auf Grund ihrer morphologischen Erscheinung als semirough bezeichnet werden; zu diesem Typ zählt auch der Stamm E. coli Nissle 1917 (Grozdanov et al., 2002). Charakteristisch für E. coli Nissle 1917 ist die Tatsache, dass die O- spezifische Kette nur eine einzige Wiederholungseinheit aufweist, was auf eine Defektmutation im O- Antigen- Polymerasegen (wzy) zurückzuführen ist. Eine Punktmutation im wzy- Gen von E. coli Nissle 1917 führt zur Ausbildung eines internen Stopcodons, welches eine Verkürzung der wzy- Polymerase von E. coli 1917 gegenüber der wzy- Polymerase von E. coli W536 bewirkt (Grozdanov et al., 2002). Diese verkürzte Polymerase ist nicht funktionell. Der Wildtypstamm von E. coli Nissle 1917, E. coli W536, weist diese Defektmutation nicht auf und kann daher eine lange O- spezifische Kette von ca. 40 Wiederholungseinheiten synthetisieren. Aufgrund dieser Eigenschaften eignet sich das LPS des Stammes E. coli W536 zum direkten Vergleich mit dem LPS von E. coli Nissle 1917 (Grozdanov et al., 2004). Da die erste Wiederholungseinheit von der O- Antigen- Ligase an das Kernoligosaccharid gebunden wird, weist die O- spezifische Kette des LPS von E. coli 21

25 Einleitung Nissle 1917 eine Wiederholungseinheit auf, das LPS wird auf Grund der defekten O- Antigen- Polymerase jedoch nicht polymerisiert. Die Oligosaccharideinheit, die an das Kernoligosaccharid gebunden wird, entspricht einer Wiederholungseinheit des Serotyps 06 (Grozdanov et al., 2002). Eine lange O- spezifische Kette schützt ihren Träger vor dem Angriff durch bakterizide Serumfaktoren und das Komplementsystem, was eine hohe Virulenz des Erregers bedingt. Dieser Schutz ist bei E. coli Nissle 1917 nicht mehr gegeben, weshalb er effektiv durch das Komplementsystem beseitigt werden kann (Reeves, 1995, Porat et al., 1992, Valvano, 1992). Zusätzlich sind weitere Serumfaktoren an der Abwehr der Bakterien beteiligt. Dazu zählen die Pentraxine (z. B. C- reaktives Protein), Fikoline und Kollektine (wie z.b. surfactant protein A und D), die an Glykostrukturen von Bakterien binden, sie opsonieren und so eine Aktivierung des Komplementsystems bzw. der Phagozyten bewirken (Du Clos und Mold, 2004, Holmskov et al., 2003, Ramadori und Christ, 1999). Die Länge der O- spezifischen Kette spielt auch eine Rolle bei der Aktivierung von proinflammatorischem TNF-α. So bewirkt das S- Typ- LPS von Salmonella minnesota über den CD14- vermittelten Signalweg eine um den Faktor 1000 höhere TNF-α- Freisetzung aus Makrophagen als das R- Typ- LPS von Bacteroides fragilis (Gangloff et al., 1999). Durch das verkürzte LPS weist E. coli Nissle 1917 eine verminderte Virulenz auf, die auf eine Defektmutation im wzy- Gen zurückzuführen ist und neben dem Fehlen von Pathogenitätsfaktoren maßgeblich zu dessen Avirulenz beiträgt. Unbekannt ist jedoch, ob die verkürzte O- spezifische Kette von E. coli Nissle 1917 besondere Auswirkungen auf die Zellen des Immunsystems hat und welche Rolle die fehlenden Pathogenitätsfaktoren in diesem Zusammenhang spielen. Aus diesem Grund sollte auf breiter Basis untersucht werden, ob E. coli Nissle 1917 einen anderen Einfluss auf die Genexpression immunologisch wichtiger Zellen hat als E. coli W536. Dies ist insbesondere deswegen zu vermuten, weil E. coli Nissle 1917 im Gegensatz zu E. coli W536 apathogen ist und probiotisch wirkt. Um dies analysieren, wurde die Methode der Mikroarray- Hybridisierung als Screeningmethode angewandt. 22

26 Einleitung 1.4 Mikroarrays Die Methode der Mikroarray- Hybridisierung wurde erstmals 1996 von Patrick O. Brown und David Botstein an der Stanford University zur Analyse des Genoms von Saccharomyces cervisiae verwendet (Brown und Botstein, 1999). Mikroarrays ermöglichen die gleichzeitige Analyse des Expressionsverhaltens von mehreren tausend Genen in einem einzigen Experiment (Brown und Botstein, 1999, Schena et al., 1996). Auf diese Weise kann auf einer breiten Basis analysierter Gene untersucht werden, in welchen Zellen des Organismus welche Gene konstitutiv, reprimiert oder induziert exprimiert werden. Insbesondere können zellspezifische Genexpressionsmuster und deren Veränderungen infolge von physiologischen oder krankheitsbedingten Stimuli erfasst werden (Murphy, 2002). Voraussetzung für die Analyse des Expressionsverhaltens tausender Gene auf einem Mikroarray ist die Kenntnis genspezifischer kurzer Nukleotidsequenzen, die nach einem festgelegten Muster auf eine Trägermatrix aufgetragen und so immobilisiert bzw. durch photolithographische Methoden direkt auf dem Glasobjektträger synthetisiert werden (Murphy, 2002). 23

27 Einleitung Auftragen der Oligonukleotide mrns und Cy-5- markierte Nukleotide mrns und Cy-3 markierte Nukleotide Mikroarray mit spezifischen Oligonukleotidspots Fluoreszenzmarkierte cdns Mikroarray mit hybridisierter cdns Detektion der Fluoreszenzintensitäten Abb. 1.3: Herstellung und Hybridisierung von Mikroarrays. Die genspezifischen Oligonukleotide werden nach einem vorgegebenen Muster auf den Mikroarray in Form von gensequenzspezifischen spots hybridisiert. Die zu untersuchende mrns wird in einer kombinierten reversen Transkriptions- und Markierungsreaktion fluoreszenzmarkiert. Dabei werden die miteinander zu vergleichenden cdns- Präparationen unterschiedlich fluoreszenzmarkiert und gemeinsam auf einem Mikroarray hybridisiert. Die Fluoreszenzen werden detektiert und deren Intensität für jeden spot zueinander ins Verhältnis gesetzt. 24

28 Einleitung Methodisches Prinzip der Mikroarray- Hybridisierung Die zu analysierenden Gensequenzen werden aus entsprechenden Datenbanken ausgewählt und auf den Mikroarray gespottet (s. Abb. 1.3) (Gershon, 2002, Murphy, 2002). Je nach Größe werden sie aus unterschiedlichen Quellen, z.b. BAC (bacterial artificial chromosome)- Klonen, Plasmiddatenbanken oder durch Oligonukleotidsynthese gewonnen (Watson et al., 2004, Anzick und Trent, 2002, Murphy, 2002). In dieser Arbeit wurden Oligonukleotidarrays verwendet. Oligonukleotide sind mit 50 bp die kürzesten Nukleotideinheiten und bestehen aus einer für das zu analysierende Gen spezifischen Oligonukleotidsequenz (Murphy, 2002). Dieses genspezifische Oligonukleotid wird durch den mechanischen Kontakt zwischen der Nadel und der Glasoberfläche an den Objektträger angelagert (Lashkari et al., 1997, Schena et al., 1996). Auf diese Weise werden kleine Merkmale (spots) gebildet, die die jeweils spezifische Nukleotidsequenz für die zu untersuchenden Gene aufweisen (s. Abb 1.3). Die mrns- Präparationen, die aus zwei miteinander zu vergleichenden Zielzell- Proben isoliert werden, werden durch das Enzym reverse Transkriptase in cdns umgeschrieben und diese während der Transkription durch Einbau fluoreszenzfarbstoffgekoppelter Nukleotide (z.b. Cy-3- oder Cy-5- dctp) markiert (s. Abb 1.3). Cy-3 und Cy-5 werden oft als Fluoreszenzfarbstoffe kombiniert, da sie effizient von der reversen Transkriptase in cdns integriert werden und bezüglich ihres Absorptions- und Emissionsspektrums weit auseinanderliegen (Murphy, 2002). Beide miteinander zu vergleichenden cdns- Präparationen werden in einer einzigen kompetetiven Reaktion auf einem Mikroarray hybridisiert (s. Abb 1.3). Die Farbstoffe werden durch einen Laser zur Fluoreszenz angeregt und das von jedem Farbstoff emittierte Licht in einem konfokalen Scanner detektiert (s. Abb. 1.3) (Murphy, 2002). Da die Fluoreszenzfarbstoffe direkt in die cdns integriert werden, ist die detektierte Fluoreszenzintensität proportional zu der Menge an genspezifischer cdns und ermöglicht so eine quantitative Aussage über die Menge spezifischer Genprodukte der Zielzellen. 25

29 Einleitung Die beiden Fluoreszenzintensitäten werden für jeden spot miteinander ins Verhältnis gesetzt, um Mengenveränderungen der Genprodukte miteinander zu vergleichen und so die Induktion oder Repression einzelner Gene unter definierten Stimulationsbedingungen zu messen. Um diese Mengenveränderungen detektieren zu können, werden jedoch große Mengen an Ausgangsmaterial (z. B. RNS) benötigt. Die niedrige Sensitivität ist ein Nachteil der Mikroarray- Hybridisierung, zudem ist sie auf Grund des großen technischen Aufwandes sehr kostenintensiv. Die Nachteile werden jedoch durch den großen Vorteil überwogen, dass mittels Mikroarray- Hybridisierung ein breitgefächertes Screening möglich ist, d. h. in einer Messung mehrere tausend Gene gleichzeitig hinsichtlich ihrer Expression erfasst werden können. So wurden mit Hilfe der Mikroarray- Hybridisierung bereits umfangreiche Genexpressionsanalysen an unterschiedlichen Zellpopulationen durchgeführt, beispielhaft sei hier die Arbeit von Huang et al. erwähnt, in der Änderungen im Genexpressionsprofil dendritischer Zellen bei Stimulation mit E. coli- LPS, Candida albicans und Influenzavirus untersucht wurden (Huang et al., 2001). In der vorliegenden Arbeit wurden Mikroarrays als Screeningmethode eingesetzt, die es erlaubt, auf breiter Basis Genexpressionsänderungen in PBMZ zu erfassen und so die Grundlage für eine genauere Analyse eben dieser zu schaffen. 26

30 Methodik 2. Methodik 2.1 Material Verwendete Chemikalien Agarose BioProducts, Rockland, USA Ammoniumsulfat Serva, Heidelberg Bromphenolblau Riedel- de Haen, Seelze Columbia Agar Basis Oxoid, Wesel di- Natriumhydrogenphosphat Merck, Darmstadt Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Sigma, Taufkirchen Ethanol, reinst Riedel- de Haen Ethidiumbromid Amresco, Solon, Ohio, USA Formaldehyd, 37 % Merck Formamid (100%) Fluka, Buchs, Schweiz Ficoll/ Isopaque (1,077 g/ml) PAN Biotech, Aidenbach Glycerin Merck 27

31 Methodik Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Biochrom, Berlin Kaliumdihydrogenphosphat Merck Kaliumchlorid Riedel- de Haen Kathon Merck Lithiumchlorid Merck Magnesiumchlorid Merck ß- Mercaptoethanol Merck 3- (N- Morpholino)- propan- sulfonsäure (MOPS) Boehringer, Mannheim Natriumacetat Merck Natriumchlorid Caesar & Loretz, Hilden Natriumcitrat Merck Natriumdodecylsulfat ICN Biomedicals Inc., Ohio Natriumheparin Ratiopharm, Ulm Natriumhydrogencarbonat Merck Natriumcarbonat Merck Phenol Merck 28

32 Methodik Polyoxyethylensorbitanmonolaurat (Tween- 20) Merck Schwefelsäure Merck Sojabouillon Oxoid Tetramethylbenzidin Fluka Thimerosal Roth, Karlsruhe Tri- (hydroxymethyl-) aminomethan (TRIS) Roth Trypanblau Sigma Verwendete Kits und Enzyme Cy- Scribe First- Strand cdns- labeling Kit Dynabeads mrns Purification Kit Amersham Biosciences, Freiburg Dynal Biotech, Oslo, Norway MinElute PCR Purification Kit Qiagen, Hilden Ribonuklease H USB RNeasy Midi Kit Qiagen Taq Man Reverse Transcription Reagents Applied Biosystems 29

33 Methodik Verwendete Bakterienstämme Der probiotische Bakterienstamm E. coli Nissle 1917 (Serotyp: 06 K5 H1) und der Wildtypstamm E. coli W536 (Serotyp: 06 K15) wurden als Dauerkulturen von der Firma Ardeypharm, Herdecke bereitgestellt Verwendete Lipopolysaccharide (LPS) Das LPS des Stammes E. coli Nissle 1917 (im Folgenden bezeichnet als LPS Nissle ) und LPS des Stammes E. coli W536 (im Folgenden bezeichnet als LPS W536 ) wurden hochaufgereinigt und lyophyllisiert bereitgestellt durch Herrn Prof. Dr. Ulrich Zähringer, Abteilung für Immunchemie und biochemische Mikrobiologie, Forschungszentrum Borstel (Grozdanov et al., 2002). Als LPS des Stammes Salmonella minnesota (Serotyp: R7 H915; im Folgenden bezeichnet als LPS S.min. ) wurde das kommerziell erhältliche LPS der Firma Sigma verwendet. Die lyophyllisierten LPS- Präparationen wurden in pyrogenfreiem A. dest. (Braun) gelöst (Endkonzentration: 1 mg/ml) Verwendetes Spenderblut Für die Zellisolierung wurde venöses Vollblut von freiwilligen adulten Spendern verwendet, deren Daten in einer Spenderdatei der Abteilung für Experimentelle Pneumologie unter Einhaltung der Vorschriften des Datenschutzes geführt werden. Die Verwendung der Blutproben erfolgte mit Genehmigung der lokalen Ethikkommission. 30

34 Methodik Verwendete Fluoreszenzfarbstoffe zur cdns- Markierung Für die Fluoreszenzmarkierung der cdns wurden die folgenden Fluoreszenzfarbstoffe der Firma Amersham verwendet. Tab. 2.1: Verwendete Fluoreszenzfarbstoffe Bezeichnung des Farbstoffes Cy- 3- dctp und Cy- 3- dutp Cy- 5- dctp und Cy- 5- dutp Absorptionsmaximumaximum Emissions- Extinktionskoeffizient 550 nm 570 nm M 1 x cm nm 670 nm M 1 x cm -1 Indocarbocyanin Indodicarbocyanin Abb. 2.1: Cy-3- dctp (5- aminopropargyl- 2 - deoxycytidin 5 - triphosphat gebunden an Cy-3- Fluoreszenzfarbstoff Abb. 2.2: Cy-5- dctp (5- aminopropargyl- 2 - deoxycytidin 5 - triphosphat gebunden an Cy-5- Fluoreszenzfarbstoff) Verwendete Mikroarrays Für die Analyse der Genexpression wurden Mikroarrays verwendet, die mit 50 immunologisch relevanten Genen und vier Referenzgenen als Kontrollen versehen waren (custom- made Test- Mikroarrays, im Folgenden als Test- Mikroarrays 31

35 Methodik bezeichnet; Genliste s. Anhang). Die Gene wurden selbst ausgewählt, die entsprechenden Oligonukleotidsequenzen von der Firma MWG Biotech synthetisiert und auf den Mikroarray aufgetragen. Des Weiteren wurde der kommerziell erhältliche GeneArray Human 10KA aus der human- 30K- Serie der Firma MWG Biotech (im Folgenden als 10K- Mikroarray bezeichnet) für die Genexpressionsanalysen eingesetzt. Tab. 2.2: Physikalische Parameter der verwendeten Mikroarrays custom- made Test- Mikroarrays (MWG) GeneArray Human 10KA, MWG Anzahl der spots 108 (2 x 54 Gene in Doppelbestimmung) Durchmesser der spots 140 µm 100 µm Abstand der spots 400 µm 240 µm Länge der Oligonukleotide 50- mer 50- mer Analysierter DNS- Strang sense- Strang sense- Strang Anzahl der Oligonukleotidsequenzen pro Gen Medien und Lösungen Medium für die Bakterienkultur Soja- Bouillon (Oxoid) 17 g/l Caseinpepton 3 g/l Sojamehlpepton 5 g/l NaCl 2,5 g/l Dikaliumhydrogenphosphat (K 2 HPO 4 ) 2,5 g/l Glucose 32

36 Methodik Agarplatten (aus Columbia Agar Basis, Oxoid) 23 g/l Oxoid- Spezialpepton 10 g/l Agar mit Zusatz von 4 g/l defibrinisiertem Schafsblut (Oxoid) 5 g/l NaCl 1 g/l Stärke Medium für die PBMZ- Kultur RPMI 1640 (Life Technologies, Karlsruhe) + 24 mm NaHCO % autologes Serum + 1 % v/v Penicillin/ Streptomycin- Lösung U/10 mg/ml (Biochrom, Berlin) + 1 % v/v L- Glutamin- Lösung, 200 mm (Biochrom) Das Medium für die PMBZ- Kultur wurde durch eine 0,2 µm- Filtriereinheit sterilfiltriert (Milipore). HANKS based salt solution (HBSS) 9,9 g HANKS Salz Trockensubstanz (Biochrom) 0,036% w/v NaHCO 3 ad 1L mit A. dest. Die HBSS wurde durch eine 0,2 µm- Filtriereinheit sterilfiltriert. Phosphate buffered saline (PBS) 80 g NaCl 11,6 g Na 2 HPO 4 2 g KH 2 PO 4 2 g KCl Die PBS- Lösung wurde durch eine 0,2 µm- Filtriereinheit sterilfiltriert. 33

37 Methodik Puffer für die PBMZ- Lyse RLT- Lysepuffer (Qiagen) + 1% v/v ß- Mercaptoethanol Puffer für die mrns- Isolierung Bindepuffer (Dynal Biotech) 20 mm TRIS- HCl (ph = 7,5) 1 M LiCl 2 mm EDTA Waschpuffer B (Dynal Biotech) 10 mm TRIS- HCl (p = 7,5) 0,15 M LiCl 1 mm EDTA Elutionspuffer (für die mrns- Isolation) 10 mm TRIS- HCl (ph = 7,5) Puffer für die RNS- Gelelektrophorese MOPS- Puffer (10- fach konz.) 200 mm MOPS 50 mm Natriumacetat 10 mm EDTA in A. dest. gelöst, ph = 7,0 Der MOPS- Puffer wurde bei 120 C für 20 min. autoklaviert. 34

38 Methodik RNS- Gelelektrophorese- Laufpuffer 10 %v/v 10- fach konz. MOPS- Puffer 0,74 % v/v Formaldehyd in A. dest. gelöst RNS- Probenpuffer 4 mm EDTA 80 mm MOPS 17 % v/v Glycerin 30% v/v Formamid 2,6 % v/v Formaldehyd 1 % w/v Bromphenolblau in A. dest. gelöst Waschpuffer für die Mikroarray- Hybridisierung SSC- Puffer (20- fach konz.) 300 mm Natriumcitrat 2,9 M Natriumchlorid in A. dest. gelöst, ph = 7,0, vor Gebrauch sterilfiltriert (Milipore) SDS- Lösung 10 % w/v Natriumdodecyl- Sulfat, in A. dest. gelöst 35

39 Methodik ELISA- Puffer IL-6- Sensibilisierungspuffer 5 g NaH 2 PO 4 2,9 g Na 2 HPO 4 ad 500 ml mit A. dest, ph = 7,5 IL-6- Absättigungspuffer 12,1 g TRIS 0,05 ml Thimerosal 5 g Rinderserumalbumin (Biochrom) ad 500 ml mit A. dest, ph=7,5 IL-6- Verdünnungspuffer 6,05 g TRIS 0,1 ml Kathon 0,5 g Phenol 50 ml FBS (hitzeinaktiviert bei 56 C für 30 min.) ad 500 ml mit A. dest IL- 6- Waschpuffer 20 mm Na 2 HPO 4 9 g/l NaCl 0,5ml/l Tween-20 in A. dest. gelöst, ph = 7,5 36

40 Methodik IL-6- Substratlösung 120 mg Tetramethylbenzidin 45 ml Ethanol 5 ml Aceton 500 µl H 2 O 2 (30%) Coating Buffer (für IL-10- und IL-12p40- ELISA ; 0,1 M Carbonat- Puffer, ph = 9,5) 8,4 g NaHCO 3 3,6 g Na 2 CO 3 in 1L A. dest. gelöst Assay Diluent (für IL-10- und IL-12p40- ELISA) PBS mit 10% FBS ph= 7,0 PBS-T (für IL-10- und IL-12p40- ELISA) PBS mit 0,05 % Tween 2.2 Methoden Herstellung der Bakterienrohlysate Vergleichende Wachstumskurvenanalyse der Bakterienstämme E. coli Nissle 1917 und E. coli W536 Um das Wachstumsverhalten der beiden Bakterienstämme E. coli Nissle 1917 und E. coli W536 vergleichend zu analysieren, wurde je eine Übernachtkultur in Soja- 37