Förster-Energietransfer (FRET)

Transkript

1 Förster-Energietransfer (FRET) Gegenstand dieses Experiments ist die strahlungslose Übertragung von absorbierter Lichtenergie zwischen verschiedenen Chromophoren. Dieses Phänomen findet u.a. Anwendung im Bereich der Biophysikalischen Chemie, um intramolekulare Abstände weit unterhalb des optischen Auflösungsvermögens zu bestimmen. Farbstoffmarkierte DNA-Stränge werden hybridisert und die optischen Eigenschaften der Doppelstränge mittels Absorptions- und Fluoreszenzspektroskopie vermessen. Damit wird experimentell die Energietransfereffizienz ermittelt, die anschließend mit dem theoretisch zu erwartenden Wert verglichen werden kann, der sich aus dem spektralen Überlapp der gemessenen Absorptions- und Fluoreszenzspektren ergibt. Themen des Kolloquiums Lumineszenz, Fluoreszenz, Phosphoreszenz Jablonski-Diagramm, Wellenlänge, Wellenzahl Übergänge mit und ohne Strahlung Energietransfermechanismen Übergangsdipolmoment, Oszillatorenstärke Singulett- und Triplett-Zustände Fermis Goldene Regel Fluoreszenzspektrometer (Komponenten, Methodik) Lambert-Beersches Gesetz der Absorption

2 Förster-Energietransfer (FRET) 2 1. Theoretische Grundlagen 1.1 Absorption und Fluoreszenz Absorptions- und Fluoreszenzprozesse spielen sowohl in der Forschung als auch im Alltag eine große Rolle. Durch Absorption wird ein Molekül/Atom durch die Aufnahme von einem Photon geeigneter Wellenlänge/Energie in einen höheren Energiezustand angeregt. Die Abgabe der Energie kann sich über verschiedene Prozesse vollziehen, welche anhand eines Jablonski-Diagramms erläutert werden können: 1) Nach erfolgter Anregung erfolgen die direkte Aussendung eines Photons (in der Regel mit niedrige rer Energie - Stokes-Shift) und die Rückkehr des Moleküls in den elektronischen Grundzustand. Dieser Vorgang wird als Fluoreszenz bezeichnet, und es handelt sich in der Regel um einen Singulett-Singulett-Übergang (S 1 S 0 ). 2) Nach erfolgter Anregung erfolgt ein sogenanntes Intersystem Crossing, bei dem das Molekül in einen Triplett-Zustand wechselt. Unter Aussendung eines Photons kehrt es in den Grundzustand zurück. Dieser Vorgang heißt Phosphoreszenz (T 1 S 0 ). 3) Die Anregungsenergie kann auch durch strahlungslose Desaktivierung als Wärme an die Umgebung angegeben werden. 4) Außerdem besteht die Möglichkeit der direkten Energieübertragung an Moleküle, die sich in unmittelbarer Umgebung zu dem angeregten Molekül befinden. Direkte Energieübertragung wird auch als Förster- bzw. Dexter-Energietransfer bezeichnet. Dieser Praktikumsversuch beschäftigt sich mit dem Energietransfer nach Förster (auch Fluorescence Resonance Energy Transfer = FRET genannt). Er ist an bestimmte Voraussetzungen gebunden, welche in diesem Skript erläutert werden. 1.2 Energietransfermechanismen Energieübertragung durch Strahlung Während sich dieser Versuch mit dem (strahlungslosen)förster-energietransfer beschäftigt, existiert daneben eine "triviale" Form der Energieübertragung. Dabei wird die Anregungsenergie von einem Donor- Molekül D, das sich in einem angeregten Zustand befindet (gekennzeichnet durch D*), auf ein Akzeptor- Molekül A in einer zweistufigen Abfolge übertragen: 1) D* D + hn 2) hn + A A*

3 Förster-Energietransfer (FRET) 3 In Worten ausgedrückt: Das angeregte Molekül D* emittiert ein Photon, welches von A absorbiert wird. Die Effizienz dieses Vorgangs, also die Energieübertragungswahrscheinlichkeit, hängt von vier Faktoren ab: D a) der Quantenausbeute Φ e für die Emission aus D*, b) der Anzahl der Moleküle von A, denen die von D* ausgesandten Photonen begegnen können, c) der Wahrscheinlichkeit der Lichtabsorption durch A, d) dem Überlapp des Emissionsspektrums von D* und des Anregungsspektrums von A, Theorie der strahlungslosen Energieübertragung Neben der Energieübertragung von einem Donor-Molekül D* auf ein Akzeptor-Molekül A durch Strahlung gibt es auch Möglichkeiten der strahlungslosen Energieübertragung. Eine solche Form des Energietransfers kann auf zwei Wegen stattfinden: a) durch Zusammenstoß bzw. Austausch-Wechselwirkung (Dexter-Energietransfer) b) durch Coulomb-Wechselwirkung (Förster-Energietransfer) Beim Energietransfer nach Dexter kommt es zu einem "Zusammenstoß" der beteiligten Orbitale und einem Austausch des angeregten Elektrons mit einem Elektron des Akzeptor-Moleküls. Der Energietransfer erfolgt unter Spin-Änderung von Donor und Akzeptor: 3 D* + 1 A 1 D + 3 A* Spin-Wechselwirkungen nehmen jedoch exponentiell mit der Entfernung r zwischen Donor und Akzeptor ab, weshalb der Dexter-Mechanismus eine sehr kleine Distanz von Donor und Akzeptor mit einer Durchdringung ihrer Orbitale erfordert. Da die Energietransfereffizienz exponentiell abnimmt (anstatt mit r 6 wie beim Förster-Mechanismus, wie unten erklärt) und nur für Distanzen r < 10 Å effektiv ist, wird in diesem Versuch der Dexter-Energietransfer vernachlässigt. Die zweite Form, der so genannte Förster-Mechanismus, ist für die hier betrachteten Vorgänge erheb lich wichtiger und wird darum im Folgenden hauptsächlich behandelt. In Abb. 1 sind die Vorgänge beim Förster-Mechanismus schematisch dargestellt: Die beiden Vorgänge Desaktivierung von D* und Anregung von A sind miteinander gekoppelt. Die Kopplung erfolgt durch eine Coulombsche Dipol-Dipol-Wechselwirkung. Zu beachten ist, dass kein räumlicher Kontakt (wie beim Stoßmechanismus) zwischen den Molekülen erforderlich ist, damit diese Form der Energieübertragung möglich wird. In gewisser Weise kann man D* mit einer molekularen Sende-Antenne vergleichen, die ihre Energie auf den (molekularen) Empfänger A überträgt.

4 Förster-Energietransfer (FRET) 4 Abbildung 1: Förster-Mechanismus Fermis Goldene Regel Die Geschwindigkeitskonstante k r für alle spektroskopischen Übergänge, bei denen eine störungstheoretische Beschreibung angewendet werden kann, lautet gemäß der "Goldenen Regel" von Fermi: k r = 2π ħ Φ I Ĥ Φ F 2 ρ(e ) (1) Hierin ist die Dichte der Endzustände, die für den Übergang in Frage kommen, (d.h. die Dichte isoenergetischer Donor-Akzeptor-Zustände), I steht für die Wellenfunktion des Ausgangs-, F für die des Endzustandes, und Ĥ ist der Operator der Wechselwirkung. Angewandt auf den Fall des Förster-Energietransfers gilt: Φ I =φ D* (1)φ A (2) and Φ F =φ D (1)φ A* (2) Die Zahlen deuten an, dass es sich beim betrachteten Fall nicht etwa um einen Sprung eines Elektrons ' von einem Molekül auf das andere handelt: Ein Endzustand F F = jd ( ) ja* ( ) 2 1 wäre nämlich genau das Ergebnis des konkurrierenden Stoßmechanismus, der - da es dabei zu einen echten Elektronenaustausch kommt - deshalb auch Austauschmechanismus heißt. Beachten Sie dabei, dass Donor und Akzeptor zusammen als quantenmechanischer Ausgangs- und Endzustand I und F betrachtet werden müssen!

5 Förster-Energietransfer (FRET) Dipol-Dipol-Wechselwirkung Die Übergangswahrscheinlichkeit für einen strahlenden Übergang zwischen einem angeregten Zustand und dem Grundzustand wird vom Übergangsdipolmoment bestimmt. Das Übergangsdipolmoment R ist dabei definiert durch R= φ 2 * e r φ 1 dv (2) Hier ist 1 die elektronische Wellenfunktion des Moleküls im angeregten Zustand, 2 die konjugiert komplexe elektronische Wellenfunktion des Moleküls im Grundzustand, e die elektrische Ladung und r die Ortskoordinate. Etwas vereinfachend ausgedrückt gibt das Integral φ * 2 e r φ 1 dv das Ausmaß der Verschiebung der Ladungswolke zwischen angeregtem und Grundzustand bei einem durch das elektromagnetische Wechselfeld des Lichtes induzierbaren Übergang an. Das Übergangsdipolmoment des Donors kann nun strahlungslos mit dem Übergangsdipolmoment des Akzeptormoleküls wechselwirken und so einen Transfer der Anregungsenergie zwischen beiden Molekülen bewirken. Die Wechselwirkungsenergie zwischen zwei elektrischen Dipolen ist gemäß der klassischen Physik gegeben durch: E Dipol Dipol = κ μ Dμ A (3) 3 4πϵ 0 r DA Dabei ist κ ein Orientierungsfaktor (dessen Wert von der relativen Orientierung der elektrischen Dipole abhängt), ε 0 die elektrische Feldkonstante (8, F m ), µd der Betrag des elektrischen Dipolmoments des Donors, µ A der Betrag des elektrischen Dipolmoments des Akzeptors und r DA der (mittlere) Abstand zwischen den beiden Dipolen. Bei der quantenmechanischen Behandlung stellt sich heraus, dass a) die r -3 -Abhängigkeit beim Ersatz des Energieausdrucks durch den entsprechenden Hamilton-Operator erhalten bleibt b) µ D bzw. µ A durch die Oszillatorstärken für die Übergänge D* D bzw. A A* gegeben sind. Insgesamt ergibt sich somit für das Matrixelement in (1): Φ Ĥ Φ I F 2 = φ D * φ A κ μ Dμ A φ 4πϵ 0 r 3 D φ A* 2= 2 2 κ2 16 π 2 2 ϵ R D R A (4) 0 r 6 mit R A und R D als den Übergangsdipolmomenten der Übergänge D* D bzw. A A*. Bereits hier kann die für den Försterenergietransfer charakteristische r -6 -Abhängigkeit gesehen werden. In Gl. (1) bezeichnet E einen scharfen Energiewert, welcher in der Realität aufgrund der Unschärfe des Zustandes D* jedoch nicht vorliegt. Das gleiche gilt auch für den Energiewert des Akzeptors, welcher

6 Förster-Energietransfer (FRET) 6 ebenfalls eine gewisse Unschärfe besitzt. Aus diesem Grund muss Gl.(1) in differentieller Schreibweise notiert und dann integriert werden (eine detaillierte Herleitung findet sich bei Interesse in [1]). dk r = κ2 4hϵ ρ(e) 2 dr r 6 A dr D (5) Einen makroskopisch messbaren Zugang zu der Größe (E) in Gl.(5) erhält man aus dem so genannten Überlappungsintegral ϵ A (λ)i D F (λ)λ 4 d λ, welches aus der normierten Fluoreszenzintensität I D F (λ) des Donors und der Absorption A() des Akzeptors berechnet wird. Berücksichtigt man dies und dass man in einem Lösungsmittel des Brechungsindexes n arbeitet, erhält man folgende Beziehung: D k r = 9 κ2 ln10 Φ e ϵ 128 π 5 n 4 N A τ D r 6 A (λ)i D F (λ )λ 4 d λ (6) wobei D die mittlere Lebensdauer von D* ist und N A die Avogadro-Konstante Abstandsabhängigkeit Fasst man alle Konstanten in Gl.(6) zusammen, erhält man die Förstersche Formel: k r = 1 τ D ( r 0 r ) 6 (7) wobei man r 0 als Förster-Radius bezeichnet. Der Förster-Radius ist diejenige Distanz, nach der 50 % der angeregten Donor-Moleküle durch den Förster-Mechanismus deaktiviert wurden. Förster-Radien sind für verschiedene Donor-Akzeptor-Paare in der Literatur tabelliert. Die Förster-Gleichung wird häufig ausgenutzt, indem man die Effizienz der Energieübertragung misst, d.h. den Anteil der vom Donor absorbierten Photonen, der auf den Akzeptor übertragen wird. Dieser ist gegeben durch: E= r 6 r 0 6 +r 6 (8) Die Energieübertragungseffizienz kann man aus den relativen Fluoreszenzausbeuten in Gegenwart (F DA) und in Abwesenheit des Akzeptors (F D) bestimmen: E=1 F DA F D (9)

7 Förster-Energietransfer (FRET) 7 2. Der Förster-Energietransfer in der Biophysikalischen Chemie Wegen der markanten r -6 -Abstandsabhängigkeit des Förster-Mechanismus (auch Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer = FRET genannt), die im Bereich der Dimensionen biologischer Makromoleküle liegt, bietet sich die Methode an, um räumliche Informationen über die betreffenden Moleküle zu gewin nen. Dies liegt daran, dass sich FRET in eben diesem Größenbereich von Makromolekülen abspielt, da die Förster-Radien in der Größenordnung von etwa Å liegen. Somit liegt der typische Einsatzbereich bei Distanzen weit unterhalb des Auflösungsvermögens der optischen Spektroskopie (max. /2, also ca. 200 nm). Beispiele für Makromoleküle im untersuchbaren Größenbereich sind beispielsweise viele Proteine, DNA-Strukturen, die Dicke von biologischen Membranen und Distanzen zwischen den Seiten von Großproteinen mit mehreren Untereinheiten. Jede Änderung der Distanzen zwischen Donor und Akzeptor verändert die Effizienz des FRET und kann somit effektiv zur Strukturaufklärung beitragen. Wird beispielsweise ein Protein mit zueinander passenden Donor- und Akzeptor-Farbstoffen an voneinander entfernten Positionen markiert, so kann eine Strukturverformung des Makromoleküls (z.b. aufgrund von variierendem Lösemitteleinfluss) leicht verfolgt werden. Zu diesem Zweck muss die Transfereffizienz nach Gl.(9) aus der Fluoreszenzausbeute in Gegenwart und in Abwesenheit des Akzeptors bestimmt werden. Da die Förster-Radien r 0 für eine Vielzahl von Donor-Akzeptor-Paaren tabelliert sind, kann mittels Gl.(8) und dem zuvor ermitteltem Wert von E der Abstand zwischen Donor und Akzeptor zu jedem Zeitpunkt errechnet werden.

8 Förster-Energietransfer (FRET) 8 3. Fluoreszenzspektroskopie Den prinzipiellen Aufbau eines Fluoreszenzspektrometers verdeutlicht die folgende Abbildung 2: Abbildung 2: Prinzip-Aufbau eines Fluoreszenz-Spektrometers Als Quelle für das Anregungslicht kann beispielsweise eine Xenon-Hochdrucklampe verwendet werden. Im Gegensatz zu einem einfachen optischen Spektrometer hat man beim Fluoreszenzspektrometer zwei Monochromatoren, einen für das Anregungslicht und einen für das emittierte Licht. Um die Detektion von Streustrahlung zu minimieren, werden die beiden Strahlengänge üblicherweise im 90 -Winkel angeordnet. Spezielle Spiegeloptiken dienen zur Aufsammlung möglichst vieler Photonen (dies ist nötig, da das emittierte Licht optisch isotrop ausgesandt wird). Als Detektoren dienen z.b. Photomultiplier. Während UV/VIS-Spektrometer üblicherweise Zweistrahlgeräte sind, handelt es sich bei Fluoreszenzspektrometern um Einstrahlgeräte. Ein weiterer Unterschied betrifft die Spaltbreite der Monochromatoren: Während man in der UV/VIS-Spektroskopie in der Regel kleine optische Spaltbreiten wählt (z.b. 1 nm) a, um eine möglichst gute Auflösung zu erzielen, sind bei Fluoreszenzmessungen die Spaltbreiten im Allgemeinen größer (Anregungslicht: 2-5 nm, emittiertes Licht: 5-20 nm). So kann man möglichst viel Lichtenergie erfassen. Der Verlust an Auflösung ist hinnehmbar, da Fluoreszenzspektren in Lösung meist breit und wenig strukturiert sind. Man beachte, dass zwei Arten der Fluoreszenzspektroskopie möglich sind: a.) Bei fester Anregungswellenlänge misst man das Emissionsspektrum. b.) Bei fester Emissionswellenlänge misst man das Anregungsspektrum. Natürlich kann man auch beide Wellenlängen verändern, was zu zweidimensionalen Spektren führt. a Die reale Spaltbreite im Gitter ist natürlich wesentlich größer als 1 nm. Die Angabe in nm bezieht sich auf die spektrale Auflösung des Spaltes und nicht auf die physikalische Spaltbreite.

9 Förster-Energietransfer (FRET) 9 4. Das Experiment Im Experiment soll die Effizienz des Energietransfers zweier Farbstoff-Moleküle (Donor(D): Cy3 und Akzeptor(A): Cy5) an hybridisierten DNA-Strängen bestimmt werden. Der Donorstrang hat dabei folgende Sequenz: Cy3 CCC AAA CTA AAC TTA ACT AAA CTA AAC CCC und der Akzeptorstrang hat die Sequenz: GGG TTT GAT TTG AAT TGA TTT GAT TTG GGG Cy5 Bitte beachten Sie, dass der zweite Strang zur besseren Übersicht nicht in der üblichen Notierung vom 5 -Ende zum 3 -Ende dargestellt ist. 1) Vom Assistenten werden zwei Stammlösungen (ca. 10µM) mit Donor- und Akzeptorfarbstoff markierter DNA-Einzelstränge sowie nackter DNA-Einzelstränge ausgegeben. Als erstes müssen daraus alle möglichen Kombinationen von DNA-Doppelsträngen hybridisiert werden: a) Donor/Akzeptor (Cy3/Cy5), b) Donor/Nacktstrang (Cy3/N), c) Akzeptor/Nacktstrang (Cy5/N), d) Nacktstrang/Nacktstrang (N/N). 2) Danach sollen die Absorptionsspektren der jeweiligen Doppelstränge bestimmt werden. Daraus können Sie zum einen die tatsächlichen Farbstoff-Konzentrationen bestimmen und zum anderen die geeig neten Anregungswellenlängen für die Fluoreszenzmessungen ermitteln. Nehmen Sie auch ein Absorptionsspektrum für die leere Küvette und die nur mit Pufferlösung gefüllte Küvette auf. Sie erhalten insgesamt 6 Absorptionsspektren! 3) Nehmen Sie dann für die drei Farbstoff enthaltenden Doppelstränge (Cy3/Cy5, Cy3/N und Cy5/N) je weils zwei Fluoreszenzspektren mit den Anregungswellenlängen der beiden Absorptionsmaxima l A A und l D A der Farbstoffe auf. Sie erhalten also auch 6 Fluoreszenzspektren. Für die Auswertung berechnen Sie aus dem Absorptionsspektrum des Akzeptors und dem Fluoreszenzspektrum des Donors das Überlappintegral J und daraus den Förster-Radius r 0. Ermitteln Sie dann den Förster-Radius experimentell aus der Energietransfereffizienz E und vergleichen Sie mit dem zuvor berechneten Wert.

10 Förster-Energietransfer (FRET) 10 Zu 1) Probenvorbereitung Die Verwendung der Proben setzt die Handhabung von Eppendorf-Pipetten voraus. Falls diese unbekannt sein sollte, lassen Sie sie sich vom Betreuer erläutern. Vermischen Sie jeweils 30 µl der beiden zu hybridisierenden Einzelstränge in einem kleinen Mikrozentrifugen-Röhrchen (einem "Epi"), das für die Verwendung des Thermocyclers Peqlab Primus 25 geeignet ist. Stellen Sie die 4 Mischungen dann in den Thermocycler. Schalten Sie den Thermocycler ein und starten Sie das Programm Hybridisierung Cyc. durch Drücken der RUN-Taste. Dabei werden die Proben zunächst 30 s auf 25 C gehalten und dann für 2 min auf 95 C erhitzt. Danach werden sie mit 0,2 C/s abgekühlt und für 8 min wieder bei 25 C gehalten. Nach ca. 20 min sind die Proben hybridisiert. Zu 2) Aufnahme von Absorptionsspektren Vor jeder Verwendung muss die Küvette (optische Weglänge 3 mm) gereinigt werden. Diese Reinigung muss bei jedem Probenwechsel wiederholt werden. Falls sich noch Probe in der Küvette befindet, wird sie aus der Küvette mit einer Pipette (+ Pipettenspitze), die auf etwa μl eingestellt ist, entfernt und wieder in das Epi zurückgegeben. Im Anschluss daran wird die Küvette mit 100 μl doppelt-destilliertem (DD) H 2O befüllt. Durch dreimaliges Aufziehen und Entleeren der Pipettenspitze am Boden der Küvette wird diese gereinigt. Nach Entfernung des DD H 2O durch "Ausgießen" bleibt ein Rest in der Küvette. Dieser muss mit der Pipette entfernt werden, indem diese bis auf den Boden der Küvette eintaucht. Dieser Vorgang wird dreimal wiederholt. Der Vorgang wird mit Ethanol anstatt DD H 2O wiederholt. Abschließend wird die gereinigte Küvette mit Druckluft getrocknet. Als nächstes wird die Küvette mit einer der Proben befüllt. Dabei ist zu beachten, dass die Pipettenspitzen immer so gewechselt werden, dass die Proben nicht gegenseitig verunreinigt werden oder mit Lösungsmittelresten verdünnt wer den. Beim Befüllen der Küvetten ist außerdem darauf zu achten, dass auf dieser keine Fingerabdrücke hinterlassen werden dürfen und dass man eine kleine Luftblase beim Aufsetzen des Stopfens lässt. Messen Sie alle 6 Absorptionsspektren wie in Anhang 1 beschrieben. Sichern Sie alle Daten auf einem geeigneten Datenträger (z.b. Memory-Stick). Vermeiden Sie zu häufige aufwändige Reinigungsprozeduren der Küvette, indem Sie für zwei der drei Farbstoff enthaltenden Proben Absorptions- und Fluoreszenzspektren direkt hintereinander aufnehmen. Lediglich für die erste Farbstoff enthaltende Probe ist dies nicht möglich, da Sie für diese die zweite Anregungswellenlänge noch nicht kennen. Zu 3) Aufnahme der Fluoreszenzspektren A Bestimmen Sie aus den Absorptionsspektren der Farbstoff/Nacktstrang-Hybride die Wellenlängen λ A D und λ A A der jeweiligen Absorptionsmaxima. Verwenden Sie λ A D und λ A als Anregungswellenlängen bei der Aufnahme der Fluoreszenzspektren für alle drei Farbstoff enthaltenden Proben. Die Vorgehensweise bei der Aufnahme der Fluoreszenzspektren ist in Anhang 2 beschrieben.

11 Förster-Energietransfer (FRET) Auswertung und Diskussion 1) Stellen Sie die Absorptionsspektren graphisch dar. Diskutieren Sie das Transmissionsverhalten der Küvette, der Pufferlösung, der nackten DNA sowie der Farbstoffe. Normieren Sie die Absorptionsspektren der Farbstoff enthaltenden Doppelstränge und stellen Sie die normierten Spektren im relevanten Wellenlängenbereich graphisch dar. Ermitteln Sie die tatsächlichen Konzentrationen ihrer Proben. Der dekadische molare Absorptionskoeffizient von Cy3 beträgt ca. ε D = M 1 cm 1 bei 550 nm und der Absorptionskoeffizient von Cy5 ca. ε A = M 1 cm 1 bei 650 nm. Verwenden Sie das Lambert-Beersche Gesetz A= lg ( I t I 0 )=ϵc s (10) um die Konzentrationen beider Farbstoff/Nacktstrang-Proben zu errechnen. Dabei sind A die Absorbanz (optische Dichte, Extinktion), ε der dekadische molare Absorptionskoeffizient, l die Weglänge des Lichtes durch die Probe, c die Konzentration, I t die Intensität des transmittierten Lichtes und I 0 die Intensität des einfallenden Lichtes. Schätzen Sie ab, wie groß der Fehler bei der Bildung von möglichst 100%igen 1:1 Komplexen ist. 2) Stellen Sie die Fluoreszenzspektren graphisch dar. Benutzen Sie Gl.(9), um die Energietransfereffizienz E zu berechnen. Sie benötigen dazu die integrierten Fluoreszenzintensitäten des Donor/ Nacktstrang-Hybrids F D sowie des Donor/Akzeptor-Hybrids F DA. Ein Vergleich der Amplituden am Fluoreszenzmaximum liefert dafür zwar einen guten Anhaltspunkt, ist aber ungenau, da die Fluoreszenzspektren von Cy3 und Cy5 nicht vollständig spektral getrennt sind. Überlegen Sie, wie die Auswertung durch geeignete Integration der Fluoreszenzspektren genauer durchgeführt werden kann. 3) Berechnen Sie das spektrale Überlappungsintegral J. Dazu müssen Sie das Absorptionsspektrum als den Verlauf des dekadischen molaren Absorptionskoeffizienten A angeben. Dies erreichen Sie, wenn Sie die gemessenen Absorbanzen durch das Produkt aus Küvettenlänge und Konzentration dividieren. Das Fluoreszenzspektrum muss flächen-normiert werden, so dass I()d) = 1. Beachten Sie, dass der Integrand die Einheit einer inversen (Wellen-)Länge besitzt. Da Sie mit diskreten Spektren aus endlich vielen Punkten arbeiten, müssen Sie dabei die Amplitude I() jedes Intervalls auf die Intervallbreite beziehen. Bilden Sie dann die Produkte I() A() 4 und integrieren (summieren) Sie darüber. Die Summe ist das Überlapp-Integral J. Als Einheit von J erhalten Sie eine Länge zur 6. Potenz, bezogen auf ein Mol (cm 6 /mol, L/(molcm)nm 4, L/molcm 3 oder dergleichen)! Berechnen Sie aus dem Überlapp-Integral J den Förster-Radius r 0 (aus dem Vergleich der Gl.(6) und (7)).

12 Förster-Energietransfer (FRET) 12 Um welchen Faktor wäre J kleiner, wenn das Fluoreszenzspektrum des Donors und das Absorptionsspektrum des Akzeptors um 50 nm weiter auseinander verschoben wären? Diskutieren Sie, wie sich das auf den Förster-Radius und die Energietransfereffizienz auswirken würde. 4) Schätzen Sie den Abstand der beiden Farbstoffe zunächst aus der DNA-Struktur und der Information ab, dass die Ganghöhe einer DNA-Helix 0,34 nm pro Basenpaar beträgt. Errechnen Sie die Energie transfereffizienz E aus den Intensitäten des Donor- und Akzeptorfarbstoffes in den Einzelsträngen und im Doppelstrang. Wie groß ist der aus der Energietransfereffizienz errechnete Abstand, wenn man von dem von Ihnen zuvor ermittelten Förster-Radius ausgeht? Diskutieren Sie mögliche Ursachen der Abweichungen. Eine weitere Möglichkeit den Abstand abzuschätzen ist, in einer bekannten DNA-Struktur mit einem Visualisierungsprogramm wie VMD (s. Anhang 3) den Abstand zwischen einer entsprechenden Anzahl von Basen abzumessen. Suchen sie sich dazu eine geeignete Struktur aus der Protein-Datenbank (PDB) aus und drucken Sie eine Ansicht aus, in der Sie die Punkte markieren, zwischen denen Sie die Distanz gemessen haben. 5) Die verwendeten DNA-Stränge können theoretisch auch sehr leicht an anderen Basen mit Cy5 oder Cy3 markiert werden. Stellen Sie mit Hilfe der Förster-Theorie eine Tabelle von Energietransfereffizienzen für alle möglichen Markierungsabstände der verwendeten DNA-Stränge auf. Literatur [1] P. J. Walla, Modern Biophysical Chemistry, Wiley-VCH, Weinheim [2] G. von Bünau, T. Wolff: Photochemie. 1. Aufl., Weinheim [3] N. J. Turro: Modern Molecular Photochemistry.1. Aufl., Sausalito (USA) 1991, Kap. 9. [4] W. Schmidt: Optische Spektroskopie. 1. Aufl., Weinheim [5] H. Haken, H. C. Wolf: Molekülphysik und Quantenchemie, 2. Aufl., Springer-Verlag 1993.

13 Förster-Energietransfer (FRET) 13 Anhang 1 Bedienungsanleitung Absorption-Spektrometer Perking-Elmer Lambda 25 UV-Vis Spektrometer anschalten PC anschalten (Passwort beim Assistenten erfragen) Programm PerkinElmer UV WinLab aufrufen Eigenen Ordner anlegen (Automatische Speicherung) Folgende Einstellungen vornehmen: Scan speed: 120nm/min Wellenlängenbereich: nm Automatische Hintergrundmessung durchführen durch Klicken auf Start Dabei ist darauf zu achten, dass sich keine Küvette im Absorptionsspektrum befindet. Nach Fertigstellung dieser Hintergrundmessung wird die Küvette in das Spektrometer eingesetzt. Die matte Küvettenseite befindet sich dabei immer rechts.

14 Förster-Energietransfer (FRET) 14 Anhang 2 Bedienungsanleitung Fluoreszenz-Spektrometer Cary Eclipse Spektrometer anschalten Programm Cary Eclipse, Unterprogramm Scan aufrufen im Menü Setup den Unterpunkt Setup aufrufen: Es erscheint eine Eingabemaske aus 5 Blättern. Wichtig davon sind hier nur die Blätter "Cary" und "AutoStore" Blatt "Cary" unter DataMode Fluorescence, unter ScanSetup Emission einstellen unter Excitation geeignete Anregungswellenlänge eingeben (vorher Rücksprache mit Assistenten!) unter Start und Stop werden die Werte 500 und 800 nm eingegeben. unter Excitation slit und Emission slit Werte eingeben, die dazu führen, dass die maximale Fluoreszenzwerte im im Bereich 100 bis < 1000 liegen. Dies erfordert in der Regel etwas Probieren, d.h. Messungen mit verschiedenen Werten für die Spaltbreiten. Niemals darf aufgrund einer zu großen Spaltbreite die gemessene Fluoreszenzintensität außerhalb des Messbereichs geraten (> 1000)! Zu kleine Intensitäten sind wegen des schlechten Signal-Rausch-Verhältnisses zu vermeiden. Für einen Vergleich der Proben miteinander müssen alle Proben bei den gleichen Spalteinstellungen gemessen werden. Sonst kann nachher nicht die Energietransfereffizienz bestimmt werden. Bei ScanControl Medium anklicken. Blatt "AutoStore" Unter "Storage" prompt at start aktivieren, unter "AutoConvert" ASC II (csv) aktivieren. mit o.k. Fenster schließen Probe in den Strahlengang bringen mit Start Messung starten

15 Förster-Energietransfer (FRET) 15 Anhang 3 Darstellung von Biomolekülen mittels des Programms VMD Auf der Website kann das Programm VMD kostenlos heruntergeladen werden. Dazu ist nur eine kostenlose Registrierung erforderlich. Klicken auf Download VMD und erneute Auswahl des Programms lädt die etwa 11Mb große Datei auf den Computer. Ein Doppelklick auf die Datei startet die Installation, die nach wenigen Sekunden abgeschlossen ist. Auf der Website befindet sich die PDB-Datenbank. In dieser sind die Kristall strukturen für eine Vielzahl von Molekülen gespeichert. In der Kopfzeile kann der Molekülname der ge suchten Verbindung eingegeben werden. Die Eingabe von serum albumin liefert z. B mehr als 60 Tref fer. Die Treffer sind leider jedoch in Form von Paper-Titeln aufgelistet. Daher muss man die Treffer durchscrollen und anhand der Titel das gewünschte Molekül suchen. Neben den Bildchen befindet sich auch der Download link. Zum Öffnen der herunter geladenen Datei muss VMD geöffnet werden und mit File, New Molecule, Browse, Auswählen, Load die Datei ausgewählt werden. Das Molekül erscheint auf dem Bildschirm. In der Kopfzeile von VMD Main muss über Auswählen von Graphics, Representations und über Graphics, Colors die Bearbeitungsfenster geöffnet werden. Im Representations Menu kann über Selections, und unter dem Keyword resname im Value Fenster die im Molekül vorhandenen Basen gesehen werden, über element die enthaltenen Atome. Somit kann ein Überblick über die Einzelnen Bestand teile des Moleküls gewonnen werden. Durch Klicken von Create Rep erscheint im Fenster eine neue Zeile, die mit der vorherigen überein stimmt. In der Eingabezeile Selected Atoms kann man nun beispielsweise resname ALA eingeben, wodurch selektiv alle ALA Basen graphisch dargestellt werden können. Durch Doppelklicken auf die alte Zeile (all) wird diese Repräsentation ausgeblendet und man sieht nur noch die ALA-Basen. Im Menu Draw Style können über coloring method und drawing method die Darstellungen einer im Fenster ausgewählten Repräsentation verändert werden. Im Fenster Color Controls kann über Categories resname, NamesALA und Colorsred die Farbe der ausgewählten Base verändert werden. Das gleiche gilt natürlich für alle anderen ausgewählten Gruppen, Atome, etc., für die vorher eine eigene Repräsentation erzeugt wurde. Auch die Darstellung wie der Hintergrund, etc. sind hier einstellbar. Das im Fenster VMD Open GL Display dargestellte Molekül kann einfach über das Mausscrollrad rein- und rausgezoomt werden und durch Gedrückthalten der rechten und linken Maustaste in ver schiedenen Richtungen gedreht werden. Das Speichern der ausgewählten Darstellung erfolgt im VMD Main Fenster über File, Render, [Renderoptionen wählen], start rendering.