Zelluläre Charakterisierung neuer Hemmstoffe der Jumonji C Domäne enthaltenden Demethylasen

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1 Zelluläre Charakterisierung neuer Hemmstoffe der Jumonji C Domäne enthaltenden Demethylasen Inauguraldissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Albert Ludwigs Universität Freiburg im Breisgau vorgelegt von Inga Hoffmann aus Frankfurt am Main 2015

2 Vorsitzender des Promotionsausschusses: Prof. Dr. Stefan Weber Referent: Prof. Dr. Manfred Jung Korreferentin: Prof. Dr. Heike Pahl Datum der mündlichen Prüfung:

3 Die vorliegende Dissertation entstand in der Zeit von Februar 2012 bis September 2015 am Institut für Pharmazeutische Wissenschaften der Albert Ludwigs Universität Freiburg unter der fachlichen Leitung von Prof. Dr. Manfred Jung. Ihm gilt mein besonderer Dank für die Aufnahme in seinen Arbeitskreis, den Vorschlag des interessanten und aktuellen Promotionsthemas, die wertvollen Diskussionen sowie die angenehme Arbeitsatmosphäre. Darüber hinaus danke ich meinen aktuellen und ehemaligen Kolleginnen und Kollegen im Arbeitskreis, Teresa Burgahn, Dr. Alokta Chakrabarti, Dr. Silviya Furdas, Mirjam Hau, Dr. Alexander Hauser, Daniel Herp, Dr. Kristina Keller, Andreas Kürner, Dr. Benjamin Maurer, Daria Monaldi, Dr. Ludovica Morera, Martin Roatsch, Dr. Tobias Rumpf, Matthias Schiedel, Karin Schmidtkunz, Dr. Martin Schmitt, Johannes Schulz Fincke, Johanna Senger, Roman Simon, Dr. Diana Stolfa, Sören Swyter, Tobias Wagner, Alexandra Walter und Sarah Zähringer, für die gute Atmosphäre im Labor und die motivierte Zusammenarbeit. Außerdem gilt mein Dank: Prof. Dr. Heike Pahl und Prof. Dr. Regine Süss für ihr Engagement in meinem Thesis Advisory Committee und die Übernahme des Korreferats, Prof. Dr. Christopher Schofield und Dr. Akane Kawamura von der University of Oxford für die Möglichkeit, Experimente in ihrem Arbeitskreis durchzuführen, Dr. Eric Metzger aus dem Arbeitskreis von Prof. Dr. Roland Schüle am Universitätsklinikum Freiburg für seine fachliche Unterstützung, Dr. Marie Follo aus der Core Facility der Klinik für Innere Medizin 1 des Universitätsklinikums Freiburg für die technische Unterstützung bei der Durchführung der Immunfluorezenz Mikroskopiemessungen, Dr. Dietmar Pfeifer und seinen Mitarbeitern aus der Core Facility der Klinik für Innere Medizin 1 des Universitätsklinikums Freiburg für die Durchführung der Microarrays, Dr. Sebastian Arnold aus der Zentralen Klinischen Forschung des Universitätsklinikums Freiburg für seine Hinweise zur Bewertung der Microarray Daten, Karin Schmidtkunz für die Durchführung einzelner Zytotoxizitätsuntersuchungen, I

4 den Mitgliedern der Integrated Research Training Group des Sonderforschungsbereichs 992 für viele spannende Diskussionen sowie dem Koordinator Dr. Stefan Kass für seine Unterstützung, der Deutschen Forschungsgemeinschaft für die Finanzierung meiner Teilnahme an Konferenzen sowie meines Forschungsaufenthalts in Oxford im Rahmen des Sonderforschungsbereichs 992, sowie allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Lehrstuhls für Pharmazeutische und Medizinische Chemie. Ganz herzlich möchte ich mich bei meiner Familie und bei meinem Freund Max Reichenbach für ihre fortwährende Unterstützung bedanken. II

5 Publikationen Originalarbeiten Pyrido and benzisothiazolones as inhibitors of histone acetyltransferases (HATs) S. D. Furdas, I. Hoffmann, D. Robaa, B. Herquel, W. Malinka, P. Swiatek, A. Akhtar, W. Sippl, M. Jung; Med. Chem. Commun (12): Weitere Originalarbeiten befinden sich derzeit in Vorbereitung. Übersichtsartikel in Zeitschriften mit Peer Review The role of histone demethylases in cancer therapy I. Hoffmann, M. Roatsch, M. L. Schmitt, L. Carlino, M. Pippel, W. Sippl, M. Jung; Mol. Oncol (6): Übersichtsartikel in sonstigen Zeitschriften Epigenetik in der Pharmazie I. Hoffmann, M. Jung; PZ Prisma (3): Posterpräsentationen Folgende Poster wurden auf wissenschaftlichen Tagungen persönlich präsentiert: Cellular characterization of histone methyltransferase inhibitors I. Hoffmann, M. Hendzel, W. Sippl, M. Jung; Konferenz Chromatin: From structure to epigenetics, Straßburg, Frankreich, Cellular characterization of histone methyltransferase inhibitors I. Hoffmann, M. Hendzel, W. Sippl, M. Jung; Summer school Players of the Epigenetic Symphony, Poitiers, Frankreich, Cellular characterization of Jumonji C domain containing histone demethylase inhibitors I. Hoffmann, A. Eberlin, M. Metzger, E. Schüle, M. Jung; Spring School Epigenetics of Civilization Diseases, Leipzig, Cellular characterization of Jumonji C domain containing histone demethylase inhibitors I. Hoffmann, A. Eberlin, M. Metzger, E. Schüle, M. Jung; Barcelona Conference on Epigenetics and Cancer, Barcelona, Spanien, III

6 Biphenylalanine Derived Hydroxamic Acids as Inhibitors of the JumonjiC Domain Containing Histone Demethylase JMJD2A M. Roatsch, L. Morera, I. Hoffmann, H. Franz, R. Schüle, M. Jung; 3 rd Max Planck Freiburg Epigenetics Meeting, Freiburg, Vorträge auf wissenschaftlichen Tagungen Establishment of a Cellular Test System for Jumonji C Domain Containing Histone Demethylase Inhibitors International PhD student / Postdoc Meeting der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft (DPhG), Biberach, IV

7 Die Wissenschaft fängt eigentlich erst da an, interessant zu werden, wo sie aufhört. Justus Freiherr von Liebig ( ) V

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9 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Aufbau und Modifikationen des Chromatins Epigenetische Bedeutung der Chromatinmodifikationen Jumonji C Domäne enthaltende Demethylasen Entdeckung Übersicht über die Familie der JmjC Demethylasen Physiologische und pathophysiologische Bedeutung Inhibitoren Zelluläre Testsysteme in der Wirkstofffindung Rolle zellulärer Assays im Prozess der Wirkstofffindung Arten zellbasierter Bioassays Zellbasierte Bioassays für Inhibitoren der JmjC Demethylasen Fragestellung Neue In vitro Inhibitoren der JmjC Demethylasen Entdeckung Strukturen und Aktivität der Inhibitoren Diskussion Ergebnisse Untersuchung des Effekts auf die Zellproliferation MTS Assay Einführung Ergebnisse Zellzahlbestimmung in der Immunfluoreszenz Mikroskopie Einführung Ergebnisse Kontinuierliche Zellproliferationsmessung ohne Androgenstimulation Einführung Ergebnisse Diskussion Untersuchung des Einflusses auf die androgeninduzierte Zellantwort Einführung MTS Assay VII

10 Inhaltsverzeichnis Kontinuierliche Zellproliferationsmessung mit Androgenstimulation qpcr für androgenabhängige Gene Einführung Ergebnisse PSA Sekretion durch LNCaP Zellen Einführung Ergebnisse Diskussion Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung Western Blots Einführung Exkurs: Untersuchung von Hemmstoffen der Histonacetyltransferasen (HATs) Western Blots für methylierte Histonproteine Diskussion Immunfluoreszenz Mikroskopie Einführung Immunfluoreszenz Mikroskopie für H3K9me3 in tranzfizierten und untransfizierten HeLa Zellen Immunfluoreszenz Mikroskopie für H3K9me3 in KYSE 150 Zellen Immunfluoreszenz Mikroskopie für H3K4me3 in KYSE 150 Zellen Immunfluoreszenz Mikroskopie für H3K9me3 in HL 60 Zellen Gegenüberstellung der Ergebnisse aus Proliferationstests und Immunfluoreszenz Mikroskopie Diskussion Untersuchung von Veränderungen der Genexpression mittels Microarray Einführung Ergebnisse des Microarray Experiments Kombinationsexperiment mit Kinaseinhibitoren Einführung Ergebnisse Diskussion Zusammenfassung Experimenteller Teil Material VIII

11 Inhaltsverzeichnis Verbrauchsmaterialien Chemikalien und Reagenzien Inhibitoren Kits Antikörper und Peptide Geräte und Software Lösungen für die Zellkultur Puffer und Lösungen Methoden Allgemeine Methoden Zellkultivierung Bestimmung der Zellzahl Behandlung der Zellen mit Inhibitoren Berechnung der GI 50 und EC 50 Werte Isolierung von RNA In vitro Testung Untersuchung der Zellproliferation Zellproliferationsassay Kontinuierliche Zellproliferationsmessung ohne Androgenstimulation Untersuchung der androgenabhängigen Zellantwort Aushungerung und Stimulation Kontinuierliche Zellproliferationsmessung mit Androgenstimulation Untersuchung der Expression androgenabhängiger Gene mit qpcr Untersuchung der PSA Sekretion nach Androgenstimulation Untersuchung der Histonmethylierung Herstellung von Gesamtzell Proteinlösungen Proteinbestimmung Histonisolierung SDS PAGE und Western Blot Dot Blots Immunfluoreszenz Mikroskopie Microarray Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis IX

12 Inhaltsverzeichnis Tabellenverzeichnis Literaturverzeichnis X

13 1. Einleitung Chromatinmodifizierende Enzyme sind in den letzten Jahren zunehmend in den Fokus der Forscher gerückt, weil sie in vielfältige, bisher wenig verstandene zelluläre Prozesse involviert sind und ihr Potenzial als Zielstrukturen bei der Behandlung von Krankheiten groß erscheint. Im folgenden Text werden zunächst allgemein die Begriffe des Chromatins und der Epigenetik vorgestellt, wobei der Fokus auf den kovalenten Chromatinmodifikationen und den Enzymen liegt, die sie herbeiführen. Die Enzymklasse der Jumonji C Domäneenthaltenden Demethylasen mit ihrem Aufbau, ihrer Funktionsweise und ihren Subfamilien wird in diesen Zusammenhang eingeordnet. Die Darstellung ihrer physiologischen und pathophysiologischen Bedeutung sowie ihrer Inhibitoren leitet über zu den Möglichkeiten der Findung neuer Inhibitoren mit zellulärer Aktivität dieser Enzymklasse Aufbau und Modifikationen des Chromatins Die Desoxyribonukleinsäure (englisch deoxyribonucleic acid, DNA) bildet zusammen mit den Histonen das Chromatin. Histone sind hochkonservierte Proteine mit einem Molekulargewicht zwischen 11 und 20 kda, die auf Grund ihres hohen Gehalts an Lysin und Arginin basisch reagieren. Es wird unterschieden zwischen den Kernhistonen H2A, H2B, H3 und H4 sowie dem Verbindungshiston H1. Die Kernhistone liegen im Chromatin als Oktamer vor, bestehend aus einem Tetramer aus je zwei Molekülen H3 und H4 und zwei Dimeren aus je einem Molekül H2A und H2B. Um die Kernhistone ist der DNA Doppelstrang mit 147 Basenpaaren knapp zweimal gewunden, wodurch eine sogenannte Perlenschnurstruktur entsteht. An der Stelle, wo die DNA Stränge das Kernhistonoktamer verlassen, ist das Verbindungshiston H1 an den Komplex gebunden. Die Untereinheit des Chromatins, die ein Histonoktamer mit der darum gewunden DNA enthält, wird als Nucleosom bezeichnet (Abb. 1 1) (Kornberg & Lorch 1999; Sarma & Reinberg 2005; Sengbusch 1979). Das Vorliegen als Chromatin führt zu einer starken und geordneten räumlichen Verdichtung der DNA, welche für ihre Unterbringung im Zellkern unerlässlich ist. Dabei treten stärker verdichtete Bereiche mit geringer transkriptioneller Aktivität und locker gepackte Bereiche, die häufiger transkribiert werden, auf. Diese werden als Heterochromatin bzw. Euchromatin bezeichnet (Huisinga et al. 2006). 1

14 1. Einleitung Das Chromatin liegt in der Zelle auf vielfältige Arten modifiziert vor. Zunächst können die Kernhiston Oktamere ähnlich den Perlen an einer Schnur durch Chromatin Remodeling Komplexe an der DNA entlang bewegt werden, was zu einer Verdichtung oder Lockerung der Packung führt. Außerdem erfolgt durch Chromatin Remodeling Komplexe auch der Austausch einzelner Histone gegen Subtypen mit anderer Aminosäuresequenz (Bartholomew 2014). Abb. 1 1: Aufbau des Chromatins (modifiziert nach Rosa & Shaw 2013) Die DNA liegt in der Zelle gewunden um Oktamere aus Histonproteinen vor, was zu einer massiven Verdichtung führt. Sowohl an den Histonen als auch an der DNA können chemische Modifikationen auftreten. PTM: Posttranslationale Modifikation eines Histons Des Weiteren treten chemische Modifikationen der DNA auf. Die Base Cytosin wird am Kohlenstoffatom in Position 5 methyliert (Burdon & Adams 1969). Dies geschieht bevorzugt innerhalb von Cytosin Guanin Dinukleotiden, welche in der DNA als palindromische Sequenzen auftreten (Lister et al. 2009). Durch nachfolgende Oxidation kann aus der Methylgruppe eine Hydroxymethyl, Formyl oder Carboxylgruppe entstehen (Bachman et al. 2014; Bachman et al. 2015; Neri et al. 2015). Vereinzelt erfolgt außerdem eine Hydroxylierung von Thymin, das dann als 5 Hydroxymethyluracil vorliegt (Pfaffeneder et al. 2014). Zudem wurde in Drosophila melanogaster eine Methylierung von Adenin an der Aminogruppe nachgewiesen (Zhang et al. 2015). 2

15 1.1. Aufbau und Modifikationen des Chromatins An den Histonen tritt ebenfalls eine Vielzahl chemischer Modifikationen auf. Meist werden Aminosäuren nahe den N terminalen Enden der Kernhistone modifiziert, die im Gegensatz zur globulären Form des C Terminus keine starre Tertiärstruktur aufweisen, sondern aus dem Histonoktamer als Stränge herausragen. Die häufigsten Modifikationen der Histone sind Acetylierung von Lysinresten und Methylierung von Lysin und Argininresten. Weiterhin treten unter anderem Ubiquitinylierung, Phosphorylierung, Sumoylierung und ADP Ribosylierung auf. Bei der Histonmethylierung wird zwischen einer Mono, Di und Trimethylierung von Lysinen, einer Monomethylierung sowie symmetrischer und asymmetrischer Dimethylierung von Argininen unterschieden (Abb. 1 2) (Kouzarides 2007). Abb. 1 2: Posttranslationale Modifikationen der Histone (modifiziert nach Rodríguez Paredes & Esteller 2011) Dargestellt sind Teile der Sequenz der Kernhistone mit den an den jeweiligen Aminosäuren am häufigsten auftretenden Modifikationen. Ac: Acetylierung, Me: Methylierung, P: Phosphorylierung, Ub: Ubiquitinylierung. Die vorgestellten Chromatinmodifikationen sind in vielfältige zelluläre Prozesse involviert, von denen viele noch nicht vollständig aufgeklärt sind. Insbesondere kommt ihnen eine Bedeutung in der Epigenetik, bei der Zellteilung sowie bei der Reparatur von DNA Strangbrüchen zu (Kouzarides 2007). 3

16 1. Einleitung 1.2. Epigenetische Bedeutung der Chromatinmodifikationen Der Begriff Epigenetik beschreibt vererbbare Veränderungen des Phänotyps, die sich nicht im Genotyp niederschlagen (Berger et al. 2009). Während für dieses Phänomen mit Bezug auf transgenerationale Vererbung nur wenige Beispiele beschrieben sind (Xing et al. 2007; Chan et al. 2006), existieren zahllose Beispiele der mitotischen Vererbung eines Phänotyps über Zellgenerationen hinweg, ohne dass eine Mutation vorliegt. Klassisches Beispiel ist die Zelldifferenzierung, bei der sich aus der befruchteten Zygote über mehrere Stufen hinweg alle Zelltypen des neuen Organismus entwickeln. Dabei wird eine vorgenommene terminale Differenzierung einer Zelle über Teilungen hinweg konstant gehalten und auf natürlichem Weg nicht wieder aufgehoben. Die Zelle enthält zwar alle Gene des kompletten Organismus, exprimiert aber nur den für ihren Zelltyp relevanten Anteil (Ursprung & Huang 1967). Diese Tatsache weist bereits darauf hin, dass es Mechanismen der Stilllegung oder Aktivierung von DNA Abschnitten geben muss, die über einen längeren Zeitraum und insbesondere die Zellteilung hinweg stabil sind. Als epigenetische Informationsträger sind kovalente Modifikationen des Chromatins, Histonvarianten, Verdichtung oder Auflockerung des Chromatins durch Chromatin Remodeling Komplexe sowie lange nichtkodierende Ribonukleinsäuren beschrieben. Ob ein kausaler Zusammenhang zwischen ihrem Auftreten und der Stilllegung oder Aktivierung von DNA Abschnitten besteht oder lediglich ein zeitgleiches Auftreten im Zuge einer ablaufenden Reaktionskaskade stattfindet, ist umstritten (Jenuwein & Allis 2001; Henikoff & Shilatifard 2011). Im Folgenden werden die am häufigsten vorkommenden kovalenten Modifikationen des Chromatins im Hinblick auf ihre epigenetische Funktion und die sie herbeiführenden Enzyme vorgestellt. Diese sind von besonderem Interesse, da sie mögliche Angriffspunkte für den pharmakologischen Eingriff in epigenetische Prozesse darstellen. Methylcytosine innerhalb von CpG Inseln werden von Proteinen mit entsprechenden Erkennungsdomänen gebunden (Meehan et al. 1992). Sie kennzeichnen stillgelegte Gene (Norris et al. 1994). Die DNA Methylierung wird durch die DNA Methyltransferasen (DNMTs) DNMT1 sowie DNMT3A und DNMT3B herbeigeführt (Bestor et al. 1988; Okano et al. 1998). Sie übertragen eine Methylgruppe von S Adenosylmethionin (SAM) auf Cytosin, wobei die de novo Methylierung durch DNMT3A und DNMT3B durchgeführt wird, während DNMT1 der Erhaltung des Methylierungsmuster nach der DNA Replikation dient 4

17 1.2. Epigenetische Bedeutung der Chromatinmodifikationen (Okano et al. 1999; Hermann et al. 2004). Die übertragene Methylgruppe kann durch Ten Eleven Translocation Proteine (TET Proteine) in mehreren Stufen zur Hydroxymethyl, Formyl und Carboxylgruppe oxidiert werden (Tahiliani et al. 2009; Ito et al. 2011). Postuliert ist neben der passiven Demethylierung durch Nichtübertragung der DNA Methylierung auf die neu synthetisierten DNA Stränge bei der Zellteilung sowie dem Austausch von 5 Methylcytosin gegen Cytosin durch Basen Exzisionsreparatur auch eine aktive Demethylierung durch Oxidation der Methylgruppe zur Carboxylgruppe und nachfolgende Decarboxylierung (Inoue & Zhang 2011; He et al. 2011b; Wu & Zhang 2014). Anders als die DNA Methylierung führt die Acetylierung der ε Aminogruppe von Lysinen in Histonen zu einer Ladungsänderung: Während Lysinreste bei physiologischem ph Wert protoniert vorliegen und dadurch eine positive Ladung tragen, setzt eine Acetylierung die Basizität herab, so dass die resultierenden Amide in der Zelle ungeladen vorliegen (Abb. 1 3). Diese Ladungsänderung hebt die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen den Lysinresten und dem negativ geladenen Phosphatrückgrat der DNA auf und führt somit zu einer Auflockerung des Chromatins. Global wird die DNA dadurch besser zugänglich für Transkriptionsfaktoren und Gene können leichter als zuvor exprimiert werden (Shogren Knaak et al. 2006). Lokal ist die Histonacetylierung in manchen Fällen auch mit verminderter Genexpression assoziiert. Beispielsweise tritt eine Acetylierung des Lysins in Position 14 von Histon H3 häufig in räumlicher Nähe von inaktiven Promotoren auf (Karmodiya et al. 2012). Die Acetylgruppen stammen aus Acetyl Coenzym A und werden durch Histonacetyltransferasen (HATs) auf die Lysinreste der Histone übertragen. Die HATs umfassen fünf Subfamilien (Abb. 1 3), die sich in ihrem Katalysemechanismus und ihrer Substratspezifität unterscheiden (Furdas et al. 2012). Bei der Histonacetylierung handelt es sich um eine reversible Modifikation. Die Acetylgruppe kann von Histondesacetylasen (HDACs) abgespalten werden, wodurch die ε Aminogruppe in ihren Ursprungszustand zurückversetzt wird. Die Histonacetylierung wurde lange als kurzlebige Modifikation mit Halbwertszeiten von wenigen Minuten bis wenigen Stunden betrachtet (Covault & Chalkley 1980; Zheng et al. 2013). Zheng et al. zeigten aber, dass in der Zervixkarzinom Zelllinie HeLa Acetylgruppen an einzelnen Stellen auch über einen Zeitraum von 30 Stunden hinweg unverändert an Lysinen verbleiben können, was eine mitotische Vererbung wahrscheinlich macht (Zheng et al. 2013). Durch die Mono, Di oder Trimethylierung der ε Aminogruppe eines Lysinrestes ändert sich dessen Ladung bei physiologischem ph Wert nicht (Abb. 1 4). Elektrostatische Anziehungskräfte zur DNA bestehen somit unverändert fort, es kommt jedoch zur Rekrutierung von Proteinen, die eine Erkennungsdomäne für den jeweiligen Lysinrest in einer 5

18 1. Einleitung bestimmten Methylierungsstufe tragen. Diese tragen selbst eine enzymatische Funktion oder rekrutieren weitere Proteine, so dass es in der entsprechenden Region der DNA zu einem Effekt wie beispielsweise der Bildung von Heterochromatin kommt (Shi et al. 2007; Bannister et al. 2001). Die rekrutierten Proteine und hervorgerufenen Effekte sind dabei hochspezifisch für die jeweilige Position des Lysinrests innerhalb des N terminalen Endes eines Histons sowie für seine jeweilige Methylierungsstufe. Unter Umständen wird eine Wirkung sogar erst durch das Zusammenspiel mehrerer Histonmodifikationen in räumlicher Nähe vermittelt (Bernstein et al. 2006). Übertragen werden die Methylgruppen durch hochspezifische Enzyme, die Histonmethyltransferasen, wobei SAM als Cofaktor fungiert. Entfernt werden können sie durch Histondemethylasen. Diese heterogene Enzymfamilie beinhaltet die Klasse der Lysin spezifischen Demethylasen und die Klasse der Jumonji C Domäne enthaltenden Demethylasen (JmjC Demethylasen). Sie werden in Kapitel 1.3 detailliert vorgestellt. HAT HDAC Abb. 1 3: Reversible Lysinacetylierung und HAT Subfamilien Die Acetylierung der ε Aminogruppe eines Lysins führt im physiologischen Milieu zum Wechsel seiner Ladung von positiv zu neutral. Rechts dargestellt ist der phylogenetische Stammbaum der HATs (modifiziert nach Arrowsmith et al. 2012). HMT HMT HMT HDM HDM HDM Abb. 1 4: Reversible Lysinmethylierung Durch Histonmethyltransferasen (HMTs) können auf die ε Aminogruppe eines Lysinrestes bis zu drei Methylgruppen übertragen werden. Die Demethylierung erfolgt durch Histondemethylasen (HDMs). 6

19 1.2. Epigenetische Bedeutung der Chromatinmodifikationen Beispielhaft soll hier die Bedeutung der Trimethylierung von Lysin 9 in Histon H3 (H3K9me3) sowie von Lysin 4 in Histon H3 (H3K4me3) dargestellt werden: H3K9me3 ist ein Kennzeichen von Heterochromatin. Es führt zur Rekrutierung von Heterochromatin Protein 1 (HP1), das maßgeblich an der Bildung von Heterochromatin beteiligt ist (Bannister et al. 2001). Durch eine weitere Rekrutierung von HP1 via Selbstassoziierung und der Histon H3 Lysin 9 Methyltransferase Suv39h1 durch HP1 kommt es zu einer Selbstverstärkung des Effekts (Lee et al. 2005). In der Hefe Schizosaccharomyces pombe konnte die Vererbung von H3K9me3 über die Zellteilung hinweg nachgewiesen werden. Dabei wird H3K9me3 an definierten Stellen im Chromatin auf die Tochterzellen vererbt, wenn diesem Prozess nicht aktiv durch eine Demethylierung entgegengewirkt wird (Audergon et al. 2015). H3K4me3 ist mit aktiver Transkription assoziiert (Santos Rosa et al. 2002). Die Modifikation tritt häufig in den Regionen des Transkriptionsstartes aktiver Gene auf (Liang et al. 2004). Über den mechanistischen Zusammenhang zwischen H3K4me3 und der Transkription ist wenig bekannt. In der Hefe Saccharomyces cerevisiae wird die für die Bildung von H3K4me3 verantwortliche Methyltransferase durch phosphorylierte RNA Polymerase II an das Chromatin rekrutiert. H3K4me3 bleibt an diesen Stellen auch nach Abschluss der Transkription bestehen. Ng et al. schlagen vor, dass H3K4me3 in diesem Fall der Markierung vor kurzem aktiver Gene dient (Ng et al. 2003). Eine mitotische Vererbung ist postuliert, wurde aber bisher nicht nachgewiesen. Neben ihrer physiologischen Funktion insbesondere in der Zelldifferenzierung und der Aufrechterhaltung der zellulären Identität spielt die Epigenetik auch eine Rolle bei der Pathophysiologie verschiedener Erkrankungen. Den derzeitigen Forschungsschwerpunkt bilden dabei Tumorerkrankungen. Für verschiedene solide Tumore sowie maligne hämatologische Erkrankungen wurde gezeigt, dass eine epigenetische Fehlregulation vorliegt (Suva et al. 2013). Die beschriebene grundsätzliche Reversibilität epigenetischer Prozesse macht epigenetische Enzyme dabei zu potenziellen Zielstrukturen von Hemmstoffen. Die HDAC Hemmstoffe Vorinostat (Suberoylanilidhydroxamsäure, englisch suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA) und Romidepsin sind in den USA zur Behandlung des kutanen T Zell Lymphoms zugelassen (Mann et al. 2007; Celgene 2015). Die DNMT Hemmstoffe Azacytidin und Decitabin haben unter anderem in der EU eine Zulassung zur Behandlung des myelodysplastischen Syndroms, chronischer myelomonozytärer Leukämie und akuter myeloischer Leukämie bzw. ausschließlich zur Behandlung akuter myeloischer Leukämie (Celgene 2012; Janssen Cilag 2012). Sie zeigen, 7

20 1. Einleitung dass der Einsatz von Inhibitoren chromatinmodifizierender Enzyme als Arzneistoffe möglich und sinnvoll ist kam als neuer Wirkstoff der HDAC Inhibitor Belinostat zur Behandlung des peripheren T Zell Lymphoms in den USA auf den Markt (O'Connor et al. 2015) folgten die HDAC Hemmstoffe Panobinostat zur Behandlung des Multiplen Myeloms und Chidamide zum Einsatz bei Pankreaskarzinom, welche in den USA bzw. China die Zulassung erhielten (Fenichel 2015; Qiao et al. 2013). Weitere Hemmstoffe chromatinmodifizierender Enzyme, unter anderem auch von Histonmethyltransferasen und demethylasen, befinden sich derzeit in klinischen Studien (Maes et al. 2015) Jumonji C Domäne enthaltende Demethylasen Entdeckung Die JmjC Demethylasen wurden im Vergleich zu anderen epigenetischen Enzymfamilien spät beschrieben wurde das erste Protein mit Jumonji C Domäne, JARID2, im Rahmen eines Gene Trap Experiments an Mäusen entdeckt. Die Neuralrinne der Embryonen, denen das Protein fehlt, bildet sich in Form eines Kreuzes statt eines Spaltes und es wurde deshalb Jumonji (japanisch für kreuzförmig ) genannt (Takeuchi et al. 1995). Es existiert ein humanes Protein mit circa 90 % Sequenzhomologie (Bergé Lefranc et al. 1996). In einer bioinformatischen Analyse wurden zwei Domänen identifiziert, die unter anderem in JARID2, aber auch in anderen Proteinen vorhanden sind. Sie wurden nach ihrem Auftreten im N bzw. C terminalen Bereich des Proteins Jumonji N Domäne und Jumonji C Domäne genannt (Balciunas & Ronne 2000) wurde für JHDM1 als erstes Protein mit Jumonji C Domäne eine Demethylaseaktivität nachgewiesen und gezeigt, dass die Jumonji C Domäne Träger dieser katalytischen Aktivität ist (Tsukada et al. 2006) Übersicht über die Familie der JmjC Demethylasen Bekannt sind über 30 humane Proteine, die eine Jumonji C Domäne enthalten. 18 von ihnen weisen eine Demethylaseaktivität auf (Johansson et al. 2014). Sie sind abzugrenzen von der zweiten Familie humaner Histondemethylasen, der LSD Familie mit den Mitgliedern Lysin Spezifische Demethylase 1 (LSD1) und Lysin Spezifische Demethylase 2 (LSD2), die 2004 bzw entdeckt wurden (Shi et al. 2004; Fang et al. 2010). Von ihnen unterscheiden sie sich im Aufbau, im Katalysemechanismus und im Substratspektrum. 8

21 1.3. Jumonji C Domäne enthaltende Demethylasen 3 H 2 O α-kg Substrat O 2 A B Succinat F2 F1 C 3 H 2 O CO2 E D Abb. 1 5: Mechanismus der Demethylierung durch JmjC Demethylasen (modifiziert nach Martinez & Hausinger 2015) Im aktiven Zentrum der JmjC Demethylasen wird ein Eisen(II) Ion durch zwei Histidinreste und einen Glutamat oder Aspartatrest sowie drei Wassermoleküle koordiniert. Zu Beginn des Reaktionszyklus ersetzen α KG und molekularer Sauerstoff die Wassermoleküle im Komplex. Das Eisen(II) Ion wird durch den molekularen Sauerstoff zum Eisen(III) Ion oxidiert (A). Durch Angriff des distalen Sauerstoffatoms am Kohlenstoffatom der Ketogruppe des α KGs entsteht eine bicyclische Peroxohalbketal Verbindung (B). Unter Freisetzung von Kohlenstoffdioxid reagiert diese weiter zu einer Eisen(IV) Oxo Verbindung (C), welche ein Wasserstoffatom vom Substrat entfernt. Das Substrat liegt somit als Radikal vor (D). Es reagiert mit der Eisen(III) Hydroxy Verbindung zum Halbaminal (E), welches spontan in das demethylierte Produkt und Formaldehyd zerfällt (F1). Über die Freisetzung von Succinat gelangt das Enzym in den Ausgangszustand zurück (F2) (Martinez & Hausinger 2015). Die JmjC Demethylasen sind α Ketoglutarat abhängige Dioxygenasen. Sie übertragen eine Hydroxylgruppe auf eine Methylgruppe eines methylierten Lysinrestes, wodurch ein Halbaminal entsteht. Dieses zerfällt spontan in Formaldehyd und den demethylierten Lysinrest. Als Cofaktoren nutzen JmjC Demethylasen neben α Ketoglutarat (α KG) molekularen Sauerstoff (Tsukada et al. 2006). In ihrem katalytischen Zentrum tragen sie 9

22 1. Einleitung ein Eisen(II) Ion, das für die katalytische Funktion essentiell ist. Der detaillierte Reaktionsmechanismus ist in Abbildung 1 5 dargestellt. Weitere Subfamilien der humanen α KG abhängigen Oxygenasen sind Prolylhydroxylasen, Collagenprolylhydroxylasen und Nucleotidhydroxylasen (Abb. 1 6). Im Gegensatz zu den JmjC Demethylasen nutzen LSD1 und LSD2 Flavinadenindinukleotid (FAD) als Cofaktor (Forneris et al. 2005). Sie oxidieren die ε Aminogruppe durch Übertragung eines Hydrids auf FAD. Das resultierende Iminiumion reagiert spontan mit Wasser. Produkt dieser Reaktion ist wie bei der durch JmjC Demethylasen katalysierten Reaktion auch ein Halbaminal, das zu Formaldehyd und der demethylierten Aminogruppe zerfällt (Spannhoff et al. 2009). Auf Grund dieses Reaktionsmechanismus akzeptieren LSD1 und LSD2 mono und dimethylierte, nicht aber trimethylierte Lysinreste als Substrat. Im Gegensatz dazu können JmjC Demethylasen auch trimethylierte Lysinreste demethylieren. Abb. 1 6: Phylogenetischer Stammbaum der humanen α KG abhängigen Oxygenasen (Johansson et al. 2014) Proteine, für die noch keine enzymatische Aktivität nachgewiesen wurde, sind mit einem roten Stern markiert. 10

23 1.3. Jumonji C Domäne enthaltende Demethylasen Die Jumonji C Domäne setzt sich aus acht parallel angeordneten β Faltblättern zusammen, die eine rollenartige Struktur bilden. Diese Anordnung wird häufig im Vergleich als jelly roll (englisch für Biskuitrolle ) bezeichnet. JmjC Demethylasen gehören damit wie alle α KG abhängigen Oxygenasen der Cupin Superfamilie an (von lateinisch Cupa, kleines Fass ). Diese Struktur stellt ein unflexibles Grundgerüst dar, durch welches das Eisen(II) Ion sowie der Cofaktor α KG in Position gehalten werden (Abb. 1 7) (Chen et al. 2006; Johansson et al. 2014). Die JmjC Demethylasen unterscheiden sich untereinander in der Art der weiteren Domänen, die sie enthalten, sowie der Beschaffenheit ihrer Substratbindungstasche und damit ihrem Substratspektrum (Tab. 1 1). Als weitere Domänen kommen hauptsächlich Motive vor, die der Erkennung methylierter Lysine dienen wie beispielsweise Tudordomäne und Pflanzen Homöodomäne oder zur DNA Bindung notwendig sind wie das Zinkfinger CxxC Motiv (Johansson et al. 2014). Eine Jumonji N Domäne ist nicht in allen JmjC Demethylasen enthalten, in der KDM4 Subfamilie jedoch zusätzlich zur Jumonji C Domäne für die katalytische Aktivität notwendig (Klose et al. 2006). Abb. 1 7: Struktur von JMJD2A (modifiziert nach Chen et al. 2006) Dargestellt ist eine Übersicht über das katalytische Zentrum von JMJD2A (Aminosäuren 1 bis 350, links) sowie eine Detailansicht (rechts). Die einzelnen Strukturbestandteile sind wie folgt angefärbt: Jumonji C Domäne: hellblau, Jumonji N Domäne: grün, lange β Haarnadelschleife: violett, C terminale Domäne: rosa, Eisen(II) Ion: braun, Zink(II) Ion: violett. Im katalytischen Zentrum koordinieren ein Glutamatrest sowie zwei Histidinreste das Eisen(II) Ion (vergleiche Abb. 1 5), genauso wie der Cofaktor α KG. Das Zink(II) Ion hat eine Bedeutung für die Struktur der Demethylase und ist außerdem in die Substratbindung involviert. 11

24 1. Einleitung Die Größe und die Form der Substratbindungstasche sind entscheidend dafür, welches methylierte Lysin eines Histons eine JmjC Demethylase als Substrat akzeptiert. Anders als beispielsweise HDACs weisen JmjC Demethylasen eine hohe Spezifität für bestimmte Lysinreste innerhalb eines Proteins sowie für einzelne Methylierungsstufen auf. Am Beispiel der KDM4 Subfamilie wurde gezeigt, dass einzelne Aminosäuren in oder nahe der katalytischen Domäne entscheidend sind für die Substratspezifität: So akzeptiert JMJD2D nur H3K9me3 und nicht wie JMJD2A, JMJD2B und JMJD2C zusätzlich trimethyliertes Lysin 36 in Histon H3 (H3K36me3) als Substrat. Die Aufnahme von H3K36me3 in die Substratbindungstasche wird insbesondere durch Histidin in Position 90 und Leucin in Position 75 von JMJD2D sterisch behindert (Hillringhaus et al. 2011; Krishnan & Trievel 2013). Im Fall von JMJD6 ist die Substratbindungstasche soweit abgewandelt, dass es zur Hydroxylierung des Kohlenstoffatoms in ε Position statt einer Methylgruppe kommt. Das Produkt dieser Reaktion ist ε Hydroxylysin, welches stabil ist. Als Substrat fungieren H2A/H2B und H3/H4 in vivo (Unoki et al. 2013). Zusätzlich existieren für JMJD6 Einzelberichte über die Demethylierung methylierter Arginine in Histonen. Die Katalyse dieser Reaktion durch JMJD6 ist jedoch umstritten (Böttger et al. 2015). Tab. 1 1: Aufbau und Substrate der humanen Proteine mit Jumonji C Domäne (modifiziert nach Johansson et al. 2014) Name Aufbau Histonsubstrate Nicht Histonsubstrate KDM2 Subfamilie FBXL10 H3K36me1/me2, H3K4me3 FBXL11 H3K36me1/me2 P65, NF κb KDM3 Subfamilie JMJD1A H3K9me1/me2 JMJD1B H3K9me1/me2 JMJD1C HR 12

25 1.3. Jumonji C Domäne enthaltende Demethylasen KDM4 Subfamilie JMJD2A JMJD2B JMJD2C JMJD2D JMJD2E JMJD2F H3K9me2/me3, H3K36me2/me3, H1.4K26me2/me3 H3K9me2/me3, H3K36me2/me3, H1.4K26me2/me3 H3K9me2/me3, H3K36me2/me3, H1.4K26me2/me3 H3K9me2/me3, H1.4K26me2/me3 H3K9me2/me3, H1.4K26me2/me3 WIZ, CDYL1, CSB, G9a WIZ, CDYL1, CSB, G9a WIZ, CDYL1, CSB, G9a KDM5 Subfamilie JARID1A JARID1B JARID1C JARID1D JARID2 H3K4me1/me2/ me3 H3K4me1/me2/ me3 H3K4me1/me2/ me3 H3K4me1/me2/ me3 KDM6 Subfamilie UTX H3K27me2/me3 UTY JMJD3 H3K27me2/me3 KDM7 Subfamilie PHF2 H3K9me2 PHF8 H3K9me1/me2, H4K20me1 13

26 1. Einleitung KIAA 1718 H3K9me1/me2, H3K27me1/me2 Hydroxylasen NO66 H3K4me1/me2/ me3, H3K36me2/me3 Rpl8 MINA53 H3K9me3 Rpl27a JMJD4 JMJD5/ KDM8 JMJD6 JMJD7 H3K36me2/me1 H3R2me2, H4R3me1/me2, H2A/H2B, H3/H4 NFATc1 U2AF2/ U2AF65, LUC7L2 JMJD8 FIH HSPB AP1 TYW5 HIF 1α, ARDenthaltende Proteine trna Symbole für die Domänen: : JmjC, : PHD, : JmjN, : Tudor, : LRR, : TPR, : ARID, : FBOX, : whth, : GATAL, : zf C2HC4, : CxxC, : zf C5HC2, : PLU, : AlkB, : RRM, : MTase, : DSBH1, : DSBH2, : Zn Bindungsmotif, : FTO CTD. Für die Histonsubstrate sind jeweils der Reihe nach das Histonprotein, die Position des Lysin oder Argininrests und die Methylierungsstufe aufgeführt. Leere Felder in der Tabelle bedeuten, dass für das entsprechende Enzym in der jeweiligen Kategorie kein Substrat bekannt ist. Während andere histonmodifizierende Enzyme, wie insbesondere HDACs, vielfältige andere Substrate neben Histonproteinen akzeptieren, gibt es für JmjC Demethylasen nur wenige Berichte über die Umsetzung anderer Substrate als der Histone. Alternative Substrate für Demethylierungs oder Hydroxylierungsreaktionen sind in Tabelle 1 1 aufgeführt. Zur Vereinheitlichung der Nomenklatur und um dem breiteren Substratspektrum Rechnung zu tragen, wurden Histondemethylasen in Lysindemethylasen 14

27 1.3. Jumonji C Domäne enthaltende Demethylasen (KDMs) umbenannt und entsprechend ihrer Zugehörigkeit zu Subfamilien mit Nummern versehen (Allis et al. 2007). Gebräuchlich ist jedoch weiterhin die traditionelle Nomenklatur Physiologische und pathophysiologische Bedeutung Da es sich bei den JmjC Demethylasen um eine vergleichsweise spät entdeckte Enzymklasse handelt, ist ihre physiologische und pathophysiologische Bedeutung noch wenig bekannt. Der Mangel an potenten und selektiven Inhibitoren erschwert eine genaue Charakterisierung und insbesondere die Untersuchung der Rolle der enzymatischen Aktivität der Enzyme unabhängig von ihrer Gerüstfunktion im Komplex mit anderen Proteinen. Berichte über die physiologische und pathophysiologische Bedeutung der JmjC Demethylasen sind größtenteils deskriptiv und beschränkt auf Expressionsanalysen, Knockdown Experimente und Überexpressionsstudien. Insgesamt lässt sich sagen, dass sich die einzelnen JmjC Demethylasen in ihrer biologischen Funktion stark unterscheiden. Ihre Expression variiert sowohl gewebe als auch entwicklungsabhängig und einzelne Demethylasen können in einer Zelle entgegengesetzte Funktionen haben (Pedersen & Helin 2010). Häufig sind einzelne JmjC Demethylasen Bestandteil von Proteinkomplexen, die dann Auswirkungen auf Rekrutierung und Funktion der Demethylase haben. Die einfachste Form ist dabei die Homodimerisierung, die zum Beispiel bei JMJD1A auftritt. Es erfolgt eine Demethylierung von am Lysin in Position 9 dimethyliertem Histon H3 (H3K9me2) zum unmethylierten Produkt durch Weitergabe des Produkts der ersten Demethylase an ihren Dimerisierungspartner (Goda et al. 2013). Beispiel für eine Komplexbildung mit anderen Proteinen ist die Rekrutierung des Polycomb repressive complex 1 (PRC1) durch JMJD2B. Dabei bindet JMJD2B über sein Zinkfinger CxxC Motiv an methylierte CpG Inseln und rekrutiert PRC1 dorthin. Die katalytische Funktion von JMJD2B kommt in diesem Komplex nicht zum Tragen (He et al. 2013). Des Weiteren wirken mehrere JmjC Demethylasen mit Steroidhormonrezeptoren zusammen. So führt der Knockdown von JMJD1A zu einer verminderten Transkription von ps2 und GREB1, die beide Zielgene des Estrogenrezeptors sind. Der Histonmethylierung wird dabei eine Funktion als Pförtner zugeschrieben, welche die basale Transkription der durch nukleäre Rezeptoren gesteuerten Gene gering halten soll (Garcia Bassets et al. 2007). Mehrere JmjC Demethylasen interagieren mit dem Androgenrezeptor: JMJD1A, JMJD2A und JMJD2C binden an den durch ein Androgen aktivierten Androgenrezeptor. Knockdown von 15

28 1. Einleitung JMJD1A und Expression einer katalytisch inaktiven Mutante von JMJD2A statt des katalytisch aktiven Enzyms führen zu einer verminderten Transkription androgenabhängiger Gene (Yamane et al. 2006; Shin & Janknecht 2007). Die Rolle von JMJD2C als Coaktivator des Androgenrezeptors ist als einzige mechanistisch beschrieben. Zusätzlich ist dieses Enzym auch Coaktivator des Glucocorticoidrezeptors sowie des Progesteronrezeptors (Wissmann et al. 2007). Im Folgenden soll beispielhaft die Rolle von JMJD2C als Coaktivator des Androgenrezeptors vorgestellt werden: In Abwesenheit von Androgenen liegt der Androgenrezeptor frei im Zytoplasma vor. Androgenabhängige Gene werden nicht transkribiert. Das Chromatin im Promotorbereich dieser Gene ist an Histon H3 in Position 9 trimethyliert und trägt die Demethylasen JMJD2C und LSD1 sowie die Proteinkinase C beta 1 (PKCB1), welche jedoch in diesem Zustand nicht aktiv sind. Bei Aktivierung des Androgenrezeptors durch ein Androgen kommt es zur Dimerisierung der Rezeptoren, ihrer Translokation in den Zellkern und der Komplexbildung mit den genannten Enzymen sowie Protein kinase C related kinase 1 (PRK1). Im Komplex kommt es zur Phosphorylierung des Threonins in Position 11 von Histon H3 durch PRK1, was die Demethylierung von H3K9me3 durch JMJD2C einleitet (Metzger et al. 2008; Wissmann et al. 2007). Gleichzeitig aktivieren der Androgenrezeptor sowie PRK1 PKCB1, welches Histon H3 in Position 6 phosphoryliert. LSD1 akzeptiert als Teil von anderen Proteinkomplexen mono und dimethyliertes Lysin 4 in Histon H3 als Substrat. Durch die Phosphorylierung in Position 6 wird seine Substratspezifität jedoch geändert, so dass es das bereits durch JMJD2C in den mono oder dimethylierten Zustand überführte Lysin 9 in Histon H3 weiter demethyliert. Histon H3 wird an Lysin 4 methyliert und diese Methylierung auf Grund der Phosphorylierung an Threonin 6 nicht durch LSD1 entfernt (Metzger et al. 2005; Metzger et al. 2010). Durch diese Kaskade wird die mit nicht transkribierten Genen assoziierte Histonmodifikation H3K9me3 durch die mit aktiver Transkription assoziierte Mono oder Dimethylierung von Lysin 4 in Histon H3 ersetzt und die Transkription des betroffenen Gens eingeleitet (Abb. 1 8). Die Cofaktoren der JmjC Demethylasen, α KG und molekularer Sauerstoff, sind auch in vielfältige andere zelluläre Prozesse involviert. So ist α KG als Intermediat des Citrat Zyklus Teil des zellulären Metabolismus und zudem Cofaktor für andere Hydroxylierungsreaktionen neben der Hydroxylierung im Zuge der Demethylierung, während Sauerstoff die Grundlage aller zellulären Oxidationsreaktionen bildet. Die Umwelt einer Zelle könnte sich somit über die Konzentrationen dieser Cofaktoren in ihrer Histonmethylierung niederschlagen. Zudem könnten reaktive Moleküle über den Redoxstatus des Eisen Ions 16

29 1.3. Jumonji C Domäne enthaltende Demethylasen im aktiven Zentrum der JmjC Demethylasen die katalytische Aktivität der Enzyme beeinflussen. Derartige Mechanismen des Zusammenspiels zwischen Umwelt, Histonmodifikationen und damit möglicherweise auch Gentranskription werden für viele chromatinmodifizierende Enzyme vermutet. Für Sauerstoff wurde bereits gezeigt, dass die Michaelis Menten Konstanten der Mitglieder der KDM4 Subfamilie in einem Bereich liegen, der eine Beeinflussung ihrer Aktivität durch veränderte zelluläre Sauerstoffkonzentrationen wahrscheinlich erscheinen lässt (Cascella & Mirica 2012). Bei einem Sauerstoffpartialdruck von unter 3 % tritt zudem in Makrophagen eine Hypermethylierung an Histon H3 Lysin 9 und Lysin 36 auf (Tausendschön et al. 2011). Gleichzeitig erfolgt eine verstärkte Expression insbesondere von JMJD1A und JMJD2B als Folge einer Hypoxie, da beide Gene Zielstrukturen des Hypoxie induzierten Faktors 1 alpha (HIF 1α) sind (Pollard et al. 2008). Abb. 1 8: JMJD2C und LSD1 als Coaktivatoren des Androgenrezeptors (modifiziert nach Izzo & Schneider 2010) Ein androgenabhängiges Gen wird in Abwesenheit von Androgenen nicht transkribiert (links). Bei Aktivierung des Androgenrezeptors (AR) durch ein Androgen kommt es durch das Zusammenwirken des Androgenrezeptors mit seinen Coaktivatoren zur Transkription (rechts). Vielen Jumonji C Domäne enthaltenden Proteinen kommt eine essentielle Rolle in Embryonalentwicklung und Zelldifferenzierung bzw. Erhaltung der Pluripotenz von Stammzellen zu. Wie eingangs erwähnt kommt es durch Knockdown des enzymatisch inaktiven Proteins JARID2 zu einer Fehlbildung der Neuralplatte der Maus (Takeuchi et al. 1995). Auch die Demethylase JMJD2A ist an der neuronalen Entwicklung beteiligt. Ihr Knockdown führt zu einer verminderten Expression der für die Neuralleiste spezifischen Gene und einer massiven Fehlbildung der kranialen Ganglien im Zuge der Entwicklung von Hühnerembryos (Strobl Mazzulla et al. 2010). Das verwandte Enzym JMJD2B ist beteiligt an der Erhaltung der Pluripotenz muriner embryonaler Stammzellen. Über die Rekrutierung von PRC1 unterdrückt es die Expression der für einzelne Zell oder Gewebetypen typischen Gene und verhindert so eine Differenzierung (He et al. 2013). Der Knockdown von JHDM1B, JMJD3, JMJD5, JARID1B und UTX in Mäusen ist embryonisch 17

30 1. Einleitung oder perinatal letal (Li et al. 2014a; Oh & Janknecht 2012; Di Stefano & Dyson 2013). Genauso ist eine Mutation von JHDM1B in Kälbern beschrieben, die zu Fehlbildungen und zur Totgeburt führt (Testoni et al. 2012). Im Gegensatz dazu ist JMJD2C für die Embryonalentwicklung entbehrlich. Knockout Mäuse sind nach der Geburt im Vergleich zum Wildtyp unauffällig, entwickeln sich normal und können sich fortpflanzen (Pedersen et al. 2014). Die physiologische Bedeutung der JmjC Demethylasen nach der Geburt ist nur lückenhaft beschrieben. So wird beispielsweise JMJD3 verstärkt im Zuge der Knochenbildung in Osteoblasten exprimiert. Knockdown von JMJD3 verhindert eine Ausdifferenzierung der Osteoblasten über eine fehlende Demethylierung von trimethyliertem Lysin 27 in Histon H3 an den Promotoren der Transkriptionsfaktoren Runx2 und Osterix (Di Yang et al. 2013). JHDM1B kommt über seine Gerüstfunktion eine Rolle in der Feinabstimmung der Adipogenese zu. Es tritt eine erhöhte Expression im Fettgewebe von Mäusen auf, die mit einer stark fetthaltigen Kost gefüttert wurden. JHDM1B leitet PRC1 an Gene, die an der Adipogenese beteiligt sind, und führt so deren Unterdrückung herbei (Inagaki et al. 2015). Die pathophysiologische Rolle der JmjC Demethylasen wurde bisher hauptsächlich in Bezug auf Tumorerkrankungen untersucht. Häufig weisen Tumore erhöhte Expressionslevel einzelner JmjC Demethylasen auf. Ein Beispiel ist die erhöhte Expression von JMJD2C in Plattenepithelkarzinomen. Diese wurde bereits vor der Demethylaseaktivität des Proteins beschrieben und führte zu seiner Benennung als Gene Amplified in Squamous Cell Carcinoma 1 (GASC1) (Yang et al. 2000). Eine hohe Expression von JMJD2C im Plattenepithelkarzinom des Ösophagus korreliert mit geringer Überlebenszeit der Patienten im Vergleich zu Patienten, deren Tumore niedrige Expressionswerte an JMJD2C aufweisen (Sun et al. 2013). Der Knockdown von JMJD2C führt in der Ösophaguskarzinom Zelllinie KYSE 150 Zellen zu verminderter Proliferation (Cloos et al. 2006). Eine ähnliche Rolle als Onkogen ist für JMJD2C in Brustkrebs, Prostatakarzinom und B Zell Lymphom beschrieben (Berry & Janknecht 2013). Des Weiteren werden insbesondere die JmjC Demethylasen JMJD1A, JMJD2A und JMJD2B sowie die Hydroxylasen NO66, JMJD5 und JMJD6 in soliden Tumoren überexprimiert. In vielen Fällen geht dies mit besonderer Aggressivität der Tumore einher (Johansson et al. 2014). Für Leukämien sind besonders die JmjC Demethylasen JHDM1B und JMJD1C relevant. JHDM1B ist in mehreren akuten Leukämieformen hochreguliert. Wird es in murinen, hämatologischen Vorläuferzellen mit Hilfe eines Lentivirus überexprimiert, so verhalten sich diese Zellen nach einer Transplantation in der Maus ähnlich wie Leukämiezellen 18

31 1.3. Jumonji C Domäne enthaltende Demethylasen (He et al. 2011a). In Zusammenhang mit der Überexpression von JHDM1B kommt es zu einer verstärkten Expression an der oxidativen Phosphorylierung beteiligter Gene sowie von Nsg2, das einer Differenzierung der Zellen entgegenwirkt (Ueda et al. 2015). JMJD1C wurden in einem shrna Screening in einem Mausmodell für humane akute myeloische Leukämie (AML) als Zielstruktur identifiziert. Knockdown von JMJD1C führt zu verstärkter Apoptose in murinen AML Zellen sowie humanen akuten lymphoischen Leukämiezellen (Sroczynska et al. 2014). Mehrere physiologische Zusammenhänge spielen auch für die Pathophysiologie der JmjC Demethylasen eine Rolle: So wachsen viele Tumore der Brust und der Prostata hormonabhängig. JMJD2C als Coaktivator mehrerer Hormonrezeptoren stellt somit eine mögliche Zielstruktur in der Behandlung dieser Tumorerkrankungen dar. Möglicherweise ist das Enzym auch für die Entwicklung hin zum hormonunabhängigen Tumor wichtig, die beim Prostatakarzinom meist im Endstadium der Erkrankung auftritt (Feldman & Feldman 2001). Für das ebenfalls als Cofaktor des Androgenrezeptors agierende PRK1 wurde bereits gezeigt, dass es für die Metastasenbildung des androgenunabhängigen Prostatakarzinoms notwendig ist (Jilg et al. 2014). Des Weiteren ist von Bedeutung, dass in Tumorgewebe ab einer gewissen Größe des Tumors häufig Hypoxie herrscht. Die Hochregulation einzelner JmjC Demethylasen im Gewebe könnte eine Reaktion auf die verminderte Sauerstoffkonzentration sein. Zu erwarten ist dies insbesondere für JMJD1A und JMJD2B als direkte Zielstrukturen von HIF 1α (Beyer et al. 2008). Die JmjC Demethylasen sind an Resistenzen von Tumorzellen gegenüber Zytostatika beteiligt. In Zelllinien des nicht kleinzelligem Lungenkarzinoms und Prostatakarzinoms sorgt verstärkte Expression von JARID1A in einer Subpopulation für das Überleben dieser Zellen während einer Behandlung mit dem als Zytostatikum eingesetzten Tyrosinkinase Inhibitor Erlotinib. Knockdown von JARID1A wirkt in den Prostatakarzinom Zellen nicht antiproliferativ, senkt aber die Anzahl der Zellen, die eine Resistenz entwickeln (Sharma et al. 2010). Klinisch korreliert das Expressionslevel des verwandten Enzyms JARID1B in epithelialem Ovarialkarzinom mit dem Auftreten einer Resistenz gegenüber Chemotherapeutika (Wang et al. 2015). In manchen Fällen treten einzelne JmjC Demethylasen nicht als Onkogene, sondern als Tumorsuppressoren auf. Am Beispiel von JMJD2A wurde gezeigt, dass die Rolle einer einzelnen JmjC Demethylase in Tumorerkrankungen nicht generalisiert werden kann, sondern nach Erkrankung und weiteren Faktoren differenziert betrachtet werden muss. So agiert JMJD2A beispielsweise in der Lungenkrebszelllinie A549 als Onkogen, während 19

32 1. Einleitung hohe Level bei Blasenkrebspatienten mit längeren Überlebenszeiten korrelieren (Guerra Calderas et al. 2015). Das Auftreten als Tumorsuppressor in bestimmten Erkrankungen wurde auch für Mitglieder der JmjC Demethylase Subfamilien KDM3 (JMJD1B, JMJD1C), KDM5 (JARID1B, JARID1C, JARID1D) und KDM6 (UTX, JMJD3) beschrieben (Johansson et al. 2014). Beispielsweise fungiert UTX in T Zell akuter lymphoblastischer Leukämie (T ALL) als Tumorsuppressor. Da das UTX codierende Gen auf dem X Chromosom liegt, aber einer X Inaktivierung entgeht, kommt es nur bei männlichen Patienten zum Funktionsverlust des Enzyms durch Mutationen. In Mäusen verläuft eine Leukämie ausgelöst durch T ALL Zellen mit Knockdown von UTX besonders schwer. In den Zellen liegt eine Trimethylierung an Histon H3 Lysin 27 der Promotoren bekannter Tumorsuppressorgene vor, was mit verminderter Transkription assoziiert ist (van der Meulen et al. 2015). Die H3K4me3 Demethylase JARID1B dient in Brustkrebs als Tumorsuppressor. Verlust des Enzyms erhöht das metastatische und angiogene Potential der Brustkrebszelllinien MDA MB 231 und MCF 7 (Li et al. 2011). Die Rolle der JmjC Demethylasen in anderen Erkrankungen ist weniger gut charakterisiert. Mehrere Enzyme spielen eine Rolle in geistigen und körperlichen Behinderungen. Insbesondere treten Mutationen von PHF8 in X chromosomaler geistiger Behinderung und Deletionen von UTX in Zusammenhang mit dem Kabuki Syndrom auf (Laumonnier et al. 2005; Lederer et al. 2012). Eine für Chorea Huntington typische verminderte Expression mehrerer Gene kann durch Reduktion von JARID1C in murinen neuronalen Zellen revidiert werden. Der Knockdown von JARID1C wirkt in einem Modell der Krankheit in Drosophila melanogaster neuroprotektiv (Vashishtha et al. 2013). Mäuse mit Herz spezifischem Knockout von JMJD2A reagieren auf Aortakonstriktion mit geringerer Hypertrophie des Herzens als ihre Artgenossen des Wildtyps. Ihre normale Herzfunktion ist unbeeinflusst. Patienten mit hypertropher Kardiomyopathie weisen im Vergleich zu Gesunden erhöhte Level an JMJD2A im Herzgewebe auf (Zhang et al. 2011). Weitere Erkenntnisse über die physiologische und pathophysiologische Bedeutung der JmjC Demethylasen stammen aus Experimenten mit Inhibitoren der katalytischen Aktivität. Diese wurden in Kapitel integriert Inhibitoren Im Gegensatz zu anderen histonmodifizierenden Enzymfamilien wie insbesondere den HDACs und DNMTs ist die Entwicklung von Inhibitoren der JmjC Demethylasen wenig 20

33 1.3. Jumonji C Domäne enthaltende Demethylasen fortgeschritten, was in der späten Entdeckung dieser Enzymfamilie begründet liegt. Die bislang noch wenig verstandene physiologische und pathophysiologische Bedeutung der JmjC Demethylasen ließe sich mit potenten, selektiven und zellulär wirksamen Inhibitoren sehr viel leichter untersuchen als in Knockdown Experimenten. Gleichzeitig stellen viele der JmjC Demethylasen mögliche Zielstrukturen bei der Behandlung von Krankheiten dar, so dass ein späterer Einsatz von Inhibitoren als Arzneistoffe denkbar wäre. Bei der Entwicklung von Inhibitoren der JmjC Demethylasen wurden während der Zeit, in der diese Arbeit entstand, einige Fortschritte erzielt. Zu Beginn waren nur wenige, nicht selektive und wenig potente Hemmstoffe publiziert. Inzwischen stehen Inhibitoren mit halbmaximalen Hemmkonzentrationen (englisch inhibitory concentration 50, IC 50 ) von unter 100 nm und einer Selektivität für manche Subfamilien gegenüber anderen zur Verfügung, was zeigt, dass eine starke Verbesserung der Potenz und Selektivität möglich ist. Der Bedarf an hochpotenten und insbesondere zellulär wirksamen JmjC Demethylase Hemmstoffen ist durch diese Einzelsubstanzen jedoch bei weitem nicht gedeckt, so dass die Suche nach neuen Leitstrukturen weitergeht. Im Folgenden werden die publizierten Inhibitoren gruppiert nach gemeinsamen Strukturmotiven vorgestellt. Der Schwerpunkt liegt dabei auf den Substanzen, für die eine zelluläre Wirksamkeit gezeigt wurde. Die Strukturformeln der Inhibitoren sind in Tabelle 1 2 dargestellt. Grundsätzlich stellt sich die Frage, welcher Grad der Selektivität für JmjC Demethylase Hemmstoffe angestrebt werden sollte. Wegen der hohen Konservierung der Jumonji C Domäne wird in den meisten Fällen keine Selektivität für einzelne Subfamilien, geschweige denn für einzelne Enzyme erreicht. Analoga des Cofaktors α KG inhibieren zudem häufig auch andere α KG abhängige Enzyme wie Prolylhydroxylasen (vergleiche Abb. 1 6) (Rose et al. 2008). Als Forschungswerkzeuge sind solche Hemmstoffe am nützlichsten, die die gezielte Untersuchung eines definierten Enzyms ermöglichen und für dieses eine sehr hohe Selektivität aufweisen. Für die denkbare Entwicklung hin zum Arzneistoff müssen Experimente und klinische Studien noch zeigen, welcher Grad der Selektivität die beste Wirkung herbeiführt. Gerade in der Tumortherapie können durch pan Inhibitoren manchmal bessere Ergebnisse erzielt werden als durch selektive Inhibitoren. Ein Beispiel dafür ist der in den USA zugelassene HDAC Inhibitor Vorinostat, der alle Zink(II) abhängigen HDAC Subfamilien hemmt. Die Selektivität vieler publizierter JmjC Demethylase Inhibitoren ist unbekannt, was ihren gezielten Einsatz erschwert. 21

34 1. Einleitung Tab. 1 2: Struktur des Cofaktors α KG sowie publizierter JmjC Demethylase Inhibitoren α KG NOG (Rose et al. 2008) DMOG (Hamada et al. 2009) SAHA (Rose et al. 2008) Methylstat (Luo et al. 2011) Inhibitor von Suzuki et al. (Suzuki et al. 2013) Inhibitor von Itoh et al. (Itoh et al. 2015) Daminozid (Rose et al. 2012) 2,4 PDCA (Rose et al. 2008) GSK J1 (Kruidenier et al. 2012) JIB 04 ((E) Stereoisomer) (Wang et al. 2013) 22

35 1.3. Jumonji C Domäne enthaltende Demethylasen 2,2' Bipyridin von Chang et al. (Chang et al. 2011) Triazolylpyridin von England et al. (England et al. 2014) IOX1 (King et al. 2010) ML 324 (Rai et al. 2012) PBIT (Sayegh et al. 2013) Einer der ersten publizierten JmjC Demethylase Inhibitoren ist N Oxalylglycin (NOG), welches sich in nur einem Atom von α KG unterscheidet. Der IC 50 an JMJD2E beträgt 78 µm (Rose et al. 2008). Wie α KG chelatisiert auch NOG das Eisen(II) Ion im aktiven Zentrum der JmjC Demethylasen über die Carbonsäure Gruppe in Position 1 und die Ketogruppe in α Position. Über die zweite Carbonsäure Gruppe gehen beide Substanzen Wasserstoff Brückenbindungen mit Aminosäuren des aktiven Zentrums ein. Für JMJD2A sind dies beispielsweise Tyrosin in Position 132 und Lysin in Position 206 (vergleiche Abb. 1 7) (Chen et al. 2006). NOG inhibiert JmjC Demethylasen vermutlich, indem es die Bindung von molekularem Sauerstoff an das Eisen(II) Ion verhindert (Thinnes et al. 2014). Da die Substanz als Dicarbonsäure auf Grund ihrer negativen Ladung bei physiologischem ph Wert die Zellmembran nur schlecht überwinden kann, wurde ein Prodrug in Form eines Diesters hergestellt. Dabei handelt es sich um ein gängiges Konzept der Prodrugherstellung für Carbonsäuren. Der lipophilere Ester dringt in die Zelle ein und wird von intrazellulären Esterasen gespalten, so dass es zur Freisetzung des Inhibitors kommt (Sinkula & Yalkowsky 1975). In vielen Fällen sind die Prodrugs zusätzlich selbst schwache Inhibitoren des Zielenzyms. Das Prodrug Dimethyl N oxalylglycin (DMOG) steigert in einer Konzentration von 2,5 mm die Menge an H3K9me3 und H3K36me3 23

36 1. Einleitung sowohl in untransfizierten als auch in mit JMJD2C transfizierten Zellen der humanen embryonischen Nierenzelllinie 293T. Der Nachweis erfolgte im Western Blot (Hamada et al. 2009). Die Behandlung von humanen Fibroblasten mit DMOG bei gleichzeitiger Infektion mit dem Virus Herpes simplex führt zu einer abgeschwächten Expression viraler Gene und verminderter Viruslast. In den Trigeminal Ganglien der Maus bewirkt DMOG eine verminderte Aktivierung latenter Viren (Liang et al. 2013). In dem gleichen Screening für JmjC Demethylase Inhibitoren, aus dem NOG hervorging, wurden auch zwei Verbindungen mit Hydroxamsäure Gruppe als JmjC Demethylase Inhibitoren entdeckt. Es handelte sich um die als HDAC Hemmstoffe bekannten Substanzen Trichostatin A (TSA) und SAHA. Ähnlich wie sie das Zink(II) Ion im aktiven Zentrum der HDACs über ihre Hydroxamsäure Gruppe chelatisieren, binden sie vermutlich auch an das Eisen(II) Ion im aktiven Zentrum der JmjC Demethylasen. Der IC 50 gegenüber JMJD2E beträgt 28,4 µm für TSA und 14 µm für SAHA (Rose et al. 2008). Das Strukturmotiv der Hydroxamsäure Gruppe wurde bei der Entwicklung weiterer JmjC Demethylase Inhibitoren übernommen. Der Inhibitor Methylstat weist eine Hydroxamsäure Gruppe auf, die in einem α KGanalogen Molekülteil enthalten ist. Über ein Verbindungsstück ist sie mit einem Substratmimetikum verbunden. Methylstat ist somit einer der wenigen JmjC Demethylase Inhibitoren, der sowohl den Cofaktor als auch das Substrat der Enzyme nachahmt. Es handelt sich wiederum um einen Methylester, der als Prodrug einer Carbonsäure eingesetzt wird. Der IC 50 der freien Säure beträgt für JMJD2C 3,4 µm, andere JmjC Demethylasen und Prolylhydroxylasen werden ebenfalls inhibiert. Die Substanz wirkt zytotoxisch auf die Ösophaguskarzinom Zelllinie KYSE 150. Sie erhöht H3K4me3 und H3K9me3 in KYSE 150 Zellen in der Immunfluoreszenz Mikroskopie und im Western Blot. Außerdem erhöht sie H3K9me3 in mit JMJD2C transfizierten Zellen der Zervixkarzinom Zelllinie HeLa in der Immunfluoreszenz Mikroskopie. In murinen Myoblasten der Zelllinie C2C12 verhindert Methylstat die Entwicklung zu Myotuben, welche durch UTX vermittelt wird (Luo et al. 2011). Im Folgenden wurde das Strukturmotiv der Hydroxamsäure Gruppe von zwei Arbeitsgruppen weiterentwickelt. Ihre Inhibitoren tragen am Stickstoffatom der Hydroxamsäure Gruppe einen 2 Carboxyethyl Rest. Dieser wurde in Analogie zur zweiten Carbonsäure Gruppe in α KG und NOG in die Moleküle eingeführt, welche mit Aminosäuren im aktiven Zentrum Wasserstoffbrücken Bindungen eingeht (Suzuki et al. 2013). 24

37 1.3. Jumonji C Domäne enthaltende Demethylasen Der von Suzuki et al. entdeckte Inhibitor mit interner Hydroxamsäure Funktion ist selektiv für JmjC Demethylasen der verwandten KDM2 und KDM7 Subfamilien. Der IC 50 Wert beträgt 6,8 µm für JHDM1A und 1,2 µm für PHF8. Für JmjC Demethylasen anderer Subfamilien übersteigt er 50 µm. Die Selektivität liegt laut einer Docking Studie darin begründet, dass die Substanz über die Cyclopropan Gruppe hydrophobe Interaktionen mit JmjC Demethylasen der KDM2 und KDM7 Subfamilien eingeht, die bei anderen Subfamilien nicht möglich sind. Der Inhibitor erhöht die Dimethylierung an Histon H3 Lysin 27 in der murinen Neuroblastom Zelllinie N2a im Western Blot. Der Inhibitor unterdrückt das Wachstum von N2a, HeLa und KYSE 150 Zellen. In HeLa und KYSE 150 Zellen hat die Substanz zudem in Konzentrationen von 10 und 100 µm einen leichten Einfluss auf die Verteilung der Zellen auf die unterschiedlichen Phasen des Zellzyklus. Es kommt zu einer Abnahme des Anteils der Zellen in der G 2 /M Phase und zu einer Zunahme des Anteils der Zellen in der G 0 /G 1 Phase (Suzuki et al. 2013). Der von Itoh et al. entwickelte Inhibitor ist strukturell ähnlich, aber durch die veränderten Substituenten an der Aminogruppe selektiv für JARID1A gegenüber JMJD2C, JMJD1A und PHF8 mit IC 50 Werten von 3,3 µm für JARID1A und über 40 µm für die anderen untersuchten Enzyme. Die Selektivität für JARID1A wird laut einer Docking Studie durch die Bindung des Hexanyl Restes und der Methylgruppe in hydrophobe Taschen sowie durch eine Wasserstoffbrückenbindung des Stickstoffs zu Tyrosin 472 erreicht. Der Methylester der Verbindung erhöht H3K4me3 in der Bronchialkarzinom Zelllinie A549 in einer Konzentration von 100 µm geringfügig im Western Blot. Die Substanz wirkt allein nicht antiproliferativ, bei gemeinsamem Einsatz mit dem HDAC Inhibitor SAHA tritt jedoch eine synergistische Wirkung auf die Zellproliferation auf (Itoh et al. 2015). Der Inhibitor Daminozid inhibiert JHDM1B mit einem IC 50 von 1,5 µm und ist mindestens 60 fach selektiv für Mitglieder der KDM2 und KDM7 Subfamilien gegenüber anderen JmjC Demethylasen. Die Substanz wird als Wachstumsregulator bei Pflanzen eingesetzt. Kristallographische Studien ergaben, dass Daminozid das Eisen(II) Ion über die Carbonyl Gruppe sowie das dimethylierte Stickstoffatom des Carbonsäurehydrazids chelatisiert, während es über die Carbonsäure Gruppe weitere Interaktionen ähnlich denen der zweiten Carbonsäure Gruppe des α KGs eingeht. Die Selektivität wird wahrscheinlich dadurch erreicht, dass die beiden Methylgruppen durch eine hydrophobe Tasche aufgenommen werden, die bei den KDM2 und KDM7 Subfamilien konserviert auftritt und bei den anderen Subfamilien eine höhere Hydrophilie aufweist (Rose et al. 2012). 25

38 1. Einleitung Ein weiteres Strukturmotiv, das in mehreren JmjC Demethylase Inhibitoren vorkommt, ist ein Pyridinring. Die Bindung des Eisen(II) Ions im aktiven Zentrum der Demethylasen erfolgt dann über das freie Elektronenpaar des Stickstoffs im Pyridinring sowie eine weitere Gruppe (Thinnes et al. 2014). Die erste Substanz mit diesem Strukturmotiv war 2,4 Pyridindicarbonsäure (englisch pyridine 2,4 dicarboxylic acid, 2,4 PDCA). Es handelt sich um ein Analogon des Cofaktors α KG. Die Substanz chelatisiert das Eisen(II) Ion der Demethylasen über das freie Elektronenpaar des Stickstoffs im Pyridinring sowie die Carbonsäure Gruppe in Position 2. Sie war bereits vor ihrer Beschreibung als JmjC Demethylase Inhibitor bekannt als Inhibitor der ebenfalls α KG abhängigen Prolylhydroxylasen. Ihr IC 50 an JMJD2E beträgt 1,4 µm (Rose et al. 2008). Die Dimethyl und Diethylester von 2,4 PDCA erhöhen in einer Konzentration von 0,3 mm das Level an H3K9me3 in 293T Zellen, die JMJD2A überexprimieren. Dies wurde mittels Massenspektrometrie und Western Blot nachgewiesen (Mackeen et al. 2010) wurde GSK J1 als selektiver Inhibitor der KDM6 Subfamilie veröffentlicht. Die Substanz enthält einen Pyridin und einen Pyrimidinring, über die sie das Eisen(II) Ion chelatisiert. Sie trägt zusätzlich eine 2 Carboxyethyl Gruppe, die ebenfalls bei den Inhibitoren mit Hydroxamsäure Gruppe als Strukturmotiv vorkommt. GSK J1 inhibiert JMJD3 mit einem IC 50 von 60 nm und verhält sich dabei kompetitiv zu α KG. Mit GSK J2, der Pyridin 3 yl Verbindung, steht eine Negativkontrolle zur Verfügung. Der Methylester von GSK J1, GSK J4, erhöht in einer Konzentration von 25 µm im Immunfluoreszenz Mikroskopie Experiment das Level an trimethyliertem Lysin 27 in Histon H3 (H3K27me3) in mit JMJD3 transfizierten und in untransfizierten HeLa Zellen. Außerdem unterdrückt GSK J4 die Produktion des Entzündungsmediators TNF α durch Makrophagen von gesunden Probanden und Patienten mit rheumatoider Arthritis nach Aktivierung mit Lipopolysacchariden (Kruidenier et al. 2012). Später wurde gezeigt, dass GSK J1 auch JARID1B und JARID1C inhibiert, wobei die Substanz um den Faktor 5 bis 10 potenter an JMJD3 ist (Heinemann et al. 2014). Ebenso wie DMOG hemmt GSK J4 die Reaktivierung latenter Herpesviren aus den Trigeminal Ganglien der Maus (Messer et al. 2015). Des Weiteren hebt GSK J4 das Wachstum von Hirnstammgliom Zelllinien, die eine Mutation des Lysins in Position 27 der Histonvariante H3.3 zum Methionin tragen, in einem klonogenen Assay vollständig auf. Auf das Wachstum von Zelllinien, die die Mutation nicht tragen, hat die Substanz in dem Assay keinen Einfluss. Das Wachstum orthotopischer Xenograft Tumore, die die Mutation tragen, wird durch Gabe von GSK J4 ebenfalls 26

39 1.3. Jumonji C Domäne enthaltende Demethylasen gehemmt, wobei sich auch die Überlebenszeit der Versuchstiere signifikant verlängert (Hashizume et al. 2014). Der Inhibitor JIB 04 ähnelt 2,4 PDCA und dem Pyridylpyrimidin GSK J1 insofern, als dass es auch ein Pyridin sowie ein Heteroatom im Abstand von drei Atomen zum Stickstoff des Pyridins enthält, über die eine Chelatisierung des Eisen(II) Ions erfolgen kann (Thinnes et al. 2014). Die Substanz wurde in einem allgemeinen zellulären Screening für epigenetische Modulatoren entdeckt. In dem Locus Derepression genannten System wird die durch Substanzen hervorgerufene Reaktivierung eines unter normalen Wachstumsbedingungen nicht exprimierten Gens beobachtet. Nach seiner Identifikation wurde der Wirkmechanismus von JIB 04 durch Microarrayuntersuchungen des Transkriptoms von behandelten Zellen und den Vergleich mit publizierten Datensätzen als Inhibition der JmjC Demethylasen aufgeklärt. In vitro inhibiert das (E) Stereoisomer JARID1A mit einem IC 50 von 230 nm. Das (Z) Stereoisomer ist inaktiv, vermutlich weil es gegenüber dem Eisen(II) Ion auf Grund der Positionen seiner freien Elektronenpaare nicht als zweizähniger Ligand auftreten kann. Die IC 50 Werte anderer JmjC Demethylasen liegen im Bereich zwischen dem IC 50 an JARID1A und dem Zehnfachen dieses Wertes, so dass es sich bei JIB 04 um einen pan Inhibitor der JmjC Demethylasen handelt. Verwandte Enzymklassen werden nicht inhibiert. Zelllinien, die aus gesundem Gewebe entwickelt wurden, reagieren in einem Proliferationsassay deutlich unempfindlicher auf JIB 04 als Krebszelllinien. Die Demethylierung eines H3K9me3 Peptides erfolgt durch Extrakte von Zellen, die mit JIB 04 inkubiert wurden, schwächer als durch Kontrollextrakte. Im Xenograftmodel der Lungenkrebszelllinien H358 und A549 in der Maus senkt JIB 04 die Wachstumsgeschwindigkeit der Tumore und das Tumorgewicht am Ende des Experiments. Die Demethylaseaktivität im Tumorgewebe ist reduziert (Wang et al. 2013). Der Einfluss der Substanz auf zelluläre Histonmethylierungslevel ist nicht beschrieben. Ein weiterer potenter Inhibitor, der einen Pyridinring als Strukurelement trägt, ist die von Chang et al. publizierte Substanz mit 2,2' Bipyridin Grundgerüst. Der IC 50 gegenüber JMJD2E beträgt 110 nm. Eine zelluläre Aktivität wurde nicht nachgewiesen. Die Substanz chelatisiert das Eisen(II) Ion im aktiven Zentrum der JmjC Demethylasen über die freien Elektronenpaare der Stickstoffatome der Pyridine (Chang et al. 2011). Eine ähnliche Struktur weist außerdem das substituierte Triazolylpyridin von England et al. auf. Es inhibiert JHDM1B mit einem IC 50 von circa 60 nm und einer mindestens 30 fachen Selektivität gegenüber den anderen getesteten JmjC Demethylasen (England et al. 2014). 27

40 1. Einleitung 5 Carboxy 8 hydroxychinolin (IOX1) enthält statt eines Pyridins ein Chinolin als Grundgerüst. Die Chelatisierung des Eisen(II) Ions erfolgt bei dieser Verbindung über das freie Elektronenpaar des Stickstoffatoms des Chinolins sowie die Hydroxylgruppe. Die Carbonsäure Gruppe geht ähnlich wie bei α KG Interaktionen mit Aminosäuren des aktiven Zentrums ein. Dies wird durch eine Kristallstruktur mit JMJD2A belegt. Der IC 50 der Substanz an JMJD2E beträgt 0,2 µm. Die Substanz inhibiert auch andere α KGabhängige Dioxygenasen. Für die Testung der zellulären Aktivität der Verbindung und anderer Substanzen entwickelten King et al. einen Immunfluoreszenz Mikroskopiebasierten Assay, in dem mit JMJD2A transfizierte HeLa Zellen mit den zu testenden Verbindungen inkubiert werden und dann das Ausmaß an H3K9me3 bestimmt wird. IOX1 erreicht in diesem Assay einen halbmaximalen Effekt bei einer Konzentration von 86,5 ± 1,16 µm (King et al. 2010). Die Veresterung der Carboxylgruppe erhöht die zelluläre Potenz, wobei der n Octylester mit einer Verbesserung um circa den Faktor 30 gegenüber IOX1 am wirksamsten ist (Schiller et al. 2014). Der Inhibitor ML 324 trägt genauso wie IOX1 ein Hydroxychinolin Grundgerüst. Die Substanz inhibiert JMJD2E mit einen IC 50 von 0,92 µm. Sie wurde in den beiden auch zur Charakterisierung von DMOG eingesetzten Assays zur Expression viraler Gene in Fibroblasten bei Infektion mit dem Virus Herpes simplex sowie zur Virusaktivierung in den Trigeminal Ganglien der Maus unter Inhibitorbehandlung getestet. Die Verbindung ist in beiden Experimenten deutlich potenter als DMOG. Sie unterdrückt die Expression viraler Gene mit einem IC 50 von circa 10 µm, während der Wert für DMOG bei 750 µm liegt. (Rai et al. 2012). N Phenylbenzisothiazolinon (PBIT) inhibiert JARID1B mit einem IC 50 von circa 3 µm. JMJD3 und UTX werden bei einer Konzentration von 10 µm nicht inhibiert. Postuliert ist, dass die Inhibition ähnlich wie bei dem verwandten Inhibitor Ebselen über die Entfernung von Zink(II) aus dem Enzym verläuft (Thinnes et al. 2014). PBIT erhöht H3K4me3 in mit JARID1B transfizierten HeLa Zellen in der Immunfluoreszenz Mikroskopie und in MCF 7 Zellen im Western Blot. Das Level an JARID1B in verschiedenen Zelllinien korreliert mit der Toxizität von PBIT für die Zellen (Sayegh et al. 2013). Weitere Inhibitorklassen schließen andere Zink(II) aus Proteinen entfernende Substanzen, das durch Reduktion aus α KG hervorgehende 2 Hydroxyglutarat, diverse Naturstoffe mit Flavonoid oder Catecholstruktur sowie Inhibitoren mit Peptidbestandteilen ein. Die Inhibitoren zeigen keine zelluläre Wirksamkeit oder sind auf Grund ihrer Promiskuität oder ihres physiologischen Vorkommens nicht als JmjC Demethylase Inhibitoren 28

41 1.4. Zelluläre Testsysteme in der Wirkstofffindung einsetzbar, liefern aber Aufschlüsse über mögliche Bindungsstellen, die mit Inhibitoren angegriffen werden können sowie zusätzliche Wirkungen bekannter Substanzen (Hoffmann et al. 2012). 2 Hydroxyglutarat, das in Gliomzellen auf Grund von Mutationen der Isocitratdehydrogenasen entsteht und eine Differenzierung der Zellen verhindert, nimmt als Onkometabolit eine Sonderstellung ein (Lu et al. 2012) Zelluläre Testsysteme in der Wirkstofffindung Rolle zellulärer Assays im Prozess der Wirkstofffindung Die Identifizierung biologisch aktiver Substanzen mit dem Ziel des Einsatzes als Sonde in der Erforschung physiologischer oder pathophysiologischer Zustände oder als Arzneistoff ist ein mehrstufiger Prozess, der auf unterschiedliche Arten angegangen werden kann. Beim häufig eingesetzten targetbasierten Verfahren (Abb. 1 9) wird im ersten Schritt eine Zielstruktur ausgewählt. Dies kann beispielsweise mittels Knockdown Experimenten oder Untersuchungen der Expressionslevel in unterschiedlichen Geweben erfolgen. Als Zielstruktur kommen unter anderem Rezeptoren auf der Zelloberfläche, Ionenkanäle, Enzyme oder nukleäre Rezeptoren in Frage. Statt von einer Zielstruktur kann auch von einem Effekt ausgegangen werden, den die zu identifizierende Substanz in einem Modellsystem auslösen soll. Dies ist besonders dann sinnvoll, wenn der Mechanismus, über den der Effekt ausgelöst wird, nicht bekannt ist oder der Effekt über mehrere unterschiedliche Mechanismen ausgelöst werden kann und der Experimentator sich nicht auf einen dieser Mechanismen festlegen möchte. Abb. 1 9: Prozess der targetbasierten Wirkstofffindung 29

42 1. Einleitung Im nächsten Schritt werden bei beiden Verfahren die im Screeningprozess zu testenden Substanzen bestimmt. Dabei kann es sich um eine große Anzahl Substanzen aus einer nicht vorsortierten Bibliothek, um im virtuellen Screening ausgewählte Substanzen oder um Fragmente handeln, die später zu einem Inhibitor kombiniert werden. Im Folgeschritt wird die Potenz und Selektivität der ausgewählten Substanzen in vitro in Aktivitäts oder Bindungsassays bestimmt. Inaktive Substanzen werden verworfen, während aktive Substanzen die jeweils nächste Teststufe erreichen. Dabei werden meist mehrere, sich ergänzende Assays eingesetzt. Es schließen sich Tests an Zellen in Kultur an, die erste Erkenntnisse über das Verhalten der Testsubstanzen in vivo liefern. Die in den Invitro und den Zellkulturexperimenten gewonnenen Informationen fließen in die Auswahl oder das Design neuer Testsubstanzen ein. Meist sind mehrere iterative Zyklen der Substanzauswahl, In vitro Testung und zellulären Testung notwendig, bis ein Inhibitor mit der gewünschten Potenz und Selektivität identifiziert ist. Je nach geplantem Einsatzgebiet folgt eine weitere Charakterisierung der Kandidatenverbindungen in aufwendigeren Zellkulturexperimenten, in Experimenten an Versuchstieren und in klinischen Studien (Wu 2010; Jung 2013) Arten zellbasierter Bioassays Für zellbasierte Bioassays stehen Primärzellen sowie eine Vielzahl etablierter Zelllinien zur Verfügung. Es können pflanzliche, tierische und menschliche Zellen in gesundem oder pathologisch verändertem Zustand in Kultur gehalten und für Experimente eingesetzt werden. Zelllinien haben dabei gegenüber Primärzellen die Vorteile der besseren Verfügbarkeit und größeren Homogenität über die Zeit. Im Gegensatz dazu haben Primärzellen in Kultur eine höhere Ähnlichkeit mit Zellen in ihrer natürlichen Umgebung als Zelllinien. Vor dem Einsatz in Experimenten kann eine Modifikation der Zellen beispielsweise durch Transfektion mit einem Plasmid oder Vorbehandlung mit einem Hemmstoff erfolgen. Dies geschieht meist mit dem Ziel, das Messfenster zu vergrößern oder eine Messung überhaupt erst zu ermöglichen. Beispielsweise kann ein Plasmid für einen Reportergenassay in die Zellen eingebracht werden. Zelluläre Testsysteme werden nach der Reihenfolge des Auftretens der untersuchten Effekte in vier Kategorien eingeteilt: (1) Targetbasierte Assays messen Effekte, die sich direkt aus der Interaktion der Testsubstanz mit ihrer Zielstruktur ergeben, wie beispielsweise die Akkumulation eines Substrates nach Inhibition eines Enzyms. (2) Intermediäre Veränderungen in der Zelle wie eine ablaufende Signalkaskade können in 30

43 1.4. Zelluläre Testsysteme in der Wirkstofffindung Assays der zweiten Kategorie untersucht werden, sofern sie bekannt sind. (3) In funktionellen Assays werden nachgeschaltete Veränderungen auf Ebene der Transkription und Translation untersucht. Ein Beispiel stellt die Bestimmung eines sekretierten Proteins dar. (4) Phänotypische Assays messen Effekte, welche die ganze Zelle betreffen, unter anderem Veränderungen der Zellmorphologie, der Proliferation und des Transkriptoms. Die Messung kann bei allen Testarten je nach Methode kontinuierlich oder als Endpunktmessung durchgeführt werden. Welche Art von Test am besten geeignet ist, hängt von der individuellen Fragestellung ab. Häufig wird eine Kombination aufeinander aufbauender Tests eingesetzt. Im Gegensatz zu am isolierten Enzym durchgeführten In vitro Tests geben zelluläre Untersuchungen Aufschluss darüber, ob die Kandidatenverbindungen unter Bedingungen ähnlich den physiologischen Bedingungen chemisch stabil sind, die Zellmembran erfolgreich überwinden und ihre Zielstruktur auch innerhalb der zellulären Matrix effektiv erkennen. Gemessen wird dabei in den meisten Fällen der Gesamteffekt der Inhibitoren, so dass bei Unwirksamkeit eines Inhibitors nur Vermutungen darüber angestellt werden können, worin diese begründet liegt (Wu 2010; Jung 2013) Zellbasierte Bioassays für Inhibitoren der JmjC Demethylasen Für die zelluläre Testung neuer In vitro Inhibitoren der JmjC Demethylasen stehen verschiedene Ansätze zur Verfügung: Es können in der Literatur beschriebene Testsysteme nachgearbeitet werden, es können Standardmethoden oder kommerziell erhältliche Kits besonders für Viablitäts, Proliferations und Zytotoxizitätsassays eingesetzt werden und es besteht die Möglichkeit, aus publizierten Experimenten zur physiologischen oder pathophysiologischen Funktion der JmjC Demethylasen Testmethoden zu entwickeln. Da die Inhibitorforschung für diese Enzymklasse insgesamt wenig vorangeschritten ist, existieren in dem Feld noch keine allgemein üblichen Methoden zur Charakterisierung neuer Hemmstoffe. Beispielsweise ist nicht bekannt, ob an JmjC Demethylasen aktive Substanzen grundsätzlich zu einer verminderten Zellproliferation in bestimmten Krebszelllinien führen oder ob es auch Inhibitoren geben kann, die nicht antiproliferativ wirken. An zelluläre Testsysteme für JmjC Demethylase Inhibitoren sind die für Assays üblichen Anforderungen zu stellen. Diese schließen unter anderem eine hohe Richtigkeit und Präzision, ein ausreichendes Messfenster sowie eine gute Robustheit und Reprodu 31

44 1. Einleitung zierbarkeit ein (Wu 2010). Die Erfüllung dieser Anforderungen kann durch Testung von Referenzinhibitoren sowie die wiederholte Testung derselben Substanz überprüft werden. Zur Charakterisierung der publizierten Inhibitoren wurden hauptsächlich zelluläre Effekte untersucht, die direkt am Anfang oder weit am Ende des nach Hemmstoffbehandlung ablaufenden Prozesses stehen. Die entsprechenden zellbasierten Assays gehören den Kategorien (1) bzw. (4) an. Durch die Interaktion des Inhibitors mit dem aktiven Zentrum der Demethylasen kommt es zu einer Anhäufung des Substrates, eines di oder trimethylierten Lysins innerhalb eines Histonproteins. Das Substrat kann mittels Massenspektrometrie, Western Blot oder Immunfluoreszenz Mikroskopie quantitativ oder semi quantitativ untersucht werden, woraufhin dann eine Aussage über die Effektivität der Inhibition der betreffenden JmjC Demethylasen getroffen werden kann. Der am häufigsten untersuchte Effekt auf den Phänotyp ist die antiproliferative Wirkung auf Krebszelllinien. Die meisten Inhibitoren, die sich in anderen zellbasierten Assays gegenüber JmjC Demethylasen als wirksam erwiesen haben, wirken antiproliferativ auf Krebszellen. Lediglich bei dem von Itoh et al. beschriebenen Inhibitor mit Hydroxamsäurestruktur tritt die antiproliferative Wirkung nur synergistisch mit einem HDAC Inhibitor auf. Weitere beschriebene phänotypische Effekte sind die Reduktion der Viruslast in Trigeminal Ganglien, die Verringerung der Entwicklung von Myoblasten zu Myotuben, die Hemmung der TNF α Produktion durch Makrophagen sowie die Verlängerung der Tumorgröße und der Überlebenszeit von Versuchstieren in Xenograftexperimenten (vergleiche Kapitel 1.3.4). Die Etablierung zellbasierter Assays für neue Inhibitoren der JmjC Demethylase birgt beispielsweise im Vergleich zu entsprechenden Assays für HDAC Inhibitoren Schwierigkeiten, die in der Natur der untersuchten Enzymklasse und ihrer Zielstrukturen liegen. So beträgt die Halbwertszeit trimethylierter Lysinreste in Histonproteinen im zellulären Kontext 18 bis 25 Stunden (Byvoet et al. 1972), so dass für das Auftreten einer nachweisbaren Akkumulation eine Inhibitorbehandlung von 48 bis 72 Stunden nötig ist. In dieser Zeitspanne treten jedoch auch sofern vorhanden antiproliferative und zytotoxische Effekte der Inhibitoren auf, die dosislimitierend wirken können. Des Weiteren ähneln sich die einzelnen Methylierungsstufen eines bestimmten Lysins stark in ihrer Raumstruktur und gleichen sich in ihrer Ladung, so dass kommerziell erhältliche Antikörper teilweise neben dem deklarierten Antigen auch andere Methylierungsstufen ihrer Zielstruktur erkennen und eine für manche Anwendungen nicht ausreichende Selektivität aufweisen. Die große Redundanz der JmjC Demethylasen sowie die unsichere Datenlage, welche Veränderungen der Histonmethylierung durch eine Inhibitor 32

45 1.4. Zelluläre Testsysteme in der Wirkstofffindung behandlung zu erwarten sind und ob in manchen Fällen vielleicht nur lokale statt globale Veränderungen auftreten, stellen weitere Herausforderungen bei der Testung neuer JmjC Demethylase Inhibitoren in zellbasierten Assays dar. 33

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47 2. Fragestellung Im Rahmen dieser Arbeit sollte die zelluläre Potenz neuer Inhibitoren der JmjC Demethylasen untersucht werden. Bei den Testsubstanzen handelte es sich um in unserer Arbeitsgruppe entwickelte Inhibitoren mit nachgewiesener Aktivität in vitro. In einem ersten Schritt sollten mögliche Testsysteme für die Testung von Inhibitoren der JmjC Demethylasen an Zelllinien identifiziert und in unserem Labor etabliert werden. Mögliche Ansätze waren die Übertragung von Testsystemen für Inhibitoren anderer chromatinmodifizierender Enzyme auf JmjC Demethylasen, die Nacharbeitung publizierter Berichte über zelluläre Effekte der ersten JmjC Demethylase Inhibitoren oder die Nutzung der in Knockdown Experimenten beschriebenen Effekte. Angestrebt wurde eine Kombination von Testsystemen, die die zelluläre Testung von circa 20 bis 50 neuen Inhibitoren ermöglichen sollte. Dabei sollten nach Möglichkeit zellbasierte Assays unterschiedlicher Kategorien eingesetzt und beispielsweise die Substratakkumulation als direktes Ergebnis der Enzyminhibition, der Einfluss auf die Genexpression und nachgeschaltete Veränderungen des Phänotyps untersucht werden. Die Überprüfung der Testmethoden auf ihre Eignung sollte mithilfe der publizierten Hemmstoffe erfolgen. Im zweiten Schritt sollte die eigentliche Testung der In vitro Inhibitoren auf ihre zelluläre Potenz hin durchgeführt werden. Je nach Aufwendigkeit einer Testmethode bestand die Möglichkeit, alle Inhibitoren oder nur die Vertreter jeder Inhibitorklasse zu testen, für welche die höchste zelluläre Potenz erwartet wurde. Zeigte sich ein zellulärer Effekt einer Inhibitorklasse, konnten dann die anderen Vertreter noch nachträglich getestet werden. Die gewonnen Informationen sollten in die Weiterentwicklung der JmjC Demethylase Inhibitoren unserer Arbeitsgruppe einfließen. In einem letzten Schritt sollte ein Beitrag zum Verständnis der zellulären Wirkungsweise der JmjC Demethylase Inhibitoren geleistet werden. Hierzu sollte in einem Microarray Experiment untersucht werden, welche Veränderungen der Genexpression sich nach Behandlung mit unterschiedlichen JmjC Demethylase Inhibitoren in Zellen ergeben. Anhand dieser Daten sollte ermittelt werden, welche Enzyme gleichzeitig mit JmjC Demethylasen inhibiert werden können, um eine stärkere antiproliferative Wirkung auf Krebszelllinien zu erzielen. 35

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49 3. Neue In vitro Inhibitoren der JmjC Demethylasen Im Folgenden werden die In vitro Inhibitoren der JmjC Demethylasen vorgestellt, die in unserer Arbeitsgruppe identifiziert wurden. Die Substanzen wurden wie jeweils angegeben von anderen Mitgliedern der Arbeitsgruppe entwickelt, synthetisiert und auf ihre In vitro Aktivität getestet. Sie werden ausführlich mit ihren Strukturen und IC 50 Werten vorgestellt, da diese für ihre zelluläre Wirksamkeit entscheidend sind. Die Untersuchung der zellulären Potenz der Inhibitoren, welche Ziel dieser Arbeit war, ist in Kapitel 4 beschrieben. Präsentiert werden jeweils die Vertreter jeder Substanzklasse, die auf Grund ihrer hohen Potenz und unter Berücksichtigung ihrer physikochemischen Eigenschaften für die zelluläre Testung ausgewählt wurden. Da die Optimierung der Inhibitoreigenschaften sowie das Aufstellen der Struktur Wirkungs Beziehungen von anderen Mitarbeitern der Arbeitsgruppe durchgeführt wurden, sind sie nur an den Stellen erwähnt, wo sie die zu erwartende zelluläre Wirksamkeit betreffen. Eine ausführliche Darstellung kann den jeweiligen Publikationen sowie der Dissertation von Martin Roatsch (in Vorbereitung) entnommen werden Entdeckung Die Grundstrukturen der in unserer Arbeitsgruppe identifizierten Inhibitoren der JmjC Demethylasen wurden mittels rationalem Design entwickelt oder stammen aus virtuellem Screening. Manche Strukturen wurden zudem durch das Screening einer fokussierten Substanzbibliothek entdeckt. Das virtuelle Screening sowie Docking Studien wurden durch Mitglieder der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Wolfgang Sippl an der Martin Luther Universität in Halle Wittenberg vorgenommen. Die In vitro Testung an JmjC Demethylasen, die Optimierung der entdeckten Leitstrukturen und die Synthese kommerziell nicht erhältlicher Verbindungen wurden in unserer Arbeitsgruppe von Martin Roatsch, Dr. Ludovica Morera und Dr. Alexander Hauser durchgeführt. Die Bestimmung der IC 50 Werte gegenüber JMJD2A und JARID1A erfolgte mithilfe des kommerziell erhältlichen Lanthanide Chelate Excite Ultra Assays (LANCEUltra Assay, PerkinElmer). Dabei wird ein biotinyliertes, trimethyliertes Peptid durch eine JmjC Demethylase umgesetzt, sofern diese Reaktion nicht durch die Testsubstanz verhindert 37

50 3. Neue In vitro Inhibitoren der JmjC Demethylasen wird. Nach einer vorgegebenen Inkubationszeit wird die Reaktion mit einem Überschuss an Ethylendiamintetraacetat gestoppt und eine Detektionslösung zugesetzt. Diese enthält einen Antikörper, der gegen das Produkt der Demethylierungsreaktion gerichtet ist, und eine Sonde, ULight, die an Streptavidin gebunden ist. Der Antikörper trägt einen Europium Komplex. Vermittelt durch Streptavidin und Biotin binden Sonde und Peptid aneinander. Im Fall des demethylierten Peptids gelangen so der Antikörper und die Sonde in direkte räumliche Nähe zueinander. Zur Messung wird der Europium Komplex mit Licht der Wellenlänge 340 nm angeregt. Es findet ein Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) zwischen dem Europium Komplex und der Sonde statt. Diese emittiert Licht der Wellenlänge 665 nm, welches detektiert wird (Abb. 3 1). Da ein FRET abhängig von den eingesetzten Donor und Akzeptormolekülen über Distanzen bis maximal 10 nm hinweg auftritt, führt nur das demethylierte Peptid zu einem Fluoreszenzsignal (Stryer 1978). Das Signal ist somit proportional zum Umsatz des Enzyms während der Inkubationszeit und erlaubt die Bestimmung des IC 50 Wertes der getesteten Inhibitoren. Als Substrat wird für JMJD2A ein biotinyliertes H3K9me3 Peptid und für JARID1A ein biotinyliertes H3K4me3 Peptid eingesetzt (Rodenbrock et al. 2011). Die Ergebnisse wurden für JMJD2A durch Testung in einem zweiten, orthogonalen Assay abgesichert. In diesem wird der Umsatz über eine Quantifizierung des Formaldehyds bestimmt, das bei der Demethylierungsreaktion als Koppelprodukt entsteht (Sakurai et al. 2010). Abb. 3 1: Prinzip des LANCE Ultra Assays Ein trimethyliertes, biotinyliertes Peptid (blau, Methylgruppen als rote Rauten dargestellt) wird durch eine JmjC Demethylase demethyliert. Das Produkt der Reaktion erkennt ein Europiummarkierter Antikörper (grau). Eine Sonde (orange) bindet über Streptavidin (violett) an Biotin (B), so dass bei Einstrahlung von Licht der Wellenlänge 340 nm ein FRET zwischen Europium und der Sonde auftritt. Es folgt die Emission von Licht der Wellenlänge 665 nm durch die Sonde (PerkinElmer 2015). 38

51 3.2. Strukturen und Aktivität der Inhibitoren Für eine Gruppe an neuen Inhibitoren wurde zusätzlich die Aktivität gegenüber HDACs in einem homogenen, fluoreszenzbasierten Assay bestimmt. Dabei wird ein acetyliertes Substrat, Z (ε Acetyl)lysin 7 amino 4 methylcoumarin (ZMAL), durch HDACs umgesetzt und anschließend durch die Endopeptidase Trypsin gespalten. Die Spaltung setzt das Fluorophor 7 Amino 4 methylcoumarin (AMC) frei. Nicht desacetyliertes Substrat wird durch Trypsin nicht gespalten. Die Konzentration an AMC wird fluorimetrisch bei einer Anregungswellenlänge von 390 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm bestimmt (Abb. 3 2). Sie ist proportional zur Aktivität der HDACs im Reaktionsansatz und erlaubt somit die Ermittlung des IC 50 Wertes eines Inhibitors (Wegener et al. 2003; Heltweg et al. 2003; Heltweg et al. 2005). HDAC ZMAL Trypsin Trypsin Abb. 3 2: Prinzip des fluoreszenzbasierten Assays zur Bestimmung der HDAC Inhibition Das Substrat ZMAL wird durch HDACs desacetyliert und kann dann durch die Peptidase Trypsin gespalten werden. AMC, ein Produkt dieser Reaktion, weist andere Fluoreszenzeigenschaften auf als das Substrat und wird bei einer Anregungswellenlänge von 390 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm fluorimetrisch bestimmt (Hauser et al. 2013). AMC 3.2. Strukturen und Aktivität der Inhibitoren Der Inhibition der JmjC Demethylasen liegt in vielen Fällen eine Chelatisierung des Eisen(II) Ions im aktiven Zentrum der Demethylasen zugrunde (vergleiche Kapitel 1.3.4). In unserer Arbeitsgruppe wurden deshalb überprüft, ob die im Handel befindlichen 39

52 3. Neue In vitro Inhibitoren der JmjC Demethylasen Eisenchelatoren Deferoxamin und Deferasirox JMJD2A hemmen. Die Substanzen werden therapeutisch für die Behandlung der chronischen Eisenüberladung zum Beispiel auf Grund häufiger Bluttransfusionen eingesetzt (Sheth 2014). Die Chelatisierung eines Eisen Ions erfolgt bei Deferoxamin über die Hydroxamsäuregruppen, wobei das Molekül das Eisen Ion über sechs freie Elektronenpaare gleichzeitig koordinieren kann. Deferasirox ist ein dreizähniger Ligand. Es bindet ein Eisen Ion über die freien Elektronenpaare der Sauerstoffatome der beiden Hydroxylgruppen sowie das freie Elektronenpaar des räumlich am nächsten gelegenen Stickstoffatoms. Beide Substanzen hemmen JMJD2A mit IC 50 Werten im niedrigen mikromolaren Bereich (Tab. 3 1, Martin Roatsch, unveröffentlichte Ergebnisse). Auf Grund seiner rigideren Struktur wurde Deferasirox für die Derivatisierung ausgewählt. Es wurden mehrere Analoga hergestellt: MR04 fehlt die Carbonsäure Gruppe des Deferasirox. Die Substanz dient der Untersuchung, ob die Carbonsäure Gruppe für die Wirksamkeit des Deferasirox in vitro entscheidend ist. Zudem weist sie eine höhere Lipophilie auf als Deferasirox und könnte deshalb in Zellkulturexperimenten wirksamer sein, da sie die Zellmembran leichter überwindet und intrazellulär eine höhere Konzentration erreicht wird. Bei MR05 ist die Carbonsäure Gruppe durch einen Methylester ersetzt. Dabei wird das in Kapitel beschriebene Prodrug Konzept eingesetzt. Der lipophilere Ester soll die Zellmembran überwinden und in der Zelle durch unspezifische Esterasen gespalten werden, wodurch Deferasirox freigesetzt würde. Da Deferasirox auf Grund seiner negativen Ladung nur wenig aus der Zelle herausdiffundieren kann, sollte es zu einer Akkumulation des Inhibitors im Zellinneren kommen. MR23 und MR25 tragen Substituenten in para Stellung zu den Hydroxylgruppen. MR25 kann laut einer Docking Studie über das freie Elektronenpaar einer der Methoxy Gruppen Interaktionen mit dem Lysin in Position 206 von JMJD2A eingehen (Prof. Dr. Wolfgang Sippl, unveröffentlichte Ergebnisse). Alle Derivate des Deferasirox inhibieren JMJD2A mit ähnlichen IC 50 Werten wie die Ausgangssubstanz (Tab. 3 1, Martin Roatsch, unveröffentlichte Ergebnisse). In vitro haben die an der Struktur von Deferasirox vorgenommenen Veränderungen somit wenig Einfluss auf die Aktivität. Für MR04 und MR05 wäre eine Verschlechterung der IC 50 Werte im Vergleich zu Deferasirox denkbar gewesen, da MR04 die Carbonsäure Gruppe fehlt und MR05 speziell für die zelluläre Testung hergestellt wurde. Durch ein Docking Experiment wurde im Nachhinein bestätigt, dass die Carbonsäure Gruppe des Deferasirox keine spezifischen Wechselwirkungen mit Aminosäuren des aktiven Zentrums von JMJD2A eingeht (Prof. Dr. Wolfgang Sippl, unveröffentlichte Ergebnisse). Dies erklärt die ähnliche 40

53 3.2. Strukturen und Aktivität der Inhibitoren Tab. 3 1: Therapeutisch eingesetzte Eisenchelatoren und ihre Derivate Substanz Struktur IC 50 ± SD [µm] JMJD2A Deferoxamin 3,33 ± 0,48 Deferasirox 6,35 ± 0,57 MR04 5,27 ± 1,00 MR05 4,12 ± 0,13 MR23 5,12 ± 0,05 MR25 3,66 ± 0,11 Die Synthese der Verbindungen mit Ausnahme des Deferoxamin sowie ihre Testung an JMJD2A wurden von Martin Roatsch durchgeführt. Angegeben ist der Mittelwert zweier unabhängiger Experimente. 41

54 3. Neue In vitro Inhibitoren der JmjC Demethylasen Potenz von Deferasirox, MR04 und MR05 in vitro. MR25 ist Deferasirox möglicherweise bei der Anwendung an Zellen überlegen, da es in der zellulären Matrix vielleicht selektiver JmjC Demethylasen gegenüber anderen Enzymen hemmt, auch wenn die eingeführten Methoxy Gruppen in vitro nur zu einer schwachen Verbesserung führen. JMJD2A Inhibitoren mit Pyridylpyrimidin Grundstruktur wurden in Kollaboration mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Wolfgang Sippl an der Martin Luther Universität in Halle Wittenberg in einem virtuellen Screening für eisenbindende Motive entdeckt. Mit IC 50 Werten von unter 1 µm sind die besten Vertreter als sehr potente Hemmstoffe von JMJD2A zu bewerten. Laut Docking und Kristallisationsexperimenten chelatisieren die Inhibitoren über die freien Elektronenpaare des Stickstoffatoms im Pyridin und des Stickstoffatoms in Position 3 des Pyrimidins das Eisen(II) Ion im aktiven Zentrum von JMJD2A. Potente Vertreter der Klasse tragen in Position 4 des Pyridinrings eine Carboxylgruppe, die beispielsweise in JMJD2A Interaktionen mit Lysin in Position 206 und Tyrosin in Position 132 eingeht. Diese im Zellkulturmedium mit negativer Ladung vorliegende Gruppe erschwert die Überwindung der Zellmembran. Für Zellkulturversuche wurden deshalb wiederum die Methylester der potentesten Verbindungen synthetisiert, welche erwartungsgemäß JMJD2A in vitro schlechter hemmen als ihre Wirkformen. In Tabelle 3 2 ist jeweils der IC 50 des Prodrugs und der Carbonsäure als Wirkform aufgeführt (Martin Roatsch, Manuskript in Vorbereitung). Bei MR29 wurde statt des Methylesters ein Morpholinoethylester eingesetzt, um eine im Zellkulturmedium besser lösliche Verbindung zu erhalten. Dr. Ludovica Morera entwickelte in unserer Arbeitsgruppe einen HDAC Inhibitor mit Hydroxamsäure Funktion und Aktivität gegenüber JMJD2A dahingehend weiter, dass sich die Aktivität gegenüber HDACs verringerte, während die Aktivität gegenüber JmjC Demethylasen unverändert blieb oder sich verbesserte. Die Verbindungen weisen Biphenylalanin als Strukturelement auf. Die Hydroxamsäure Gruppe wurde in vielen Fällen ähnlich wie bei publizierten Inhibitoren um einen 2 Carboxyethyl Substituenten ergänzt, der Interaktionen mit Aminosäuren des aktiven Zentrums ähnlich denen, die α KG eingeht, ermöglichen soll (vergleiche Kapitel 1.3.4). Für die Länge des Verbindungsstücks zwischen den beiden Motiven erwiesen sich sieben bis acht Kohlenstoffatome als ideal. LM97 und LM101 stellen Methylester Prodrugs von LM75 bzw. LM105 dar. Alle Substanzen hemmen JMJD2A mit IC 50 Werten im niedrigen mikromolaren Bereich. Mit Ausnahmen von LM6 weisen sie eine gute Selektivität gegenüber HDAC1 und HDAC6 auf (Tab. 3 3, Dr. Ludovica Morera, Martin Roatsch, Johanna Senger, Manuskript in Vorbereitung). LM6 wurde als Kontrollsubstanz in manchen zellbasierten Assays mitgeführt. 42

55 3.2. Strukturen und Aktivität der Inhibitoren Tab. 3 2: Inhibitoren mit Pyridylpyrimidin Grundstruktur Substanz Struktur IC 50 ± SD [µm] JMJD2A MR ± 11 MR13 14,6 ± 1,4 IC 50 der Carbonsäure: 0,94 ± 0,05 IC 50 der Carbonsäure: 2,70 ± 0,29 MR18 3,38 ± 0,37 MR19 > 250 IC 50 der Carbonsäure: 0,37 ± 0,03 IC 50 der Carbonsäure: 0,45 ± 0,14 MR29 Nicht getestet IC 50 der Carbonsäure: 0,37 ± 0,03 Die Verbindungen wurden von Martin Roatsch synthetisiert und an JMJD2A getestet. Eine Publikation befindet sich derzeit in Vorbereitung. Angegeben ist der Mittelwert zweier unabhängiger Experimente. 43

56 3. Neue In vitro Inhibitoren der JmjC Demethylasen Tab. 3 3: Inhibitoren mit Hydroxamsäure Gruppe Substanz Struktur IC 50 ± SD [µm] oder Inhibition bei angegebener Konzentration JMJD2A HDAC1 HDAC6 LM6 8,11 ± 0,18 0,29 ± 0,16 0,14 ± 0,03 LM75 26,4 ± 1,4 LM97 11,0 ± 0,3 LM101 12,1 ± 0,5 LM105 8,75 ± 2,38 k. H. bei 10 µm 9 % bei 100 µm 2 % bei 10 µm 39 % bei 100 µm 16 % bei 10 µm 71 % bei 100 µm 9 % bei 10 µm 71 % bei 100 µm k. H. bei 10 µm 35 % bei 100 µm 10 % bei 10 µm 57 % bei 100 µm 8 % bei 10 µm 67 % bei 100 µm 11 % bei 10 µm 71 % bei 100 µm Die Verbindungen wurden von Dr. Ludovica Morera synthetisiert und von Martin Roatsch an JMJD2A getestet. Johanna Senger führte die Testungen an HDAC1 und HDAC6 durch. Eine Publikation befindet sich derzeit in Vorbereitung. Angegeben ist der Mittelwert zweier unabhängiger Experimente (JMJD2A) bzw. das Ergebnis einer Einzelmessung in Triplikaten (HDAC1 und HDAC6). K. H.: Keine Hemmung 44

57 3.2. Strukturen und Aktivität der Inhibitoren Der Inhibitor NR001 stammt von Nicole Rüger aus dem Arbeitskreis von Prof. Dr. Andreas Link an der Ernst Moritz Arndt Universität Greifswald (Tab. 3 4). Die Substanz kombiniert ein Carbonsäurehydrazid, das auch in Daminozid als Eisen(II) chelatisierende Gruppe vorkommt, mit einem Tetrazol, das als bioisostere Gruppe eine Carbonsäure Funktion ersetzt. Das Tetrazol soll ähnlich wie die zweite Carbonsäure Gruppe in α KG Bindungen zu dem Lysin in Position 206 sowie dem Tyrosin in Position 132 von JMJD2A ausbilden. Die Verbindung weist mit 142,1 g/mol ein Molekulargewicht auf, dass deutlich unter dem der meisten Wirkstoffe liegt. Es handelt sich somit um eine fragmentartige Verbindung, die möglicherweise der Optimierung durch die Einführung weiterer Molekülteile bedarf. Da sie jedoch bereits in dieser Form JMJD2A in vitro mit einem IC 50 von 2,38 ± 0,37 µm inhibiert (Rüger et al. 2015), wurde sie für die zelluläre Testung ausgewählt. Tab. 3 4: Inhibitor mit Tetrazol Grundstruktur Substanz Struktur IC 50 ± SD [µm] JMJD2A NR001 2,38 ± 0,37 Die Substanz wurde von Nicole Rüger im Arbeitskreis von Prof. Dr. Andreas Link an der Ernst Moritz Arndt Universität Greifswald synthetisiert und von Martin Roatsch an JMJD2A getestet (Rüger et al. 2015). Angegeben ist der Mittelwert zweier unabhängiger Experimente. Die Substanzen AH171 und AH174 wurden im Zuge des ersten Screening Verfahrens für Inhibitoren der JmjC Demethylasen in unserer Arbeitsgruppe entdeckt (Tab. 3 5). Es handelt sich um Dimethylester, die als Prodrugs eingesetzt werden. Die Dicarbonsäure von AH171 inhibierte JMJD2C in einer Konzentration von 10 µm in einem initialen Assay, bei dem die Detektion des umgesetzten Substrates über SDS PAGE und Western Blot erfolgt (unveröffentlichte Ergebnisse). Im LANCE Assay an JMJD2A wird dagegen keine Hemmung beobachtet, wobei Konzentrationen bis 100 µm getestet wurden (Martin Roatsch, unveröffentlichte Ergebnisse). In Zellkulturexperimenten rufen AH171 und AH174 bei einer Konzentration von 10 µm funktionelle und phänotypische Effekte hervor, die zu einer Hemmung der JmjC Demethylasen passen (vergleiche Kapitel 4.2). Auf Grund dieser zellulären Effekte wurden die Substanzen für die weitere, systematische Testung in zellbasierten Assays ausgewählt. 45

58 3. Neue In vitro Inhibitoren der JmjC Demethylasen Tab. 3 5: Prodrugs der Dicarbonsäuren Substanz Struktur AH171 AH174 Die Verbindungen wurden von Dr. Alexander Hauser synthetisiert. Um eine Vorstellung von der Subtypselektivität der JmjC Demethylase Inhibitoren unserer Arbeitsgruppe zu erhalten, wurden einzelne Vertreter jeder Substanzklasse zusätzlich in einem LANCE Assay für JARID1A getestet (Tab. 3 6). Die erhaltenen IC 50 Werte sind nicht direkt vergleichbar, da mehrere Assayparameter wie beispielsweise die Enzymkonzentration angepasst werden mussten. Es ist jedoch möglich, Trends abzuleiten: Während für die meisten Inhibitoren die IC 50 Werte gegenüber JMJD2A und JARID1A im gleichen Bereich liegen, inhibiert NR001 JMJD2A stärker als JARID1A. Umgekehrt zeigen die Inhibitoren mit Hydroxamsäure Gruppe eine ausgeprägte Selektivität für JARID1A (Martin Roatsch, unveröffentlichte Ergebnisse). 46

59 3.2. Strukturen und Aktivität der Inhibitoren Tab. 3 6: IC50 Werte für JMJD2A und JARID1A im Vergleich Substanz Struktur IC 50 ± SD [µm] JMJD2A JARID1A Deferoxamin 3,33 ± 0,48 4,62 ± 0,27 Deferasirox 6,35 ± 0,57 5,00 ± 0,62 MR ± ± 35 IC 50 der Säure: 0,94 ± 0,05 IC 50 der Säure: 0,44 ± 0,07 NR001 2,38 ± 0,37 10,41 ± 1,80 LM75 26,4 ± 1,4 2,57 ± 0,52 LM97 11,0 ± 0,3 9,02 ± 0,83 LM105 8,75 ± 2,38 1,65 ± 0,13 Die aufgeführten Verbindungen wurden von Martin Roatsch, Nicole Rüger und Dr. Ludovica Morera synthetisiert oder kommerziell erworben. Martin Roatsch testete sie an JMJD2A und JARID1A. Angegeben ist jeweils der Mittelwert zweier unabhängiger Experimente. 47

60 3. Neue In vitro Inhibitoren der JmjC Demethylasen 3.3. Diskussion Die in unserer Arbeitsgruppe entwickelten Verbindungen sind potente In vitro Inhibitoren von JMJD2A bzw. JARID1A. Ihre IC 50 Werte liegen im niedrigen mikromolaren oder im submikromolaren Bereich, womit sie eine ähnliche Potenz aufweisen wie die neueren publizierten Inhibitoren (vergleiche Kapitel 1.3.4). Für die meisten Inhibitoren stehen Prodrugs oder Analoga zur Verfügung, deren erwartete Zellgängigkeit besser ist als die der Ausgangssubstanz. Die Eisenchelatoren Deferasirox und Deferoxamin sind von besonderem Interesse, weil es sich um zugelassene Wirkstoffe handelt. Deferoxamin wurde bereits in der Literatur als Referenzinhibitor bei der zellulären Testung neuer JmjC Demethylase Inhibitoren eingesetzt, jedoch nicht explizit als solcher beschrieben (Luo et al. 2011; Wang et al. 2013). Für Deferasirox ist eine wachstumshemmende Wirkung auf maligne Zellen beschrieben: So senkt die Substanz die Viablität und Proliferation der Ösophaguskarzinom Zelllinien OE19, OE21 und OE33 und inhibiert das Wachstum von Xenograft Tumoren dieser Zelllinien in Mäusen (Ford et al. 2013). Sie verlängert außerdem die Überlebenszeit von Mäusen, denen murine lymphatische Leukämiezellen der Zelllinie L 1210 subkutan injiziert wurden (Lee et al. 2013). Ein Wirkmechanismus ist für keinen der beiden Effekte postuliert. Möglich ist, dass Deferasirox die Effekte durch eine Inhibition der JmjC Demethylasen hervorruft. Für die vorgestellten Derivate des Deferasirox ist aufgrund ihrer wahrscheinlich besseren Zellgängigkeit bzw. höheren zellulären Potenz eine stärkere Wirkung auf Tumorzelllinien zu erwarten. Die Inhibitorklassen der Pyridylpyrimidine sowie der Substanzen mit Hydroxamsäure Gruppe und das Carbonsäurehydrazid NR001 tragen Strukturmerkmale, die aus publizierten Inhibitoren bekannt sind. Dabei handelt es sich jeweils um den sogenannten Warhead der Verbindungen. So wird das Eisen(II) Ion bei den Pyridylpyrimidinen aus unserer Arbeitsgruppe ähnlich wie bei GSK J1, dem 2,2' Bipyridin von Chang et al. sowie dem Triazolylpyridin von England et al. durch die freien Elektronenpaare zweier Stickstoffatome in Heteroaromaten chelatisiert, von denen einer ein Pyridin ist (Heinemann et al. 2014; Chang et al. 2011; England et al. 2014). Die Substanzen mit Hydroxamsäure Gruppe tragen am Stickstoffatom der Hydroxamsäure Gruppe einen 2 Carboxyethyl Substituenten sowie eine unverzweigte Alkylkette als Stammsystem. Darin ähneln sie den Inhibitoren von Suzuki et al. sowie Itoh et al. (Suzuki et al. 2013; Itoh et al. 2015). Die meisten der Verbindungen mit Hydroxamsäure Gruppe weisen ebenfalls 48

61 3.3. Diskussion die von Itoh et al. für ihren Inhibitor beschriebene Selektivität für JARID1A auf (Itoh et al. 2015). NR001 teilt das Carbonsäurehydrazid als Warhead mit Daminozid (Rose et al. 2012). In den anderen Molekülteilen unterscheiden sich die Verbindungen stark von den publizierten Inhibitoren. Diese Strukturelemente sind für Interaktionen mit Aminosäuren nahe des aktiven Zentrum der JmjC Demethylasen entscheidend und bestimmen somit die Potenz des Inhibitors sowie seine Selektivität gegenüber anderen α KG abhängigen Enzymen. Sie haben zudem einen großen Einfluss auf die physikochemischen Eigenschaften der Verbindungen, die für ihre Wirksamkeit in zellbasierten Assays sowie in Tierversuchen entscheidend sind. 49

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63 4. Ergebnisse 4.1. Untersuchung des Effekts auf die Zellproliferation Assays für die Untersuchung der Effekte auf die Zellproliferation werden häufig als erster Schritt in der zellbasierten Testung eingesetzt, weil sie mit wenig Aufwand durchzuführen sind und den Konzentrationsbereich aufzeigen, in dem die Substanz in Folgeexperimenten eingesetzt werden könnte. In unserer Arbeitsgruppe wird als Standardmethode der MTS Assay durchgeführt, der als Endpunktassay Informationen über die Zellproliferation nach 72 Stunden Inkubationszeit liefert. Im Rahmen dieses Projektes wurden Einflüsse auf die Zellproliferation zusätzlich mithilfe einer weiteren Endpunktbestimmung, der Quantifizierung der Nuklei in der Immunfluoreszenz Mikroskopie, sowie als kontinuierliche, impedanzbasierte Messung unter Nutzung des icelligence Systems durchgeführt MTS Assay Einführung Der MTS Assay erlaubt die Bestimmung der Anzahl metabolisch aktiver Zellen in einer Probe. Dabei wird das Zwitterion [3 (4,5 Dimethylthiazol 2 yl) 5 (3 carboxymethoxyphenyl) 2 (4 sulfophenyl) 2H tetrazolium (MTS) durch zelluläre Dehydrogenasen zu einem Formazan umgesetzt, das per Absorptionsmessung quantifiziert werden kann (Barltrop et al. 1991). N Methylphenazoniummethylsulfat (PMS) dient bei dieser Reaktion als intermediärer Elektronenakzeptor. Das Messsignal ist proportional zur Aktivität der zellulären Dehydrogenasen und somit zur Anzahl der lebenden Zellen in der Probe (Promega 2012). Der MTS Assay wurde in dieser Arbeit genutzt, um GI 50 Werte für Inhibitoren an Zelllinien zu bestimmen. Der GI 50 Wert (englisch für growth inhibition ) ist definiert als die Konzentration, bei der ein Inhibitor die halbmaximale Wachstumshemmung aufweist. Laut Standardprotokoll wird er nach einer Inkubation der Zellen mit dem jeweiligen Inhibitor für 72 Stunden bestimmt. Ausgehend vom GI 50 Wert einer Verbindung wurden Testkonzentrationen für weiterführende Experimenten wie zum Beispiel Western Blots nach Histonextraktion ausgewählt. Außerdem wurde durch Vergleich der GI 50 Werte mit den Daten der Immunfluoreszenz Mikroskopie Experimente untersucht, ob eine Korrelation zwischen 51

64 4. Ergebnisse Wachstumshemmung und Hemmung der Demethylasefunktion der JmjC Proteine in den Zellen besteht (siehe Kapitel ). Dies wäre aus physiologischer bzw. pathophysiologischer Sicht von Interesse und würde außerdem die Testung neuer Verbindungen vereinfachen, da unwirksame Verbindungen bereits nach dem vergleichsweise wenig aufwendigen MTS Assay von weiteren Testungen ausgeschlossen werden könnten. Desweiteren liefert der MTS Assay als erster durchgeführter zellulärer Assay Informationen über die Löslichkeitseigenschaften einer Substanz. Verbindungen, die im Medium schlecht löslich sind, werden durch einfache lichtmikroskopische Prüfung der Platten identifiziert und können entweder in entsprechend niedrigeren Konzentrationen in weiteren Experimenten eingesetzt oder bei sehr schlechter Löslichkeit auch von der weiteren Untersuchung ausgeschlossen werden. Für die Untersuchung der antiproliferativen Eigenschaften der Inhibitoren wurde die Zelllinie KYSE 150 ausgewählt. Sie trägt ein Amplikon von JMJD2C (Yang et al. 2000) und reagiert auf den Knockdown von JMJD2C mit stark verminderter Proliferation (Cloos et al. 2006). Der JmjC Demethylase Inhibitor Methylstat wirkt auf diese Zelllinie antiproliferativ (Luo et al. 2011). Somit wäre zu erwarten, dass KYSE 150 Zellen auf JmjC Demethylase Inhibitoren insgesamt mit verminderter Proliferation reagieren Ergebnisse Der MTS Assay war bereits für KYSE 150 Zellen in unserer Arbeitsgruppe etabliert und konnte ohne Veränderungen zur Testung der neuen Inhibitoren genutzt werden. Die Referenzinhibitoren IOX1, JIB 04 und Methylstat weisen in KYSE 150 Zellen GI 50 Werte zwischen 0,17 ± 0,02 µm und 22 ± 3 µm auf (Tab. 4 1). Der publizierte GI 50 für Methylstat an KYSE 150 Zellen liegt bei 5,1 µm (Luo et al. 2011), dieser Wert stimmt mit dem im MTS Assay erhaltenen Wert überein. Für IOX1 und JIB 04 liegen keine publizierten GI 50 Werte für KYSE 150 Zellen vor. Da alle drei Referenzinhibitoren einen antiproliferativen Effekt auf KYSE 150 Zellen ausüben, wurde dieses System genutzt, um die in unserer Arbeitsgruppe entdeckten, neuen JmjC Demethylase Inhibitoren zu testen. 52

65 4.1. Untersuchung des Effekts auf die Zellproliferation Tab. 4 1: Ergebnisse des MTS Assays für Referenzinhibitoren Substanz Struktur GI 50 ± SE [µm] KYSE 150 IOX1 22 ± 3 JIB 04 0,17 ± 0,02 Methylstat 5,2 ± 0,3 Angegeben ist das Ergebnis einer Bestimmung in Triplikaten, welches in einem unabhängigen Experiment bestätigt wurde. Die Eisenchelatoren Deferoxamin und Deferasirox sowie die in unserer Gruppe synthetisierten Derivate des Deferasirox weisen GI 50 Werte unter 5 µm auf (Tab. 4 2). Sie sind damit ähnlich potent in ihren antiproliferativen Eigenschaften wie die oben genannten Referenzinhibitoren. Die Werte für die einzelnen Substanzen unterscheiden sich nur wenig, sie liegen zwischen 0,4 und 4 µm. Da es sich bei der Klasse der kommerziell erhältlichen Eisenchelatoren und ihrer Derivate um eine der potentesten, in unserem Arbeitskreis als JmjC Demethylase Inhibitoren identifizierten Substanzgruppen handelt, wurden die zwei Ausgangssubstanzen Deferoxamin und Deferasirox zusätzlich im MTS Assay an weiteren Zelllinien getestet, um ihre antiproliferativen Eigenschaften genauer zu charakterisieren (Tab. 4 3). Für die Testung wurden die Zelllinien MCF 7, LNCaP und HL 60 ausgewählt. 53

66 4. Ergebnisse Tab. 4 2: Ergebnisse des MTS Assays für kommerziell erhältliche Eisenchelatoren und ihre Derivate Substanz Struktur GI 50 ± SE [µm] KYSE 150 Deferoxamin 3,3 ± 0,8 Deferasirox 2,5 ± 0,5 MR04 0,42 ± 0,09 MR05 0,62 ± 0,15 MR23 1,0 ± 0,1 MR25 2,3 ± 0,7 Angegeben ist das Ergebnis einer Bestimmung in Triplikaten, welches in einem unabhängigen Experiment bestätigt wurde. 54

67 4.1. Untersuchung des Effekts auf die Zellproliferation Tab. 4 3: Vergleich der antiproliferativen Wirkung von Deferoxamin und Deferasirox auf verschiedene Zelllinien Substanz MCF 7 LNCaP Deferoxamin Deferasirox HL 60 KYSE 150 Deferoxamin GI 50 = 3,3 ± 0,8 µm Deferasirox GI 50 = 2,5 ± 0,5 µm Dargestellt sind die Ergebnisse einer Messung in Triplikaten. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung wieder. Die GI50 Werte wurden in einem unabhängigen Experiment bestätigt. 55

68 4. Ergebnisse Deferoxamin und Deferasirox wirken auf alle getesteten Zelllinien antiproliferativ, allerdings setzt diese Wirkung für die neu getesteten Zelllinien bei deutlich höheren Konzentrationen ein als bei KYSE 150 Zellen. Zudem führt Deferoxamin in MCF 7 und HL 60 Zellen anders als bei KYSE 150 Zellen bei hohen Konzentrationen nicht zu einer Abnahme des Assaysignals auf das Niveau des Blanks, sondern lediglich zu einer Senkung auf ca. 30 % des für die mit reinem Lösungsmittel Dimethylsulfoxid (DMSO) behandelten Kontrollzellen erhaltenen Signals. Möglicherweise übt die Substanz auch in hohen Konzentrationen lediglich einen zytostatischen, aber keinen zytotoxischen Effekt auf MCF 7 und HL 60 Zellen aus, so dass die ausgesäten Zellen bei allen getesteten Konzentrationen überleben. Insgesamt bestätigen diese Ergebnisse die Wahl der Zelllinie KYSE 150 für die Testung der antiproliferativen Eigenschaften neuer JmjC Demethylase Inhibitoren. Tab. 4 4: Ergebnisse des MTS Assays für Pyridylpyrimidine Substanz Struktur GI 50 ± SE [µm] oder Inhibition bei angegebener Konzentration KYSE 150 MR11 43 % bei 50 µm MR13 29 % bei 10 µm Präzipitation bei 20 µm MR18 Keine Hemmung Präzipitation bei 10 µm MR19 Keine Hemmung Präzipitation bei 10 µm MR29 Keine Hemmung bei 50 µm Angegeben ist jeweils der Mittelwert zweier unabhängiger Experimente. 56

69 4.1. Untersuchung des Effekts auf die Zellproliferation Die Ester der in vitro an JMJD2A aktiven Pyridylpyrimidine hemmen das Wachstum der KYSE 150 Zellen nur schwach (Tab. 4 4). Auf Grund ihrer schlechten Löslichkeit im Zellkulturmedium konnten einige der Verbindungen nur bei niedrigen Konzentrationen getestet werden. Das Tetrazol NR001 hat keinen antiproliferativen Effekt auf KYSE 150 Zellen. Die Substanzen AH171 und AH174 wirken mäßig antiproliferativ (Tab. 4 5). Tab. 4 5: Ergebnisse des MTS Assays für das Tetrazol NR001 sowie AH171 und AH174 Substanz Struktur GI 50 ± SE [µm] oder Inhibition bei angegebener Konzentration KYSE 150 NR001 Keine Hemmung bei 50 µm AH % bei 50 µm AH % bei 50 µm Angegeben ist jeweils der Mittelwert zweier unabhängiger Experimente. Die in unserer Arbeitsgruppe als JmjC Demethylase Inhibitoren entdeckten Hydroxamsäuren haben einen mäßigen antiproliferativen Effekt auf KYSE 150 Zellen (Tab. 4 6). Dabei ist die Wirkung des Prodrugs jeweils deutlich stärker als die der Wirkform. So wirkt LM97 stärker antiproliferativ als LM75 und LM101 hat einen stärkeren Effekt als LM105. Einige der Hydroxamsäuren sind in vitro an JARID1A wirksamer als an JMJD2A. Da KYSE 150 Zellen wie oben geschrieben auf Grund ihrer putativen Empfindlichkeit gegenüber Inhibitoren von JMJD2C und dem nah verwandten JMJD2A ausgewählt wurde, könnte in dieser Selektivität ein Grund für die geringe Ausgeprägtheit des antiproliferativen Effekts der Substanzen liegen. Aus diesem Grund wurde die Substanzklasse der Hydroxamsäuren im MTS Assay an einer weiteren Zelllinie getestet. Für die Testung wurden HL 60 Zellen ausgewählt, um der adhärenten Zelllinie KYSE

70 4. Ergebnisse eine Suspensionszelllinie gegenüberzustellen. Anders als für JMJD2C konnte aus der Literatur keine Zelllinie herausgearbeitet werden, für welche die Erwartung einer starken antiproliferativen Reaktion auf Inhibitoren von JARID1A bestünde. Tab. 4 6: Ergebnisse des MTS Assays für Hydroxamsäuren Substanz Struktur GI 50 ± SE [µm] oder Inhibition bei angegebener Konzentration LM6 KYSE % bei 100 µm HL % bei 100 µm LM75 12 % bei 50 µm 13 % bei 50 µm LM97 51 % bei 50 µm 14 ± 1 LM % bei 100 µm 18 ± 9 LM % bei 100 µm 116± 14 Für die GI50 Werte ist jeweils das Ergebnis einer Bestimmung in Triplikaten angegeben, welches in einem unabhängigen Experiment bestätigt wurde. Die prozentuale Inhibition bei einer angegebenen Konzentration gibt den Mittelwert zweier unabhängiger Experimente wieder. 58

71 4.1. Untersuchung des Effekts auf die Zellproliferation HL 60 Zellen reagieren deutlich empfindlicher auf manche der Inhibitoren mit Hydroxamsäure Struktur als KYSE 150 Zellen (Tab. 4 6). Während für die Verbindungen LM97, LM101 und LM105 an KYSE 150 Zellen auf Grund des geringen Effekts der Verbindungen kein GI 50 Wert bestimmt werden konnte, war dies an HL 60 Zellen möglich. Die GI 50 Werte der beiden Prodrugs LM97 und LM101 liegen für HL 60 Zellen im unteren mikromolaren Bereich, sie wirken somit stark antiproliferativ auf die Zellen. Die Wirkformen LM75 und LM105 haben eine deutlich schwächere antiproliferative Wirkung, vermutlich weil auf Grund ihrer höheren Polarität eine niedrigere intrazelluläre Konzentration erreicht wird. LM6 wirkt auf HL 60 Zellen stärker antiproliferativ als auf KYSE 150 Zellen. Ein GI 50 konnte auf Grund der Knappheit der Substanz nicht bestimmt werden. HL 60 Zellen sind in der Literatur als empfindlich gegenüber HDAC Inhibitoren beschrieben (Cheng et al. 2014; Hackanson et al. 2012). Durch die Alkylierung am Stickstoffatom der Hydroxamsäure Gruppe wurde die Aktivität der Inhibitoren gegenüber HDACs stark gesenkt. Die Aufstellung der vollständigen Dosis Wirkungsbeziehungen steht noch aus, für eine Konzentration von 10 µm wurde jedoch bereits gezeigt, dass die Restaktivität von LM75, LM97, LM101 und LM105 gegenüber HDAC1 und HDAC6 schwach ist (Johanna Senger, unveröffentlichte Ergebnisse, vergleiche Tab. 3 3). Bei LM97 und LM101 liegen die GI 50 Werte an HL 60 Zellen in einem Konzentrationsbereich, in dem die Substanzen HDACs nur schwach inhibieren, so dass der antiproliferative Effekt wahrscheinlich über eine Hemmung der JmjC Demethylasen hervorgerufen wird Zellzahlbestimmung in der Immunfluoreszenz Mikroskopie Einführung Die in Kapitel beschriebenen Immunfluoreszenz Mikroskopie Experimente dienen der relativen Quantifzierung der Histontrimethylierung in Zellen. Im Zuge der Auswertung wird zusätzlich für jede Bedingung die Anzahl der Nuklei im Sichtfeld bestimmt. Diese Daten können im Hinblick auf den antiproliferativen Effekt eines Inhibitors ausgewertet werden, da in alle Wells zu Beginn des Experimentes die gleiche Zellzahl ausgesät wird. Die Methode wurde genutzt, um für einige Inhibitoren halbmaximale Hemmkonzentrationen zu bestimmen, welche dann mit den Ergebnissen aus dem MTS Assay verglichen werden sollten. Die Inkubationszeit betrug wie beim MTS Assay 72 Stunden und die Experimente wurden ebenfalls an der Zelllinie KYSE 150 durchgeführt. 59

72 4. Ergebnisse Ergebnisse In Tabelle 4 7 sind die GI 50 Werte ausgewählter Inhibitoren aus dem MTS Assay und aus der Zellzahlbestimmung im Rahmen der Immunfluoreszenz Mikroskopie gegenübergestellt. Für den Vergleich wurden Inhibitoren ausgewählt, für welche die Zellzahl aufgetragen gegen die Konzentration möglichst gut auf einer sigmoidalen Kurve liegt. Dies ist nicht für alle Inhibitoren der Fall, insbesondere aus dem Grund, dass der untersuchte Konzentrationsbereich häufig nicht den Bereich der oberen und unteren Asymptote abdeckt, da die zu testenden Konzentrationen nach anderen Kriterien ausgewählt wurden als für den MTS Assay. Tab. 4 7: Vergleich der mit unterschiedlichen Bestimmungsmethoden erhaltenen GI50 Werte an KYSE 150 Zellen Substanz GI 50 ± SE [µm] MTS Assay Immunfluoreszenz Mikroskopie IOX1 22 ± 3 7,2 ± 0,4 JIB 04 0,17 ± 0,02 0,10 ± 0,003 MR23 1,0 ± 0,1 0,44 ± 0,09 MR25 2,3 ± 0,7 1,0 ± 0,08 Angegeben ist für die GI50 Werte das Ergebnis einer Messung in Triplikaten, das in einem unabhängigen Experiment bestätigt wurde. Die GI50 Bestimmung im Rahmen der Immunfluoreszenz Mikroskopie Experimente beruht auf Dosis Wirkungskurven aus neun Punkten mit jeweils einem Well je Konzentration. Beide Bestimmungsmethoden liefern für die getesteten Inhibitoren jeweils ähnliche GI 50 Werte. Lediglich für IOX1 kommt es zu einer stärkeren Abweichung. Die Unterschiede in den Werten überschreiten für alle Inhibitoren außer IOX1 nicht die Schwankungen, die bei Vergleich der Ergebnisse eines Assays bei wiederholter Durchführung zu erwarten wären. Insofern bestätigt die GI 50 Bestimmung aus den Zellzahlen der Immunfluoreszenz Mikroskopie Experimente die Ergebnisse des MTS Assays. Bei der Analyse der in der Immunfluoreszenz Mikroskopie bestimmten Zellzahlen fällt auf, dass die Zellzahl von vielen Inhibitoren bei hohen Konzentrationen nicht auf 0 reduziert wird, sondern über einen weiten Konzentrationsbereich hinweg ein Plateau bildet. Diese liegt bei circa 1000 bis 2000 Zellen (Abb. 4 1). Diese Beobachtung legt die Vermutung nahe, dass die Inhibitoren einen zytostatischen und keinen zytotoxischen Effekt auf 60

73 4.1. Untersuchung des Effekts auf die Zellproliferation KYSE 150 Zellen ausüben und zu einem Zellzyklus Arrest führen könnten. Im Folgenden wurde diese Frage mittels kontinuierlicher Messung der Zellproliferation im icelligence System näher untersucht. IOX1 MR23 MR25 Deferasirox Abb. 4 1: Anzahl der Zellen in Abhängigkeit von der Konzentration an Inhibitor bestimmt durch Immunfluoreszenz Mikroskopie KYSE 150 Zellen wurden für 72 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen an Inhibitoren behandelt. Die Bestimmung der Zellzahl erfolgte im Rahmen eines Immunfluoreszenz Mikroskopieexperiments. Für die Dosis Wirkungskurven wurde ein Well je Konzentration eingesetzt Kontinuierliche Zellproliferationsmessung ohne Androgenstimulation Einführung Die kontinuierliche Messung der Zellproliferation wurde mit dem icelligence System durchgeführt. Das Gerät ermöglicht die impedanzbasierte Messung der Zelladhäsion und proliferation. Dabei werden Zellen auf Platten gezüchtet, auf deren Böden Goldelektroden aufgebracht sind. In regelmäßigen Abständen wird die Impedanz, der Wechselstromwiderstand, aufgezeichnet. Aus dem Messwert für reines Medium und der jeweils bestimmten Impedanz errechnet das System den Zellindex, eine dimensionslose 61

74 4. Ergebnisse Größe, die proportional zur durch die Zellen bedeckten Fläche ist und zur Auswertung gegen die Zeit aufgetragen wird (Ke & Abassi 2013). Nach Abschluss eines Experiments ist eine visuelle Kontrolle des Zustands der Zellen unter dem Lichtmikroskop möglich Ergebnisse Ein Protokoll für icelligence Messungen existierte in unserem Arbeitskreis nicht, deshalb wurde in einem ersten Schritt die optimale Startzellzahl je Well bestimmt. Der Hersteller empfiehlt, eine Behandlung mit Inhibitoren 24 Stunden nach Aussaat der Zellen durchzuführen, um den Zellen so genügend Zeit zum Anwachsen zu lassen. Zum Zeitpunkt der Inhibitorbehandlung sollte ein Drittel bis ein Viertel des maximalen Zellindex erreicht sein, wobei der maximal erreichte Zellindex abhängig ist von der Zelllinie. Für KYSE 150 Zellen wird ein Maximalwert für den Zellindex zwischen 3,5 und 4,0 erreicht (Abb. 4 2). Abb. 4 2: Zunahme des Zellindex über die Zeit bei unterschiedlichen Startzellzahlen an KYSE 150 Zellen. Die angegebene Anzahl an KYSE 150 Zellen wurde pro Well in das icelligence System ausgesät und der Zellindex über 24 Stunden hinweg alle 15 Minuten aufgezeichnet. Es wird für den Zellindex ein maximaler Wert zwischen 3,5 und 4 erreicht. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung von Duplikaten an. 62

75 4.1. Untersuchung des Effekts auf die Zellproliferation Bei einer Startanzahl von 5000 Zellen beträgt der Zellindex nach 24 Stunden mit 0,9 ungefähr ein Viertel des Maximalwerts (Abb. 4 3), womit diese Zellzahl für das Experiment eingesetzt werden kann. Als Testsubstanz für die Untersuchung eines möglichen zytostatischen Effekts von JmjC Demethylase Inhibitoren auf KYSE 150 Zellen wurde Deferasirox ausgewählt. Für diese Substanz ergibt sich in der Immunfluoreszenz Mikroskopie ein Plateau für den Konzentrationsbereich zwischen 10 und 100 µm. Im icelligence wachsen die Zellen nach Inhibitorzugabe für eine Zeitspanne zwischen 15 und 55 Stunden weiter. Danach beginnt bei allen Konzentrationen eine langsame Abnahme des Zellindex, was auf ein leichtes Ablösen der Zellen eventuell verbunden mit einem Absterben einzelner Zellen hindeutet. Zu diesem Zeitpunkt überwiegt die Ablösung und das eventuelle Absterben der Zellen deutlich gegenüber einer möglichen weiteren Proliferation einzelner Zellen (Abb. 4 4). Abb. 4 3: Zunahme des Zellindex über die Zeit bei unterschiedlichen Startzellzahlen an KYSE 150 Zellen. Die angegebene Anzahl an KYSE 150 Zellen wurde pro Well in das icelligence System ausgesät und der Zellindex im Zeitraum zwischen 0 und 4,3 Stunden sowie zwischen 22,4 und 24,7 Stunden alle 15 Minuten aufgezeichnet. Die Kurve ist auf Grund eines technischen Problems zwischen diesen beiden Intervallen unterbrochen, was aber keinen Einfluss auf das Zellwachstum hatte. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung von Duplikaten an. 63

76 4. Ergebnisse Abb. 4 4: Veränderung des Zellindex über die Zeit bei Behandlung von KYSE 150 Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen an Deferasirox KYSE 150 Zellen je Well wurden in das icelligence System ausgesät und nach 24 Stunden mit den angegebenen Konzentration an Deferasirox oder dem reinen Lösungsmittel DMSO behandelt. Der Zellindex wurde über 105 Stunden mindestens alle 20 Minuten aufgezeichnet. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung von Duplikaten an. Dieses Experiment zeigt, dass Deferasirox in mäßigen bis hohen Konzentrationen keine zytostatische Wirkung auf KYSE 150 Zellen hat. Der Effekt der Plateaubildung bei der Zellzahlanalyse während der Immunfluoreszenz Mikroskopie ist wahrscheinlich durch parallel ablaufende, langsame Prozesse des Weiterwachsens und Ablösens oder Absterbens der Zellen nach Inhibitorzugabe begründet. Durch diese ergeben sich nach 72 Stunden Behandlungsdauer in etwa gleiche Zellzahlen für unterschiedliche Inhibitorkonzentrationen Diskussion Der MTS Assay wurde erfolgreich genutzt, um GI 50 Werte an KYSE 150 Zellen für Referenzinhibitoren sowie neue JmjC Demethylase Inhibitoren zu bestimmen. Diese erleichtern das Abschätzen der Konzentrationen, welche in Folgeexperimenten einzusetzen sind. Die ermittelten Werte werden durch die Ergebnisse der Zellzahlbestimmungen im Rahmen der Immunfluoreszenz Mikroskopie Experimente bestätigt. Mit KYSE 150 wurde eine Zelllinie ausgewählt, die empfindlicher auf JMJD2A Inhibitoren reagiert als andere Zelllinien. Dies wurde durch Testung der JmjC Demethylase Inhibitoren aus der Gruppe der im Handel befindlichen Eisenchelatoren an anderen 64

77 4.2. Untersuchung des Einflusses auf die androgeninduzierte Zellantwort Zelllinien bestätigt. Grundsätzlich stellt sich die Frage, ob für die mehrstufige zelluläre Testung neuer Inhibitoren eine Zelllinie ausgewählt werden sollte, die mit verminderter Proliferation auf die Inhibitoren reagiert. Einerseits kann die abgeschwächte Proliferation ein Zeichen dafür sein, dass die Inhibitoren einen starken Effekt in der Zelle haben. Beispielsweise könnte das gehemmte Enzym für die betreffende Zelllinie besonders wichtig sein und sie nicht über Ausgleichsmechanismen verfügen. In diesem Fall wäre die Erwartung, dass auch frühere Wirkungen der Inhibitoren wie beispielsweise eine Substratakkumulation in dieser Zelllinie besonders gut beobachtet werden können. Im günstigsten Fall erlauben das Auftreten und die Stärke eines antiproliferativen Effekts unter diesen Bedingungen bereits eine Vorgruppierung der Inhibitoren in mit hoher Wahrscheinlichkeit wirksamere und unwirksamere Substanzen. Nachteilig wirkt sich jedoch aus, dass die antiproliferativen Eigenschaften eines Inhibitors gegenüber einer empfindlichen Zelllinie in späteren Experimenten, beispielsweise bei der Analyse der Histonmethylierung, dosislimitierend sein können Untersuchung des Einflusses auf die androgeninduzierte Zellantwort Dem folgenden Kapitel liegt die Idee zugrunde, dass Inhibitoren der JmjC Demethylasen die Zellantwort auf Androgene abschwächen sollten, da JMJD2C als Coaktivator des Androgenrezeptors auftritt. Ein Testsystem für JmjC Demethylase Inhibitoren, das androgeninduzierte Effekte quantifiziert, wäre besonders interessant, da es funktionelle oder induzierbare phänotypische Effekte messen würde. Für derartige Effekte existieren für JmjC Demethylasen bisher nur sehr wenige Testsysteme (vergleiche Kapitel 1.4.3). Die Messung funktioneller und induzierbarer phänotypischer Effekte würde zudem eine gute Ergänzung zu den in Publikationen häufig beschriebenen Untersuchungen des Einflusses auf die Zellproliferation und die Histonmethylierung darstellen Einführung Androgenresponsive Zellen reagieren unter anderem mit verstärktem Wachstum und der Expression androgenabhängiger Gene auf eine Stimulation mit Androgenen. Wie in Kapitel beschrieben, ist die JmjC Demethylase JMJD2C gemeinsam mit der Demethylase LSD1 als Coaktivator des Androgenrezeptors an der physiologischen Zellantwort auf Androgene beteiligt. Die enzymatische Funktion der beiden Enzyme spielt dabei eine Rolle für die Änderung der Histonmodifikationen an Promotoren androgen 65

78 4. Ergebnisse abhängiger Gene hin zu Modifikationen, die mit aktiven Genen assoziiert sind. Somit ist zu erwarten, dass Inhibitoren von JMJD2C und LSD1 die Zellantwort auf Androgene unterdrücken und dabei mindestens additiv zusammenwirken. Gestützt und teilweise bewiesen wird diese Hypothese durch Knockdown Experimente und Versuche mit LSD1 Inhibitoren. So führt der Knockdown von LSD1 in LNCaP Zellen in einem Reportergenassay mit einem Plasmid, das einen androgenabhängigen Promoter enthält, zu einer reduzierten Biosynthese des Genprodukts des Reportergens (Metzger et al. 2005). Der Knockdown von JMJD2C in LNCaP Zellen führt ebenfalls zur Abnahme des Signals in einem ähnlichen Reportergenassay, zu einer verminderten Produktion der mrna des prostataspezifischen Antigens (PSA) nach Androgenstimulation sowie zu einer Verringerung der Wachstumsantwort auf Androgenstimulation (Wissmann et al. 2007). Die LSD1 Inhibitoren Pargylin und Namolin unterdrücken in LNCaP Zellen die Expression androgenabhängiger Gene auf mrna Ebene und Namolin mindert den proproliferativen Effekt von Androgenen auf LNCaP Zellen (Metzger et al. 2005; Willmann et al. 2012). Zu einem möglichen Effekt von JmjC Demethylase Inhibitoren auf die androgeninduzierte Zellantwort finden sich keine Angaben in der Literatur. In der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Roland Schüle am Universitätsklinikum Freiburg wurde gezeigt, dass die in unserer Arbeitsgruppe entdeckte Verbindung AH174 in einem Reportergenassay für androgeninduzierte Transkription in LNCaP Zellen dosisabhängig zu einer starken Signalreduktion führt. Außerdem senkt AH174 in einer Konzentration von 10 µm allein und in Kombination mit Namolin die Expression androgenabhängiger Gene in LNCaP Zellen. Die verwandte Substanz AH171 unterdrückt ebenfalls in einer Konzentration von 10 µm allein und in Kombination mit Namolin die androgenstimulierte Proliferation von LNCaP Zellen (Dr. Adrien Eberlin, Arbeitskreis Prof. Dr. Roland Schüle, unveröffentlichte Ergebnisse). Diese Unterdrückung der androgenstimulierten Zellantwort sollte für die zelluläre Testung neuer JmjC Demethylase Inhibitoren genutzt werden. Hierfür wurden nach allgemeinen Untersuchungen der antiproliferativen Eigenschaften der Substanzen zunächst die Ergebnisse aus der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Schüle für die Verbindungen AH171 und AH174 in Bezug auf Zellproliferation und Genexpression nachgearbeitet. Anschließend erfolgte die Untersuchung der Effekte publizierter Inhibitoren und in unserer Gruppe entwickelter Inhibitoren in den Systemen. In einem letzten Schritt wurde untersucht, inwieweit die leichter messbare Sekretion von PSA durch LNCaP Zellen als Testsystem geeignet ist. 66

79 4.2. Untersuchung des Einflusses auf die androgeninduzierte Zellantwort Als Zelllinie wurde wie auch bei den oben genannten publizierten Experimenten LNCaP eingesetzt. Diese Zelllinie wurde aus der Metastase eines Prostatakarzinoms in den Lymphknoten eines Patienten etabliert und ist androgen responsiv (Horoszewicz et al. 1983). Für die Androgenstimulation wurde ebenfalls wie in den zitierten Literaturstellen das synthetische Androgen R1881 eingesetzt, das sich durch seine hohe Potenz und geringe Plasmaeiweißbindung auszeichnet (Bonne & Raynaud 1975) MTS Assay Zunächst wurde der antiproliferative Effekt der Inhibitoren AH171 und Namolin auf LNCaP Zellen im MTS Assay untersucht. Während jeder der Inhibitoren einzeln bei den eingesetzten Konzentrationen nicht antiproliferativ wirkt, weisen sie in Kombination eine Hemmung der Zellproliferation auf (Tab. 4 8). Tab. 4 8: Ergebnisse des MTS Assays für AH171 und Namolin Substanz Struktur Inhibition bei angegebener Konzentration LNCaP AH171 Keine Hemmung bei 25 µm Namolin (LSD1 Inhibitor) Keine Hemmung bei 50 µm Kombination AH171 und Namolin 58 % bei 25 µm AH171 und 50 µm Namolin Angegeben ist der Mittelwert aus zwei unabhängigen Experimenten. 67

80 4. Ergebnisse Kontinuierliche Zellproliferationsmessung mit Androgenstimulation Zur kontinuierlichen Messung der Zellproliferation nach Androgenstimulation wurde das icelligence System eingesetzt. Im ersten Schritt musste eine geeignete Anzahl auszusäender Zellen je Well bestimmt werden. Der Stimulation und der Inhibitorbehandlung geht eine Aushungerung der Zellen mit hormonarmem Medium voraus. Die Stimulation und die Inhibitorbehandlung erfolgen deshalb bereits bei Aussaat der Zellen in das icelligence System. Die Vorgehensweise unterscheidet sich somit von dem in Kapitel beschriebenen Verfahren. Die auszusäende Anzahl an Zellen wird ebenfalls nach anderen Kriterien ausgewählt: Sie soll zu einem möglichst langen linearen Wachstum der Zellen sowie einem Zellindex nahe des Maximalwertes am Ende der Inkubationszeit von 70 Stunden führen. Unter diesen Bedingungen sind Zellen je Well für LNCaP Zellen eine geeignete Zellzahl (Abb. 4 5). Die Experimente der Abbildungen 4 6 und 4 7 wurden auf dem technisch gleichen xcelligence System durchgeführt, das Platten mit Wells kleinerer Grundfläche verwendet. Für dieses System wurden LNCaP Zellen je Well als geeignete Startzellzahl bestimmt (Daten nicht gezeigt). Abb. 4 5: Zunahme des Zellindex über die Zeit bei unterschiedlichen Startzellzahlen an LNCaP Zellen Die angegebene Anzahl an LNCaP Zellen wurde pro Well in das icelligence System ausgesät und der Zellindex über 70 Stunden hinweg alle 20 Minuten aufgezeichnet Zellen je Well liefert einen durchgehenden linearen Anstieg des Zellindex bei möglichst hohem Endwert. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung von Duplikaten an. 68

81 4.2. Untersuchung des Einflusses auf die androgeninduzierte Zellantwort Werden mit hormonfreiem Medium ausgehungerte LNCaP Zellen in das icelligence System ausgesät und mit dem synthetischen Androgens R1881 stimuliert, so beginnen die Zellen circa 10 Stunden nach Stimulation deutlich stärker zu wachsen als gleichzeitig ausgesäte unstimulierte Zellen und behalten diese verstärkte Proliferation bis zum Erreichen der maximalen Zelldichte bei. Dieser Effekt tritt konzentrationsabhängig zwischen 0,1 nm und 10 nm R1881 auf (Abb. 4 6). Die Verbindung AH171 unterdrückt in einer Konzentration von 10 µm die durch 1 nm R1881 hervorgerufene Steigerung der Zellproliferation (Abb. 4 7). Die Zellen wachsen so schwach wie unstimulierte Kontrollzellen. Es handelt sich bei diesem Effekt um eine Verhinderung der Androgenstimulation und nicht um einen allgemeinen antiproliferativen Effekt des Inhibitors auf die Zellen, da AH171 in einer Konzentration von 20 µm das Zellwachstum ebenfalls nur auf das Niveau der unbehandelten Kontrollzellen senkt und der Inhibitor in einer Konzentration von 25 µm keine antiproliferativen Eigenschaften im MTS Assay zeigt (vergleiche Kapitel 4.2.2). Dies entspricht einer Reproduktion der Daten aus dem Arbeitskreis von Prof. Dr. Roland Schüle am Universitätsklinikum Freiburg. Hierbei ist zu bemerken, dass die beschriebenen Effekte, sowohl was die Konzentrationsabhängigkeit der Stimulation durch R1881 als auch die Unterdrückung der androgenstimulierten Proliferation durch AH171 angeht, nicht in jedem der durchgeführten Experimente beobachtet wurden. Die Messwerte der Multiplikate für jede Bedingung in einem Einzelexperiment liegen stets nah beieinander. Somit liegt der Grund für die mäßig gute Reproduzierbarkeit der Effekte wahrscheinlich in einer unterschiedlich ausgeprägten Reaktion der LNCaP Zellen auf Aushungerung und Stimulation. Diese konnte durch eine standardisierte Kultivierung der Zellen mit Passagieren an festgelegten Tagen und Weiterkultivierung in festgelegten Dichten nicht verbessert werden. Aus diesem Grund wurde in allen folgenden Experimenten AH171 als Positivkontrolle mitgeführt und die Daten nur genutzt, wenn die Zellen mit der beschriebenen Reaktion auf AH171 reagierten (Daten für AH171 jeweils nicht gezeigt). Die Substanz AH174 unterdrückt die androgenstimulierte Zellproliferation von LNCaP Zellen in gleicher Weise wie AH171 (Abb. 4 8). 69

82 4. Ergebnisse Abb. 4 6: R1881 stimuliert dosisabhängig das Wachstum von LNCaP Zellen. Mit hormonarmem Medium ausgehungerte LNCaP Zellen wurden zum Zeitpunkt 0 in das icelligence System ausgesät und direkt mit den angegebenen Konzentrationen an R1881 behandelt. Der Zellindex wurde über 70 Stunden alle 15 Minuten aufgezeichnet. Es wurden mindestens 2 Wells je Bedingung eingesetzt. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung an. Abb. 4 7: Unterdrückung der androgenstimulierten Proliferation von LNCaP Zellen durch AH171 Mit hormonarmem Medium ausgehungerte LNCaP Zellen wurden in das icelligence System ausgesät und mit den angegebenen Konzentrationen an AH171 und R1881 behandelt. Der Zellindex wurde über 70 Stunden alle 15 Minuten aufgezeichnet. AH171 unterdrückt die durch R1881 hervorgerufene verstärkte Zellproliferation. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung von Triplikaten an. 70

83 4.2. Untersuchung des Einflusses auf die androgeninduzierte Zellantwort Abb. 4 8: Unterdrückung der androgenstimulierten Proliferation von LNCaP Zellen durch AH174. Mit hormonarmem Medium ausgehungerte LNCaP Zellen wurden in das icelligence System ausgesät und mit den angegebenen Konzentrationen an AH174 und R1881 behandelt. Der Zellindex wurde über 70 Stunden alle 20 Minuten aufgezeichnet. AH174 unterdrückt die durch R1881 hervorgerufene verstärkte Zellproliferation. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung von Duplikaten an. Im nächsten Schritt wurde untersucht, ob eine Unterdrückung des androgeninduzierten Zellwachstums auch durch die Referenzinhibitoren Methylstat und JIB 04 sowie durch den zu testenden Inhibitor Deferasirox erfolgt. Methylstat hemmt in der eingesetzten Konzentration die Proliferation der LNCaP Zellen. Die Wachstumskurve der unstimulierten, mit 15 µm Methylstat behandelten Zellen liegt unter dem Niveau der unstimulierten Kontrolle. Durch Zugabe von 1 nm R1881 kommt es aber zu einer Steigerung des Zellwachstums. Somit unterdrückt Methylstat lediglich allgemein das Zellwachstum der LNCaP Zellen, nicht aber ihre Antwort auf die Androgenstimulation (Abb. 4 9). JIB 04 und Deferasirox zeigen keinen Effekt (Abb. 4 9 und Abb. 4 10). 71

84 4. Ergebnisse Abb. 4 9: Methylstat und JIB 04 unterdrücken nicht die androgeninduzierte Zellproliferation in LNCaP Zellen. Mit hormonarmem Medium ausgehungerte LNCaP Zellen wurden in das icelligence System ausgesät und mit den angegebenen Konzentrationen an Inhibitoren und R1881 behandelt. Der Zellindex wurde über 70 Stunden alle 20 Minuten aufgezeichnet. Methylstat und JIB 04 haben keinen Einfluss auf die durch R1881 hervorgerufene verstärkte Zellproliferation. Es wurden mindestens 2 Wells je Bedingung eingesetzt. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung an. K: Kontrolle, J: JIB 04, M: Methylstat Abb. 4 10: Deferasirox unterdrückt nicht die androgeninduzierte Zellproliferation in LNCaP Zellen. Mit hormonarmem Medium ausgehungerte LNCaP Zellen wurden in das icelligence System ausgesät und mit den angegebenen Konzentrationen an Inhibitoren und R1881 behandelt. Der Zellindex wurde über 70 Stunden alle 20 Minuten aufgezeichnet. Deferasirox hat keinen Einfluss auf die durch R1881 hervorgerufene verstärkte Zellproliferation. Es wurden mindestens 2 Wells je Bedingung eingesetzt. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung an. 72

85 4.2. Untersuchung des Einflusses auf die androgeninduzierte Zellantwort qpcr für androgenabhängige Gene Einführung Die quantitative real time Polymerasekettenreaktion (qpcr) erlaubt die selektive Amplifikation einzelner DNA Abschnitte und ihre absolute oder relative Quantifizierung. Wird mrna mittels reverser Transkription in cdna umgeschrieben und anschließend eine qpcr durchgeführt, sind Aussagen über das Ausmaß der Expression einzelner Gene möglich. Wie die traditionelle Polymerasekettenreaktion verläuft auch die qpcr in Zyklen bestehend aus Denaturierung, Primer Anlagerung und Synthese der neuen DNA Stränge durch eine DNA Polymerase, die über ein Temperaturprogramm gesteuert werden. Die ursprünglich von Heid et al. entwickelte qpcr wurde in dieser Arbeit unter Verwendung des Farbstoffs SYBR Green durchgeführt, der sich an DNA Doppelstränge anlagert und in Verbindung mit diesen geänderte Fluoreszenzeigenschaften aufweist (Heid et al. 1996; Schneeberger et al. 1995). Am Ende der Synthesephase der neuen DNA Stränge wird in jedem Zyklus die Fluoreszenzintensität des SYBR Greens bestimmt. Durch die gleichzeitige Durchführung des Experiments für Zielgene und in der Zelle konstitutionell exprimierte und durch die Behandlung nicht beeinflusste Referenzgene kann aus den gemessenen Fluoreszenzwerten die Erhöhung oder Verminderung der Expression eines Gens in einer Probe im Vergleich zu einer Kontrolle bestimmt werden. Im Arbeitskreis von Prof. Dr. Roland Schüle wurde mittels qpcr gezeigt, dass AH174 in einer Konzentration von 10 µm die durch Aushungerung mit nachfolgender Androgenstimulation hervorgerufene verstärkte Expression der androgenabhängigen Gene FKBP5, KLK2, TMPRSS2, IGF1 R, NKX3.1, MAK, MAF und GREB1 in LNCaP Zellen unterdrückt. Unter Behandlung mit AH174 liegt die Menge der mrna der genannten Gene zwischen 50 und 80 % der Menge, die in stimulierten, aber nicht mit Hemmstoff behandelten Kontrollzellen erreicht wird (Dr. Adrien Eberlin, Arbeitskreis Prof. Dr. Roland Schüle, unveröffentlichte Ergebnisse) Ergebnisse Die beschriebene Hemmung der androgeninduzierten Expression durch den Hemmstoff AH174 wurde für die Gene KLK2 und TMPRSS2 reproduziert (Abb. 4 11). Das Ausmaß der Steigerung der Genexpression nach Androgenstimulation und der Unterdrückung durch den Hemmstoff fiel in Folgeversuchen sehr unterschiedlich aus. Auf Grund dieser schlechten Reproduzierbarkeit wurde von der Untersuchung abgesehen, ob auch Referenzhemmstoffe in diesem System einen Effekt hervorrufen. 73

86 4. Ergebnisse KLK2 TMPRSS2 Abb. 4 11: AH174 hemmt die androgeninduzierte Expression von KLK2 und TMPRSS2. LNCaP Zellen wurden für 48 Stunden mit Aushungerungsmedium inkubiert und dann für 16 Stunden mit 1 nm des synthetischen Androgens R1881 und 10 µm AH174 wie angegeben behandelt. Nach Isolation der mrna und reverser Transkription wurden relative Expressionslevel mittels qpcr bestimmt. Als Referenzgen diente HPRT. Fehlerbalken geben die Standardabweichung von Duplikaten wieder PSA Sekretion durch LNCaP Zellen Einführung PSA, auch Kallikrein 3 genannt, ist ein 33 kda großes Glykoprotein mit Serinprotease Funktion. Es wird von Zellen der Prostata in die Drüsenflüssigkeit sekretiert und ist für eine gute Beweglichkeit der Spermien notwendig (Kim & Coetzee 2004). LNCaP Zellen haben die Fähigkeit, PSA zu sekretieren, als Eigenschaft ihres Ursprungsgewebes beibehalten. In Kultur geben die Zellen PSA ins Zellkulturmedium ab (Papsidero et al. 1981). Die Transkription des PSA kodierenden Gens wird durch den Androgenrezeptor gesteuert und die PSA Sekretion durch LNCaP Zellen kann durch Stimulation mit Androgenen verstärkt werden (Montgomery et al. 1992). Ein Einfluss von LSD1 und JmjC Demethylase Inhibitoren auf die PSA Sekretion von LNCaP Zellen ist in der Literatur nicht beschrieben. Im Zuge dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob Hemmstoffe der LSD1 die PSA Sekretion durch LNCaP Zellen nach Androgenstimulation hemmen. Falls dies der Fall ist, sollte überprüft werden, ob JmjC Demethylase Inhibitoren die gleiche Wirkung haben und der Effekt für ein zelluläres Testsystem für JmjC Demethylase Inhibitoren genutzt werden kann. Das Experiment wurde zunächst mit LSD1 Inhibitoren durchgeführt, weil die in Kapitel beschrie 74

87 4.2. Untersuchung des Einflusses auf die androgeninduzierte Zellantwort benen Ergebnisse zur Unterdrückung der androgenstimulierten Zellproliferation durch JmjC Demethylase Inhibitoren widersprüchlich sind. Eine Bestimmung von PSA auf Proteinebene hat als Methode den Vorteil, dass sie bereits als Bestimmung von PSA in Patientenserum routinemäßig maschinell in Krankenhauslaboratorien durchgeführt wird, da PSA als Marker für Prostatatumore und andere Erkrankungen der Prostata eine Rolle spielt. Für die im Folgenden beschriebenen Experimente wurde die Quantifizierung von PSA in den eingereichten Proben durch das Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin des Universitätsklinikums Freiburg durchgeführt. Zur Erstellung eines Protokolls für die Untersuchung des Effekts von LSD1 Inhibitoren auf die Menge an durch LNCaP Zellen sekretiertem PSA wurden zwei Publikationen herangezogen: Wu et al. haben mit dem Ziel der Produktion von PSA im Milligramm Maßstab gezeigt, dass LNCaP Zellen ohne vorherige Aushungerung mit hormonfreiem Medium auf die Stimulation mit R1881 mit einer starken Produktion von PSA reagieren (Wu et al. 1998). Um eventuell durch die Aushungerung in die icelligence und qpcr Experimente eingeführte Unregelmäßigkeiten in den Zellreaktionen auszuschließen und die Versuche leichter durchführbar zu gestalten, erfolgte ebenfalls die Stimulation von LNCaP Zellen ohne vorherige Aushungerung. Lorenzetti et al. nutzen in ihrem Assay für ihre Studie zur Reproduktionstoxizität von Substanzen die Kombination aus der Quantifizierung des PSA aus den Zellkulturüberständen sowie eines MTS Assays für die in den Wells verbleibenden Zellen (Lorenzetti et al. 2010). Diese Kombination wurde für die vorliegende Arbeit ebenfalls ausgewählt, da sie eine PSA Bestimmung bei gleichzeitiger Überprüfung der Viabilität der PSA produzierenden Zellen ermöglicht. Dadurch wird sicher gestellt, dass eine Reduktion in der PSA Sekretion nicht durch eine verminderte Zellzahl durch zytotoxische oder antiproliferative Effekte der Inhibitoren hervorgerufen wird. Dieser Methode wurde gegenüber einer Zählung der Zellen oder einer Bestimmung des Gesamtproteingehalts der Vorzug gegeben, da diese Vorgehensweisen Waschschritte erfordert hätten und sich LNCaP Zellen dabei sehr leicht von den Zellkulturschalen ablösen Ergebnisse Die Konzentration von PSA im Zellkulturüberstand von LNCaP Zellen liegt bei Stimulation der Zellen mit 1 nm R1881 ohne vorherige Aushungerung deutlich über dem Kontrollwert für unstimulierte Zellen. Dabei wird für eine Anzahl an ausgesäten Zellen von Zellen 75

88 4. Ergebnisse je Well eine Steigerung um den Faktor 2,32 und für Zellen eine Steigerung um den Faktor 1,88 erzielt (Abb. 4 12). Humanes PSA liegt in frischem Zellkulturmedium unter der Bestimmungsgrenze von 0,03 ng/ml. Die gemessene Konzentration an PSA entspricht somit der durch die Zellen sekretierten Menge, ein Hintergrundwert beispielsweise verursacht durch im FCS enthaltenes bovines PSA muss nicht abgezogen werden. Für Folgeexperimente wurde trotz des etwas kleineren Messfenster Zellen je Well als Anzahl an auszusäenden Zellen ausgewählt, da die Dichte der Zellen und die für LNCaP Zellen sehr wichtige Ausgeprägtheit der Zell Zell Kontakte am Ende des Experiments deutlich besser war. Der LSD1 Inhibitor Namolin unterdrückt in einer Konzentration von 50 µm circa 40 % der durch R1881 hervorgerufenen Steigerung der Sekretion von PSA durch LNCaP Zellen. Dieser Reduktion liegen keine zytotoxischen oder antiproliferativen Mechanismen zugrunde, da die mit Namolin behandelten Zellen, in deren Kulturüberständen das PSA quantifiziert wurde, gegenüber den stimulierten und unstimulierten Kontrollzellen keine verminderte Viabilität aufweisen (Abb. 4 13). Die Methode wurde nicht weiter entwickelt und nicht auf JmjC Demethylase Inhibitoren übertragen, da sie die folgenden Mängel aufweist: Sowohl die absoluten PSA Konzentrationen als auch das Ausmaß der Stimulation durch R1881 und der Hemmung durch Namolin schwanken stark zwischen Experimenten. Beispielsweise wurden für die unstimulierte Kontrolle PSA Konzentrationen zwischen 50 ng/ml und 200 ng/ml gemessen und durch Stimulation mit R1881 Steigerungen in der PSA Produktion um den Faktor 1,9 bis 3,5 erreicht. Insgesamt weist die Methode somit eine geringe Reproduzierbarkeit auf. Des Weiteren ist das Signalfenster mit einer circa 40 % Unterdrückung der durch R1881 hervorgerufenen Steigerung in der PSA Produktion durch Namolin in einer Konzentration von 50 µm, was eine in LNCaP Zellen gerade noch nicht toxische Konzentration darstellt (Willmann et al. 2012), als klein zu bewerten. Eine stärkere Senkung der PSA Konzentration im Zellkulturüberstand wird auch durch LSD1 Inhibitoren mit niedrigeren IC 50 Werten als Namolin nicht erreicht (Daten nicht gezeigt). 76

89 4.2. Untersuchung des Einflusses auf die androgeninduzierte Zellantwort Abb. 4 12: Steigerung des PSA Gehalts im Überstand von LNCaP Zellen nach Stimulation mit R1881 in Abhängigkeit von der Ausgangszellzahl Die angegebene Anzahl an LNCaP Zellen wurde ausgesät und nach 24 Stunden mit 1 nm des synthetischen Androgens R1881 stimuliert. Nach 72 Stunden wurden die Zellkulturüberstände entnommen und der PSA Gehalt bestimmt. R1881 steigert für beide Ausgangszellzahlen die Menge an sekretiertem PSA. Fehlerbalken geben die Standardabweichung von biologischen Triplikaten wieder. Abb. 4 13: Namolin hemmt die androgeninduzierte Sekretion von PSA durch LNCaP Zellen. LNCaP Zellen wurde ausgesät und nach 24 Stunden mit 1 nm des synthetischen Androgens R1881 und 50 µm R1881 in den angegebenen Kombinationen behandelt. Nach 72 Stunden wurden die Zellkulturüberstände entnommen und der PSA Gehalt bestimmt. Die Viabilität der Zellen wurde mit Hilfe des MTS Assays untersucht. Es erfolgte eine Normalisierung auf die Werte der unstimulierten Kontrolle. Fehlerbalken geben die Standardabweichung von biologischen Triplikaten wieder. 77

90 4. Ergebnisse Diskussion Die Untersuchungen zum Einfluss von JmjC Demethylase und LSD1 Hemmstoffen auf die androgenstimulierte Zellantwort von LNCaP Zellen in Bezug auf Zellproliferation, Transkription androgenabhängiger Gene und PSA Sekretion ergaben, dass sofern Effekte beobachtet wurden diese nicht als Grundlage eines zellulären Testsystems für JmjC Demethylase Inhibitoren geeignet sind. Der Grund dafür liegt in der mangelnden Robustheit der Systeme sowie der teilweise festgestellten fehlenden Hemmung durch Referenzhemmstoffe. Allgemein weisen zellbasierte Testsysteme eine niedrigere Robustheit auf als In vitro Assays. Den Zellen inherente Faktoren wie die Zeitspanne, die sie bereits in Kultur gehalten wurden, sowie ihre Reaktionen auf minimale, nicht kontrollierbare Schwankungen der Kulturbedingungen spielen dabei eine nicht zu vernachlässigende Rolle. Gerade bei der Untersuchung epigenetischer Effekte, die automatisch nicht nur die Reaktion der Zelle auf durch den Experimentator herbeigeführte unterschiedliche Bedingungen, sondern auch auf ihre künstliche Umwelt und Schwankungen darin beinhalten, könnten letztere in besonderer Weise zum Tragen kommen. Für LNCaP Zellen ist beschrieben, dass sie in Abhängigkeit von ihrer Passagezahl und den Kulturbedingungen unterschiedlich auf eine Stimulation mit R1881 reagieren (Langeler et al. 1993; Esquenet et al. 1997). Beispielsweise wird die Expression von PSA in LNCaP Zellen mit niedriger Passagezahl durch Behandlung mit 0,1 nm R1881 um den Faktor 25 gesteigert, während das Androgen in LNCaP Zellen mit hoher Passagezahl nur eine Steigerung um den Faktor 3 bewirkt (Esquenet et al. 1997). Für diese Arbeit wurden deshalb LNCaP Zellen neu beim Leibniz Institut DSMZ Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen bestellt und nur Zellen mit weniger als 30 in unserer Arbeitsgruppe durchgeführten Passagen verwendet. Die Kultivierung der Zellen erfolgte nach einem Schema mit festgelegten, gleichmäßigen Abständen zwischen den Passagen und festen Subkultivierungsverhältnissen mit dem Ziel, über die Kultivierungszeit hinweg eine möglichst unveränderte Kultur zu erhalten und dadurch wenig Schwankungen über die Zellen in die Assays einzubringen. Die beiden Substanzen AH171 und AH174 wurden in unserer Arbeitsgruppe als Prodrugs von Dicarbonsäuren entwickelt, die JmjC Demethylasen hemmen sollten. Die erste Invitro Testung der Dicarbonsäure von AH171 (vergleiche Kapitel 3.2) sowie die funktionellen und phänotypischen zellulären Effekte der Prodrugs deuteten auf eine Aktivität der Verbindungen gegenüber JmjC Demethylasen hin. Später wurde 78

91 4.3. Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung nachgewiesen, dass die Dicarbonsäuren JMJD2A im LANCE Assay nicht hemmen und die Prodrugs in Immunfluoreszenz Mikroskopieexperimenten keine zelluläre Hypermethylierung hervorrufen (vergleiche Kapitel 3.2 und 4.3.2). Zudem stehen die Unterdrückung der zellulären Androgenantwort durch AH171 und AH174 und die fehlende Hemmung durch später eingesetzte Referenzhemmstoffe sowie den experimentellen Hemmstoff Deferasirox im Widerspruch zueinander. Die in der Einführung vorgestellte Hypothese, dass Inhibitoren von JMJD2C die Androgenantwort von LNCaP Zellen hemmen, beruht lediglich auf Knockdown Experimenten und den Experimenten mit AH171 und AH174. Es ist möglich, dass sie falsch ist oder sich zumindest nicht generell auf Inhibitoren von JMJD2C übertragen lässt. AH171 und AH174 unterdrücken die androgeninduzierte Zellantwort möglicherweise über einen anderen Mechanismus als die Inhibition von JmjC Demethylasen. Dieser wird derzeit aufgeklärt. Anwendung finden könnten die genannten Methoden für den Beweis der biologischen Aktivität von Einzelsubstanzen, wie sie beispielsweise für Namolin publiziert sind (Willmann et al. 2012). Hierzu sollten alle notwendigen Experimente innerhalb einer kurzen Zeitspanne durchgeführt werden, um Schwankungen möglichst gering zu halten. Möglicherweise ließen sich die Versuchsprotokolle zudem durch die Einführung einer Präinkubation mit den Inhibitoren statt einer gleichzeitigen Zugabe von Inhibitor und Androgen verbessern. Dies könnte das Ausmaß der Hemmung des androgeninduzierten Effekts durch den Inhibitor vergrößern Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung Während für andere chromatinmodifizierende Enzyme wie beispielsweise HDACs auch Nicht Histonproteine als Substrate beschrieben sind, setzen JmjC Demethylasen mit wenigen Ausnahmen ausschließlich methylierte Histonproteine um (vergleiche Kapitel 1.3.2). Für die Messung der Akkumulation eines Substrates als unmittelbaren Effekt der Inhibition werden deshalb häufig Histonproteine in hohen Methylierungsstufen herangezogen. Ihre Quantifizierung kann gemeinsam für eine Zellpopulation in einem Western Blot oder auf Ebene der einzelnen Zellen mittels Immunfluoreszenz Mikroskopie erfolgen. 79

92 4. Ergebnisse Western Blots Einführung Die Methode des Western Blots erlaubt die qualitative und semi quantitative Untersuchung von Proteinen. Dabei erfolgt zunächst eine gelelektrophoretische Auftrennung der Proteine nach ihrer Größe mittels Natriumdodecylsulfat Polyacrylamidgelelektrophorese (englisch sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS PAGE). Die Proteine werden dann unter Anlegen eines elektrischen Feldes auf eine Membran übertragen und mit einem primären Antikörper inkubiert, der gegen das nachzuweisende Antigen gerichtet ist. Im Folgeschritt wird ein sekundärer Antikörper zu der Membran gegeben, der an den konstanten Teil des primären Antikörpers bindet. Er trägt zusätzlich einen Markierung, welche der Detektion dient. Häufig wird hierfür das Enzym Meerrettichperoxidase eingesetzt, das nach Zugabe des Substrats Luminol eine Chemolumineszenzreaktion katalysiert. Die Intensität der Chemolumineszenz ist proportional zur vorhandenen Menge des untersuchten Antigens und stellt die Messgröße dar. Western Blots wurden bereits früh in der epigenetischen Forschung für die Untersuchung von acetylierten Histonproteinen, insbesondere bei der Entwicklung von Hemmstoffen der Histondesacetylasen, eingesetzt. Durch Einsatz von HDAC Inhibitoren können oft Steigerungen des Signals für ein acetyliertes Histonprotein auf ein Vielfaches des Ausgangswertes erreicht werden (Wagner 2011). Für den Nachweis der zellulären Wirksamkeit der ersten JmjC Demethylase Inhibitoren wurden in der Literatur vereinzelt Western Blots erfolgreich genutzt: Methylstat erhöht nach 48 Stunden Inkubation in Konzentrationen zwischen 5 und 15 µm unter anderem H3K4me3 und H3K9me3 in KYSE 150 Zellen (Luo et al. 2011). DMOG steigert in mit JMJD2C transfizierten und untransfizierten 293T Zellen H3K9me3 und H3K36me3 in einer Konzentration von 2,5 mm bei 24 Stunden Inkubationszeit (Hamada et al. 2009). In den Western Blots zur Untersuchung der zellulären Aktivität von Methylstat wurde DMOG in einer Konzentration von 1 mm bei einer Inkubationszeit von 48 Stunden als Kontrolle eingesetzt. Die Substanz führt zu einer Erhöhung von H3K4me3 und H3K9me3 in den Zellen (Luo et al. 2011). PBIT steigert H3K4me3 in MCF 7 Zellen in einer Konzentration von 10 µm bei 72 Stunden Inkubationszeit (Sayegh et al. 2013). Dabei ist zu bemerken, dass das Ausmaß der Steigerung der Histonmethylierung für JmjC Demethylase Inhibitoren jeweils deutlich geringer ausfällt als die Steigerung der Histonacetylierung bei vergleichbaren Studien mit HDAC Inhibitoren. Zudem sind wesentlich längere Inkubationszeiten notwendig (24 bis 72 Stunden für JmjC Demethylase Inhibitoren versus circa 4 Stunden für HDAC 80

93 4.3. Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung Inhibitoren), da methylierte Histone in der Zelle eine längere Halbwertszeit aufweisen als acetylierte Histone. Im Rahmen dieser Arbeit sollten Western Blots zunächst in einem Nebenprojekt zur Charakterisierung von HAT Inhibitoren eingesetzt werden. Im nächsten Schritt sollte untersucht werden, ob Western Blots für trimethylierte Histonproteine als Testsystem für JmjC Demethylase Inhibitoren in unserem Labor geeignet wären Exkurs: Untersuchung von Hemmstoffen der Histonacetyltransferasen (HATs) Im folgenden Nebenprojekt sollten Hemmstoffe der HATs mit unterschiedlichen Subtypselektivitäten auf ihre zelluläre Wirkung hin untersucht werden. Bei den Verbindungen handelt es sich um Pyrido und Benzisothiazolone. Die Substanzen ähneln strukturell PBIT, das als JARID1B Hemmstoff beschrieben ist (Sayegh et al. 2013). Ihre Strukturformeln sind in Tabelle 4 9 dargestellt. Für die ersten Vertreter dieser Klassen, PU139 und PU141, wurde bereits gezeigt, dass sie antiproliferativ auf Zelllinien verschiedener solider Tumore wirken und zu einer Hypoacetylierung in den Zelllinien SK N SH (Neuroblastom) und HCT116 (Kolonkarzinom) führen (Furdas et al. 2011; Gajer et al. 2015). Nun sollten Verbindungen hergestellt werden zwischen den Subtypselektivitäten der neuen Inhibitoren und ihren unterschiedlich ausgeprägten antiproliferativen Eigenschaften auf die Zelllinien LNCaP und HL 60. Außerdem sollte beispielhaft für einen der Hemmstoffe an LNCaP Zellen gezeigt werden, dass die Substanz zu einer Hypoacetylierung führt. Die Ergebnisse fanden Eingang in eine Publikation (Furdas et al. 2014). 81

94 4. Ergebnisse Tab. 4 9: Strukturformeln der untersuchten HAT Inhibitoren PU139 T PU141 HTS12959 SC K A P9a Die IC 50 Werte der Verbindungen an den HATs PCAF, Gcn5, CBP und p300 sind in Tabelle 4 10 dargestellt. Sie wurden von Frau Dr. Silviya Furdas in Immunoassays bestimmt. Es ergeben sich unterschiedliche Subtypselektivitäten für die Inhibitoren: Während PU139 als pan Inhibitor der getesteten HAT wirkt, ist PU141 selektiv für die KAT3 Subfamilie gegenüber der KAT2 Subfamilie. K , A und P9a inhibieren selektiv CBP , T und HTS12959SC zeigen eine Selektivität für die KAT2 Subfamilie, wobei T selektiv für PCAF gegenüber GCN5 ist. Insgesamt wirken die getesteten HAT Hemmstoffe stärker antiproliferativ auf HL 60 Zellen als auf LNCaP Zellen (Tab. 4 10). Beispielsweise unterscheiden sich die GI 50 Werte für PU139 und PU141 für die beiden Zelllinien um circa den Faktor 10. Die selektive Inhibition von CBP führt zu einer abgeschwächten Wirkung auf LNCaP Zellen, während die antiproliferativen Eigenschaften gegenüber HL 60 Zellen erhalten bleiben (K , A , P9a). Wird zusätzlich zu CBP auch p300 inhibiert, so wirken die betreffenden Inhibitoren stärker antiproliferativ (PU141). Die selektive Inhibition der KAT2 Subfamilie hat lediglich einen schwachen Einfluss auf die Proliferation von LNCaP Zellen, führt aber zu einer mäßigen bis starken antiproliferativen Wirkung auf HL 60 Zellen ( , T , HTS12959SC). 82

95 4.3. Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung Tab. 4 10: IC50 Werte sowie Ergebnisse des MTS Assays für HAT Inhibitoren Substanz IC 50 ± SE [µm] oder Inhibition bei 50 µm GI 50 ± SE [µm] oder Inhibition bei angegebener Konzentration PCAF KAT2B Gcn5 KAT2A CBP AT3A p300 KAT3B LNCaP HL 60 PU139 9,74 ± 0,24 8,39 ± 0,22 2,49 ± 0,09 5,35 ± 0,36 36 ± 5 3,4 ± 1,8 PU ,0 ± 8,49 87,36 ± 7,93 2,85 ± 0,20 5,92 ± 0,17 37 ± 5 4,1 ± 1,1 K % 42 % 0,44 ± 0,32 55 % 35 % bei 40 µm 5,6 ± 0, ,1 ± 0,75 11,2 ± 1,42 n. t. 24 % 74 ± 7 27 ± 5 T ,82 ± 0,62 50,3 % n. t. 46 % 67 ± 5 29 ± 3 HTS12959SC 13,6 ± 2,58 8,37 ± 0,63 n. t. 31 % 50 ± 4 3,5 ± 1,7 A % 21 % 1,44 ± 1,43 18 % Keine Inhibition bei 40 µm 15 % bei 20 µm P9a 14 % 9 % 1,67 ± 0,46 51 % n. t. 6,6 ± 0,2 Die IC50 Werte an KAT2A, KAT2B, KAT3A und KAT3B wurden von Dr. Silviya Furdas in einem Immunoassay bestimmt (Furdas et al. 2014). Angegeben ist jeweils der Mittelwert aus mindestens 2 unabhängigen Experimenten. n.t. = nicht getestet Um einen Zusammenhang zwischen der antiproliferativen Wirkung der Inhibitoren und einer zellulären HAT Hemmung herzustellen, wurde beispielhaft untersucht, ob es durch PU139 zu einer Hypoacetylierung in LNCaP Zellen kommt. Da die basalen Level an acetyliertem Histon H3 (H3ac) in den Zellen niedrig sind und eine weitere Senkung durch HAT Hemmstoffe nur schlecht nachgewiesen werden kann, erfolgt die Testung unter Zugabe des HDAC Inhibitors SAHA (Wagner 2011). PU139 senkt die durch SAHA hervorgerufene Steigerung von H3ac in LNCaP Zellen (Abb. 4 14). 83

96 4. Ergebnisse H3ac GAPDH SAHA 10 µm x x PU µm x x Abb. 4 14: PU139 senkt die durch SAHA hervorgerufene Steigerung von H3ac in LNCaP Zellen. LNCaP Zellen wurden für 3 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen an Hemmstoffen oder dem reinen Lösungsmittel DMSO behandelt und mit Biorad Ladepuffer lysiert. Die erhaltenen Gesamtzellextrakte wurden mittels SDS PAGE und Western Blot auf Änderungen in H3ac untersucht. Als Ladekontrolle diente GAPDH. Das Ergebnis wurde in einem unabhängigen Experiment bestätigt Western Blots für methylierte Histonproteine Um die Methode des Western Blots als Testsystem für Inhibitoren der JmjC Demethylasen in unserem Labor zu etablieren, wurden zunächst die einzusetzenden Antikörper in Dot Blots auf ihre Spezifität hin überprüft. Der anti H3K9me3 Antikörper unterscheidet korrekt zwischen H3K9me3 und H3K9me2 (Abb. 4 15). Der anti H3K4me3 Antikörper bindet H3K4me3K9me3 mit leichter Kreuzreaktivität gegenüber H3K9me3. Dimethyliertes Lysin 4 in Histon H3 (H3K4me2) erkennt er nicht. Ein reines H3K4me3 Peptid stand zum Zeitpunkt der Testung nicht zur Verfügung (Abb. 4 16). Beide Antikörper sind somit zur Untersuchung der jeweils angegebenen Histonmodifikation im Western Blot geeignet. H3K9me3 H3K9me2 Abb. 4 15: Dot Blot für anti H3K9me3 Antikörper. Lösungen der angegebenen Peptide wurden auf eine Nitrozellulose Membran aufgetragen. Die Membran wurde mit Milch blockiert und mit anti H3K9me3 Antikörper sowie einem sekundären Antikörper inkubiert und das nach Zugabe einer Substratlösung entstehende Signal detektiert. Beide Bilder entstammen einem gemeinsamen Dot Blot und haben die gleichen Helligkeitseinstellungen. Der Antikörper erkennt H3K9me3, nicht jedoch H3K9me2. Das Experiment wurde als Einzelbestimmung durchgeführt. 84

97 4.3. Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung H3K4me3K9me3 H3K9me3 H3K4me2 Abb. 4 16: Dot Blot für anti H3K4me3 Antikörper. Lösungen der angegebenen Peptide wurden auf eine Nitrozellulose Membran aufgetragen. Die Membran wurde mit Milch blockiert und mit anti H3K4me3 Antikörper sowie einem sekundären Antikörper inkubiert und das nach Zugabe einer Substratlösung entstehende Signal detektiert. Die drei Bilder entstammen einem gemeinsamen Dot Blot und haben die gleichen Helligkeitseinstellungen. Der Antikörper bindet stark an H3K4me3K9me3 und schwach an H3K9me3, nicht jedoch an H3K4me2. Das Experiment wurde als Einzelbestimmung durchgeführt. Im nächsten Schritt wurde untersucht, ob mit den in Kapitel genannten Referenzinhibitoren und den in unserer Arbeitsgruppe als In vitro JmjC Demethylase Inhibitoren beschriebenen Eisenchelatoren Deferoxamin und Deferasirox eine Hypermethylierung an H3K4 und H3K9 beobachtet werden kann. Die Inkubationszeit von 48 Stunden und die Durchführung der Testung an der Zelllinie KYSE 150 wurden hierfür aus den für Methylstat publizierten Experimenten übernommen. Für H3K4me3 zeigt sich eine starke Erhöhung durch den Referenzinhibitor DMOG. Die übrigen getesteten Inhibitoren haben keinen Einfluss auf die globalen Level von H3K4me3. Für H3K9me3 ist für keinen der Inhibitoren eine Hypermethylierung sichtbar. Die DMSO Kontrolle liefert im Vergleich zu H3K4me3 eine deutlich kräftigere Bande (Abb. 4 17). Um die Zellen mit dem Inhibitor zu behandeln, während sie konstant wachsen und dadurch möglicherweise ein größeres Signalfenster zu erzielen, wurden KYSE 150 Zellen an den drei der Aussaat für Behandlung und Histonextraktion vorausgehenden Tagen täglich passagiert. Die resultierenden Western Blots zeigen einen Effekt für DMOG an H3K4me3, der schwächer ausgeprägt ist als im Ausgangsblot. Die anderen Inhibitoren haben keinen Effekt. Für H3K9me3 ist wiederum für keinen der Inhibitoren eine Hypermethylierung zu erkennen (Abb. 4 18). 85

98 4. Ergebnisse H3K4me3 H4 DMSO DMOG PBIT Deferoxamin Deferasirox Methylstat Methylstat 1 mm 10 µm 1 µm 1 µm 5 µm 10 µm H3K9me3 H4 DMSO DMOG PBIT Deferoxamin Deferasirox Methylstat Methylstat 1 mm 10 µm 1 µm 1 µm 5 µm 10 µm Abb. 4 17: Western Blots für JmjC Demethylase Inhibitoren KYSE 150 Zellen wurden für 48 Stunden mit Inhibitoren in den angegebenen Konzentrationen behandelt. Die aus den Zellen isolierten Histonproteine wurden mittels SDS PAGE und Western Blot auf Änderungen in H3K4me3 und H3K9me3 untersucht. Als Ladekontrolle diente H4. Das Experiment wurde in dieser Form nicht wiederholt. H3K4me3 H3 DMSO DMOG PBIT Methylstat 1 mm 10 µm 10 µm H3K9me3 H3 DMSO DMOG PBIT Methylstat 1 mm 10 µm 10 µm Abb. 4 18: Western Blots für JmjC Demethylase Inhibitoren nach vorausgegangenem täglichen Passagieren der Zellen KYSE 150 Zellen wurden an drei aufeinanderfolgenden Tagen täglich passagiert und dann für 60 Stunden mit Inhibitoren in den angegebenen Konzentrationen behandelt. Die aus den Zellen isolierten Histonproteine wurden mittels SDS PAGE und Western Blot auf Änderungen in H3K4me3 und H3K9me3 untersucht. Als Ladekontrolle diente H3. Das Experiment wurde in dieser Form nicht wiederholt. 86

99 4.3. Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung Die Bedingungen wurden weiter variiert, indem bei der Aussaat der Zellen für die Behandlung mit Inhibitoren und eine nachfolgende Histonisolierung von einer geringeren Zelldichte ausgegangen wurde. Dabei war das Ziel, ein ausreichendes Signalfenster zu erhalten und einen Effekt für alle Referenzinhibitoren zu sehen. Der Western Blot für H3K4me3 zeigt eine Hypermethylierung für alle eingesetzten Referenzinhibitoren, wobei die Steigerung für DMOG deutlich ausgeprägter ist als für PBIT und Methylstat. Im Western Blot für H3K9me3 ist keine Hypermethylierung erkennbar. Wie auch bei den Ausgangsblots liegt das Signal für die DMSO Kontrolle bei H3K9me3 deutlich höher als bei H3K4me3 (Abb. 4 19). H3K4me3 H3 DMSO DMOG PBIT Methylstat 1 mm 10 µm 10 µm H3K9me3 H3 DMSO DMOG PBIT Methylstat 1 mm 10 µm 10 µm Abb. 4 19: Western Blots für JmjC Demethylase Inhibitoren nach Aussaat verminderter Zellzahl Die Hälfte der für die anderen Western Blots eingesetzten KYSE 150 Zellen wurden ausgesät und für 48 Stunden mit Inhibitoren in den angegebenen Konzentrationen behandelt. Die aus den Zellen isolierten Histonproteine wurden mittels SDS PAGE und Western Blot auf Änderungen in H3K4me3 und H3K9me3 untersucht. Als Ladekontrolle diente H3. Das Experiment wurde in dieser Form nicht wiederholt Diskussion Western Blots sind eine Standardmethode für die Untersuchung der zellulären Aktivität von HDAC und HAT Hemmstoffen. Es werden große Unterschiede in den Acetylierungsleveln zwischen mit potentem Inhibitor und mit Lösungsmittel behandelten Ansätzen erzielt, was die klare Bewertung der zellulären Aktivität neuer Inhibitoren ermöglicht. Auch in dieser Arbeit wurden Western Blots für den Nachweis der intrazellulären HAT Inhibition durch einen Hemmstoff erfolgreich eingesetzt. 87

100 4. Ergebnisse Beim Einsatz von Western Blots zur Untersuchung zellulärer Histon Hypermethylierung tun sich mehrere Schwierigkeiten auf: Zum einen ist auf Grund der geringeren Änderungen der Histonmethylierung über die Zeit eine längere Inkubationszeit mit Inhibitor notwendig. Während für HAT Inhibitoren bereits nach 3 Stunden Inkubation eine deutliche Hypoacetylierung beobachtet werden konnte, sind in der Literatur Histon Hypermethylierungen nach einer Inkubation mit JmjC Demethylase Inhibitoren für 24 bis 72 Stunden beschrieben. In dieser Zeitspanne entfalten die Inhibitoren zusätzlich zu ihrer möglichen hemmenden Wirkung auf JmjC Demethylasen auch ihre antiproliferative Wirkung, so dass es zu stark verminderten Zellzahlen und damit zu einem sehr geringen Proteingehalt in mit höheren Konzentrationen behandelten Proben kommt, was eine Testung dieser vielleicht wirksamen Bedingungen stark erschwert oder unmöglich macht. Des Weiteren ist der erzielte Unterschied zwischen Kontrollzellen und mit Inhibitor behandelten Zellen für JmjC Demethylase Hemmstoffe im Vergleich zu HAT und HDAC Hemmstoffen gering. Dieses kleine Signalfenster verbunden mit der Western Blots inhärenten relativ hohen Standardabweichung erschwert einen sicheren Aktivitätsnachweis. In dieser Arbeit wurden tägliches Passagieren zum Halten der Zellen in der Wachstumsphase sowie unterschiedliche Zellzahlen eingesetzt, um das Signalfenster zu verbessern. Für H3K4me3 konnte das Signalfenster durch Anpassen der Zellzahl soweit verbessert werden, dass eine Hypermethylierung für alle Referenzhemmstoffe beobachtet wurde. Für H3K9me3 wurde unter keiner der getesteten Bedingungen ein Effekt der Hemmstoffe beobachtet. Zur Testung der zugelassenen Eisenchelatoren Deferasirox und Deferoxamin ist anzumerken, dass die Testkonzentration in den ersten Versuchen mit 1 µm deutlich zu niedrig gewählt wurde (vergleiche Kapitel ), so dass für diese Inhibitoren rückblickend kein Effekt zu erwarten war. Weitere Parameter, die optimiert werden könnten, um die Methode zu verbessern und nutzbar zu machen, sind die Inkubationszeit mit Inhibitoren sowie die Zelllinie. Außerdem könnte die Hemmstofflösung im Medium während der Inkubationszeit regelmäßig ausgetauscht werden, um einem Zersetzen der Hemmstoffe im Medium und damit einer Abnahme der Konzentration über die Zeit vorzubeugen. Auch eine Untersuchung der JmjC Demethylase Hemmstoffe in Kombination mit einer festen Konzentration an einem Methyltransferase Hemmstoff ähnlich der Kombination aus HAT Hemmstoffen mit 88

101 4.3. Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung HDAC Hemmstoff wäre möglich. Dies würde eventuell das Signal der DMSO Kontrolle absenken und somit zu einem größeren Signalfenster führen. Ohne weitere Optimierung ist die Methode des Western Blots für H3K9me3 nicht zum Nachweis der intrazellulären Aktivität von JmjC Demethylase Inhibitoren geeignet. Für H3K4me3 ist ein Nachweis der Aktivität einzelner, sehr potenter Hemmstoffe möglich. Zu erwarten wäre ein Effekt in Höhe der für Methylstat und PBIT beobachteten Hypermethylierung. Der Referenzinhibitor DMOG führt zu einer deutlich ausgeprägteren Hypermethylierung, diese wird aber wahrscheinlich auf Grund seiner Unspezifität als dem Cofaktor α Ketoglutarat sehr ähnliches Molekül sowie der als extrem hoch zu bewertenden eingesetzten Konzentration von 1 mm erreicht und ist somit für spezifischere und bei hohen Konzentrationen stärker antiproliferativ wirksame Inhibitoren nicht zu erwarten. Für die Bewertung der zellulären Aktivität aller in unserer Arbeitsgruppe identifizierten In vitro Inhibitoren der JmjC Demethylasen ist die Methode auf Grund ihrer geringen Sensitivität nicht geeignet. Eine Alternative zur globalen Untersuchung der Histonmethylierungslevel im Western Blot stellt ihre promotorspezifische Untersuchung dar. Diese kann beispielsweise mittels Chromatin Immunopräzipitation und nachfolgender Sequenzierung der erhaltenen DNA Fragmente (ChIP seq) durchgeführt werden Immunfluoreszenz Mikroskopie Einführung Die Methode der Immunfluoreszenz Mikroskopie erlaubt es, Histonmodifikationen für eine große Anzahl Zellen in jeder einzelnen Zelle zu quantifizieren und dann den Durchschnitt über die Zellpopulation hinweg zu errechnen. Die Methode ist deshalb gut geeignet für Experimente, bei denen sich die Zellzahlen in den unterschiedlichen Proben stark unterscheiden. Sie wurde in der Literatur mehrfach erfolgreich für den Nachweis der zellulären Aktivität neuer JmjC Demethylase Inhibitoren eingesetzt (vergleiche Kapitel 1.3.4). Nach Inkubation mit dem Inhibitor werden die Zellen fixiert und permeabilisiert sowie mit einem primären Antikörper inkubiert, der gegen die zu untersuchende Histonmodifikation gerichtet ist. Ein sekundärer Antikörper, der ein fluoreszierendes Molekül trägt, dient der Verfolgung des primären Antikörpers. Zusätzlich werden die Zellen mit 4,6 Diamidin 2 phenylindol (DAPI) angefärbt. Diese Substanz ist ein DNA Interkalator und fluoresziert 89

102 4. Ergebnisse nach Bindung an die DNA deutlich stärker als in ungebundener Form (Kapuściński & Skoczylas 1978). Mit einem Fluoreszenzmikroskop werden von jedem Ausschnitt eines Wells zwei Bilder aufgenommen: Eines bei der Emissionswellenlänge des DAPI und eines bei der Emissionswellenlänge der Fluoreszenzmarkierung des sekundären Antikörpers. Die Auswertungssoftware identifiziert Zellkerne über einen Schwellenwert für das DAPI Signal, überträgt die entsprechenden Regionen in das zweite Bild und quantifiziert das Fluoreszenzsignal der Markierung des sekundären Antikörpers für jede der Regionen. Ausgabegrößen sind die Anzahl der Nuklei sowie der Durchschnitt der durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten aller Nuklei im Kanal des sekundären Antikörpers. Mit einem JmjC Demethylase Hemmstoff kann so die Zunahme von beispielsweise H3K9me3 bei steigenden Konzentrationen des Inhibitors verfolgt werden. Um nachzuweisen, dass die beobachtete Zunahme einer Modifikation durch Inhibition der katalytischen Aktivität eines bestimmten Enzyms verursacht wird, kann das Enzym in den Zellen überexprimiert werden. Dazu werden die Zellen vor der Inhibitorinkubation mit einem Plasmid transfiziert, das für das entsprechende Enzym markiert mit einem FLAG Tag kodiert. Während der Anfärbung werden die Zellen dann zusätzlich mit einem primären Antikörper, der gegen den FLAG Tag gerichtet ist, sowie einem entsprechenden sekundären Antikörper inkubiert. Der sekundäre Antikörper ist fluoreszenzmarkiert, so dass erfolgreich transfizierte Zellen mikroskopisch identifiziert werden können. Bei Überexpression einer JmjC Demethylase ist das Fluoreszenzsignal für das methylierte Histon, das sie als Substrat akzeptiert, deutlich reduziert. Wird ein Inhibitor zugesetzt, so nimmt das Signal mit steigender Konzentration des Inhibitors wieder zu. Als Kontrolle dienen Zellen, die mit einer katalytisch inaktiven Form des Enzyms transfiziert sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst Immunfluoreszenz Mikroskopie für H3K9me3 in HeLa Zellen transfiziert mit JMJD2A für einen Referenzinhibitor durchgeführt. Diese Methode war im Arbeitskreis von Prof. Dr. Christopher Schofield an der University of Oxford etabliert und wurde dort unter Anleitung von Dr. Akane Kawamura durchgeführt. Anschließend erfolgte die Testung ausgewählter Vertreter der in unserer Arbeitsgruppe identifizierten In vitro Inhibitoren der JmjC Demethylasen mit diesem System. Um die Testung effizienter zu gestalten und dadurch die Untersuchung einer größeren Anzahl an Substanzen zu ermöglichen, wurde in einem nächsten Schritt Immunfluoreszenz Mikroskopie für H3K9me3 für die Zelllinie KYSE 150 Zellen ohne vorherige Transfektion in unserem Arbeitskreis etabliert. Im letzten Schritt erfolgte die Übertragung der Technik auf die Quantifizierung von H3K4me3 in KYSE 150 Zellen sowie auf die Quantifizierung von H3K9me3 in der Suspensionszelllinie HL 60, um speziellen Fragestellungen nachzugehen. 90

103 4.3. Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung Immunfluoreszenz Mikroskopie für H3K9me3 in tranzfizierten und untransfizierten HeLa Zellen Zunächst wurde untersucht, ob HeLa Zellen erfolgreich mit JMJD2A transfiziert werden können und das Enzym in den Zellen katalytisch aktiv ist. Mit JMJD2A transfizierte HeLa Zellen weisen in der Region des Nukleus ein durchschnittliches Fluoreszenzsignal von 52,8 ± 6,9 relativen Fluoreszenzeinheiten (englisch relative fluorescence units, RFU) für H3K9me3 auf, während es bei untransfizierten Zellen bei 187 ± 1 RFU liegt. Das Signal für den FLAG Tag des Enzyms ist deckungsgleich mit dem DAPI Signal (Abb. 4 20). Somit wird das Enzym in transfizierten Zellen in einer für den Assay ausreichenden Menge exprimiert, es lokalisiert korrekt in den Zellkern und ist enzymatisch aktiv gegenüber seinem natürlichen Substrat H3K9me3. Die Nuklei der transfizierten Zellen sehen unverändert aus, insbesondere tritt keine Fragmentierung des Zellkerns auf, welche auf eine Apoptose hinweisen würde (Abb. 4 20). Die Zellen sind somit auch mit überexprimiertem JMJD2A für die Dauer des Assays lebensfähig und leiten keine apoptotischen Prozesse ein. Für HeLa Zellen, die katalytisch inaktives JMJD2A überexprimieren, liegt das H3K9me3 Signal bei durchschnittlich 185 ± 7 RFU und entspricht damit dem Signal in untransfizierten Zellen (Abb. 4 21). Das niedrige H3K9me3 Signal der mit JMJD2A transfizierten Zellen ist somit nicht auf den Transfektionsprozess, sondern auf die katalytische Aktivität des eingebrachten Enzyms zurückzuführen. 91

104 4. Ergebnisse DAPI Anti FLAG Anti H3K9me3 JMJD2A WT Abb. 4 20: Effekt der Transfektion mit JMJD2A auf HeLa Zellen. HeLa Zellen wurden mit JMJD2A markiert mit FLAG Tag transfiziert, nach 24 Stunden fixiert und mit DAPI sowie Antikörpern gegen die FLAG Markierung und H3K9me3 angefärbt. Die mikroskopischen Aufnahmen wurden bei 20 facher Vergrößerung gemacht. Transfizierte Zellen zeigen keine Veränderungen des Zellkerns, die ein Hinweis auf eintretende apoptotische Prozesse wären. Das eingebrachte JMJD2A ist korrekt im Zellkern lokalisiert und reduziert H3K9me3 in den transfizierten Zellen. Der gezeigte Ausschnitt ist beispielhaft für ein Experiment, in dem über 50 transfizierte Zellen analysiert wurden. DAPI Anti FLAG Anti H3K9me3 JMJD2A WT JMJD2A H188A Abb. 4 21: Vergleich von HeLa Zellen transfiziert mit katalytisch aktivem bzw. inaktivem JMJD2A. HeLa Zellen wurden mit Wildtyp (WT) bzw. durch den Austausch von Histidin in Position 188 gegen Alanin (H188A) katalytisch inaktivem JMJD2A transfiziert, nach 24 Stunden fixiert und mit DAPI sowie Antikörpern gegen H3K9me3 und die FLAG Markierung der Enzyme angefärbt. Die mikroskopischen Aufnahmen wurden bei 10 facher Vergrößerung gemacht. Beide Plasmide werden in den Zellen exprimiert und ihre Produkte lokalisieren korrekt in den Zellkern. Nur mit dem Wildtyp transfizierte Zellen zeigen eine Reduktion von H3K9me3, während die Transfektion mit der katalytisch inaktiven Mutante keinen Effekt auf H3K9me3 hat. Der gezeigte Ausschnitt ist beispielhaft für ein Experiment, in dem über 30 transfizierte Zellen für den Wildtyp und über 100 transfizierte Zellen für die katalytisch inaktive Mutante analysiert wurden. 92

105 4.3. Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung Für die Inhibitortestung wurde IOX1 als Referenzinhibitor ausgewählt, da die Substanz im Labor von Prof. Schofield standardmäßig dafür eingesetzt wird. Der zelluläre EC 50 des Referenzinhibitors IOX1 in HeLa Zellen, die mit JMJD2A transfiziert waren, wurde für eine Inkubationszeit von 24 Stunden als 73,4 ± 5,7 µm bestimmt (Abb und Abb. 4 23). Literaturangaben zufolge liegt er bei 86,5 ± 1,2 µm (King et al. 2010). Die Methode liefert somit unter Benutzung der getesteten Chargen an Plasmiden korrekte Ergebnisse für die Testung von Hemmstoffen der JmjC Demethylase JMJD2A. Sie kann für die Untersuchung der zellulären Potenz neuer In vitro Hemmstoffe eingesetzt werden. Zusätzlich zu seinem Effekt auf transfizierte Zellen erhöht IOX1 auch in nicht transfizierten Zellen H3K9me3 (Abb und Abb. 4 23). Dieser Effekt ist sowohl auf die Hemmung des endogenen JMJD2A als auch auf die Hemmung anderer JmjC Demethylasen zurückzuführen, die ebenfalls H3K9me3 als Substrat akzeptieren. Der EC 50 Wert für die Steigerung von H3K9me3 in untransfizierten Zellen für IOX1 liegt in einem ähnlichen Bereich wie für transfizierte Zellen (Abb. 4 22). Ein Literaturwert existiert nicht. IOX1 transfiziert IOX1 untransfiziert Abb. 4 22: IOX1 erhöht dosisabhängig H3K9me3 in HeLa Zellen. HeLa Zellen wurden mit JMJD2A transfiziert und für 24 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen an IOX1 behandelt. Die Quantifizierung von H3K9me3 erfolgte durch Immunfluoreszenz Mikroskopie. Der EC50 von IOX1 in mit JMJD2A transfizierten HeLa Zellen beträgt 73,4 ± 5,7 µm. Die Dosis Wirkungskurven wurden aus den Daten eines Experiments mit einem Well je Konzentration aufgestellt. Dargestellt ist jeweils der für die angegebene Anzahl an Zellen erhaltene Mittelwert, Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts wieder. 93

106 4. Ergebnisse DAPI Anti FLAG Anti H3K9me3 DMSO IOX1 300 µm Abb. 4 23: IOX1 erhöht H3K9me3 in mit JMJD2A transfizierten und in untransfizierten HeLa Zellen. HeLa Zellen wurden mit JMJD2A mit FLAG Tag transfiziert, nach 24 Stunden Inkubation mit 300 µm IOX1 fixiert und mit DAPI sowie Antikörpern gegen die FLAG Markierung und H3K9me3 angefärbt. Die mikroskopischen Aufnahmen wurden bei 20 facher Vergrößerung gemacht. IOX1 erhöht das durch Transfektion mit JMJD2A erniedrigte Level an H3K9me3 in transfizierten Zellen und führt außerdem zu einer Zunahme von H3K9me3 in nicht transfizierten Zellen im Vergleich zu den mit dem reinen Lösungsmittel DMSO behandelten Kontrollzellen. Die Aufnahmen sind beispielhaft für das in Abbildung 4 22 dargestellte Experiment. Mit Hinblick auf einen eventuellen späteren Einsatz als Referenzhemmstoffe in anderen Experimenten wurde überprüft, ob die Inhibitoren JIB 04 und Methylstat ebenfalls H3K9me3 in mit JMJD2A transfizierten HeLa Zellen erhöhen. Für JIB 04 ist die Inhibition von JmjC Demethylasen in verschiedenen Zelllinien durch funktionelle Effekte nachgewiesen (Wang et al. 2013), eine Untersuchung des Effekts auf die Methylierungslevel der Histone steht jedoch aus. Methylstat hingegen erhöht laut Literaturangaben H3K9me3 in HeLa Zellen, die JMJD2C überexprimieren, und in KYSE 150 Zellen. Dies wurde mittels Immunfluoreszenz Mikroskopie und Western Blot nachgewiesen (Luo et al. 2011). Im Immunfluoreszenz Mikroskopieexperiment erhöht JIB 04 H3K9me3 in transfizierten und nicht transfizierten HeLa Zellen. Der EC 50 beträgt 6,8 ± 0,5 µm für transfizierte Zellen und 5,6 ± 1,5 µm für nicht transfizierte Zellen (Abb und Abb. 4 25). Hingegen zeigt Methylstat in Konzentrationen bis zu 10 µm keinen Effekt auf H3K9me3. In Konzentrationen von 30 bis 100 µm wirkt es stark toxisch auf die Zellen, was eine Bestimmung des H3K9me3 Levels unmöglich macht (Abb. 4 25). Dieser Widerspruch zu den publizierten Daten könnte in der Überexpression von JMJD2A statt JMJD2C wie in den publizierten Versuchen oder in der gewählten Inkubationszeit von 24 statt 48 Stunden begründet 94

107 4.3. Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung liegen. Da bereits auch die Erhöhung von H3K4me3 und H3K9me3 in KYSE 150 Zellen im Western Blot für Methylstat nicht reproduziert werden konnte (vergleiche Kapitel ), wurde dieser Hemmstoff nicht weiter eingesetzt. DAPI Anti FLAG Anti H3K9me3 DMSO JIB µm Abb. 4 24: JIB 04 erhöht H3K9me3 in mit JMJD2A transfizierten und in untransfizierten HeLa Zellen. HeLa Zellen wurden mit JMJD2A mit FLAG Tag transfiziert, nach 24 Stunden Inkubation mit 30 µm JIB 04 fixiert und mit DAPI sowie Antikörpern gegen die FLAG Markierung und H3K9me3 angefärbt. Die mikroskopischen Aufnahmen wurden bei 20 facher Vergrößerung gemacht. JIB 04 erhöht das durch Transfektion mit JMJD2A erniedrigte Level an H3K9me3 in transfizierten Zellen und führt außerdem zu einer Zunahme von H3K9me3 in nicht transfizierten Zellen im Vergleich zu den mit dem reinen Lösungsmittel DMSO behandelten Kontrollzellen. Die Aufnahmen sind beispielhaft für das in Abbildung 4 25 dargestellte Experiment. 95

108 4. Ergebnisse JIB 04 transfiziert JIB 04 untransfiziert Methylstat transfiziert Methylstat untransfiziert Abb. 4 25: JIB 04 erhöht dosisabhängig H3K9me3 in HeLa Zellen, Methylstat hat keinen Effekt. HeLa Zellen wurden mit JMJD2A transfiziert und für 24 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen an Inhibitoren behandelt. Die Quantifizierung von H3K9me3 erfolgte durch Immunfluoreszenz Mikroskopie. Der EC50 von JIB 04 beträgt 6,8 ± 0,5 µm in mit JMJD2A transfizierten HeLa Zellen und 5,6 ± 1,5 µm in untransfizierten HeLa Zellen. Methylstat steigert H3K9me3 in HeLa Zellen nicht. Die Dosis Wirkungskurven wurden aus den Daten eines Experiments mit einem Well je Konzentration aufgestellt. Dargestellt ist jeweils der für die angegebene Anzahl an Zellen erhaltene Mittelwert, Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts an. 96

109 4.3. Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung Im nächsten Schritt wurde die Charakterisierung der neuen Hemmstoffe durchgeführt: Hierzu wurden in einem ersten Screening zunächst ein bis zwei Vertreter jeder Substanzklasse mit dem bestehenden Testsystem getestet. Diese Vorgehensweise war auf Grund der begrenzten Kapazität des Testsystems notwendig. Die Auswahl erfolgte in Abhängigkeit der IC 50 Werte und der zu erwartenden zellulären Potenz, welche anhand der Molekülstruktur und des ermittelten GI 50 Wertes beurteilt wurde. Aus der Gruppe der zugelassenen Eisenchelatoren und ihrer Derivate wurden Deferoxamin, Deferasirox und MR05 für die Testung ausgewählt. Alle drei Substanzen zeigen einen starken Effekt auf H3K9me3 sowohl in transfizierten als auch in nicht transfizierten HeLa Zellen. Die EC 50 Werte von Deferasirox und Deferoxamin sind ähnlich und liegen sowohl für transfizierte als auch für nicht transfizierte HeLa Zellen im Konzentrationsbereich zwischen 100 und 300 µm. MR05, der Methylester von Deferasirox, führt bereits bei einer Konzentration von 10 µm zu einem Anstieg von H3K9me3. Die höhere Potenz liegt wahrscheinlich in einer besseren Zellgängigkeit der Substanz begründet. Bei Konzentrationen über 60 µm kristallisiert MR05 im Zellkulturmedium aus, was eine Testung in diesem Bereich unmöglich macht (Abb und Abb. 4 27). Deferoxamin transfiziert Deferoxamin untransfiziert 97

110 4. Ergebnisse Deferasirox transfiziert Deferasirox untransfiziert MR05 transfiziert MR05 untransfiziert Abb. 4 26: Deferoxamin, Deferasirox und MR05 erhöhen dosisabhängig H3K9me3 in HeLa Zellen. HeLa Zellen wurden mit JMJD2A transfiziert und für 24 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen an Inhibitoren behandelt. Die Quantifizierung von H3K9me3 erfolgte durch Immunfluoreszenz Mikroskopie. Der EC50 von Deferoxamin beträgt 137 ± 61 µm in mit JMJD2A transfizierten HeLa Zellen, für die anderen Substanzen ergibt sich keine vollständige Dosis Wirkungskurve. Die Dosis Wirkungskurven wurden aus den Daten eines Experiments mit einem Well je Konzentration aufgestellt. Dargestellt ist jeweils der für die angegebene Anzahl an Zellen erhaltene Mittelwert, Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts wieder. 98

111 4.3. Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung DAPI Anti FLAG Anti H3K9me3 Deferoxamin 300 µm Deferasirox 300 µm MR05 30 µm Abb. 4 27: Deferoxamin, Deferasirox und MR05 erhöhen H3K9me3 in HeLa Zellen. HeLa Zellen wurden mit JMJD2A mit FLAG Tag transfiziert, nach 24 Stunden Inkubation mit den Hemmstoffen in den angegebenen Konzentrationen fixiert und mit DAPI sowie Antikörpern gegen die FLAG Markierung und H3K9me3 angefärbt. Die mikroskopischen Aufnahmen wurden bei 10 facher Vergrößerung gemacht. Deferoxamin, Deferasirox und MR05 erhöhen das durch Transfektion mit JMJD2A erniedrigte Level an H3K9me3 in transfizierten Zellen. Die Aufnahmen sind beispielhaft für das in Abbildung 4 26 dargestellte Experiment. Die Substanzen MR11 und MR13 aus der Klasse der Pyridylpyrimidine erhöhen das Level an H3K9me3 weder in mit JMJD2A transfizierten noch in untransfizierten HeLa Zellen. Die unpolarere Substanz, MR13, kann nur in Konzentrationen bis 30 µm getestet werden, da sie bei höheren Konzentrationen im Zellkulturmedium auskristallisiert (Abb und Abb. 4 29). 99

112 4. Ergebnisse DAPI Anti FLAG Anti H3K9me3 MR11 30 µm MR13 30 µm Abb. 4 28: MR11 und MR13 haben keinen Effekt auf H3K9me3 in HeLa Zellen. HeLa Zellen wurden mit JMJD2A mit FLAG Tag transfiziert, nach 24 Stunden Inkubation mit den Hemmstoffen in den angegebenen Konzentrationen fixiert und mit DAPI sowie Antikörpern gegen die FLAG Markierung und H3K9me3 angefärbt. Die mikroskopischen Aufnahmen wurden für MR11 bei 10 facher Vergrößerung und für MR13 bei 20 facher Vergrößerung gemacht. MR11 und MR13 erhöhen das durch Transfektion mit JMJD2A erniedrigte Level an H3K9me3 in transfizierten Zellen nicht. Die Aufnahmen sind beispielhaft für das in Abbildung 4 29 dargestellte Experiment. MR11 transfiziert MR11 untransfiziert 100

113 4.3. Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung MR13 transfiziert MR13 untransfiziert Abb. 4 29: Die Pyridylpyrimidine MR11 und MR13 rufen in HeLa Zellen keine Zunahme von H3K9me3 hervor. HeLa Zellen wurden mit JMJD2A transfiziert und für 24 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen an Inhibitoren behandelt. Die Quantifizierung von H3K9me3 erfolgte durch Immunfluoreszenz Mikroskopie. MR11 und MR13 steigern weder in transfizierten noch in untransfizierten HeLa Zellen H3K9me3. Die Unterschiede in den Fluoreszenzwerten für MR11 und MR13 sind darin begründet, dass die Bilder mit unterschiedlichen Belichtungszeiten aufgenommen wurden. Die Dosis Wirkungskurven wurden aus den Daten eines Experiments mit einem Well je Konzentration aufgestellt. Dargestellt ist jeweils der für die angegebene Anzahl an Zellen erhaltene Mittelwert, Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts wieder. Aus der Reihe der AH Substanzen wurden die Prodrugs AH171 und AH174 sowie als Negativkontrolle das Carbonsäurederivat von AH174, AH177, getestet. Von AH177 war auf Grund seiner hohen Polarität nur in vitro eine Wirkung zu erwarten. AH171 erhöht H3K9me3 bei Konzentrationen ab 30 µm in transfizierten und untransfizierten HeLa Zellen, erreicht dabei jedoch nicht die gleichen maximalen Fluoreszenzwerte wie die Positivkontrolle IOX1 im gleichen Experiment. AH174 und die Negativkontrolle AH177 haben keinen Effekt (Abb und Abb. 4 31). Für diese Substanzen war insbesondere von Interesse, ob sie bei einer Konzentration von 10 µm H3K9me3 erhöhen, da bei dieser Konzentration eine Unterdrückung der androgeninduzierten Zellantwort beobachtet worden war (vergleiche Kapitel 4.2). Bei einer Konzentration von 10 µm erhöht keine der Substanzen H3K9me3 in HeLa Zellen. Somit sind die beobachteten phänotypischen und funktionellen Effekte wahrscheinlich nicht in der Inhibition von JmjC Demethylasen begründet (vergleiche Kapitel 4.2.6). 101

114 4. Ergebnisse AH171 transfiziert AH171 untransfiziert AH174 transfiziert AH174 untransfiziert 102

115 4.3. Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung AH177 transfiziert AH177 untransfiziert Abb. 4 30: Die Substanzen der AH Reihe rufen in HeLa Zellen keine bzw. nur eine leichte Zunahme von H3K9me3 hervor. HeLa Zellen wurden mit JMJD2A transfiziert und für 24 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen an Inhibitoren behandelt. Die Quantifizierung von H3K9me3 erfolgte durch Immunfluoreszenz Mikroskopie. AH174 und AH177 steigern weder in transfizierten noch in untransfizierten HeLa Zellen H3K9me3, AH171 hat bei höheren Konzentrationen einen Effekt auf H3K9me3. Die Dosis Wirkungskurven wurden aus den Daten eines Experiments mit einem Well je Konzentration aufgestellt. Dargestellt ist jeweils der für die angegebene Anzahl an Zellen erhaltene Mittelwert, Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts wieder. 103

116 4. Ergebnisse DAPI Anti FLAG Anti H3K9me3 AH µm AH µm AH µm Abb. 4 31: AH171, AH174 und AH177 haben keinen bzw. nur einen schwachen Effekt auf H3K9me3 in HeLa Zellen. HeLa Zellen wurden mit JMJD2A mit FLAG Tag transfiziert, nach 24 Stunden Inkubation mit den Hemmstoffen in den angegebenen Konzentrationen fixiert und mit DAPI sowie Antikörpern gegen die FLAG Markierung und H3K9me3 angefärbt. Die mikroskopischen Aufnahmen wurden bei 20 facher Vergrößerung gemacht. AH174 und AH177 erhöhen das durch Transfektion mit JMJD2A erniedrigte Level an H3K9me3 in transfizierten Zellen nicht, AH171 ruft eine schwache Steigerung hervor. Die Aufnahmen sind beispielhaft für das in Abbildung 4 30 dargestellte Experiment. Weder die Hydroxamsäure LM97 noch das Tetrazol NR001 bewirken eine Steigerung von H3K9me3 in HeLa Zellen (Abb und Abb. 4 33). 104

117 4.3. Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung LM97 transfiziert LM97 untransfiziert NR001 transfiziert NR001 untransfiziert Abb. 4 32: LM97 und NR001 rufen in HeLa Zellen keine Zunahme von H3K9me3 hervor. HeLa Zellen wurden mit JMJD2A transfiziert und für 24 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen an Inhibitoren behandelt. Die Quantifizierung von H3K9me3 erfolgte durch Immunfluoreszenz Mikroskopie. Die Substanzen steigern weder in transfizierten noch in untransfizierten HeLa Zellen H3K9me3. Die Dosis Wirkungskurven wurden aus den Daten eines Experiments mit einem Well je Konzentration aufgestellt. Dargestellt ist jeweils der für die angegebene Anzahl an Zellen erhaltene Mittelwert, Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts wieder. 105

118 4. Ergebnisse DAPI Anti FLAG Anti H3K9me3 LM µm NR µm Abb. 4 33: LM97 und NR001 haben keinen Effekt auf H3K9me3 in HeLa Zellen. HeLa Zellen wurden mit JMJD2A mit FLAG Tag transfiziert, nach 24 Stunden Inkubation mit den Hemmstoffen in den angegebenen Konzentrationen fixiert und mit DAPI sowie Antikörpern gegen die FLAG Markierung und H3K9me3 angefärbt. Die mikroskopischen Aufnahmen wurden bei 20 facher Vergrößerung gemacht. Die Inhibitoren erhöhen das durch Transfektion mit JMJD2A erniedrigte Level an H3K9me3 in transfizierten Zellen nicht. Die Aufnahmen sind beispielhaft für das in Abbildung 4 32 dargestellte Experiment. Nach der beschriebenen Testung einzelner Vertreter der in unserer Arbeitsgruppe identifizierten Klassen in vitro aktiver JmjC Demethylase Inhibitoren sollten einzelne Klassen durch Testung einer größeren Anzahl ihrer Vertreter näher charakterisiert werden. Ein Problem stellte dabei die geringe Transfektionseffizienz der Plasmide für den JMJD2A Wildtyp und die H188A Mutante dar. Sie lag im Bereich zwischen 2 und 10 % und konnte durch erneute Vermehrung und Aufreinigung der Plasmide sowie durch Optimierung des Verhältnisses von DNA zu Transfektionsreagenz nicht verbessert werden. Dies schränkt je nach Durchführung den Durchsatz oder die Aussagekraft des einzelnen Experiments ein, da je Ansatz nur eine geringe Zahl an transfizierten Zellen erreicht wird. Mit dem Ziel, den Transfektionsschritt zu umgehen, aber trotzdem ein großes Signalfenster zu erhalten, wurde im Folgenden die Methode der Immunfluoreszenz Mikroskopie für H3K9me3 auf KYSE 150 Zellen übertragen. Diese Zelllinie trägt ein Amplikon von JMJD2C und weist besonders hohe Level an mrna für JMJD2C auf (Yang et al. 2000). Gleichzeitig ermöglicht die Umstellung der Methode eine direkte 106

119 4.3. Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung Gegenüberstellung der Ergebnisse des MTS Assays und der Immunfluoreszenz Mikroskopie Immunfluoreszenz Mikroskopie für H3K9me3 in KYSE 150 Zellen Die Inkubationszeit wurde zunächst auf 72 Stunden festgesetzt, da in der Literatur für JmjC Demethylase Inhibitoren Inkubationszeiten zwischen 48 und 72 Stunden für untransfizierte Zellen angewendet werden und diese Zeitspanne außerdem der Inkubationszeit mit Inhibitor im MTS Assay entspricht. Der EC 50 für den Referenzinhibitor IOX1 liegt bei dieser Inkubationszeit bei 10,0 ± 0,6 µm (Abb und Abb. 4 35). Der Literaturwert für untransfizierte HeLa Zellen liegt für die gleiche Inkubationszeit bei circa 100 µm (Rotili et al. 2014). Somit sind KYSE 150 Zellen deutlich empfindlicher gegenüber dem Referenzinhibitor als HeLa Zellen. Dies ist für die Testung günstig, da durch die höhere Empfindlichkeit auch Inhibitoren mit höheren EC 50 Werten noch als solche erkannt und nicht als unwirksam bewertet werden. IOX1 Abb. 4 34: IOX1 erhöht dosisabhängig H3K9me3 in KYSE 150 Zellen. KYSE 150 Zellen wurden für 72 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen an IOX1 behandelt. Die Quantifizierung von H3K9me3 erfolgte durch Immunfluoreszenz Mikroskopie. Der EC50 von IOX1 beträgt 10,0 ± 0,6 µm. Die Dosis Wirkungskurven wurden aus den Daten eines Experiments mit einem Well je Konzentration aufgestellt. Dargestellt ist jeweils der für die angegebene Anzahl an Zellen erhaltene Mittelwert, Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts wieder. 107

120 4. Ergebnisse DAPI Anti H3K9me3 DMSO IOX1 30 µm Abb. 4 35: IOX1 erhöht H3K9me3 in KYSE 150 Zellen. KYSE 150 Zellen wurden für 72 Stunden mit IOX1 inkubiert, fixiert und mit DAPI sowie einem primären Antikörper gegen H3K9me3 und einem fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper angefärbt. Die mikroskopischen Aufnahmen wurden bei 10 facher Vergrößerung gemacht. H3K9me3 ist in den mit IOX1 behandelten Zellen im Vergleich zu den mit dem reinen Lösungsmittel DMSO behandelten Kontrollzellen deutlich erhöht. Die Aufnahmen sind beispielhaft für das in Abbildung 4 34 dargestellte Experiment. Für die Testung der neuen Inhibitoren wurden analog zur Testung in transfizierten HeLa Zellen Bestimmungen mit neun Konzentrationen je Inhibitor durchgeführt. Für jede Konzentration wurde ein Well einer Mikrotiterplatte eingesetzt. Dieser Methode wurde gegenüber einem Vortest bei wenigen Konzentrationen mit anschließender GI 50 Bestimmung der wirksamen Substanzen der Vorzug gegeben, da bei Immunfluoreszenz Mikroskopieexperimenten häufig einzelne Wells als Ausreißer auftreten und die Dosis Wirkungs Kurven manchmal bei hohen Konzentrationen wieder abfallen. Dadurch können Vortests mit wenigen Konzentrationen sowohl falsch positive als auch falsch negative Ergebnisse liefern. Um zu testen, inwieweit die Genauigkeit durch Mehrfachbestimmungen erhöht wird, wurden die neuen Inhibitoren MR23 und MR25 mit drei Wells für jede von insgesamt 9 Konzentrationen getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 11 dargestellt. Die erhaltenen EC 50 Werte für jede Konzentrationsreihe überlappen sich in ihren Standardfehlern und sind dem unter Einbeziehung aller Werte ermittelten EC 50 Wert sehr ähnlich. Der mit einer einzelnen Dosis Wirkungskurve ermittelte Wert hat somit einen hohen prädiktiven Charakter. Für die Testung neuer Inhibitoren liefert die Bestimmung mit einer einzelnen 108

121 4.3. Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung Konzentrationsreihe ein ausreichend exaktes Ergebnis und ist wegen des damit verbundenen höheren Durchsatzes und geringeren Reagenzienverbrauchs vorzuziehen. Zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse wurde der EC 50 Wert für den Referenzinhibitor IOX1 an KYSE 150 Zellen wiederholt in voneinander unabhängigen Experimenten bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 12 dargestellt. Die ermittelten Werte liegen alle innerhalb der durch ihre Standardfehler definierten Unsicherheit. Die Methode weist somit eine gute Robustheit auf. Tab. 4 11: Vergleich der Bestimmung von EC50 Werten in Triplikaten mit den Ergebnissen der Einzelmessungen Inhibitor EC 50 aus 1. Datenreihe EC 50 aus 2. Datenreihe EC 50 aus 3. Datenreihe EC 50 aus Mittelwerten MR23 1,6 ± 0,4 µm 3,2 ± 1,2 µm 2,7 ± 1,5 µm 2,5 ± 0,4 µm MR25 1,6 ± 0,4 µm 2,4 ± 0,5 µm 1,7 ± 0,1 µm 1,8 ± 0,1 µm Angegeben ist jeweils der EC50 ± SE bestimmt aus einer Dosis Wirkungskurve mit 9 Messpunkten. Es wurde ein Well je Konzentration eingesetzt. Die rechte Spalte gibt den EC50 ± SE aus der Dosis Wirkungskurve wieder, die aus den Mittelwerten der Messwerte der drei Datenreihen aufgestellt wurde. Tab. 4 12: Reproduzierbarkeit der Bestimmung von EC50 Werten mittels Immunfluoreszenz Mikroskopie Inhibitor EC 50 bestimmt an Tag 1 EC 50 bestimmt an Tag 2 EC 50 bestimmt an Tag 3 Mittelwert der EC 50 Werte IOX1 10,0 ± 0,6 µm 12,6 ± 1,8 µm 13,5 ± 3,7 µm 12,0 ± 1,8 µm Angegeben ist jeweils der EC50 ± SE bestimmt aus einer Dosis Wirkungskurve mit 9 Messpunkten. Es wurde ein Well je Konzentration eingesetzt. Die rechte Spalte gibt den Mittelwert der anderen Werte an. Zur Untersuchung des Einflusses der Inkubationszeit auf den Grad der Hypermethylierung und den antiproliferativen Effekt der Inhibitoren wurde Immunfluoreszenz Mikroskopie für H3K9me3 für die Referenzinhibitoren IOX1 und JIB 04 sowie den bereits in Experimenten mit HeLa Zellen wirksamen neuen JmjC Demethylase Inhibitor Deferasirox für Inkubationszeiten von 24, 48 und 72 Stunden durchgeführt. In Abbildung 4 36 sind die Ergebnisse für IOX1 dargestellt, JIB 04 und Deferasirox bestätigten die für IOX1 erhaltenen Trends (nicht gezeigt). Der EC 50 Wert beträgt für eine Inkubationszeit von 48 Stunden 23,0 ± 14,6 µm und für eine Inkubationszeit von 72 Stunden 13,5 ± 3,7 µm. Eine klar dosisabhängige Hypermethylierung ist ab einer Inkubationszeit von 48 Stunden 109

122 4. Ergebnisse zu beobachten. Der maximal erreichte Grad der Methylierung im Vergleich zur DMSO Kontrolle nimmt mit steigender Inkubationszeit zu, während der EC 50 Wert abnimmt. Eine im Vergleich zur DMSO Kontrolle verminderte Zellzahl tritt stets ab den Konzentrationen auf, bei denen auch die Hypermethylierung einsetzt (Abb. 4 36). Für die folgenden Experimente wurden 72 Stunden als Inkubationszeit beibehalten, da diese Zeitspanne das größte Fenster sowohl für das Fluoreszenzsignal als auch für die messbaren EC 50 Werte liefert. Das Testsystem wurde mit den so optimierten Parametern für die Testung der in unserer Arbeitsgruppe entdeckten In vitro JmjC Demethylase Inhibitoren eingesetzt. IOX1 wurde dabei in allen Experimenten als Positivkontrolle mitgeführt, um mögliche Probleme im Testsystem direkt bei ihrem Auftreten aufzudecken. Es wurden alle Vertreter der Klasse von Deferasirox und seinen Derivaten sowie der Klasse der Pyridylpyrimidine getestet, weil für diese Gruppen der Einfluss einzelner Modifikationen am Molekül auf ihre zelluläre Wirksamkeit auf H3K9me3 untersucht werden sollte. Zusätzlich wurden einzelne Vertreter der anderen Inhibitorklassen für die Testung ausgewählt. Diese hatten sich zwar an mit JMJD2A transfizierten HeLa Zellen als unwirksam erwiesen, wurden aber auf Grund der größeren Empfindlichkeit des neuen Testsystems der Immunfluoreszenz Mikroskopie für H3K9me3 in KYSE 150 Zellen sowie der Tatsache, dass an HeLa Zellen teilweise nur ein Vertreter je Klasse getestet werden konnte, erneut getestet. 110

123 4.3. Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung IOX1 24 Stunden IOX1 48 Stunden IOX1 72 Stunden Abb. 4 36: Abhängigkeit der durch IOX1 hervorgerufenen Zunahme an H3K9me3 von der Inkubationszeit mit Inhibitor KYSE 150 Zellen wurden für 24, 48 oder 72 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen an IOX1 behandelt. Die Quantifizierung von H3K9me3 erfolgte durch Immunfluoreszenz Mikroskopie. Die Dosis Wirkungskurven wurden aus den Daten eines Experiments mit einem Well je Konzentration aufgestellt. Dargestellt ist jeweils der für die angegebene Anzahl an Zellen erhaltene Mittelwert, Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts wieder. 111

124 4. Ergebnisse Sowohl Deferasirox als auch alle seine Derivate erhöhen H3K9me3 in KYSE 150 Zellen (Abb und Abb. 4 38). Dies bestätigt die positiven Ergebnisse aus dem Experiment mit transfizierten HeLa Zellen (siehe Kapitel ). Deferasirox weist dabei mit 40,5 ± 11,8 µm einen deutlich höheren EC 50 für H3K9me3 in KYSE 150 Zellen auf als seine Derivate MR04 mit 3,3 ± 1,7 µm, MR05 mit ungefähr 10 µm, MR23 mit 1,6 ± 0,4 µm und MR25 mit 1,8 ± 0,1 µm. Die Derivate MR04 und MR05 weisen eine höhere Lipophilie und damit wahrscheinlich eine bessere Zellgängigkeit auf (vergleiche Kapitel 3). Während MR04 die Carbonsäure Gruppe fehlt, ist MR05 ein Prodrug des Deferasirox. Der EC 50 für MR05 ist um circa den Faktor 4 niedriger als der Wert für Deferasirox. Dies entspricht den Erwartungen und liegt mit hoher Wahrscheinlichkeit darin begründet, dass intrazellulär eine höhere Inhibitorkonzentration erreicht wird. Die Inhibition der JmjC Demethylasen in den Zellen erfolgt dann entweder durch die Wirkform Deferasirox oder durch MR05, das auch selbst ein potenter Inhibitor von JMJD2A ist. MR04 ist zwar auf Grund seiner höheren Lipophilie besser zellgängig als Deferasirox, kann aber wegen der fehlenden Carbonsäure Gruppe weniger Interaktionen mit dem aktiven Zentrum der JmjC Demethylasen eingehen. Besonders im zellulären Kontext hätte dies ein Nachteil sein können, da die Substanz JmjC Demethylasen weniger spezifisch binden kann. Der EC 50 des Inhibitors ist jedoch um mehr als den Faktor 12 niedriger als für Deferasirox. Somit scheint die Interaktion der Carbonsäure Gruppe mit Aminosäuren des aktiven Zentrums für die Bindung an das Enzym nicht sehr wichtig zu sein. Die Derivate MR23 und MR25 sind auf Grund der freien Carbonsäure Gruppe, die sie mit Deferasirox gemeinsam haben, polarere Moleküle als MR04 und MR05. MR25 geht laut Insilico Untersuchungen weitere Interaktionen mit Aminosäuren des aktiven Zentrums von JMJD2A ein. Im IC 50 Wert sind beide Substanzen Deferasirox sehr ähnlich, im EC 50 Wert sind sie Deferasirox jedoch deutlich überlegen. Auffällig ist, dass der mit MR25 erreichte maximale Fluoreszenzwert geringer ist als bei allen anderen Vertretern der Substanzklasse. Mögliche Erklärungen wären eine geringere Stabilität von MR25 im Zellkulturmedium oder eine gewisse wenn auch unwahrscheinliche Selektivität der Substanz für einzelne Subtypen der JmjC Demethylasen, die H3K9me3 als Substrat akzeptieren. Die einsetzbare Konzentration aller Derivate wird durch ihre Löslichkeit im Zellkulturmedium begrenzt. 112

125 4.3. Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung Deferasirox MR05 MR04 MR23 113

126 4. Ergebnisse MR25 Abb. 4 37: Deferasirox und seine Derivate erhöhen dosisabhängig H3K9me3 in KYSE 150 Zellen. KYSE 150 Zellen wurden für 72 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen an Inhibitoren behandelt. Die Quantifizierung von H3K9me3 erfolgte durch Immunfluoreszenz Mikroskopie. Die EC50 Werte betragen 40,5 ± 11,8 µm für Deferasirox, 3,3 ± 1,7 µm für MR04, 1,6 ± 0,4 µm für MR23 und 1,8 ± 0,1 µm für MR25. Die Dosis Wirkungskurven wurden aus den Daten eines Experiments mit einem Well je Konzentration aufgestellt. Dargestellt ist jeweils der für die angegebene Anzahl an Zellen erhaltene Mittelwert, Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts wieder. DAPI Anti H3K9me3 DMSO Deferasirox 60 µm MR05 10 µm 114

127 4.3. Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung MR04 6 µm MR23 10 µm MR25 5 µm Abb. 4 38: Deferasirox und seine Derivate erhöhen H3K9me3 in KYSE 150 Zellen. KYSE 150 Zellen wurden für 72 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen an Inhibitoren inkubiert, fixiert und mit DAPI sowie einem primären Antikörper gegen H3K9me3 und einem fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper angefärbt. H3K9me3 ist in den mit Inhibitoren behandelten Zellen im Vergleich zu den mit dem reinen Lösungsmittel DMSO behandelten Kontrollzellen deutlich erhöht. Die Aufnahmen sind beispielhaft für das in Abbildung 4 37 dargestellte Experiment. 115

128 4. Ergebnisse Keine der Substanzen aus der Gruppe der Pyridylpyrimidine erhöht H3K9me3 in KYSE 150 Zellen (Abb und Abb. 4 40). MR11, MR13, MR18 und MR19 sind schlecht löslich im Zellkulturmedium und können deshalb nur in relativ niedrigen Konzentrationen getestet werden. Bei Konzentrationen über 10 µm kommt es bei MR11 und MR13 zu einem leichten Anstieg von H3K9me3. Dieser ist allerdings prozentual betrachtet sehr gering und es kann insbesondere für die höchsten Konzentrationen nicht ausgeschlossen werden, dass er auch durch eine leichte Auskristallisation der Substanz im Medium ausgelöst wurde, die bei Betrachtung der Zellen unter dem Lichtmikroskop am Ende der Inkubationszeit nicht bemerkt wurde. Mit MR29 wurde ein Morpholinoethylester synthetisiert, welcher eine deutlich bessere Löslichkeit im Zellkulturmedium aufweist als der entsprechende Methylester. Die Substanz konnte in Konzentrationen bis einschließlich 250 µm eingesetzt werden, ohne dass eine Auskristallisation eintrat. Bei Konzentrationen bis 100 µm hat sie keinen Einfluss auf H3K9me3 in KYSE 150 Zellen, darüber hinaus steigert sie H3K9me3 minimal. MR11 MR13 116

129 4.3. Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung MR18 MR19 MR29 Abb. 4 39: Pyridylpyrimidine rufen in KYSE 150 Zellen keine Zunahme von H3K9me3 hervor. KYSE 150 Zellen wurden für 72 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen an Inhibitoren behandelt. Die Quantifizierung von H3K9me3 erfolgte durch Immunfluoreszenz Mikroskopie. Die Inhibitoren steigern H3K9me3 in den Zellen nur um wenige Prozent und sind somit als unwirksam oder wenig wirksam zu bewerten. Die Dosis Wirkungskurven wurden aus den Daten eines Experiments mit einem Well je Konzentration aufgestellt. Dargestellt ist jeweils der für die angegebene Anzahl an Zellen erhaltene Mittelwert, Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts wieder. 117

130 4. Ergebnisse DAPI Anti H3K9me3 DMSO (zum Vergleich mit MR11, MR13, MR18 und MR19) MR11 50 µm MR13 20 µm MR18 7,5 µm MR19 7,5 µm DMSO (zum Vergleich mit MR29) 118

131 4.3. Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung MR µm Abb. 4 40: Pyridylpyrimidine haben keinen Einfluss auf H3K9me3 in KYSE 150 Zellen. KYSE 150 Zellen wurden für 72 Stunden wie angegeben mit den Inhibitoren inkubiert, fixiert und mit DAPI sowie einem primären Antikörper gegen H3K9me3 und einem fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper angefärbt. H3K9me3 ist in den mit Inhibitoren behandelten Zellen unverändert im Vergleich zu den mit dem reinen Lösungsmittel DMSO behandelten Kontrollzellen. Die Aufnahmen sind beispielhaft für das in Abbildung 4 39 dargestellte Experiment. Die Substanzen AH174 und LM101 wurden als Vertreter ihrer Substanzklassen auf ihren Effekt auf H3K9me3 in KYSE 150 Zellen getestet (Abb. 4 41). AH174 hatte sich bereits in HeLa Zellen als unwirksam erwiesen und zeigt trotz des größeren Messbereichs für EC 50 Werte auch in KYSE 150 Zellen keinen Effekt. LM101 steigert H3K9me3 in KYSE 150 Zellen nicht. Bei einer Konzentration von 100 µm wurde ein erhöhter Fluoreszenzwert gemessen, dieser ist aber auf Grund der bei dieser Konzentration extrem reduzierten Zellzahl im Messfeld und der Tatsache, dass es nicht auch schon bei der nächst niedrigeren Konzentration zu einer leichten Steigerung kommt, nicht aussagekräftig. Die verwandte Substanz LM97 zeigte ebenfalls keinen Effekt bei der Testung an transfizierten und untransfizierten HeLa Zellen, so dass keine weiteren Vertreter dieser Substanzklassen auf ihren zellulären Effekt auf H3K9me3 getestet wurden. NR001 wurde nicht an KYSE 150 getestet, da es sich um eine fragmentartige Verbindung handelt, für die keine zelluläre Wirksamkeit zu erwarten war. Die Substanz hatte sich bereits bei der Testung an HeLa als unwirksam erwiesen. 119

132 4. Ergebnisse AH174 LM101 Abb. 4 41: Die Inhibitoren AH174 und LM101 rufen in KYSE 150 Zellen keine Zunahme von H3K9me3 hervor. KYSE 150 Zellen wurden für 72 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen an Inhibitoren behandelt. Die Quantifizierung von H3K9me3 erfolgte durch Immunfluoreszenz Mikroskopie. AH174 und LM101 steigern H3K9me3 in den Zellen nicht. Die Dosis Wirkungskurven wurden aus den Daten eines Experiments mit einem Well je Konzentration aufgestellt. Dargestellt ist jeweils der für die angegebene Anzahl an Zellen erhaltene Mittelwert, Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts wieder Immunfluoreszenz Mikroskopie für H3K4me3 in KYSE 150 Zellen Die Inhibitoren mit Hydroxamsäure Gruppe weisen eine Selektivität für JARID1A gegenüber JMJD2A auf. Sie rufen zellulär keine Hypermethylierung an H3K9, dem Substrat von JMJD2A, hervor (vergleiche Kapitel ) und sollten deshalb auf ihren Effekt auf H3K4me3, dem Substrat von JARID1A, untersucht werden. Zunächst stellte sich die Frage, ob das für H3K9me3 etablierte Testsystem durch Austausch des primären Antikörpers für H3K4me3 nutzbar gemacht werden könnte oder ob weiter Anpassungen notwendig wären. Hierfür wurde überprüft, ob mit der Methode eine Hypermethylierung an H3K4 unter Behandlung mit Referenzinhibitoren nachgewiesen werden kann. Als Referenzinhibitoren wurden die unspezifischen Inhibitoren IOX1 und JIB 04 sowie GSK J4 als Inhibitor mit Selektivität für JARID1A ausgewählt (vergleiche Kapitel 1.3.4). 120

133 4.3. Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung Alle Referenzinhibitoren bewirken einen Anstieg von H3K4me3 in KYSE 150 Zellen. Die EC 50 Werte für IOX1 und JIB 04 liegen mit 17,1 ± 2,7 µm bzw. 0,22 ± 0,02 µm in der gleichen Größenordnung wie für H3K9me3. Dies entspricht den Erwartungen, da es sich um Hemmstoffe handelt, die keine Selektivität für einzelne Klassen von JmjC Demethylasen aufweisen. Für GSK J4 kann kein EC 50 bestimmt werden, da die Substanz die Anzahl der Zellen bei hohen Konzentrationen sehr stark reduziert. Es tritt aber auch bei diesem Referenzinhibitor eine deutliche Hypermethylierung an H3K4 auf (Abb und Abb. 4 43). Das Testsystem ist somit ohne weitere Optimierungen dafür geeignet, Änderungen an H3K4me3 in dem Ausmaß, das durch JmjC Demethylase Inhibitoren hervorgerufen wird, nachzuweisen und kann für die Testung neuer Inhibitoren eingesetzt werden. Es ist auffällig, dass der erreichte Maximalwert für H3K4me3 deutlich geringer ist als für H3K9me3. So erfolgt nur eine Steigerung auf das maximal 1,5 fache des Basiswertes, während bei H3K9me3 eine Steigerung des Signals durch Hemmstoffe um das 2 bis 3 fache zu beobachten ist. Dies stimmt mit Literaturangaben überein, wonach für IOX1 und Methylstat ebenfalls deutlich stärkere zelluläre Effekte auf H3K9me3 als auf H3K4me3 beschrieben sind (Rotili et al. 2014; Luo et al. 2011). Ein weiterer Unterschied in den Ergebnissen der Immunfluoreszenz Mikroskopie für H3K9me3 und H3K4me3 ist die Verteilung der Modifikation im Zellkern: Während H3K9me3 gleichmäßig gefärbt aussieht und dabei vereinzelte hellere Punkte aufweist, sind einzelne Bereiche des Zellkerns frei von H3K4me3, was sich an dunklen Kreisen innerhalb der gefärbten Zone zeigt. Diese unterschiedlichen Muster sind in der Literatur beschrieben (Zinner et al. 2006; Abcam 2015). In Abbildung 4 43 fällt zudem auf, dass die Zellen, die mit Inhibitoren behandelt wurden, im Vergleich zu den Kontrollzellen deutlich vergrößert sind. Das gleiche Phänomen wurde auch bei der Immunfluoreszenz Mikroskopie für H3K9me3 beobachtet (vergleiche zum Beispiel Abb. 4 38), ist in diesen Aufnahmen aber besonders gut zu sehen. Möglich ist, dass durch die Inhibitoren eine Seneszenz der Zellen auftritt, welche häufig mit einer Vergrößerung der gesamten Zelle einhergeht (Rodier & Campisi 2011). 121

134 4. Ergebnisse IOX1 JIB 04 GSK J4 Abb. 4 42: IOX1, JIB 04 und GSK J4 erhöhen dosisabhängig H3K4me3 in KYSE 150 Zellen. KYSE 150 Zellen wurden für 72 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen an Referenzinhibitoren behandelt. Die Quantifizierung von H3K4me3 erfolgte durch Immunfluoreszenz Mikroskopie. Die EC50 Werte betragen 17,1 ± 2,7 µm für IOX1 und 0,22 ± 0,02 µm für JIB 04. Die Dosis Wirkungskurven wurden aus den Daten eines Experiments mit einem Well je Konzentration aufgestellt. Dargestellt ist jeweils der für die angegebene Anzahl an Zellen erhaltene Mittelwert, Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts wieder. 122

135 4.3. Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung DAPI Anti H3K9me3 DMSO IOX1 30 µm JIB 04 0,3 µm GSK J4 3 µm Abb. 4 43: IOX1, JIB 04 und GSK J4 erhöhen H3K4me3 in KYSE 150 Zellen. KYSE 150 Zellen wurden für 72 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen an Referenzinhibitoren inkubiert, fixiert und mit DAPI sowie einem primären Antikörper gegen H3K4me3 und einem fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper angefärbt. H3K4me3 ist in den mit Inhibitoren behandelten Zellen im Vergleich zu den mit dem reinen Lösungsmittel DMSO behandelten Kontrollzellen erhöht. Die Aufnahmen sind beispielhaft für das in Abbildung 4 42 dargestellte Experiment. 123

136 4. Ergebnisse Aus der Klasse der Inhibitoren mit Hydroxamsäurestruktur wurden LM75 und LM105 auf Grund ihrer niedrigen IC 50 Werte gegenüber JARID1A für die Testung ausgewählt. Die beiden Substanzen bewirken in KYSE 150 Zellen nur in Konzentrationen über 100 µm eine Erhöhung von H3K4me3. Diese ist zudem in Konzentrationen, bei denen die Zellzahl nicht massiv reduziert ist, deutlich weniger stark ausgeprägt als bei den Referenzinhibitoren (Abb und Abb. 4 45). Auf Grund dieser geringen zellulären Potenz wurden keine weiteren Vertreter der Substanzklasse in dem System getestet. LM75 LM105 Abb. 4 44: LM75 und LM105 erhöhen H3K4me3 in KYSE 150 Zellen nur in sehr hohen Konzentrationen. KYSE 150 Zellen wurden für 72 Stunden mit Inhibitoren in den angegebenen Konzentrationen behandelt. Die Quantifizierung von H3K4me3 erfolgte durch Immunfluoreszenz Mikroskopie. Die Inhibitoren erhöhen H3K4me3 nur wenig und nur in Konzentrationen, die 100 µm überschreiten. Die Dosis Wirkungskurven wurden aus den Daten eines Experiments mit einem Well je Konzentration aufgestellt. Dargestellt ist jeweils der für die angegebene Anzahl an Zellen erhaltene Mittelwert, Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts wieder. 124

137 4.3. Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung DAPI Anti H3K9me3 DMSO LM µm LM µm Abb. 4 45: LM75 und LM105 haben in einer Konzentration von 100 µm keinen Einfluss auf H3K4me3 in KYSE 150 Zellen. KYSE 150 Zellen wurden für 72 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen an Inhibitoren inkubiert, fixiert und mit DAPI sowie einem primären Antikörper gegen H3K4me3 und einem fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper angefärbt. H3K4me3 ist in den mit LM75 bzw. LM105 behandelten Zellen unverändert im Vergleich zu den mit dem reinen Lösungsmittel DMSO behandelten Kontrollzellen. Die Aufnahmen sind beispielhaft für das in Abbildung 4 44 dargestellte Experiment Immunfluoreszenz Mikroskopie für H3K9me3 in HL 60 Zellen Da die Inhibitoren mit Hydroxamsäure Gruppe mit einer Ausnahme einen deutlich stärkeren antiproliferativen Effekt an HL 60 Zellen als an KYSE 150 Zellen zeigen und in KYSE 150 Zellen weder an H3K9 noch an H3K4 zur Hypermethylierung führen (vergleiche Kapitel und ), sollte überprüft werden, ob die Substanzen zu einer Hypermethylierung in HL 60 Zellen führen. Das Testsystem der Immunfluoreszenz Mikroskopie musste hierfür von der adhärenten Zelllinie KYSE 150 auf die Suspensionszelllinie HL 60 übertragen und entsprechend angepasst werden. Hierfür wurde wiederum IOX1 als Referenzinhibitor eingesetzt. Das System wurde zunächst für H3K9me3 etabliert, 125

138 4. Ergebnisse um das größere Signalfenster auszunutzen, dass diese Modifikation im Vergleich zu H3K4me3 in der Immunfluoreszenz Mikroskopie zeigt. Der Referenzinhibitor IOX1 zeigt in HL 60 Zellen einen EC 50 Wert für H3K9me3 von 35.2 ± 17.2 µm (Abb und Abb. 4 47). Die Genauigkeit dieser Methode ist durch die notwendigen Waschschritte, während derer stets ein Teil der Suspensionszellen verloren geht, und der dadurch bedingten niedrigen Zellzahl am Ende des Experiments im Vergleich zu den Experimenten mit adhärenten Zellen stark eingeschränkt. Der Anstieg von H3K9me3 ist jedoch ausgeprägt genug, um eine Aussage darüber zu treffen, ob Testsubstanzen eine zelluläre Hypermethylierung hervorrufen. Die Methode wurde deshalb für die Testung der neuen Inhibitoren eingesetzt. Der neue Inhibitor LM97 zeigt bei Konzentrationen bis zu 30 µm keinen Effekt auf H3K9me3 in HL 60 Zellen (Abb und Abb. 4 49). Die Testkonzentrationen wurden anhand des GI 50 so gewählt, dass am Ende der Inkubationszeit noch ausreichend Zellen für die Fixierung zur Verfügung standen. Die sehr niedrige Anzahl vermessener Zellen ist in Verlusten während der Waschschritte begründet. IOX1 Abb. 4 46: IOX1 erhöht dosisabhängig H3K9me3 in HL 60 Zellen. HL 60 Zellen wurden für 72 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen an IOX1 behandelt. Die Quantifizierung von H3K9me3 erfolgte durch Immunfluoreszenz Mikroskopie. Der EC50 von IOX beträgt 35.2 ± 17.2 µm. Die Dosis Wirkungskurven wurden aus den Daten eines Experiments mit einem Well je Konzentration aufgestellt. Dargestellt ist jeweils der für die angegebene Anzahl an Zellen erhaltene Mittelwert, Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts wieder. 126

139 4.3. Untersuchung des Effekts auf die Histonmethylierung DAPI Anti H3K9me3 DMSO IOX1 60 µm Abb. 4 47: IOX1 erhöht H3K9me3 in HL 60 Zellen. HL 60 Zellen wurden für 72 Stunden mit IOX1 inkubiert, fixiert und mit DAPI sowie einem primären Antikörper gegen H3K9me3 und einem fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper angefärbt. H3K9me3 ist in den mit IOX1 behandelten Zellen im Vergleich zu den mit dem reinen Lösungsmittel DMSO behandelten Kontrollzellen deutlich erhöht. Die Aufnahmen sind beispielhaft für das in Abbildung 4 46 dargestellte Experiment. LM97 Abb. 4 48: LM97 hat keinen Effekt auf H3K9me3 in HL 60 Zellen. HL 60 Zellen wurden für 72 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen an LM97 behandelt. Die Quantifizierung von H3K9me3 erfolgte durch Immunfluoreszenz Mikroskopie. Der Inhibitor erhöht H3K9me3 in den Zellen nicht. Die Dosis Wirkungskurven wurden aus den Daten eines Experiments mit einem Well je Konzentration aufgestellt. Dargestellt ist jeweils der für die angegebene Anzahl an Zellen erhaltene Mittelwert, Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts wieder. 127

140 4. Ergebnisse DAPI Anti H3K9me3 DMSO LM97 30 µm Abb. 4 49: LM97 hat keinen Einfluss auf H3K9me3 in HL 60 Zellen. HL 60 Zellen wurden für 72 Stunden mit LM97 inkubiert, fixiert und mit DAPI sowie einem primären Antikörper gegen H3K9me3 und einem fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper angefärbt. H3K9me3 ist in den mit LM97 behandelten Zellen unverändert im Vergleich zu den mit dem reinen Lösungsmittel DMSO behandelten Kontrollzellen. Die Aufnahmen sind beispielhaft für das in Abbildung 4 48 dargestellte Experiment Gegenüberstellung der Ergebnisse aus Proliferationstests und Immunfluoreszenz Mikroskopie Um zu untersuchen, ob eine Korrelation zwischen der Wirksamkeit eines Inhibitors wie sie in der Immunfluoreszenz Mikroskopie beobachtet wird und einer möglichen antiproliferativen Wirkung der Substanz besteht, sind im Folgenden die Ergebnisse der Immunfluoreszenz Mikroskopieexperimente (vergleiche Kapitel und ) und des MTS Assays (vergleiche Kapitel ) gegenübergestellt (Tab. 4 13). Tab. 4 13: Übersicht über die Ergebnisse aus MTS Assay und Immunfluoreszenz Mikroskopie Substanz GI 50 ± SE [µm] oder Inhibition bei angegebener Konzentration im MTS Assay KYSE 150 EC 50 ± SE [µm] in Immunfluoreszenz Mikroskopie für H3K9me3 HeLa transfiziert mit JMJD2A KYSE 150 IOX1 22 ± 3 73,4 ± 5,7 µm 10,0 ± 0,6 µm JIB 04 0,17 ± 0,02 6,8 ± 0,5 µm Wirkung ab 0,3 µm 128