OC-10: Chemical Biology. Part II: Biology

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1 OC-10: Chemical Biology Part II: Biology

2 Literatur C. Mühlhardt: Der Experimentator - Molekularbiologie/Genomics H. Rehm & T. Letzel: Der Experimentator: Proteinbiochemie/Proteomics Lottspeich/Engels/Zettlmeier Lay: Bioanalytik H. Waldmann & P. Janning: Chemical Biology

3 Definitions Biochemistry The chemistry of biological systems: study of enzyme action. Biological chemistry (Bio-organic and Bio-inorganic Chemistry) The synthesis of bio-molecules, both natural and model compounds: e.g. DNA, sugar, lipid and peptide synthesis. Chemical biology The study and manipulation of biological systems by chemical (synthetic) means. Synthetic Biology Building and re-building of bio-inspired structures to even artificial lifeforms.

4 Definitions Chemical biology may be defined as the development and use of chemistry techniques for the study of biological phenomena (Breinbauer & Waldmann)

5 Examples Structural X-linking Mass Spectrometry Activity-based protein profiling Next/Third Generation Sequencing Therapeutic proteins Novel therapeutics, e.g. sirna

6 Structural Proteomics Published by AAAS K Murakami et al. Science 2013;science

7 Activity based protein profiling

8 Third generation sequencing

9 Pharmaceutical conjugation

10 sirna delivery

11 The Basics of Cloning & Protein Production

12 Methods Choice of Expression System Bacteria Yeast Insect Cells Mammalian Cells

13 Methods Purification Strategy Affinity tags His Strep GST/MBP/Trx Epitope Native purification Thermal Stability

14 Methods Molecular Cloning Classic (restriction digest) Ligation independent cloning Recombination (Gateway, Stargate) Gene synthesis

15 Bakterielle Systeme Escherichia coli Bacillus subtilis Caulobacter crescentus Lactococcus lactis Vorteile: Einfacher DNA Transfer Einfache Anzucht (billig!) Einfache und kleine Promotoren Hohe Ausbeute Nachteile: Keine posttranslationale Modifikation Große Proteine oft schwierig

16 e.g. Bacillus stains e.g. E. coli stains

17 Eukaryontische Systeme Golgi Zellkern ER Hefen Insektenzellen Säugerzellen Pflanzen Mitochondrium Vorteile: Posttranslationale Modifikationen Große Proteine oft erfolgreicher Sekretion einfacher Nachteile: Geringere Ausbeuten Teure Medien Komplexe Handhabung Keine Weitergabe von Plasmiden (außer Hefe)

18 Glycosylierungen

19 2

20 Bioinformatics

21

22 Choice of Source

23

24 Learn from structure

25 Get the nucleotide sequence

26 Expressionsplasmid Was brauche ich zur Expression?

27 Promotoren Konstitutive Promotoren immer aktiv, daher ist kontinuierliche Kultur möglich. Nachteil: toxische Proteine inhibieren Biomasse-Produktion Induzierbare Promotoren Expression wird durch physikalischen oder chemischen Auslöser gestartet. Biomasseproduktion und Proteinexpression sind zeitlich getrennt. Nachteil: Expressionen müssen immer neu gestartet werden.

28 Was brauche ich zur Expression? Origin of replication (ORI) Damit das Plasmid unabhängig vermehrt werden kann. Üblicherweise werden highcopy-number ORI verwendet. Durch die Wahl des ORI kann auch die Expressionsstärke beeinflusst werden. Der F1 origin dient vermutlich historischen Zwecken zur Herstellung einzelsträngiger Plasmide für die Sequenzierung.

29 Was brauche ich zur Expression? Selektionsmarker Da ein Plasmid immer eine Belastung für das Bakterium darstellt, wird es versuchen das Plasmid abzustoßen. Ein Selektionsmarker verschafft Plasmid-tragenden Bakterien einen Vorteil (z.b. Resistenz gegen ein Antibiotikum oder eine Verwertungsoption für Nährstoffe) Häufige Selektionsmarker: ß-Lactamase (Ampicillin- Resistenz), N-Acetyltransferase (Kanamycin- Resistenz)

30 Was brauche ich zur Expression? Repressor (optional) Verhindert unkontrollierte Expression in Abwesenheit von Induktionsmittel.

31 Promotor Operator ATG..TAA CDS

32 Promotorsysteme lac-operon Starke Expression, Option zur Autoinduktion, leaky. ara-operon Stärkere Expressionskontrolle bei starker Expression. tet-operon Geringere Expression, aber stark kontrolliert. tac-promoter Hybrid auf dem konstitutiven trp-promoter und dem lac-operon. Starke Expression, aber leaky. T7-Promoter Sehr starke Expression, benötigt T7-RNA-Polymerase

33 Klonierung? Klonen ist das vermehren eines (mehrzelligen) Organismus von einer somatischen (also differenzierten) Zelle. Der Begriff Molecular Cloning bezieht sich jedoch auf die Erzeugung identischer Kopien von meist rekombinanter DNA. Klonieren sei hier also definiert als das Neuarrangement von DNA (zum Zweck der Proteinexpression) mit all seinen Verfahrensschritten: Gewinnung des genetischen Materials Amplifikation und Modifikation Herstellung der Vektoren Vervielfältigung, Nutzung Extraktion, Gensynthese PCR Restriktion, Ligation, Rekombination Transformation, Selektion, Extraktion

34 PCR

35 Primerdesign Denaturierung: C Annealing: C Extension: C T m Zielbereich Vermeidung von: Primer-Dimeren Hairpin-Loops Selbstkomplementarität 5 - Anhang spez. Primer Sinnvolle Anhänge: Restriktionsschnittstellen Rekombinationssequenzen Affinitäts-Tags Protease-Erkennungssequenzen Ribosom Bindestellen

36 Exkurs: Anhänge 5 -Phosphat: Ligation in dephosphorylierten Vektor Herstellung einzelsträngiger DNA mit -Exonuklease Radioaktive Markierung mit 32 P 5 -Biotin: Aufreiningung von PCR-Produkten (allerdings zur Ligation ungeeignet) 5 -Fluorescein: Als Marker auf Gelen 5 -Thiol- oder Aminomodifier: Immobilisierung auf Oberflächen dutp: Zur Vermeidung von Kontamination durch Verschleppung (in der Analytik)

37 Gewinnung des genetischen Materials Eukaryonten cdna Synthese (complementary DNA) mrna AAAAAAAA TTTTTTTTT AAAAAAAA TTTTTTTTT AAAAAAAA cdna Hybridisierung mit oligo-dt Elongation mit reverser Transkriptase TTTTTTTTT TTTTTTTTT AAAAAAAA ds-cdna optional: Zweitstrangsynthese

38 Gensynthese Gensynthese Bioinformatik verhindert die Gefahr der fehlerhaften Assemblierung 48 oligos 921 bp 2 oligos 80 bp

39 Codon-Wahl ist nicht zufällig aa Codon A. thali- Homo S. cere- E. coli ana sapiens visiae Warum Gensynthese? Der genetische Code ist universell, aber... Ala GCG GCA GCT GCC Arg AGG AGA CGG CGA CGT CGC Leu TTG TTA CTG CTA CTT CTC Codons vs. 20 AS 18 AS benutzen synonyme Codons alternative Codons werden mit unterschiedlicher Frequenz genutzt Codon-Usage unterscheidet sich in (fast) jedem Organismus frequent rare

40 Bastelstunde Vom PCR-Produkt (oder synthetischen Gen) zum Plasmid PCR-Produkt? Restriktion/Ligation Topoisomerase Rekombination Ligation-free cloning

41 Bastelstunde

42 Bastelstunde 5 -ATGCATGCATGCATGC-3 3 -TACGTACGTACGTACG-5 5 -GAATTC-3 3 -CTTAAG-5 5 -GAATTCATGCATGCATGCATGCGAATTC-3 3 -CTTAAGTACGTACGTACGTACGCTTAAC-5 PCR-Produkt (blunt-end) Restriktionsschnittstelle 5 - AATTCATGCATGCATGCATGCG GTACGTACGTACGTACGCTTAA -5 Sticky-end AATTCATGCATGCATGCATGCG GTACGTACGTACGTACGCTTAA AATTCATGCATGCATGCATGCG GTACGTACGTACGTACGCTTAA

43 Exkurs: Restriktionsendonukleasen Sind eigentlich immer vom Typ II: Schneiden nahe der Erkennungssequenz Benötigen kein ATP Haben meist palindromische Erkennungssequenzen Produzieren blunt ends, 5 -Überhänge und 3 - Überhänge (sticky ends) Hintergrund: Restriktionsenzyme sind ein Abwehrsystem gegen virale Infektionen. Sie existieren als Kombination mit einer Methyltransferase, die die Zielsequenz methylieren und damit vor dem Zerschneiden schützen. Virale DNA ist nicht methyliert und wird somit verdaut.

44 Mechanismus 5 -AAGCTT-3 3 -TTCGAA-5 Haemophilus influenzae Literatur: Stryer, 5. Auflage, Kapitel 9.3 (

45 Exkurs: Restriktionsendonukleasen to be continued

46 Kompatible Enden Problem: zu viele Erkennungssequenzen Multiple Cloning Site BamHI SalI EcoRI SacI BamHI Gene of Interest HindIII NotI XhoI HindIII XhoI XhoI 5 -GGATCC-3 3 -CCTAGG-5 BamHI 5 -TGATCA-3 3 -ACTAGT-5 AbaI 5 -AGATCT-3 3 -TCTAGA-5 BglII

47 Raffinierte Enzyme Problem: zu viele Erkennungssequenzen Multiple Cloning Site BamHI SalI EcoRI SacI BamHI Gene of Interest HindIII NotI XhoI HindIII XhoI XhoI 5 -CGTCTCNNNNNN-3 3 -GCAGAGNNNNNN-5 BsmBI 5 -GGATCC-3 3 -CCTAGG-5 BamHI 5 -CGTCTCGGATCC-3 3 -GCAGAGCCTAGG-5

48 Recapitulate What an expression vector needs: Origin of replication Selection marker Promoter Ribosome binding site Cloning site Optional: Tags, Repressors

49 Recapitulate Know your gene Important sequences? Possible Tags? Source organism? Prepare the Insert AmplifybyPCR RT-PCR or buy as a whole Attach anything you may need in your primers

50 Glätten 5 Überhang 3 Überhang NNNGGATCC-3 NNNCCTAGG-5 BamHI NNNCTGCAG-3 NNNGACGTC-5 PstI NNNG-3 NNNCCTAG-5 BamHI NNNCTGCA-3 NNNG-5 PstI NNNGGATC-3 NNNCCTAG-5 DNA Pol I + dntp NNNC-3 NNNG-5 DNA Pol I + dntp DNA Polymerasen (z.b. DNA Pol I Klenow Fragment) haben eine 3 5 Exonuklease Aktivität (proof-reading). Bei ungepaarten 3 Überhängen wird sie aktiv. Die Zugabe von dntp verhindert übermäßiges Zurückschneiden. 5 Überhänge werden aufgefüllt (primer extension).

51 Ligieren Eigentlich trivial, weil jetzt nicht mehr zu umgehen: Lückenschluss mit T4 DNA Ligase! Zu beachten: Re-ligation verhindern: inkompatible Enden oder Dephosphorylierung? Blunt-end oder sticky-end? Insert/Vektor Verhältnis? Temperatur? Eine Ligation ist kontrollierbares Voodoo!

52 Exkurs: DNA Ligase

53 Ligation Independent Cloning

54 TOPO-cloning Alternativen

55 Recombination-cloning Alternativen 2

56 Gateway cloning

57 Einfügen von gezielten Mutationen z.b. zur Funktionsanalyse oder zum Einbau unnatürlicher Aminosäuren Exkurs: Site Directed Mutagenesis

58 Exkurs: Site Directed Mutagenesis

59 Transformationsmethoden Chemische Transformation Permeabilisierung mit polyvalenten Kationen (meist Calcium) und/oder DMSO Hitzeschock (42 C) zur forcierten Aufnahme Regeneration der Zellen und Ausbildung des Selektionsmarkers Selektion Elektroporation Herstellung salzfreier Bakteriensuspensionen Elektroschock Regeneration der Zellen und Ausbildung des Selektionsmarkers Selektion

60 Proteinexpression

61 Parameter: Zelldichte Medium Wachstumsphase Schütteln oder Fermentation? Temperatur Je kälter, desto langsamer Induktion Viel hilft viel gilt nicht immer! Proteinexpression

62 Purification Strategy Affinity tags His Strep GST/MBP/Trx Epitope Native purification

63 Protein Purification Tags 6xHis-Tag IDA Eluent: Imidazol NTA Vorteile: klein (6 Reste) billig (Material, Eluent) auch für denaturierte Proteine weit verbreitet Nachteile: geladen relativ unsauber Empfindlichkeit (EDTA, DTT)

64 Protein Purification Tags Streptavidin-Biotin Interaktion Zur Proteinreinigung ungeeignet, da Biotin mit außergewöhnlicher Affinität an Avidin /Streptavidin bindet (quasi irreversibel).

65 Protein Purification Tags Strep-Tag Modifiziertes Streptavidin (Strep- Tactin) als immobile Phase, ein 8mer Peptid als Biotin-Mimic. Die Elution erfolgt mit Desthiobiotin. Vorteile: klein (8 Reste) ungeladen sehr sauber weit verbreitet Nachteile: teuer (Matrix und Eluent) nur native Aufreinigung Kreuzreaktion mit Biotin

66 Protein Purification Tags GST-Tag Glutathion-S-Transferase Vorteile: relativ günstig unterstützt Faltung stabilisiert Proteine Nachteile: groß (245 Reste) nur native Aufreinigung