TOSCANA VIRUS oligomix Alert kit Nachweis von Toscana-Virus-cDNA

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1 INHALT ANWENDUNGSGEBIET Seite 1 PRODUKTBESCHREIBUNG Seite 1 PRODUKTMERKMALE Seite 2 ERGÄNZUNGSKITS Seite 2 IM KIT ENTHALTENES MATERIAL Seite 2 ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES, NICHT MITGELIEFERTES MATERIAL Seite 3 ALLGEMEINE HINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN Seite 3 VERFAHREN Seite 4 LITERATUR Seite 8 PROBLEMLÖSUNGEN Seite 9 ERKLÄRUNG DER SYMBOLE Seite 10 ANWENDUNGSGEBIET Der Test ist ein qualitativer Nukleinsäure-stest zum Nachweis der cdna von Toscana-Virus im Reaktionsprodukt der Reversen Transkription in RNA- Extrakten aus EDTA-Vollblut, EDTA-Plasma, Liquor und Aspiratproben. Der Nachweis der cdna von Toscana-Virus mit einem stest kann für den Nachweis von Toscana-Virus-Infektionen bei klinischem Verdacht eingesetzt werden. PRODUKTBESCHREIBUNG ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Büro: Tel Fax E. mail: emd.support@elitechgroup.com Internetseite: C Der Kit enthält den Reaktionsmix OligoMIX für die erste und zweite sreaktion, gebrauchsfertig voraliquotiert in «Monotest» Reaktionsgefäße. Im Testverfahren werden zwei aufeinander folgende (nested) sreaktionen, spezifisch für die kodierte Genomregion des N-Protein von Toscana-Virus, durchgeführt. Als Testmaterial dient das Produkt der Reversen Transkription, der aus den Testproben extrahierten RNA. Der Nachweis des spezifischen Genproduktes nach der zweiten sreaktion bedeutet, dass Toscana-Virus cdna im Produkt der Reversen Transkriptionsreaktion vorhanden ist. PRODUKTMERKMALE Die Sensitivität der Reaktion ermöglicht den Nachweis von ca. 10 Molekülen der Ziel-DNA (d.h. ca. zehn cdna des Virusgenom) in 10 µl DNA-Extrakt, die dem «Monotest» Reaktionsgefäß hinzugefügt wurden. Hinweis: Wenn 300 µl Liquor mit dem Kit «EXTRAgen» (siehe folgender Abschnitt zu den Ergänzungskits) extrahiert werden und die Reverse Transkription mit dem Kit «RT - kit plus» (siehe folgender Abschnitt zu den Ergänzungskits) erfogt, beträgt die Sensitivität der Methode ca. 200 Virusgenome / ml. Hinweis: Wenn 200 µl Aspiratproben mit dem Kit «EXTRAzol» (siehe folgender Abschnitt zu den Ergänzungskits) extrahiert werden und die Reverse Transkription mit dem Kit «RT - kit plus» (siehe folgender Abschnitt zu den Ergänzungskits) erfolgt, beträgt die Sensitivität der Methode ca. 300 Virusgenome / ml. Mit dem Kit können 50 Reaktionen inklusive Positiv- und Negativ-Kontrollen durchgeführt werden. ERGÄNZUNGSKITS NICHT in diesem Kit enthalten sind die Reagenzien für die RNA-Extraktion aus den zu testenden Proben, für die positive Extraktionskontrolle, für die Reverse RNA-Transkription, für die positive skontrolle, für die interne Eignungskontrolle und für den Nachweis der amplifizierten DNA. Für diese Analysenschritte werden die folgenden Ergänzungskits von ELITechGroup S.p.A empfohlen: «EXTRAgen» (Katalognr. EXTG01), Kit für die RNA-Extraktion aus nicht-zellulären Proben. Mit dem Kit können 50 Extraktionen durchgeführt werden. «EXTRAzol» (Katalognr. EXTR01), Kit für die RNA-Extraktion aus zellulären und nicht-zellulären Proben. Mit dem Kit können 50 Extraktionen durchgeführt werden. «RT - Kit plus» (Katalognr. BRK200), Kit für die Reverse RNA-Transkription mit "Random Primer. Mit dem Kit können 50 Reaktionen durchgeführt werden. «TOSCANA VIRUS - Positive Control» (Katalognr. CTR071), positive skontrolle der Plasmid-DNA. Mit dem Kit können 25 Testläufe durchgeführt werden. «DNA polymerase 2U / µl» (Katalognr. ER140), thermostabile DNA-Polymerase für die von Nukleinsäuren. Mit dem Kit können 100 Reaktionen durchgeführt werden. «RECK» (Katalognr. RK100), interne Eignungskontrolle, nutzt «CPE-RNA» als Target. Mit dem Kit können 100 Reaktionen durchgeführt werden. «ELECTROPHORESIS 2» (Katalognr. EPH02), Nachweis der amplifizierten DNA mittels Agarosegel- Elektrophorese. Mit dem Kit können 64 Nachweise durchgeführt werden. IM KIT ENTHALTENES MATERIAL Komponente Beschreibung Menge Zusammensetzung Etikettierung OligoMIX für die erste OligoMIX für die zweite smix in FARBLOSEN 0,2- oder 0,5 ml- Reaktionsgefäßen smix in ROTEN 0,2- oder 0,5 ml- Reaktionsgefäßen 50 x 85 µl 50 x 94 µl Externe Primer, Kaliumchlorid, TRIS Base, TRIS-HCl, Triton X-100, Magnesiumchlorid, Desoxynukleotidtriphosphat-mix, Vaselinöl Interne Primer, Kaliumchlorid, TRIS Base, TRIS- HCl, Triton X-100, Magnesiumchlorid, Desoxynukleotidtriphosphat-mix, Vaselinöl - - SCH mban071_de 28/05/13 Revisionsstand 02 Seite 1/10 SCH mban071_de 28/05/13 Revisionsstand 02 Seite 2/10

2 ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES, NICHT MITGELIEFERTES MATERIAL - PCR-Werkbank (Laminarflow). - Ungepuderte Einweghandschuhe aus Latex o.ä. - Tisch-Mikrozentrifuge ( U/min). - Mikropipetten und sterile Pipettenspitzen mit Aerosolfilter oder Direktverdrängungs-Dispensierpipetten (0,5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl, µl). - Steriles bidestilliertes Wasser. - Programmierbarer Thermostat (Thermocycler). ALLGEMEINE HINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN Dieser Kit ist ausschließlich für die In-vitro-Diagnostik bestimmt. Allgemeine Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen Alle biologischen Proben müssen wie potentiell infektiöses Material gehandhabt und entsorgt werden. Der direkte Kontakt mit den biologischen Proben ist zu vermeiden. Es dürfen keine Spritzer oder Aerosol erzeugt werden. Material, das mit den biologischen Proben in Kontakt gekommen ist, muss vor der Entsorgung mindestens 30 Minuten lang mit 3%-igem Natriumhypochlorit behandelt oder eine Stunde lang bei 121 C autoklaviert werden. Alle Reagenzien und im Test verwendeten Materialien müssen wie potentiell infektiöses Material gehandhabt und entsorgt werden. Der direkte Kontakt mit den Reagenzien ist zu vermeiden. Es dürfen keine Spritzer oder Aerosol erzeugt werden. Abfälle müssen gemäß den geltenden Sicherheitsvorschriften behandelt und entsorgt werden. Brennbares Einwegmaterial muss verbrannt werden. Flüssige Abfälle, die Säuren oder Basen enthalten, müssen vor der Entsorgung neutralisiert werden. Geeignete Schutzkleidung und -handschuhe tragen. Augen und Gesicht sind zu schützen. niemals mit dem Mund pipettieren. Im Arbeitsbereich nicht essen, trinken und keine Kosmetika auftragen. Nach der Arbeit mit Proben und Reagenzien gründlich die Hände waschen. Überschüssige Reagenzien und Abfälle nach den geltenden Vorschriften entsorgen. Vor der Testdurchführung alle Gebrauchsanweisungen zum Kit lesen. Bei der Testdurchführung sind die im Kit enthaltenen Anweisungen zu befolgen. Das Verfallsdatum des Kits ist einzuhalten. Nur die im Kit enthaltenen oder vom Hersteller empfohlenen Reagenzien verwenden. Nie Reagenzien verschiedener Chargen gegeneinander austauschen. Keine Reagenzien aus Testbestecken anderer Hersteller verwenden. Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen für die Molekularbiologie Die Verfahren der Molekularbiologie wie Extraktion, Reverse Transkription, und Nachweis von Nukleinsäuren erfordern geschultes Personal, um falsche Ergebnisse - bedingt durch den Abbau von Nukleinsäuren in den Proben oder Kontamination der Proben durch sprodukte - zu vermeiden. Die DNA-Extraktion aus den Proben und die Vorbereitung der sreaktionen müssen räumlich separat von der und dem Nachweis der sprodukte durchgeführt werden. Ein sprodukt darf nie in den Arbeitsbereich Extraktion/Vorbereitung der sreaktionen gelangen. Für die Extraktion/Vorbereitung der sreaktionen einerseits und für die /Nachweis der sprodukte andererseits müssen jeweils gesondert Kittel, Handschuhe und Instrumente zur Verfügung stehen. Die Kittel, Handschuhe und Instrumente aus dem Bereich /Nachweis der sprodukte dürfen nie in den Bereich Extraktion/Vorbereitung der sreaktionen gelangen. Die Proben dürfen ausschließlich für diese Art von Analyse verwendet werden. Die Proben müssen an einer Laminarflow-Werkbank gehandhabt werden. Reaktionsgefäße mit verschiedenen Proben dürfen nie gleichzeitig geöffnet werden. Die Pipetten zum Pipettieren der Proben dürfen ausschließlich nur dafür verwendet werden. Die Pipetten müssen Direktverdrängungs-Dispensierpipetten sein, andernfalls müssen Pipettenspitzen mit Aerosolfilter verwendet werden. Die verwendeten Spitzen müssen steril, DNAse/RNAsefrei sowie DNA/RNA-frei sein. Die Reagenzien müssen an einer Laminarflow-Werkbank gehandhabt werden. Die für die erforderlichen Reagenzien müssen so vorbereitet werden, dass sie in einer Sitzung aufgebraucht werden. Die Pipetten zum Pipettieren der Reagenzien dürfen nur zu diesem Zweck benutzt werden. Die Pipetten müssen Direktverdrängungs-Dispensierpipetten sein, andernfalls müssen Pipettenspitzen mit Aerosolfilter verwendet werden. Die verwendeten Spitzen müssen steril, DNAse/RNAse-frei sowie DNA/RNA-frei sein. Die sprodukte müssen so gehandhabt werden, dass ihre Verbreitung in die Umgebung weitestgehend begrenzt wird, um Kontaminationen zu vermeiden. Die Pipetten zum Pipettieren der sprodukte dürfen nur ausschließlich dafür benutzt werden. Spezielle Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen für die Komponenten Die Reaktionsgefäße mit OligoMIX für die erste und für die zweite sind Einweggefäße und dürfen daher nur einmal für sreaktionen verwendet werden. Für OligoMIX für die erste und für die zweite gelten folgende Sicherheitsempfehlungen (S-Sätze): S Gas/Rauch/Dampf/Aerosol nicht einatmen. Berührung mit den Augen vermeiden. Programmierung des Thermocyclers VERFAHREN - Überprüfen, ob der Temperaturblock des programmierbaren Thermostats (Thermocycler) kompatibel mit dem Format der im Kit enthaltenen «Monotest» Reaktionsgefäße ist (0,2 oder 0,5 ml-plastikröhrchen); - Im Handbuch des Cyclers prüfen, wie die Temperaturkontrolle erfolgt; - Möglichst die direkte Temperaturkontrolle am Heizblock auswählen (z.b. beim Thermocycler Hybaid TM oder Eppendorf TM ): Temperaturkontrollen mit Probesonde oder mit Simulationssoftware sollten nicht verwendet werden; - Wenn dies nicht möglich ist und bei Thermocyclern Modell GeneAmp PCR System 9600, 2400, 9700 oder 2700 (Applied Biosystems TM ) die Kontrolle der Temperaturvoreinstellung wählen; - Am Thermocycler die Parameter des Reaktionszyklus entsprechend den folgenden Tabellen einstellen: Programm der ersten Anzahl der Zyklen Temperatur Zeitdauer 1 Zyklus 95 C 4 min. 95 C 1 min. 35 Zyklen 55 C 1 min. 72 C 1 min. 1 Zyklus 72 C 5 min. 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3 Programm der zweiten Anzahl der Zyklen Temperatur Zeitdauer 1 Zyklus 95 C 2 min. 95 C 1 min. 30 Zyklen 55 C 1 min. 72 C 1 min. 1 Zyklus 72 C 5 min. Proben Dieses Kit darf nur mit dem Reaktionsprodukt der Reversen Transkription (cdna) aus RNA- Extrakten aus biologischen Proben verwendet werden. Das System zur Reversen RNA-Transkription verwendet den "Random Primer" zum Start der Polymerisationsreaktion. Wenn zelluläre biologische Proben analysiert werden, z.b. Vollblut, sollte die zur Reversen Transkriptionsreaktion eingesetzte Menge an extrahierter gesamt-rna überprüft werden, da sonst unspezifische sprodukte und Inhibitionsphänomene auftreten können. Die maximale Endkonzentration der gesamt-rna in der Reversen Transkriptionsreaktion sollte ca. 40 ng / µl betragen. Z.B. beträgt die Höchstmenge der gesamt-rna, die der Reversen Transkriptionsreaktion bei 25 µl Endvolumen hinzugefügt werden kann, ca. 1 µg. Die zur RNA-Extraktion aus der Ausgangsprobe eingesetzte Methode muss für die Reaktion der Reversen Transkription und sreaktion geeignete RNA erbringen. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist zu vermeiden. Daher wird empfohlen, die Proben vor dem Einfrieren zu aliquotieren. skontrollen Es ist absolut notwendig, jeden slauf zu validieren, indem eine negative und eine positive Kontrolle mitgeführt werden. Für die Negativkontrolle verwendet man steriles bidestilliertes Wasser (nicht im Kit enthalten), das der Reaktion anstelle der aus der Probe extrahierten cdna hinzugefügt wird. Für die Positivkontrolle verwendet man das Produkt «TOSCANA VIRUS - Positive Control». Vorbereitung der ersten - Die Proben für die Analyse und die Positivkontrolle auftauen, 5 Sekunden zentrifugieren, um den gesamten Inhalt am Gefäßboden zu konzentrieren, und in Eis stellen. - Jeweils ein farbloses Reaktionsgefäß «Monotest» für jede Analyseprobe, für die Negativkontrolle und für die Positivkontrolle auftauen, 5 Sekunden zentrifugieren, um den gesamten Inhalt am Gefäßboden zu konzentrieren, gut lesbar mit einem wasserfesten Stift beschriften und in Eis stellen. - Das Enzym «DNA pol. 2U / µl» nach den Angaben in der folgenden Tabelle mit «RECK» verdünnen. Das verdünnte Enzymvolumen sollte mindestens für alle vorgesehenen Reaktionen (einschließlich Kontrollen) ausreichen. Das verdünnte Enzym kann nicht aufbewahrt werden. Anzahl der Reaktionen «DNA pol. 2U / µl» RECK Gesamtvolumen 4 2,0 µl 18,0 µl 20 µl 5 2,5 µl 22,5 µl 25 µl 6 3,0 µl 27,0 µl 30 µl 7 3,5 µl 31,5 µl 35 µl 8 4,0 µl 36,0 µl 40 µl 9 4,5 µl 40,5 µl 45 µl 10 5,0 µl 45,0 µl 50 µl 11 5,5 µl 49,5 µl 55 µl 12 6,0 µl 54,0 µl 60 µl 13 6,5 µl 58,5 µl 65 µl 14 7,0 µl 63,0 µl 70 µl 15 7,5 µl 67,5 µl 75 µl 16 8,0 µl 72,0 µl 80 µl 17 8,5 µl 76,5 µl 85 µl 18 9,0 µl 81,0 µl 90 µl 19 9,5 µl 85,5 µl 95 µl 20 10,0 µl 90,0 µl 100 µl 21 10,5 µl 94,5 µl 105 µl 1. In jedes farblose «Monotest» Reaktionsgefäß 5 µl der verdünnten thermostabilen DNA-Polymerase (1U) pipettieren. 2. In jedes farblose «Monotest» Reaktionsgefäß 10 µl der extrahierten cdna pipettieren. Für die Negativkontrolle und die Positivkontrolle geht man in der gleichen Weise vor. 3. Die farblosen «Monotest» Reaktionsgefäße in den Thermocycler stellen und die Zeit-Temperatur-Folge für die erste sreaktion anschalten. Vorbereitung der zweiten - Ebenso viele rote Reaktionsgefäße «Monotest» auftauen, wie farblose verwendet wurden, 5 Sekunden zentrifugieren, um den gesamten Inhalt am Gefäßboden zu konzentrieren, gut lesbar mit einem wasserfesten Stift beschriften und auf Eis halten. - Das Enzym «DNA pol. 2U / µl» mit «RECK» verdünnen, wie vorher beschrieben. 4. In jedes rote «Monotest» Reaktionsgefäß 5 µl der verdünnten temperaturstabilen DNA Polymerase (1 U) pipettieren. 5. In jedes rote «Monotest» Reaktionsgefäß 1 µl des Produkts aus der ersten dazu pipettieren. Hinweis: Das Produkt der ersten kann spätere Analysen kontaminieren. Halten Sie die überschüssigen Produkte aus der ersten separat und wechseln Sie die Handschuhe am Ende dieses Schrittes. 6. Die roten «Monotest» Reaktionsgefäße in den Thermocycler stellen und die Zeit-Temperatur-Folge für die zweite sreaktion anschalten. Hinweis: Das Reaktionsprodukt kann bei -20 C für maximal einen Monat aufbewahrt werden. SCH mban071_de 28/05/13 Revisionsstand 02 Seite 5/10 SCH mban071_de 28/05/13 Revisionsstand 02 Seite 6/10

4 Nachweis des spezifischen sprodukts Das spezifische Produkt der zweiten kann durch elektrophoretische Trennung unter den folgenden Bedingungen nachgewiesen und bestimmt werden: - Verwendung eines 2%iges Agarosegel mit 1 µg/ml Ethidiumbromid 1x TBE-Puffer (89 mm TRIS, 89 mm Borsäure, 2 mm Dinatrium-EDTA); - Verwendung eines 4%iges Agarosegel mit 1 µg/ml Ethidiumbromid in 1x TAE-Puffer (40 mm TRIS Base, 20 mm TRIS Acetat, 1 mm Dinatrium-EDTA), analog zu den Produkten der Reihe «ELECTROPHORESIS». Das spezifische Produkt der zweiten hat eine Größe von 310 bp. Hinweis: Das Produkt der zweiten kann spätere Analysen kontaminieren. Überschüssige Produkte aus der zweiten und der beim Nachweis erzeugte Abfall müssen separiert werden. Das Beispiel zeigt das Schema eines Elektrophoresegels nach Auftrennung der sprodukte aus einem slauf. Taschen 1380 bp Positive Probe Negative Probe 517 bp ( *) ( *) 456 bp ( 610 bp *) (610 bp *) 396 bp 247 bp 310 bp 310 bp 75 bp 65 bp 46 bp Molekulargewichtsmarker Positivkontrolle Negativkontrolle Molekulargewichtsmarker * Wenn «RECK», interne Eignungskontrolle, eingesetzt wurde, müssen die Toscana-Virus- sprodukt negativen Proben dem sprodukt von «CPE-RNA - Internal Control» in einer Größe von ca. 610 bp entsprechen. Bei Einsatz von «RECK» können auch die Toscana-Virus- sprodukt positiven Proben das sprodukt von «CPE-RNA - Internal Control» aufweisen. Es ist unbedingt notwendig, die Spezifität des zweiten sprodukts zu validieren. Dazu vergleicht man seine Migration im Gel mit der Migration eines Markers mit bekannter Basenpaar-Länge und mit der Migration des zweiten sprodukts der Positivkontrolle. Das eventuelle Auftreten von unspezifischen Produkten bei der zweiten hat für den Nachweis der Toscana-Virus-cDNA keinerlei Bedeutung. Allgemeine Validierung des slaufs Die Ergebnisse der negativen und der positiven Kontrollreaktionen werden zur Validierung der entsprechend der folgenden Tabelle verwendet: der Negativkontrolle Spezifisches Produkt NICHT VORHANDEN der Positivkontrolle Spezifisches Produkt VORHANDEN korrekt korrekt Wenn das spezifische sprodukt in der negativen Kontrollreaktion vorhanden ist, sind Probleme in der sphase aufgetreten (Kontamination), die zu falschen Positivergebnissen führen können. Der Test muss ab der wiederholt werden. Wenn das spezifische sprodukt in der positiven Kontrollreaktion nicht vorhanden ist, sind Probleme in der sphase aufgetreten (unwirksame oder keine ), die zu falschen Negativergebnissen führen können. Der Test muss ab der wiederholt werden. Bewertung der Ergebnisse Zum Nachweis der Präsenz von Toscana-Virus cdna werden die Reaktionsergebnisse der Analysenproben werden nach folgender Tabelle beurteilt: der Probe Testergebnis Toscana virus-cdna Spezifisches Produkt NICHT VORHANDEN negativ NICHT VORHANDEN Spezifisches Produkt VORHANDEN positiv VORHANDEN Bevor das Ergebnis "cdna des Toscana-Virus NICHT VORHANDEN" für eine Testprobe definitiv validiert wird, muss die Möglichkeit geprüft werden, ob Probleme in der sphase (unwirksame oder keine ), in der Reversen Transkriptionsphase (unwirksame oder keine Reverse Transkription), oder in der Extraktionsphase (Verlust von RNA, Präsenz von Inhibitoren, RNA in degradierter Probe oder Ausgangsprobe mit ungenügender Zellenzahl) aufgetreten sind. In diesen Fällen könnte die Probe ungeeignet sein und zu einem falsch negativen Ergebnis führen. Die Eignung der Proben kann nachgewiesen werden, indem man ein System für die interne Qualitätskontrolle wie «RECK» verwendet. LITERATUR M. Valassina et al. (1996) J. Clin. Microbiol. 34: SCH mban071_de 28/05/13 Revisionsstand 02 Seite 7/10 SCH mban071_de 28/05/13 Revisionsstand 02 Seite 8/10

5 PROBLEMLÖSUNGEN ERKLÄRUNG DER SYMBOLE Das spezifische sprodukt ist in der negativen Kontrollreaktion vorhanden Fehlerhafte Dispensierung der cdna. Fehlerhafte Dispensierung des Produktes der ersten. Kontamination der vorbereiteten Reagenzien. Kontamination des sterilen Wassers für die Enzymverdünnung Kontamination des Enzymvorrats. Kontamination des Bereichs für die Extraktion/Vorbereitung oder der sreaktionen. Immer nur ein Reaktionsgefäß zurzeit öffnen; deren Inhalt nicht verschütten; Pipettenspitze immer wechseln. Immer nur ein Reaktionsgefäß zurzeit öffnen; deren Inhalt nicht verschütten; Pipettenspitze immer wechseln. Das Enzyms sorgfältig verdünnen und dispensieren; Pipettenspitze immer wechseln. Ein neues Aliquot vom sterilen Wasser verwenden. Ein neues Enzymaliquot verwenden. Oberflächen und Instrumente mit wasser-löslichen Detergenzien reinigen; Laborkittel wechseln; Reaktionsgefäße und Pipettenspitzen erneuern. Das spezifische sprodukt ist in der Positive Control Reaktion nicht vorhanden. Enzym zu stark verdünnt oder Fehler bei der Dispensierung des Enzyms. Fehler bei der Dispensierung der Positivkontrolle. Verdünnungsberechnungen überprüfen; Enzym sorgfältig dispensieren und gut mischen. Positivkontrolle sorgfältig dispensieren. Katalognummer. Oberer Temperaturgrenzwert. Chargencode. Zu verwenden bis (letzter Tag des Monats). In-vitro-Diagnostikum. Entspricht den Anforderungen der Europäischen Richtlinie 98\79\EG über In-vitro- Diagnostika. Inhalt ausreichend für "N" Tests. Achtung, lesen Sie die Gebrauchsanleitung. Abbau der Positivkontrolle. Fehler bei der Programmierung. ein neues Aliquot der Positivkontrolle verwenden. Zeit-Temperatur-Folge am Thermocycler kontrollieren. Hersteller. Fehler bei der Dispensierung des Produkts aus der ersten. Fehler bei der Dispensierung des Produkts der zweiten in die Geltaschen. das Produkt der ersten vorsichtig entnehmen und sorgfältig zur zweiten dispensieren. das Gel vorsichtig beladen. Unspezifische sprodukte in den Reaktionen der Proben vorhanden. Enzym zu stark konzentriert. die Berechnungen der Enzymverdünnung kontrollieren. Die Vorbereitung der ersten sreaktion dauert zu lange. Reaktionsgefäße, denen bereits die cdna zugesetzt wurde, auf Eis halten, bis sie in den Thermocycler gestellt werden. Fehler bei der Programmierung. Zu viel cdna in der Reaktion. Zeit-Temperatur-Folge am Thermocycler kontrollieren. Neuberechnung der Konzentration der RNA in der Reversen Transkriptionsreaktion. Die optimale Konzentration von 40 ng / 1 µl (1 µg RNA in den abschließenden Endvolumen 25 µl) dürfen nicht überschritten werden. SCH mban071_de 28/05/13 Revisionsstand 02 Seite 9/10 SCH mban071_de 28/05/13 Revisionsstand 02 Seite 10/10