Dissertation. zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. der Fakultät für Naturwissenschaften der Universität Ulm. vorgelegt von.

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1 Charakterisierung des Pyruvatdehydrogenase- Komplexes aus Corynebacterium glutamicum und Einfluss von Enzymen des anaplerotischen Knotenpunkts auf die Bildung von Valin und Pantothenat Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. der Fakultät für Naturwissenschaften der Universität Ulm vorgelegt von Diana Fiur aus Heidenheim Ulm 2004

2 Die vorliegende Arbeit wurde in der Abteilung Mikrobiologie und Biotechnologie der Universität Ulm angefertigt: Amtierender Dekan: Prof. Dr. Rolf Behm 1. Referent: Prof. Dr. Bernhard J. Eikmanns 2. Referent: Prof. Dr. Peter Dürre Tag der mündlichen Prüfung: 30. Juli 2004

3 INHALTSVERZEICHNIS I Inhaltsverzeichnis I. Einleitung... 1 II. Material und Methoden Bakterienstämme, Plasmide und Oligonukleotide Chemikalien, Geräte, Enzyme Nährmedien Kultivierung und Stammhaltung Transformationstechniken Transformation von C. glutamicum mittels Elektroporation Transformation von Corynebakterien Konjugativer Transfer von E. coli nach C. glutamicum Transformation von E. coli Isolierung und Reinigung von DNA Lösungen zur Isolierung von DNA Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli ( Mini-Präp ) Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli ( Midi-Präp ) Isolierung von Plasmid-DNA aus C. glutamicum Isolierung von chromosomaler DNA aus C. glutamicum Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Reinigung und Konzentrierung von Nukleinsäuren...23 Phenolisierung...23 Ethanolfällung...24 Isopropanolfällung...24 Butanolfällung...24 Mikrodialyse von DNA...24 Reinigung und Konzentrierung von DNA mittels Mikrokonzentratoren...25 Konzentrations-und Reinheitsbestimmung von Nukleinsäure-Lösungen25 7. Amplifikation, Rekombination und Analyse von DNA Polymerase-Kettenreaktion (PCR)...25

4 INHALTSVERZEICHNIS II 7.2 Restriktion von DNA Dephosphorylierung von DNA Ligation von DNA-Fragmenten Agarose-Gelelektrophorese Sequenzierung Southern-Blot -Hybridisierung...29 Digoxigenin-Markierung von DNA-Sonden...29 Auftrennung von DNA und Übertragung auf eine Nylonmembran...29 Hybridisierung von DNA mit einer Digoxigenin-markierten DNA-Sonde.30 Detektion der hybridisierten Sonde Isolierung und Analyse von RNA Allgemeine Bemerkungen zur Isolierung von RNA Zellernte zur RNA-Präparation RNA-Präparation mit heißem Phenol RNA-Isolierung mit Hilfe des RNeasy-Mini-Kit Radioaktive Northern-Blot -Hybridisierungen...34 Transfer von RNA...34 Radioaktive Markierung von Sonden...35 Hybridisierung mit radioaktiven DNA-Sonden Primer Extension -Analyse LI-COR-Analyse Bestimmung von Enzymaktivitäten Zellaufschluss mit dem RiboLyser Zellaufschluss mittels Universalmischgerät Proteinbestimmung nach Bradford Berechnung von spezifischen Enzymaktivitäten Bestimmung der Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex- und 2-Oxoglutarat- Komplex-Aktivität Bestimmung der Pyruvat-Decarboxylase-Aktivität Bestimmung der Dihydrolipoamid-Transacetylase-Aktivität Bestimmung der Dihydrolipoamid-Dehydrogenase-Aktivität Bestimmung der Pyruvat-Kinase Bestimmung der PEP-Carboxylase Bestimmung der PEP-Carboxykinase...43

5 INHALTSVERZEICHNIS III 9.12 Bestimmung der Pyruvat-Carboxylase Bestimmung der Pyruvat-Chinon-Oxidoreduktase Bestimmung der Chloramphenicol-Acetyltransferase-Aktivität Detektion von Aminosäuren mittels HPLC-Analyse Fermentationen und Probenahme zur Bestimmung von Valin mittels RP- HPLC RP-HPLC zur Quantifizierung von Aminosäuren Bestimmung von Pantothenat...48 III. Ergebnisse Analyse des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes (PDHC) in Corynebacterium glutamicum Spezifische Aktivitäten des PDHC im Wachstumsverlauf Charakterisierung der PDHC-Akivität in Zellextrakten von C. glutamicum Bestimmung des K s -Wertes von Pyruvat für den PDHC Etablierung eines Enzymtests zum Nachweis der Pyruvat-Decarboxylase (E1-Untereinheit des PDHC) aus C. glutamicum Isolierung und Untersuchung der Dihydrolipoamid-Transacetylase (E2- Untereinheit) aus C. glutamicum Transkriptionsanalysen zur Expression der Gene acee und acef aus C. glutamicum Northern-Blot -Experimente der Gene acee und acef Promotoraktivitäten der Gene acee und acef im Wachstumsverlauf und auf unterschiedlichen Kohlenstoffquellen Transkriptionsstartpunkt-Bestimmung von acee Transkriptionsstartpunkt-Bestimmung von acef Valin- und Pantothenatproduktion mit rekombinanten Stämmen Konstruktion rekombinanter Stämme Optimierung der Fermentationsbedingungen Valinsekretion rekombinanter Stämme Pantothenatsekretion rekombinanter Stämme...82

6 INHALTSVERZEICHNIS IV 6. Valinproduktion und Wachstumsverhalten von Deletionsmutanten im Gen acee Nachweis der Deletion des acee-gens im Chromosom von C. glutamicum Pyruvat-Dehydrogenase und Pyruvat-Decarboxylase-Aktivität in C.glutamicum-Stämmen mit deletiertem acee-gen Wachstumsverhalten und Valinproduktion rekombinanter Valinstämme 87 IV. Diskussion Charakterisierung des PDHC von C. glutamicum Transkriptionsstudien zu den Genen acee und acef in C. glutamicum Valin- und Pantothenatproduktion mit C. glutamicum V. Zusammenfassung Summary VI. Literaturverzeichnis

7 ABKÜRZUNGEN V Abkürzungen A Adenin A. Azotobacter α Alpha Ac Acetat acee Pyruvat-Decarboxylase (Gen) acef Dihydrolipoamid-Transacetylase (Gen) Acetyl-P Acetylphosphat (d) ADP (2 -Deoxy-) Adenosin-5'-diphosphat AE Acetat-EDTA-Puffer A 260/280 AK APS AS ATCC ATP Absorption bei 260/280 nm Acetat-Kinase (Protein) Ammoniumpersulfat Aminosäure(n) 'American Type Culture Collection' Adenosin-5'-triphosphat B. Bacillus β Beta BHI 'Brain-Heart-Infusion' BHIS 'Brain-Heart-Infusion'-Sorbitol bp Basenpaare BSA Rinderserumalbumin bzw. beziehungsweise C Cytosin, Kohlenstoff C. Corynebacterium C Grad Celsius ca. circa CaCl 2 Calciumchlorid CAT Chloramphenicol-Acetyltransferase cdna komplementäre DNA cm Zentimeter Cm Chloramphenicol CMN Corynebacterium-Mycobacterium-Nocardia

8 ABKÜRZUNGEN VI CoA Coenzym A CO 2 Kohlendioxid CSPD Disodium 3-(4-metho xyspiro {1,2-dioxetane-3,2-(5- chloro)tricyclo [ ,7]decan}-4-yl)phenyl phosphat CTP Cytosin-5'-triphosphat CuSO 4 Kupfersulfat DCPIP 2,6-Dichlorindophenol DEPC Diethylpyrocarbonat Da Dalton DHL Dihydrolipoamid-Transacetylase (Protein) DIG Digoxygenin DMSO Dimethylsulfoxid DNA Deoxyribonukleinsäure DNase Deoxyribonuklease DTNB Dithionitrobenzoat DTT Dithiothreitol E. Escherichia, Enterococcus EDTA Ethylendiamintetraessigsäure et al. 'et alii' (und andere) FAD/FADH 2 Flavin-Adenin-Dinukleotid oxidiert/reduziert FeSO 4 Eisensulfat G Guanin g Gramm; Erdbeschleunigung GDP Guanosin-5 -diphosphat Glk Glukose Glukose-6-P Glukose-6-Phosphat GmbH Gesellschaft mit beschränkter Haftung GTP Guanosin-5'-triphosphat h Stunde(n) HCl Salzsäure HEPES 4-(2-Hydroxylethyl)-1-Piperazinethansulfonsäure H 2 O Wasser HPLC High-performance-liquid-chromatography ICL Isocitrat-Lyase (Protein)

9 ABKÜRZUNGEN VII i. d. R. in der Regel IPTG Isopropyl-1-thio-β-D-galactosid ilva Threonin-Dehydratase (Gen) ilvbn Acetohydroxy-Säure-Synthase (Gen) ilvc Isomero-Reduktase (Gen) ilvd Dihydroxy-Säure-Dehydratase (Gen) k Kilo-(10 3 ) K-Acetat Kaliumacetat kb Kilobasen KCl Kaliumchlorid kda Kilodalton KG Kommanditgesellschaft KHCO 3 Kaliumhydrogencarbonat K 2 HPO 4 Dikaliumhydrogenphosphat KH 2 PO 4 Kaliumdihydrogenphosphat Km Kanamycin K m/s KM KOH kv l λ LB LDH LiCl IDP log ln lpda µf Microfarad µl Microliter M Mol, Molar m Milli-(10-3 ) ma Milliampère Michaelis-Menten-Konstante Komplexmedium Kalilauge Kilovolt Liter Lambda Luria-Bertani Laktat-Dehydrogenase Lithiumchlorid Inosin-5 -diphosphat Dekadischer Logarithmus natürlicher Logarithmus Lipoamid-Dehydrogenase-Gen

10 ABKÜRZUNGEN VIII MAE MOPS-Acetat-EDTA-Puffer male Malat-Enzym (Gen) MCS Multiple cloning site ME Malat-Enzym MES Morpholinoethansulfonsäure mg Milligramm Mg 2+ MgCl 2 MgSO 4 min ml mm mm/mmol MM MnCl 2 MnSO 4 mol MOPS mrna MS mu N Magnesium Magnesiumchlorid Magnesiumsulfat Minute(n) Milliliter Millimeter Millimolar Minimalmedium Manganchlorid Mangansulfat Stoffmenge (6,022 x Teilchen) 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure 'messenger'-rna Malat-Synthase (Protein) Milliunits Amino- n Nano-(10-9 ) NaAc Natriumacetat Na-Citrat Natrium-Citrat NaCl Natriumchlorid NAD(P)H Nikotinamidadenindinukleotid (-2'-phosphat), reduziert NaHCO 3 Natriumhydrogencarbonat NaN 3 Natriumazid NaOH Natronlauge ng Nanogramm (NH 4 ) 2 SO 4 Ammoniumsulfat Ni Nickel NiCl 2 Nickelsulfat

11 ABKÜRZUNGEN IX nm Nanometer NTA Nitrilotrichloressigsäure (d)ntps (2 -Deoxy) Nukleotide Ω Ohm OD x Optische Dichte bei einer Wellenlänge von x nm ODx Oxalacetat-Decarboxlyase (Protein) OGDH 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase (Protein) OGDHC 2-Oxoglutaratdehydrogenase-Komplex (Protein) OPA ortho-pthaldialdehyd ORF offener Leseraster p Pico-(10-12 ) P. Pseudomonas panb Keto-Pantoate-Hydroxymethyl-Transferase (Gen) panc Pantothenat-Synthetase (Gen) P i PAGE PC pck PCR PCx PEG PEP PEPCk PEPCx PEX PDC PDH PDHC ph PK PIPES pmol PMSF anorganisches Phosphat Polyacrylamid-Gelelektrophorese Phenol-Chloroform PEP-Carboxykinase (Gen) Polymerasekettenreaktion Pyruvat-Carboxylase (Protein) Polyethylenglykol Phosphoenolpyruvat PEP-Carboxykinase (Protein) PEP-Carboxylase (Protein) Primer-Extension Pyruvat-Decarboxylase (Protein) Pyruvat-Dehydrogenase (Protein) Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (Protein) Negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration Pyruvat-Kinase (Protein) Piperazin-N,N'-bis (2-ethansulfonsäure) Picomolar Phenylmethylsulfonylfluorid

12 ABKÜRZUNGEN X ppc PEP-Carboxylase (Gen) PTA Phosphotransacetylase (Protein) pqo Pyruvat-Chinon-Oxidoreduktase (Gen) PQO Pyruvat-Chinon-Oxidoreduktase (Protein) pyc Pyruvat-Carboxylase (Gen) pyk Pyruvat-Kinase (Gen) R Resistenz 'registered' (eingetragenes Warenzeichen) RNA Ribonukleinsäure RNase Ribonuklease RP Reversed phase rpm Umdrehungen pro Minute RT Raumtemperatur, Reverse Transkriptase s Sekunde(n) S. Salmonella SAP shrimp alkaline phosphatase SDS Natriumdodecylsulfat spez. spezifisch t Tonnen T Thymin TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer Taq Abkürzung für die DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer TE Tris-EDTA TEMED N,N,N',N'-Tetramethyl-ethylendiamin TM Tris TPP TY 'trade mark' (Handelsmarke) Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Thiaminpyrophosphat Tryptone Yeast µg Mikrogramm µm Mikromolar U Einheiten ('units') ÜN über Nacht ÜNK Übernachtkultur

13 ABKÜRZUNGEN XI (d) UTPs (2 -Deoxy) Uridintriphosphat UV Ultraviolett V Volt VADHC Verzweigtkettiger-Dehydrogenase-Komplex Val1 C. glutamicum ilva Val2 C. glutamicum ilva panbc Vol Volumen v/v Volumen pro Volumen w/v Gewicht pro Volumen WT Wildtyp Z. Zymomonas z. B. zum Beispiel ZnSO 4 Zinksulfat Aminosäuren A Alanin M Methionin C Cystein N Asparagin D Asparaginsäure P Prolin E Glutaminsäure Q Glutamin F Phenylalanin R Arginin G Glycin S Serin H Histidin T Threonin I Isoleucin V Valin K Lysin W Tryptophan L Leucin Y Tyrosin

14 EINLEITUNG 1 I. Einleitung Die Gattung Corynebacterium gehört zusammen mit den Gattungen Mycobacterium und Nocardia zur CMN-Gruppe (Barksdale, 1970) der Actinomyceten (Stackebrandt, 1997). Das Hauptcharakteristikum dieser Gruppe ist der Besitz von die Zelle umgebenden Mycolsäuren (Minnikin, 1978). Alle zu dieser Gruppe gehörenden Organismen sind nicht-bewegliche und Gram-positive Stäbchen. Die in dieser Arbeit verwendete Art, Corynebacterium glutamicum, wurde erstmals 1957 von Kinoshita et al. als unregelmäßig geformtes und nicht sporulierendes Bodenbakterium isoliert, das sich durch einen hohen GC-Gehalt von 53,8 % auszeichnet (Kalinowski et al., 2003). Besondere Bedeutung erlangte C. glutamicum aufgrund seiner Fähigkeit, Aminosäuren mit hohen Erträgen zu produzieren. C. glutamicum ist zur Verwertung von Zuckern, Alkoholen und Säuren in der Lage (Liebl, 1991). In Abbildung 1 ist der Zentralstoffwechsel von C. glutamicum abgebildet. Glukose wird in der Regel über die Glykolyse zu Pyruvat reduziert. Der oxidative Pentosephosphat-Weg kann jedoch alternativ zum Zuckerabbau genutzt werden. Pyruvat wird anschließend über den Pyruvatdehydrogenase-Komplex (PDHC) oxidativ zu Acetyl-CoA decarboxyliert, wobei das Acetyl-CoA in den Tricarbonsäure-Zyklus eingeht. Die PDHC ist ein Multienzym-Komplex bestehend aus den drei Untereinheiten Pyruvat-Decarboxylase, Dihydrolipoamid- Transacetylase und Dihydrolipoamid-Dehydrogenase. Spezifische Aktivitäten dieses Thiaminpyrophosphat- und Mg 2+ -abhängigen Komplexes wurden bereits in diversen C. glutamicum Stämmen nachgewiesen (Shiio et al., 1984, Cocaign- Bousquet und Lindley, , Schwinde et al., 2001). Bei Wachstum auf z. B. Acetat wird dieses über die Enzyme Acetatkinase und Phosphotransacetylase zu Acetyl-CoA aktiviert (Shiio et al., 1969) und anschließend in den Tricarbonsäure-Zyklus eingeschleust. Weiterhin spielen die Enzyme Malat-Synthase und Isocitrat-Lyase, zwei Enzyme des Glyoxylat-Zyklus, die von Reinscheid et al. (1994) charakterisiert wurden, hierbei eine wichtige Rolle. Da C. glutamicum industriell zur Produktion von Aminosäuren eingesetzt wird, und hierzu Intermediate aus dem Zentralstoffwechsel abgezogen werden, ist der Glyoxylat-Zyklus als anaplerotische Einheit zum Auffüllen und der Aufrechterhaltung des Tricarbonsäure-Zyklus unerläßlich.

15 EINLEITUNG 2 Glukose Acetat CO 2 Glukose-6-P Phosphoenolpyruvat CO 2 Glykolyse CO 2 Pyruvat Glukoneogenese PDHC Acetyl-CoA Valin, Pantothenat PTA Acetat AK Acetyl-P Aspartat Oxalacetat Citrat Threonin Malat MS Acetyl-CoA Isocitrat Lysin Isoleucin Fumarat Glyoxylat ICL Succinat 2-Oxoglutarat CO 2 Succinyl-CoA Glutamat CO 2 Abbildung 1: Zentralstoffwechsel von C. glutamicum.

16 EINLEITUNG 3 Ein bedeutender Knotenpunkt im Zentralstoffwechsel von C. glutamicum, insbesondere für die Bereitstellung benötigter Vorläuferprodukte zur Produktion von Aminosäuren und Vitaminen, ist der PEP-Pyruvat-Oxalacetat-Knotenpunkt, der auch als anaplerotischer Knotenpunkt bezeichnet wird (Sahm et al., 2000). Er stellt das Bindeglied zwischen der Glykolyse und dem Tricarbonsäure-Zyklus dar, ist Startpunkt für die Glukoneogenese und für anaplerotische Reaktionen. Die wichtigsten Enzyme dieses Knotenpunkts sind die Pyruvat-Kinase (kodiert vom pyk-gen), die beiden C3-carboxylierenden Enzyme PEP-Carboxylase (kodiert vom ppc-gen) und Pyruvat-Carboxylase (kodiert vom pyc-gen), sowie die drei C4- decarboxylierenden Enzyme PEP-Carboxykinase (kodiert vom pck-gen), das Malat-Enzym (kodiert vom male-gen) und die Oxalacetat-Decarboxylase (kein Gen bekannt). Der letzte Schritt der Glykolyse, in dem Pyruvat unter ATP-Bildung aus PEP entsteht, wird von der Pyruvat-Kinase bewerkstelligt (Gubler et al., 1994). Die PEP-Carboxylase katalysiert die reversible Carboxylierung von PEP zu Oxalacetat. Deletionsmutanten im ppc-gen haben gezeigt, dass dieses für das Wachstum nicht essentiell ist (Peters-Wendisch et al., 1993; Gubler et al., 1994), da ein weiteres C3-carboxylierendes Enzym, die Pyruvat-Carboxylase, in C. glutamicum e- xistiert (Peters-Wendisch et al., 1997). Letzteres katalysiert die irreversible Carboxylierung von Pyruvat zu Oxalacetat (Scrutton und Young, 1972) und ist essentiell für das Wachstum auf Laktat und Pyruvat (Peters-Wendisch et al., 1997). Die beiden genannten Enzyme sind in der Lage, sich bei Wachstum auf Glukose gegenseitig zu ersetzen, wohingegen eine Doppelmutante in den Genen ppc und pyc nicht mehr zum Wachstum befähigt war (Peters-Wendisch et al., 1998). Das dritte Enzym, die PEP-Carboxykinase, katalysiert im Allgemeinen die Decarboxylierung von Oxalacetat zu PEP und ist ATP- oder GTP-abhängig (Utter und Kohlenbrander, 1972), während es in C. glutamicum GTP- oder ITP-abhängig ist (Jetten und Sinskey, 1993). Die Herstellung einer Deletionsmutante im pck-gen zeigte, dass die PEP-Carboxykinase essentiell für das Wachstum auf Aceatat oder Laktat, nicht jedoch für das Wachstum auf Glukose ist, was auf eine gluconeogenetische Funktion dieses Enzyms hinwies (Riedel et al., 2001). Es existieren generell zwei weitere C4-decarboxylierende Enzyme, das Malat-Enzym, das die reversible Decarboxylierung von Malat zu Pyruvat (Fraenkel, 1975) katalysiert und die Oxalacetat-Decarboxylase, die verantwortlich für die Umsetzung von Oxalacetat zu Pyruvat ist (Krampitz und Werkman, 1941). Enzymaktivitäten des Malat-Enzyms konn-

17 EINLEITUNG 4 ten in verschiedenen C. glutamicum-stämmen gemessen und das male-gen isoliert werden (Cocaign-Bousquet und Lindley, 1995; Cocaign-Bousquet et al., 1996; Gourdon und Lindley, 1999; Vallino und Stephanopoulos, 1993; Gourdon et al., 2000). Die Reinigung und Charakterisierung der Oxalacetat-Decarboxylase von C. glutamicum war bereits möglich, ein dazugehöriges Gen konnte bislang jedoch nicht isoliert werden (Jetten und Sinskey, 1995). Der PEP-Pyruvat-Oxalacetat- Knotenpunkt mit allen bedeutenden Enzymen ist in Abbildung 2 dargestellt. PK Pyruvat ODx Oxaloacetat ME Abbildung 2: Schematische Darstellung des PEP-Pyruvat-Oxalacetat- Knotenpunkts mit allen involvierten Enzymen. PK: Pyruvat-Kinase; PEPCx: PEP-Carboxylase; PEPCk: PEP-Carboxykinase; PCx: Pyruvat-Carboxylase; ODx: Oxalacetat-Decarboxylase; ME: Malat-Enzym; PQO: Pyruvat-Chinon-Oxidoreduktase; PDHC: Pyruvatdehydrogenase-Komplex

18 EINLEITUNG 5 Neben der PDHC existiert in C. glutamicum eine Pyruvat-Chinon-Oxidoreduktase, die Pyruvat direkt zu Acetat umsetzt (M. Schreiner, persönliche Mitteilung). Das für dieses Enzym kodierende pqo-gen konnte identifiziert und das Enzym gereinigt und biochemisch charakterisiert werden, wobei sich mit einem K m -Wert von 30 mm eine sehr geringe Affinität zu Pyruvat zeigte. C. glutamicum wird als Aminosäureproduzent industriell eingesetzt. Besondere Bedeutung kommt diesem Organismus bei der Herstellung von Glutamat, von welchem gegenwärtig 1,5 Millionen t/jahr produziert werden (Hermann, 2003), zu. Glutamat wird unter bestimmten induzierenden Bedingungen wie z. B. durch Zugabe von Detergentien wie Tween (Takinami et al., 1965) oder unter Biotinmangel (Shiio et al., 1962) ins Medium ausgeschieden und kommt in erster Linie als Geschmacksverstärker in der Lebensmittelindustrie zum Einsatz (Kleemann et al., 1985). Im Gegensatz zu Glutamat findet Lysin, dessen Produktion momentan bei t/jahr liegt, hauptsächlich als Futtermittelzusatz (Leuchtenberger, 1996) Verwendung. Eine immer stärker werdende Nachfrage gibt es für die drei verzweigtkettigen A- minosäuren Leucin, Isoleucin und Valin ( t/jahr). Diese Aminosäuren kommen als Zusatz zu Futtermittel und Infusionslösungen sowie als Vorstufe für die chemische Synthese von Herbiziden (Eggeling, 2001; Leuchtenberger, 1996) zur Anwendung. Ein weiteres biotechnologisch bedeutendes Produkt ist Pantothenat, das mit 4000 t/jahr zum Großteil chemisch synthetisiert wird (Vandamme, 1992). Pantothenat gehört zu den wasserlöslichen B-Vitaminen (Vitamin B5), ist der Vorläufer für die Herstellung von Coenzym A und kann von Tieren nicht selbst synthetisiert werden. Demzufolge liegt der wirtschaftliche Nutzen für Pantothenat in der pharmazeutischen Industrie und als Zusatz zu Futter- und Nahrungsmitteln. Die erste Generation von Produktionsstämmen wurde durch ungerichtete Mutagenese hergestellt. Mit dieser Methode konnte im Jahre 1961 eine Homoserinauxotrophe und Lysin-produzierende Mutante erhalten werden (Kitada et al., 1961). Spätere Verfahren zum Auffinden von Mutanten konzentrierten sich auf solche Stämme, die auf das Lysin-Analog S-(2-Aminoethyl)-Cystein und Threonin resistent waren (Sano und Shiio, 1970). Einer dieser Stämme zeichnete sich durch eine auf Lysin Feedback-resistente Aspartat-Kinase aus, wodurch eine Steigerung

19 EINLEITUNG 6 der Lysinproduktion möglich war. Die Tatsache, dass die Herstellung von Produktionsstämmen durch ungerichtete Mutagenese unerwünschte Nebeneffekte wie ein instabiles Produktionsverhalten, eine höhere Sensitivität gegenüber der Temperatur oder des ph-wertes und eine teilweise kostspielige Supplementation führten dazu, dass in der zweiten Generation von Produktionsstämmen Gene gezielt in bereits durch ungerichtet Mutagenese hergestellten Stämmen überexprimiert wurden. Durch gezielte Überexpression der Gene des Lysinbiosynthesewegs in dem auf Lysin Feedback-resistenten Stamm konnte von Cremer et al. (1991) gezeigt werden, dass neben der Aspartat-Kinase der vom dapa-gen kodierten Dihydrodipicolinat-Synthase die größte Bedeutung bei der Kontrolle des Flusses in Richtung Lysin zukommt. Die beste Möglichkeit, unerwünschte Sekundäreffekte zu vermeiden, geht mit der Entschlüsselung des Genoms von C. glutamicum einher (Kalinowski et al., 2003), wodurch nun gezielte genetische Manipulationen zur Steigerung der Aminosäureproduktion durchgeführt werden können. Die gezielte Veränderung von Genen des Zentralstoffwechsels sollte in dieser Arbeit zur Produktionssteigerung von Valin und Pantothenat angewandt werden. Die Gene des Valin- und Pantothenatbiosynthese-Wegs in C. glutamicum konnten identifiziert und Stämme, die sowohl Valin als auch Pantothenat ins Medium ausscheiden, hergestellt werden (Cordes et al., 1992; Keilhauer et al., 1993; Dusch et al., 1999; Sahm und Eggeling, 1999; Radmacher et al., 2002; Merkamm et al., 2003). Abbildung 3 zeigt sowohl die Biosynthesewege der Aminosäuren Isoleucin und Valin als auch des Vitamins Pantothenat. Isoleucin wird aus Threonin hergestellt, wobei der einleitende Schritt dieses Biosynthesewegs von der Threonin- Dehydratase katalysiert wird. Bei einer Konzentration von mehr als 5 mm Isoleucin im Medium (Morbach et al., 1995) wird die Threonin-Dehydratase und alle folgenden Enzyme, die zur Synthese von Isoleucin und Valin notwendig sind, gehemmt. Die Synthese von Valin erfolgt ausgehend von zwei Molekülen Pyruvat in drei Schritten durch die von ilvb, N, C und D kodierten Enzyme zum Keto-Isovalerat. Aus Keto-Isovalerat kann entweder über eine von ilve kodierte Transaminase B

20 EINLEITUNG 7 Threonin-Dehydratase (ilva) Threonin Pyruvat + Pyruvat Oxobutyrat + Pyruvat Acetolaktat Dihydroxy-Isovalerat Acetohydroxy-Säure- Synthase (ilvb,n) Isomero-Reduktase (ilvc) Valin Transaminase B (ilve) Aspartat- Decarboxylase (pand) β-alanin Keto-Isovalerat Pantothensäure Dihydroxy-Säure- Dehydratase (ilvd) Keto-Pantoat- Hydroxymethyl- Transferase (panb) Aspartat Keto-Pantoatet Ketopantoat-Reduktase (pane) Isoleucin Pantothenat-Synthetase (panc) Pantothenat Abbildung 3: Biosynthesewege zur Herstellung der Aminosäuren Valin und Isoleucin und des Vitamins Pantothenat. Valin oder alternativ in drei weiteren Schritten Pantothenat hergestellt werden. Hierfür wird Keto-Isovalerat in zwei Schritten zu Pantothensäure umgesetzt, die in einem letzten Schritt mit β-alanin über eine Pantothenat-Synthetase zu Pantothenat katalysiert wird. Ein Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung des PDHC von C. glutamicum in Zellextrakten. Weiterhin sollten für die beiden Untereinheiten Pyruvat- Decarboxylase (E1-Untereinheit, kodiert von acee) und Dihydrolipoamid- Transacetylase (E2-Untereinheit, kodiert von acef) der PDHC geeignete Nach-

21 EINLEITUNG 8 weissysteme etabliert werden und beide Enzyme in Zellextrakten und auf transkriptioneller Ebene untersucht werden. Eine weitere Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war, ausgehend von bereits bekannten und produzierenden Valin- und Pantothenatproduktionsstämmen (C. glutamicum ilva und C. glutamicum ilva panbc), die Enzymaktivitäten des PEP-Pyruvat-Oxalacetat-Knptenpunkts zu variieren und diese Stämme hinsichtlich ihres Wachtumsverhaltens und der Produktion von Valin und Pantothenat zu untersuchen.

22 MATERIAL UND METHODEN 9 II. Material und Methoden 1. Bakterienstämme, Plasmide und Oligonukleotide In Tabelle 1 sind die in dieser Arbeit verwendeten Escherichia- sowie Corynebacterium- Stämme zusammengetragen; Tabelle 2 zeigt die in dieser Arbeit verwendeten Plasmide und Tabelle 3 die Oligonukleotide, mit denen gearbeitet wurde. Tabelle 1: Verwendete Bakterienstämme Stamm genetische Eigenschaften Referenz/ Herkunft Escherichia- Stämme E. coli DH5α reca1, enda1, hsdr17, sup E44, rela1, gyra96, thi-1, lac Zα E. coli S17-1 thi-1, endar1, hsdr17, sup E44, pro Hanahan, 1985 Simon et al., 1983 Corynebacterium- Stämme C. glutamicum Wildtyp Abe et al., 1967 C. glutamicum acee acee M. Schreiner C. glutamicum ilva ilva Sahm und Eggeling, 1999 C. glutamicum ilva panbc ilva, panbc Radmacher et al., 2002 C. glutamicum ilva panb pck C. glutamicum ilva panbc acee ilva, panbc, pck ilva, panbc, acee diese Arbeit diese Arbeit

23 MATERIAL UND METHODEN 10 C. glutamicum ilva pyc C. glutamicum ilvn/ M13 C. glutamicum ilvn/ M13 acee C. glutamicum ilva panbc ilvn/m13 C. glutamicum ilva panbc ilvn/m13 acee C. glutamicum R127 panc: pk 18 mob panc ilva, pyc ilvn resistent gegenüber der Rückhemmung von Val, Ile, Leu ilvn resistent gegenüber der Rückhemmung von Val, Ile, Leu; acee ilva, panbc, ilvn resistent gegenüber der Rückhemmung von Val, Ile, Leu ilva, panbc; ilvn resistent gegenüber der Rückhemmung von Val, Ile, Leu; acee panc-integrationsmutante in restriktions-negativem Stamm diese Arbeit V. Elisakova diese Arbeit V. Elisakova diese Arbeit Sahm und Eggeling, 1999 Tabelle 2: Plasmide Vektor Eigenschaften Referenz pjc1 ilvbncd Km R ; trägt Ile-Biosynthesegene ilvbncd mit nativen Promotoren Sahm et al., 1999 pecm3 ilvbncd Cm R ; trägt Ile-Biosynthesegene ilvbncd mit nativen Promotoren Sahm et al., 1999 pek0 Km R, ori pbl1, ori cole1 Eikmanns et al., 1991a pek0-pck peko-lpda Km R, ori pbl1, ori cole1; Überexpression von pck Km R, ori pbl1, ori cole1; Überexpression von lpda Riedel et al., 2001 Schwinde et al., 2001 pk19 mobsacb Km R, orit (mobilisierbar), oriv Schäfer et al., 1994 pk19 acee Km R, ori pbl1, ori cole1; Vektor zur Deletion von acee M. Schreiner

24 MATERIAL UND METHODEN 11 pk19 mobsacbpyc pk19 mobsacbpck pvwex1-pyc pxtpoxbex Km R, ori pbl1, ori cole1; Vektor zur Deletion von pyc Km R, ori pbl1, ori cole1; Vektor zur Deletion von pck Km R, laci q, P tac, ori phm1519, ori E,c., pyc ohne eigenen Promotor Tet R, laciq, trägt pqo zur Überexpression Peters-Wendisch et al., 1998 Riedel et al., 2001 Katsoulidis, Dissertation B. Bathe, Degussa pekex2 Km R, laciq, tacp, ori pbl1, ori cole1 Eikmanns et al., 1994 pekex2-pyk pmfα-ppc pet2 Km R, laciq, tacp, ori pbl1, ori cole1; trägt pyk-gen zur Überexpression Km R, trägt ppc-gen mit nativem Promotor Km R, cat, ori pbl1, ori cole1 diese Arbeit Eikmanns et al., 1989 Vasicova et al., 1998 pet2-acee pet2-acef Km R, cat, ori pbl1, ori cole1 Promotortestvektor zur Untersuchung der acee-promotorregion Km R, cat, ori pbl1, ori cole1 Promotortestvektor zur Untersuchung der acef-promotorregion diese Arbeit diese Arbeit Tabelle 3: Oligonukleotide Primer DNA-Sequenz Beschreibung Primer zur Überexpresssion over pyk1 CGGGATCCCGAATGGTAGTACCTGTGGC Hin- Primer, BamHI over pyk2 GGGGTACCCCGCGCTGACACCACGTACA Rück- Primer, KpnI

25 MATERIAL UND METHODEN 12 Primer zur Klonierung von Promotorfusionen ace1 ACGCGTCGACCACCAAAAGGACATCAGACC Hin- Primer, SalI acee2 CGCGGATCCACACCTCCTGTTGGAATG Rück- Primer, BamHI acef1 ACGCGTCGACGCTCATATTCAATGCGTTCGCG Hin- Primer, SalI acef2 CGCGGATCCGCAAGTCGTGTCGTTAAAACGG Rück- Primer, BamHI Primer zum Nachweis von Deletionsmutanten acee1 ACGCGTCGACCACCAAAAGGACATCAGACC Nachweis der acee- Deletion acee3 GGATAGGTGATTGGAAGTTGGGCAAACGAAG CATGA Nachweis der acee- Deletion acee5.3 CGCGGATCCGCGGGATTTATCTGTCCC Nachweis der acee- Deletion pyc1 GTCGACTCACACATCTTC Nachweis der pyc- Deletion pyc2 CACCAGCGAATGGTGCAG Nachweis der pyc- Deletion IRD800-markierte Primer für Primer -Extension-Reaktionen CM4 GAAAATCTCGTCGAAGCTCG IRD800-markiert CM5 AAGCTCGGCGGATTTGTC IRD800-markiert Sequenzier- Primer Sec-Hin2 TGACCATGATTACGCCAAGC Hin- Primer zur Sequenzierung von pekex2 sec-rev CTTCTCTCATCCGCCAAAAC Rück- Primer zur Sequenzierung von pekex2 M13 for GTTTTCCCAGTCACGAC Universal primer sec-pyk-kin2 CACAGCGATGGCTCCGAA Primer zur Sequenzierung des Mittelstücks von pyk Alle Primer wurden von den Firmen MWG Biotech GmbH (Ebersberg) und Biomers (Ulm) bezogen. Die jeweiligen Schnittstellen sind rot hinterlegt.

26 MATERIAL UND METHODEN Chemikalien, Geräte, Enzyme Die eingesetzten Chemikalien wurden von folgenden Firmen bezogen: Difco Laboratories (Detroit, USA), Geschäftsbereich Fluka, Merck KGaA (Darmstadt), Riedel de Häen AG (Seelze), Serva Feinbiochemica GmbH & Co KG (Heidelberg), Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Deisenhofen) (Ausnahmen sind im Text gesondert erwähnt) Folgende zum Teil nicht im Text erwähnte Geräte wurden benutzt: Fotodokumentationsanlage: MWG-Biotech GmbH (Ebersberg) Photometer: Ultrospec 3000 (Amersham Pharamacia Biotech GmbH, Freiburg) ph-meter: WTW ph521 (Wissenschaftlich-Technische Werkstätten, Weilheim) Waagen: Sartorius BP 8199 u. BP 2100 (Sartorius AG, Göttingen) Zentrifugen: Centrifuge 5804 R (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Köln) Heraeus Sepatech Minifuge RF (Heraeus Hoding GmbH, Stuttgart) Galaxy 14D (VWR International, Darmstadt) Enzyme: RNase-freie DNase: Roche Molecular Biochemicals GmbH, Mannheim Restriktionsenzyme, Taq-Polymerase, T4-DNA-Ligase, SAP ('shrimp alkaline phosphatase'): MBI-Fermentas GmbH (St. Leon-Rot) High fidelity PCR Enzyme Mix: MBI-Fermentas GmbH (St. Leon-Rot) Mul-V- Reverse Transkriptase: MBI-Fermentas GmbH (St. Leon-Rot).

27 MATERIAL UND METHODEN Nährmedien Vollmedium 2x TY (Sambrook et al., 2001) Bacto-Trypton 16 g/l Hefeextrakt 10 g/l NaCl 5 g/l Vollmedium LB (Sambrook et al., 2001) Bacto-Trypton 10 g/l Hefeextrakt 5 g/l NaCl 10 g/l Zur Herstellung von Platten wurden dem jeweiligen Medium 15 g Agar/l zugesetzt. SOB-Medium (Sambrook et al., 2001) Bacto-Trypton 20 g/l Hefeextrakt 6 g/l NaCl 0,5 g/l KCl 0,2 g/l MgCl 2 x 6 H 2 O 2 g/l MgSO 4 x 7 H 2 O 2,4 g/l Die Magnesiumsalze wurden getrennt autoklaviert und danach zugegeben. CgC-Minimalmedium (modifiziert nach Kase et al., 1972) (NH 4 ) 2 SO 4 5 g/l Harnstoff 5 g/l MOPS 21 g/l K 2 HPO 4 0,5 g/l KH 2 PO 4 0,5 g/l MgSO 4 0,25 g/l CaCl 2 0,01 g/l Spurenelemente-Lösung 1 ml/l Biotin (200 mg/l) 1 ml/l

28 MATERIAL UND METHODEN 15 Der ph-wert wurde für Wachstum auf Glukose auf ph 6,7, für Wachstum auf Mischsubstrat auf ph 6,5 und für Wachstum auf Säuren mit 1 N NaOH auf ph 6,3 eingestellt. Das Medium wurde bis 90 % des Gesamtvolumens aufgefüllt und autoklaviert. Biotin, Spurenelemente, Kohlenstoffquellen, sowie gegebenenfalls Vitamine und Aminosäuren wurden nach dem Autoklavieren zugegeben. Spurenelemente-Lösung FeSO 4 x 7 H 2 O 16,4 g/l MnSO 4 x H 2 O 10 g/l CuSO 4 x 5 H 2 O 0,2 g/l ZnSO 4 x 7 H 2 O 1,0 g/l NiCl 2 x 6 H 2 O 0,02 g/l Die Lösung wurde mit konzentrierter HCl auf einen ph-wert von etwa 1 eingestellt. Kohlenstoffquellen Glukose g/l K-Acetat 10 g/l Es wurden 20 %-ige (K-Acetat) bzw. 50 %-ige (Glukose) Stammlösungen hergestellt und sterilfiltriert. Für die Fermentationen zur Untersuchung von Valin und Pantothenat wurde in der Regel eine Glukose-Endkonzentration von 4 % verwendet. Bei anderen Experimenten lag die Endkonzentration der Substrate bei 1 %. CGXII-Medium (modifiziert nach Kase et al., 1972) (NH 4 ) 2 SO 4 20 g/l Harnstoff 5 g/l MOPS 42 g/l K 2 HPO 4 1 g/l KH 2 PO 4 1 g/l MgSO 4 0,25 g/l CaCl 2 0,01 g/l Das Medium wurde auf ein Volumen von 750 ml aufgefüllt, auf einen ph von 7 eingestellt und 45 ml in 500 ml Erlenmeyer-Schikanenkolben abgefüllt und au-

29 MATERIAL UND METHODEN 16 toklaviert. Nach dem Autoklavieren wurden 100 µl Spurenelemente und Biotin zugesetzt, sowie 4,8 ml einer 50 %-igen Glukose-Stammlösung. Das restliche fehlende Volumen wurde auf ein Gesamtvolumen von 60 ml mit H 2 O aufgefüllt. Epo-Medium (van der Rest et al., 1999) Bacto-Trypton 10 g/l Hefeextrakt 5 g/l NaCl 10 g/l Lösen in H 2 O und autoklavieren Isonikotinsäurehydrazid 0,4 g/l Glycin 2,5 g/l Tween 80 0,1 ml In 20 ml lösen, sterilfiltrieren und zu 80 ml Vollmedium geben BHIS-Medium (Liebl et al., 1989) BHI 5 g/l Sorbitol 91 g/l Beide Lösungen wurden getrennt voneinander autoklaviert und dann vereinigt. LB/BHIS-Platten (Liebl et al., 1989) BHI 18,5 g/l Bacto-Trypton 5 g/l Hefeextrakt 2,5 g/l NaCl 5 g/l Sorbitol 91 g/l Agar 18 g/l Die Sorbitol-Lösung wurde getrennt angesetzt und autoklaviert und nach dem Autoklavieren zugegeben.

30 MATERIAL UND METHODEN 17 Saccharose-Platten LB-Medium Saccharose 100 g/l Agar 18 g/l Medienzusätze Zusatz Stammlösung Arbeitskonzentration Kanamycin 50 mg/ml 50 µg/ml Chloramphenicol 50 mg/ml (in 70% Ethanol) 5 µg/ml Tetracyclin 10 mg/ml (in 70% Ethanol) 10 µg/ml Biotin 200 mg/ml 200 µg/ml IPTG 100 mm 1 mm 4. Kultivierung und Stammhaltung Die Bakterienstämme wurden in 30 % (v/v) Glycerin (Gesamtvolumen 1 ml) in fest verschließbaren Gefäßen bei 70 C gelagert. Ausgehend von diesen Stammkulturen wurden Stammplatten (LB-Platten) hergestellt, die als Inokulum für Vorkulturen dienten. Die Platten für E. coli wurden für 1 Tag bei 37 C inkubiert, die für Corynebacterium für 2 Tage bei 28 C. Diese wurden in der Regel nicht länger als 2 Wochen (Corynebakterien) bzw. nicht länger als 1 Woche (E. coli) verwendet. Zur Anzucht von E. coli in Flüssigkultur diente LB-Medium. Die Züchtung von E. coli erfolgte in 5 ml (in Reagenzgläsern) bzw. 50 ml Medium (in 250 ml Erlenmeyerkolben) bei 160 rpm und 37 C. Für Wachstumsversuche mit C. glutamicum wurde CgC-Medium mit der entsprechenden Kohlenstoffquelle eingesetzt. Für die Vorkultur wurden die Zellen über Nacht auf 2x TY-Medium gezüchtet (in 500-ml- Schikanenkolben bei 28 C, 120 rpm), durch Zentrifugation (4000 rpm, 4 C, 10 min) geerntet und 2x mit 0,9 % NaCl gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden in 5 ml 0,9 % NaCl resuspendiert und dienten als Inokulum für die Hauptkulturen auf CgC-Minimalmedium mit der entsprechenden Kohlenstoffquelle. Bei Wachstum auf Glukose lag die optische Dichte bei 600 nm (OD 600 ) zu Beginn bei 0,5, bei

31 MATERIAL UND METHODEN 18 Wachstum auf Säuren und Mischsubstraten bei 1,0. Die Inkubation erfolgte anschließend bei 28 C und 120 rpm. 5. Transformationstechniken 5.1 Transformation von C. glutamicum mittels Elektroporation (van der Rest et al., 1999) Zur Einbringung von Plasmid-DNA in C. glutamicum wurde eine Elektroporation mit anschließender Hitzeschockbehandlung durchgeführt. Kompetente Zellen, die zur Aufnahme von DNA bereit waren, wurden nach folgendem Protokoll hergestellt: 70 ml LB-Medium wurde mit einer Einzelkolonie (frische Platte) inokuliert und im Schüttelkolben anschließend über Nacht bei 28 C inkubiert. Ausgehend von dieser Vorkultur wurden 100 ml Epo-Medium in einem 1 l Erlenmeyerkolben ohne Schikanen zu einer OD 600 von 0,3 angeimpft. Diese Kultur wurde dann in einem zweidimensional schüttelndem Wasserbad (Schüttelfrequenz ca. 1/s) bei 18 C bebrütet - die OD 600 entsprach nach 28 h ca. 1. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (5000 rpm, 4 C, 10 min) geerntet und insgesamt viermal mit 50 ml eiskaltem Glycerin (10 %, v/v) gewaschen. Die Zellen wurden dann in 0,5 ml Glycerin (10 %, v/v) aufgenommen und in 50 µl Aliquots in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Lagerung der kompetenten Zellen erfolgte bei 70 C. Zur Transformation wurde je ein Aliquot auf Eis aufgetaut, in Elektroporationsküvetten transferiert und mit 1-5 µl entsalzter Plasmid-DNA versetzt. Nach 15-minütiger Inkubation auf Eis erfolgte die Elektroporation bei 25 µf, 600 Ω und 2,5 kv in einem Gene-Pulser (Bio-Rad Laboratories GmbH, München). Sofort nach der Elektroporation wurden die Zellen in den Küvetten mit 600 µl BHIS-Medium versetzt und in einem Wasserbad einem Hitzeschock unterzogen (46 C, 6 min). Anschließend wurde die Zellsuspension in 1,5 ml- Reaktionsgefäße transferiert und zur Resistenzausprägung für 1 h bei 30 C im Wasserbad inkubiert. Die Zellen wurden zur Selektion auf LB-Platten mit Kanamycin (15 µg/ml) ausplattiert.

32 MATERIAL UND METHODEN Transformation von Corynebakterien (modifiziert nach Liebl et al., 1989) Mit einer frischen Kolonie wurden 50-ml 2x TY-Medium angeimpft und über Nacht inkubiert. Von dieser ÜNK wurden am folgenden Tag 500 ml LB-Medium mit 4 mg/ml Isonikotinsäurehydrazid, 2,5% Glycin und 0,1 % (v/v) Tween 80 (1 l Schikanenkolben) mit 10 ml angeimpft. Die Zellen wuchsen bei 28 C und 120 rpm bis zu einer End-OD von 0,5. Nach 15-minütiger Kühlung auf Eis wurden die Zellen abzentrifugiert (4500 x g, 4 C, 10 min) und anschließend 2x mit eiskaltem 10%-igem Glycerin gewaschen. Die Zellen wurden in 1 ml Glycerin aufgenommen und in 100 µl Aliquots bei 70 C gelagert. Zur Elektroporation wurden 100 µl Zellen mit 100 µl 10%-igem kaltem Glycerin verdünnt, mit 1-10 µl Plasmid-DNA versetzt und mit einem Gene Pulser (Bio-Rad Laboratories GmbH, München) bei 200Ω, 25 µf und 2,5 kv elektroporiert. Anschließend wurden sofort 600 µl BHIS-Medium zugegeben und für 6 min ein Hitzeschock bei 46 C durchgeführt. Die Regeneration erfolgte für 1 h bei 28 C. Zur Selektion wurde der Ansatz auf LB-Platten mit entsprechendem Antibiotikum ausplattiert. 5.3 Konjugativer Transfer von E. coli nach C. glutamicum Die Konjugation zwischen E. coli und C. glutamicum erfolgte nach einem modifizierten Protokoll von Schäfer et al. (1990). Mit 50 µl einer ÜNK eines rekombinanten E. coli S17-1 Donorstammes wurden 5 ml 2x TY inokuliert. Nachdem die Donorkultur eine OD 600 von 1 erreicht hatte, wurde sie für 10 min auf Eis inkubiert. Der C. glutamicum-rezipient wurde über Nacht in 70 ml 2x TY gezüchtet (OD 600 von 5) und anschließend zur Inaktivierung des Restriktionssystems für 9 min bei 48,5 C inkubiert. Donor und Rezipient wurden im Verhältnis 1:3 gemischt und durch Zentrifugation sedimentiert. Die Zellen wurden in 150 µl LB-Medium resuspendiert und auf einen Zellulosenitratfilter (25 mm Durchmesser; 0,45 µm Porengröße), der auf einer LB-Platte lag, übertragen. Die Inkubation erfolgte für 20 h bei 28 C. Danach wurde der Filter in ein Falkon überführt und die Zellen mit 600 µl LB-Medium abgeschwemmt. Die Zellen wurden kurz sedimentiert und der Ansatz auf BHIS-Platten mit Nalidixinsäure zum Abtöten von E. coli und Kanamycin zur Selektion ausplattiert.

33 MATERIAL UND METHODEN Transformation von E. coli Die Transformation von E. coli erfolgte mit Hilfe kaltkompetenter Zellen (Inoue et al., 1990). Mit 5 ml einer LB-Vorkultur wurden 250 ml SOB-Medium beimpft. Bei 18 C wurde die Kultur bis zum Erreichen einer OD 600 von 0,6 geschüttelt (ca. 18 h) und anschließend auf Eis abgekühlt. Nach der Zellernte durch Zentrifugation (4000 rpm, 4 C, 10 min) wurde das Zellpellet in 80 ml eiskaltem TB-Puffer gewaschen, 10 min auf Eis gekühlt und erneut abzentrifugiert. Die sedimentierten Zellen wurden anschließend in 20 ml kaltem TB-Puffer aufgenommen, langsam mit 1,5 ml DMSO versetzt und in 200 µl Aliquots in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Lagerung der kompetenten Zellen erfolgte bei 70 C. Zur Transformation wurde je ein Aliquot aufgetaut und mit Plasmid-DNA (bis 20 µl) versetzt. Nach Inkubation des Ansatzes auf Eis (40 min) erfolgte ein kurzer Hitzeschock (42 C, 1 min) und eine erneute 10-minütige Inkubation auf Eis. Nach Zugabe von 0,8 ml LB-Medium wurden die Zellen für 1 h bei 37 C unter Schütteln zur Resistenzausprägung inkubiert und anschließend zur Selektion von Transformanten auf LB- Platten ausplattiert. TB-Puffer: 10 mm PIPES, ph 6,7 15 mm CaCl mm KCl 55 mm MnCl 2 PIPES und CaCl 2 wurden getrennt von KCl und MnCl 2 autoklaviert 6. Isolierung und Reinigung von DNA 6.1 Lösungen zur Isolierung von DNA Im folgenden sind die zur Isolierung von DNA verwendeten Lösungen aufgeführt. TE-Puffer: 10 mm Tris-HCl (ph 8,0) 1 mm EDTA (ph 8,0)

34 MATERIAL UND METHODEN 21 Lösung A: 50 mm Glucose 25 mm Tris-HCl (ph 8,0) 10 mm EDTA (ph 8,0) Lösung B: 0,2 N NaOH 1 % SDS frisch ansetzen Lösung C: 3 M K-Acetat 11,5 % Essigsäure 6.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli ('Mini'-Präp, nach Birnboim, 1983, modifiziert) Die Isolierung von Plasmid-DNA erfolgte nach dem Prinzip der alkalischen Lyse. Dazu wurden 1,5 ml Zellen einer LB-ÜNK durch kurze Zentrifugation (13000 rpm, 30 s, RT) sedimentiert und in 100 µl Lösung A resuspendiert. Nach Zugabe von 200 µl Lösung B erfolgte die Lyse der Zellen bei gleichzeitiger Denaturierung von Proteinen und DNA. Durch Zugabe von 150 µl Lösung C ging bei neutralem ph die Plasmid-DNA wieder in ihre native Form über. Die Fällung der Plasmid-DNA erfolgte mit Ethanol (siehe 6.7). Nach einmaligem Waschen mit 70 %-igem Ethanol wurde die DNA in 50 µl TE-Puffer gelöst. Die Qualität der Plasmid-DNA war für Restriktionsanalysen ausreichend. Um die DNA von RNA-Verunreinigungen zu befreien, wurde der Ansatz mit 1 µl RNase A (10 mg/ml) versetzt und für 30 min bei 37 C inkubiert. Anschließend wurde eine Phenolextraktion (sieh 6.7) durchgeführt, um die Plasmid-DNA von Proteinverunreinigungen zu befreien. Die DNA wurde dann mit Ethanol gefällt und nach Lufttrocknung in TE-Puffer aufgenommen. 6.3 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli ('Midi-Präp', Sambrook et al., 2001) Große Mengen sauberer Plasmid-DNA aus E. coli wurden aus 50 ml einer LB- ÜNK isoliert. Das durch Zentrifugation (4000 rpm, 10 min, 4 C) erhaltene Zellpellet

35 MATERIAL UND METHODEN 22 wurde in 5 ml Lösung A resuspendiert. Anschließend wurden 10 ml Lösung B zugegeben, gemischt und jeweils 10 min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von Lösung C wurde die Suspension etwa 15x invertiert, um das Präzipitat aufzubrechen, bevor erneut 10 min auf Eis inkubiert wurde. Nach Abzentrifugieren des flockigen Präzipitates (20 min, 5000 rpm, 4 C) wurde der Überstand durch 2 Lagen Mullbinden in ein Falkon überführt und die Plasmid-DNA durch Zugabe von 15 ml Isopropanol zum Überstand gefällt und anschließend sedimentiert (5000 rpm, 20 min, 4 C). Das DNA-haltige Pellet wurde in 2 ml H 2 O gelöst. Zur selektiven und quantitativen Abreicherung der noch zu einem hohen Anteil enthaltenen RNA, wurden 2 ml LiCl-Lösung (5 M LiCl, 50 mm Tris-HCl, ph 7,5) zugegeben. Nach 15-minütiger Inkubation auf Eis konnte die präzipitierte RNA durch Zentrifugation sedimentiert werden (5000 rpm, 4 C, 15 min). Der Überstand wurde einer Ethanolfällung unterzogen. Das nach erneuter Zentrifugation erhaltene Pellet wurde in 400 µl TE- Puffer gelöst. Zur Entfernung jeglicher RNA-Reste wurde der Ansatz 30 min mit 5 µl RNase A (20 mg/ml) bei 37 C inkubiert. Nach zweimaliger Phenolisierung (siehe 6.7) wurde die Plasmid-DNA mit Ethanol gefällt (siehe 6.7) und in 200 µl TE- Puffer aufgenommen. 6.4 Isolierung von Plasmid-DNA aus C. glutamicum Die Plasmid-Präparation aus C. glutamicum erfolgte in Anlehnung an die Methode, die für E. coli verwendet wurde (Eikmanns et al., 1994). Es wurden 5 ml einer 2x TY-ÜNK zentrifugiert (5000 rpm, 5 min, RT), mit 1 ml TE-Puffer gewaschen und das Zellpellet nach erneuter Zentrifugation in 200 µl Lösung A mit 15 mg Lysozym/ml suspendiert. Der Zellwandabbau durch das Lysozym erfolgte durch Inkubation für 2-3 h bei 37 C. Anschließend wurden 400 µl Lösung B zugegeben. Nach 5-minütiger Inkubation auf Eis erfolgte die Zugabe von 350 µl eiskalter Lösung C. Nach weiterer 10-minütiger Inkubation auf Eis wurde das Präzipitat durch Zentrifugation (13000 rpm, 10 min, 4 C) sedimentiert und der Überstand durch Zugabe von 0,8 Vol Isopropanol (siehe 6.7) in einem frischen Reaktionsgefäß gefällt. Anschließend wurde die Plasmid-DNA abzentrifugiert (13000 rpm, 15 min, RT) und nach Waschen mit 70 % (v/v) Ethanol in 30 µl TE-Puffer gelöst. Auch hier wurde optional eine Phenolbehandlung angeschlossen, um eine höhere Reinheit zu erreichen.

36 MATERIAL UND METHODEN Isolierung von chromosomaler DNA aus C. glutamicum Chromosomale DNA wurde nach der von Eikmanns et al. (1994) beschriebenen Methode isoliert. Ein Zellpellet aus 5 ml einer ÜNK (2x TY mit 0,5 % (w/v) Glukose) wurde einmal mit TE-Puffer gewaschen und in 1 ml TE-Puffer mit 15 mg Lysozym/ml suspendiert. Nach 3-stündiger Inkubation bei 37 C wurden 3 ml Lysis- Puffer, 220 µl SDS und 150 µl Proteinase K-Lösung (20 mg/ml) zugegeben und ÜN bei 37 C inkubiert. Durch anschließende Zugabe von gesättigter NaCl-Lösung wurden selektiv Proteine präzipitiert. Nach Zentrifugation (20 min, 5000 rpm, RT) wurde die chromosomale DNA mit kaltem, absolutem Ethanol aus dem Überstand gefällt (siehe 6.7), mit einer Glasöse gefischt und zum Waschen in 70 %-iges Ethanol überführt. Nach Lufttrocknung wurde die DNA in µl TE-Puffer ü- ber Nacht bei 4 C gelöst. Lysis-Puffer: 10 mm Tris-HCl, ph 8,2 400 mm NaCl 2 mm EDTA 6.6 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Zur Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurden die gewünschten DNA-Banden mit einem sauberen Skalpell ausgeschnitten. Die Extraktion der DNA aus der Agarose erfolgte mit Hilfe des Nucleospin Extract Kit (Macherey- Nagel GmbH, Düren). Das Verfahren beinhaltet das Aufschmelzen der Agarose und das Freisetzen der DNA in Gegenwart von Natrium-Jodid. Anschließend erfolgt die Aufreinigung über eine Anionenaustauscher-Säule. Die DNA wurde mit 10 mm Tris (ph 8,0) von der Säule eluiert und konnte direkt weiterverwendet werden. 6.7 Reinigung und Konzentrierung von Nukleinsäuren Phenolisierung Die Abtrennung von Proteinen aus DNA-Lösungen erfolgte durch Extraktion mit 1 Vol Phenol-Chloroform (PC) (v/v) (Sambrook et al., 2001). Das Volumen der Nukleinsäurelösung wurde mit TE-Puffer (10 mm Tris-HCl, ph 7,6, 1 mm EDTA)

37 MATERIAL UND METHODEN 24 auf ein Volumen von 400 µl eingestellt und mit 1 Vol PC für 30 s gründlich durchmischt. Nach erfolgter Phasentrennung (Zentrifugation bei rpm, 5 min, RT) wurde die obere wässrige Phase in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Die Phenolbehandlung wurde so oft wiederholt, bis keine Protein-Interphase mehr erkennbar war. Phenolreste wurden im Anschluß durch einmaliges Ausschütteln mit 1 Vol Chloroform-Isoamylalkohol (24:1 (v/v)) und erneuter Phasentrennung durch Zentrifugation entfernt. Der DNA-haltige Überstand wurde mit Ethanol gefällt (siehe unten). Ethanolfällung Die DNA wurde zu diesem Zweck mit 0,1 Vol 3 M Natriumacetatlösung (ph 5,2) und 2,5 Vol eiskaltem Ethanol (96% (v/v)) versetzt. Nach Inkubation für 1 h bei 20 C wurde die präzipitierte DNA zentrifugiert (13000 rpm, 10 min, 4 C) und das Sediment einmal mit kaltem 70 %-igem Ethanol (v/v) gewaschen. Das Sediment wurde anschließend luftgetrocknet und danach in einem geeigneten Volumen TE- Puffer aufgenommen. Isopropanolfällung Die DNA-haltige Lösung wurde mit 0,8 Vol Isopropanol versetzt und sofort zentrifugiert (13000 rpm, 30 min, RT). Anschließend wurde analog zur Ethanolfällung verfahren. Butanolfällung (Thomas, 1994) Im Gegensatz zu Ethanol oder Isopropanol, hat Butanol nicht die Eigenschaft, Salze zu präzipitieren. Diese Eigenschaft macht man sich zum schnellen und effektiven Entsalzen von DNA-Lösungen zunutze. Die DNA-Lösung wurde mit 10 Vol 1-Butanol versetzt und für 30 s kräftig durchmischt. Anschließend wurde die präzipitierte DNA sofort durch Zentrifugation (13000 rpm, 30 min, RT) sedimentiert. Nach einmaligem Waschen mit 70 %-igem Ethanol wurde das DNA-Pellet in H 2 O aufgenommen. Mikrodialyse von DNA DNA-Lösungen wurden alternativ zur Butanolfällung durch Mikrodialyse gegen H 2 O auf sterilen Membranfiltern entsalzt (Marusyk und Sergeant, 1980). Dabei

38 MATERIAL UND METHODEN 25 wurde die DNA-Lösung auf einen Membranfilter ('VS' Membranfilter, Porengröße 0,025 µm, Millipore GmbH, Eschborn) pipettiert, der auf sterilem H 2 O schwamm. Nach 30 min war die Dialyse abgeschlossen und die entsalzte DNA-Lösung wurde vom Filter in ein Reaktionsgefäß überführt. Reinigung und Konzentrierung von DNA mittels Mikrokonzentratoren Kleine Volumina (bis 0,5 ml) von DNA-Lösungen wurden je nach zu reinigender Fragmentgröße über Microcon-100 oder Microcon-30 Säulchen (Amicon GmbH, Witten) entsalzt und konzentriert. Diese Methode beruht auf dem Prinzip der Ultrafiltration und erlaubt außerdem eine Abreicherung kleiner, unerwünschter DNA- Fragmente bis zu einer Größe von bp. Die DNA-Lösung wurde dazu auf die Membran des Konzentrators gegeben und dieser solange zentrifugiert (2500 rpm, RT), bis das Volumen der Lösung auf das gewünschte Maß reduziert war. Anschließend wurden ca. 500 µl H 2 O auf die Membran gegeben und erneut zentrifugiert. Durch Wiederholung dieser Schritte konnte eine bessere Entsalzung der Lösung erreicht werden. Die entsalzte und konzentrierte DNA-Lösung wurde durch Umdrehen des Konzentrators und Zentrifugation (5000 rpm, 5 min) in einem frischen Reaktionsgefäß gesammelt. Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von Nukleinsäure-Lösungen Die Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren in wässrigen Lösungen erfolgte photometrisch in Quarzküvetten bei einer Wellenlänge von 260 nm. Eine Absorption von 1,0 entsprach dabei 50 µg doppelsträngiger DNA/ml bzw. 40 µg einzelsträngiger RNA. Die Reinheit wurde aus dem Quotienten aus A 260 und A 280 ermittelt. Reine Nukleinsäure-Lösungen erreichen einen A 260 /A 280 -Quotienten von 1,8 2,0. 7. Amplifikation, Rekombination und Analyse von DNA 7.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die PCR wurde von Kary B. Mullis entwickelt (Saiki et al., 1985) und von Saiki (1988) durch Einführen einer hitzestabilen DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq-Polymerase) verbessert. Bei der PCR handelt es sich um eine sehr wir-

39 MATERIAL UND METHODEN 26 kungsvolle Methode zur Vervielfältigung kurzer Genomabschnitte. Dazu ist es nötig, daß die Sequenz der flankierenden Bereiche bekannt ist. In diesem Fall können zwei Oligonukleotid- Primer synthetisiert werden, die jeweils komplementär zu einem der beiden 3 -Einzelstrangenden des zu amplifizierenden DNA- Doppelstranges sind. Im ersten Schritt wird die DNA denaturiert. Im zweiten Schritt können die Primer bei einer definierten Annealing-Temperatur an die einzelsträngige DNA entsprechend ihrer Sequenzhomologie hybridisieren. An diesen kurzen, doppelsträngigen Abschnitten kann die DNA-Polymerase im dritten Schritt ansetzen, und mit den im Ansatz enthaltenden vier Desoxynucleosidtriphosphaten die Primer in 3 -Richtung verlängern. Anschließend wird der Zyklus wiederholt. Ist n die Anzahl der Zyklen, so können 2 n Kopien amplifiziert werden. Die von MWG oder Biomers bezogenen Primer wurden in 10 mm Tris-HCl (ph 7,6) gelöst und besaßen eine Endkonzentration von 100 pmol/µl. Der PCR-Reaktionsansatz enthielt folgende Komponenten: 10x Reaktionspuffer : 5 µl DNA : ca. 100 ng 25 mm MgCl 2 : 2,5 µl dntp-mix (jeweils 2 mm) : 5 µl 10 pmol Primer A : 1 µl 10 pmol Primer B : 1 µl Taq-Polymerase (1 U/ µl) : 1 µl H 2 O : ad 50 µl Das Standard-PCR- Protokoll ist nachfolgend aufgeführt: Vorabdenaturierung : 94 C; 5 min Denaturierung : 94 C; 30 sec Annealing : 55 C; 30 sec 32x Elongation : 72 C; 1 min/ 1000 bp End-Elongation : 72 C; 10 min

40 MATERIAL UND METHODEN 27 Nach Ablauf des Programms wurde ein Aliquot jedes Ansatzes auf einem 0,8 % (w/v) Agarosegel kontrolliert. 7.2 Restriktion von DNA Plasmid-DNA bzw. chromosomale DNA oder PCR-Produkte wurden mit Restriktionsenzymen nach Angaben des Herstellers verdaut. Analytische Restriktionsverdaus erfolgten im 20 µl Maßstab, präparative wurden in µl Volumina durchgeführt. Die Restriktionsenzyme sowie die dazugehörigen Puffer wurden von MBI-Fermentas (St. Leon-Rot) oder New England Biolabs (Schalbach) bezogen. Wenn möglich, wurden die Ansätze im universalen TangoY-Puffer-System durchgeführt. Die meisten Enzyme sind in diesem Puffer aktiv, was den parallelen Verdau der DNA mit zwei Enzymen ermöglicht. Die Restriktionsenzyme wurden anschließend, wenn möglich, durch Hitze inaktiviert (65 80 C, 10 min). War eines der eingesetzten Enzyme hitzestabil, erfolgte eine Reinigung mittels Microcon- Säulchen oder Nucleospin laut Angaben des Herstellers. 7.3 Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten Um die unerwünschte Religation von geschnittenen Plasmiden zu vermeiden, erfolgte deren Dephosphorylierung mittels 'shrimp alkaline phosphatase' (SAP). Nach SAP-Behandlung (1-2 U/Reaktion) im µl Maßstab (37 C, 30 min) wurde das Enzym durch Inkubation bei 80 C für 1 h inaktiviert. Die Reinigung des Ansatzes erfolgte wiederum über Microcon-Säulchen oder Nucleospin. 7.4 Ligation von DNA-Fragmenten Die Ligation von DNA-Fragmenten erfolgte in 20 µl-reaktionsansätzen. Es wurden die dephosphorylierte Plasmid-DNA und das zu klonierende DNA-Fragment ('insert') in einem molaren Verhältnis von ca. 1:5 gemischt und mit 2 µl 10x Ligationspuffer und 1 µl T4-DNA-Ligase versetzt. Nach Inkubation bei 16 C ÜN mit anschließendem Hitzeschritt zum Abstoppen der Reaktion (65 C, 5 min) oder 1,5 h bei 22 C (mit anschließendem Hitzeschritt für 10 min bei 65 C) wurde der Ligati-

41 MATERIAL UND METHODEN 28 onsansatz ohne weitere Behandlung in kaltkompetente E. coli Zellen transformiert. 7.5 Agarose-Gelelektrophorese Mit Agarosegelen ist es durch Anlegen eines elektrischen Feldes möglich, DNA nach ihrer Größe aufzutrennen. Die Phosphatgruppen der DNA-Moleküle sind bei den verwendeten ph-werten negativ geladen, wodurch die DNA zur Anode wandert. Eine elektrisch neutrale Gelmatrix (Agarose) fungiert hierbei als Sieb, so daß kleinere DNA-Fragmente schneller wandern als große (Sambrook et al., 2001). In der Regel wurden 0,8 % (w/v) Agarosegele verwendet. Dazu wurde die Agarose in 1x TAE-Puffer eingewogen und anschließend in der Mikrowelle aufgekocht. Das Gel wurde nach Abkühlen auf ca. 60 C in die Gelgießvorrichtung gegossen. Als Laufpuffer wurde ebenfalls 1x TAE-Puffer verwendet. Die Proben wurden mit 1/5 Volumen Ladepuffer versetzt und in die Geltaschen pipettiert. Zur Größenbestimmung wurde eine 1 kb-dna-leiter mit aufgetragen. Der Gellauf erfolgte bei 90 V. Anschließend wurde das Agarosegel für 5-30 min in einer Ethidiumbromid- Lösung (1µg/ml) gefärbt und danach in Wasser entfärbt. Die DNA-Banden wurden dann durch UV-Licht (λ = 312 nm), bei dem das an die DNA angelagerte Ethidiumbromid fluoresziert, sichtbar gemacht und mit einer Fotodokumentationsanlage fotografiert. Die hierfür benötigten Puffer sind im folgenden aufgeführt. 50x TAE-Puffer : 2 M Tris- HCl (ph 8,0) 50 mm EDTA 500 mm Natriumacetat Ladepuffer : 0,25 % (w/v) Bromphenolblau 40 % (v/v) Glycerol

42 MATERIAL UND METHODEN Sequenzierung Sequenzierungen von klonierten DNA-Fragmenten wurden von der Firma MWG- Biotech GmbH (Ebersberg) durchgeführt. Die notwendige hohe Reinheit der zu sequenzierenden Proben wurde durch Plasmidpräparation mit dem 'GFX Micro Plasmid Prep Kit' (Amersham Pharmacia Biotech GmbH, Freiburg), einem Säulenbasierten Anionentauschersystem, erreicht. 7.7 'Southern-Blot'-Hybridisierung (nach Southern, 1975, modifiziert) Zur Analyse genomischer DNA durch 'Southern-Blot'-Hybridisierung wurde die zu untersuchende DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut und anschließend gelelektrophoretisch aufgetrennt. Die aufgetrennten DNA-Fragmente wurden im Gel zunächst denaturiert und anschließend auf eine Nylonmembran übertragen. Digoxigenin-(DIG)-markierte DNA-Sonden wurden mit der auf eine Membran übertragenen DNA hybridisiert. Die Detektion der hybridisierten Sonden erfolgte durch Chemilumineszenz. Digoxigenin-Markierung von DNA-Sonden Die Markierung der Sonden erfolgte durch Einbau von DIG-dUTPs (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim) in einer Standard-PCR. Zu 50 µl PCR-Ansatz wurde zusätzlich zu den dntps 0,5 µl der DIG-dUTP-Lösung hinzugegeben. Mit Hilfe der sondenspezifischen 'Primer' wurde so das Sondenfragment amplifiziert und gleichzeitig markiert. Ob der Einbau erfolgreich war, konnte durch Vergleich der markierten Sonde mit dem jeweiligen unmarkierten Fragment auf einem Agarosegel überprüft werden. DIG-markierte DNA wandert während der Gelelektrophorese immer etwas langsamer und damit weniger weit, als unmarkierte DNA gleicher Länge. Auftrennung der DNA und Übertragung auf eine Nylonmembran Die chromosomale DNA wurde nach einem Restriktionsverdau in einem Agarosegel bei 20 V für 16 h elektrophoretisch aufgetrennt und im Anschluß durch vakuumunterstützte Diffusion mittels eines Vacugene XL Vakuum Blotting Systems (Amersham Pharmacia Biotech GmbH, Freiburg) nach einer Methode von Gross et al. (1988) auf eine positiv geladene Membran (positive Membran Quantum,

43 MATERIAL UND METHODEN 30 Oncor/Appligene, Heidelberg-Wieblingen) übertragen. Dazu wurde das Gel zuerst für jeweils 20 min mit Depurinierungslösung, Denaturierungslösung und Neutralisierungslösung und anschließend für 60 min mit Transferlösung überschichtet, wobei alle min die Lösung erneuert wurde. Die Membran wurde kurz zwischen Filterpapier getrocknet und die DNA in einem Stratagene UV Crosslinker (Stratagene GmbH, Heidelberg) durch UV-Bestrahlung auf der Membran fixiert. Zur Aufbewahrung der Membran wurde der Blot bei 80 C für etwa 1 h gebacken. Depurinierungslösung: 0,25 M NaOH Denaturierungslösung: 1 M NaCl 0,5 M NaOH Neutralisierungslösung: 1 M Tris-HCl, ph 5,0 2 M NaCl Transferlösung (20x SSC): 0,3 M Na-Citrat, ph 7,0 3 M NaCl Hybridisierung der DNA mit einer Digoxigenin-markierten DNA-Sonde Die Membran wurde zunächst 1 h bei 65 C in 20 ml Prähybridisierungslösung (6x SSC, 5x Denhardt-Lösung, 0,5 % (w/v) SDS: lösen bei 55 C, dann Zugabe von 400 µl frisch denaturierter Heringssperma-DNA (50 µg/ml)) inkubiert. Die Hybridisierung erfolgte nach Zugabe von 500 ng frisch denaturierter DNA-Sonde im Hybridisierungsofen ÜN bei 65 C. Prähybridisierungslösung: 6 x SSC 5 x Denhardt-Lösung 0,5 % (w/v) SDS 50 x Denhardt-Lösung: 1 % (w/v) Ficoll 1 % Polyvinylpyrolidon (w/v)

44 MATERIAL UND METHODEN 31 1 % (w/v) BSA Fraktion V in H 2 O bei 37 C lösen Detektion der hybridisierten Sonden Nicht gebundene DNA-Sonden wurde durch zweimaliges 15-minütiges Waschen bei RT in 20 ml Waschlösung 1 und anschließendes zweimaliges 20-minütiges Waschen bei 65 C in 30 ml Waschlösung 2 entfernt. Die folgenden Schritte erfolgten bei RT. Die Membran wurde 1 min in 20 ml Waschpuffer gewaschen. Nach 30- minütiger Inkubation in 20 ml Puffer II und kurzem Waschen in Waschpuffer erfolgte die Bindung des Antikörpers durch 30-minütige Inkubation der Membran in 20 ml Puffer II mit Anti-Digoxigenin-AP-Konjugat (150 mu/ml). Das nicht gebundene Antikörper-Konjugat wurde durch zweimaliges 15-minütiges Waschen in 20 ml Waschpuffer entfernt. Es folgten 2 min Inkubation in 20 ml Puffer III und 15 min Inkubation in 10 ml des Chemilumineszenz-Substrates CSPD (2,5 µm in Puffer III). Überschüssige Feuchtigkeit wurde mit Hilfe von Filterpapier von der Membran entfernt, ohne diese dabei zu trocknen. Die Membran wurde anschließend zwischen zwei Klarsichtfolien gelegt und 15 min bei 37 C inkubiert. Die Exposition erfolgte 1 h oder länger mit Hyperfilm TM ECL TM -Film (Amersham Pharmacia Biotech GmbH, Freiburg). Waschlösung 1: 2 x SSC 0,1 % (w/v) SDS Waschlösung 2: 0,1 x SSC 0,1 % (w/v) SDS Waschpuffer: Puffer I mit 0,3 % (w/v) Tween 20 Puffer I: 0,1 M Maleinsäure, ph 7,5 0,15 M NaCl Puffer II: 1 % (w/v) Blocking-Reagenz in Puffer I frisch ansetzen und bei 50 C lösen

45 MATERIAL UND METHODEN 32 Puffer III: 0,1 M Tris-HCl, ph 9,5 0,1 M NaCl 8. Isolierung und Analyse von RNA 8.1 Allgemeine Bemerkungen zur Isolierung von RNA Alle wäßrigen Lösungen wurden in DEPC-behandeltem H 2 O angesetzt. H 2 O wurde dafür mit 1/1000 Vol DEPC versetzt und für 2 h bei 37 C inkubiert. Anschließend wurde das DEPC durch Autoklavieren inaktiviert. Plastikgefäße und Lösungen wurden grundsätzlich zweimal autoklaviert. Glaspipetten wurden durch Backen (160 C, 3 h) von RNasen befreit. Nicht autoklavierbare Plastikgefäße wurden durch Waschen mit 0,1 N NaOH und DEPC-behandeltem Wasser von RNasen befreit. Alle kritischen Arbeiten wurden mit Handschuhen durchgeführt. Gestopfte Pipettenspitzen halfen, RNase-Kontamination aus Pipetten zu vermeiden. 8.2 Zellernte zur RNA-Präparation Wegen der kurzen Halbwertszeit von mrna in der Zelle - die Halbwertszeit der mrna beträgt in manchen Fällen weniger als 30 s (Carpousis et al., 1999) - war es wichtig, bei der Aufarbeitung der Zellen sehr schnell zu arbeiten. Um den Stoffwechsel der Zellen zum Stillstand zu bringen, wurde in eine exponentiell wachsende Kultur von C. glutamicum 1 Vol eiskalter 'Killingbuffer' (Wirkkomponente: Natriumazid) gegossen und die Zellsuspension sofort auf Eiswasser gekühlt. Nach Zentrifugation in 50 ml Zentrifugenröhrchen (5000 g, 4 C, 10 min) und Dekantieren des Überstands wurde das Zellpellet sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur Aufarbeitung bei 70 C gelagert. 'Killingbuffer': 20 mm Tris-HCl, ph 8 20 mm NaN 3 5 mm MgCl 2

46 MATERIAL UND METHODEN RNA-Präparation mit heißem Phenol (Schwinde et al., 1993) 1,5 ml saures Phenol (Roth A980.1), 1,5 ml Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) und 2,5 ml AE-Puffer wurden in 15 ml Reaktionsgefäßen in einem 60 C Wasserbad vorgeheizt. 2 ml Schraubdeckelgefäße mit ca. 250 mg 'Glasbeads' (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) wurden mit 0,5 ml saurem Phenol und 0,5 ml chaotropher Salzlösung (RLT-Puffer, RNeasy-Kit, Qiagen GmbH, Hilden) gefüllt und 5 min auf Eis gekühlt. Nach Auftauen der Zellen auf Eis wurden etwa 0,6-1 ml Zellpellet (aus ca. 120 ml Zellen einer OD 600 von 3) auf 3 eisgekühlte Schraubdeckelgefäße verteilt. Nach dem Aufschluss der Zellen (3x 45 s, Stufe 6,5) im 'RiboLyser' (siehe 9.1) wurden die Aufschlussgefäße kurz auf Eis abgekühlt und anschließend durch Zentrifugation (13000 rpm, 4 C, 5 min) Zelltrümmer und präzipitierte Proteine sedimentiert. Der wässrige Überstand wurde sofort in die Reaktionsgefäße mit dem auf 60 C vorgeheizten Phenol-Chloroform-Puffer-Gemisch gegeben, und diese im Wasserbad zur ständigen Phasendurchmischung für 10 min geschüttelt. Nach erneuter Phasentrennung durch Zentrifugation (4000 g, 4 C, 5 min), wurden die Überstände in neue Reaktionsgefäße überführt und bei RT phenolisiert. Der Wechsel von Phenolisierung, Überführung in neue Gefäße und Phasentrennung wurde so oft wiederholt, bis die proteinhaltige Interphase deutlich reduziert war. Um restliches Phenol zu entfernen, wurde die Probe mit 1 Vol Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) versetzt, geschüttelt und wiederholt zentrifugiert. Die RNA wurde durch Zugabe von 0,1 Vol 3 M NaAc und 2,5 Volumen Ethanol zum Überstand bei 20 C für mindestens 2 h gefällt. Die anschließend durch Zentrifugation (13000 rpm, 30 min, 4 C) sedimentierte RNA wurde einmal mit 70 %-igem Ethanol gewaschen und dann luftgetrocknet (20 min) und in 400 µl RNase-freiem H 2 O gelöst. Nach Zugabe von 1/10 Vol 10x -DNase-Puffer und 30 µl RNase-freier DNase (150 U, MBI-Fermentas GmbH, St. Leon-Roth) wurde die DNA durch Inkubation bei 37 C für 20 min abgebaut. Der Verdauansatz wurde danach mit 2 ml RLT-Puffer (Qiagen, Hilden) und 20 µl ß-Mercaptoethanol versetzt, gemischt und nach Zugabe von 1,4 ml Ethanol auf die Membran eines Säulchens aus dem RNeasy-Midi-Kit (Qiagen, Hilden) gegeben. Die weitere Aufarbeitung erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers. Die RNA wurde zweimalig mit je 250 µl RNasefreiem H 2 O durch Zentrifugation (5000 rpm, 2 min, RT) vom Säulenmaterial eluiert und in 50 µl-aliquots in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei 70 C gelagert. Die typische Ausbeute lag bei µg RNA. Die Qualität der RNA wurde

47 MATERIAL UND METHODEN 34 auf einem nativen Agarosegel optisch kontrolliert. In einer RT-PCR wurde die RNA-Lösung auf das Vorhandensein von mrna untersucht. In einer PCR wurde die RNA-Lösung außerdem auf eventuelle Reste an chromosomaler DNA überprüft. Nach dieser Methode isolierte, sehr saubere RNA wurde für Primer Extension Experimente eingesetzt. AE-Puffer: 40 mm Na-Acetat, ph 5,2 1 mm EDTA 8.4 RNA-Isolierung mit Hilfe des Rneasy-Mini-Kit (Quiagen GmbH, Hilden) Der Rneasy-Mini-Kit eignet sich für die Isolierung von RNA-Molekülen, die größer als 200 Nukleotide sind. Dazu wurden Zellen wie unter 8.2 beschrieben auf Komplex- und Minimalmedium mit Glukose angezogen und geerntet. Das Pellet wurde auf Eis aufgetaut, in 350 µl RLT-Puffer resuspendiert und anschließend mittels RiboLyser (siehe 9.1) (1x 20s, Stufe 6,5; 1x 35s, Stufe 6,5) aufgeschlossen. Das weitere Vorgehen entsprach den Herstellerangaben. Die nach dieser Methode isolierte RNA wurde für 'Northern-Blot'-Experimente eingesetzt. 8.5 Radioaktive 'Northern-Blot'-Hybridisierungen Transfer von RNA Um RNA durch 'Northern-Blot'-Hybridisierung zu analysieren wurde diese zunächst nach einer Methode von Alwine et al. (1977) unter denaturierenden Bedingungen in einem Agarosegel aufgetrennt. Dazu wurde ein Formaldehyd-Gel verwendet (20 ml 5x MOPS-Puffer, 63 ml H 2 O, 0,9 g Agarose: diese Komponenten wurden aufgekocht und anschließend 17 ml Formaldehyd zugesetzt), das nach dem Gießen in eine mit 0,1 % SDS gereinigte Kammer für 1-2 h unter dem Abzug zum Ausdampfen lagerte. Als Laufpuffer diente MOPS. Nach dem Auftragen der denaturierten Proben lief das Gel für etwa 4 h bei V. Die RNA wurde anschließend durch vakuumunterstützte Diffusion mittels eines Vacugene XL Vaku-

48 MATERIAL UND METHODEN 35 um Blotting Systems (Amersham Pharmacia Biotech GmbH, Freiburg) nach einer Methode von Gross et al. (1988) auf eine positiv geladene Membran (positive Membran Quantum, Oncor/Appligene, Heidelberg-Wieblingen) übertragen. Dazu wurde das Gel für 2 h mit Transferpuffer überschichtet, wobei die Lösung alle 15 min gewechselt wurde. Die Membran wurde nach dem Transfer zwischen Whatman-Papier getrocknet, im UV-Crosslinker fixiert und für 1 h bei 80 C gebacken. Transferpuffer: 5x SSC 10 mm NaOH ph 11,5 5x MOPS: 0,2 M MOPS 0,05 M Na-Acetat 0,01 M EDTA Puffer mit autoklaviertem H 2 O ansetzen und mit NaOH auf ph 7,0 einstellen 5x RNA-Auftragspuffer: 20 ml Glycerin 400 µl 1 M EDTA 3,8 ml Formamid 1 ml Ethidiumbromid (10 mg/ml) 10x MAE-Puffer 7,2 ml Formaldehydlösung 37% 0,5 % Bromphenolblau ad 100 ml H 2 O MAE-Puffer: 200 mm Mops 50 mm Na-Acetat 5 mm EDTA Radioaktive Markierung von Sonden Die Markierung von DNA-Fragmenten erfolgte nach dem Random Primer labeling (Feinberg und Vogelstein, 1983) mit dem Random Primers DNA Labeling

49 MATERIAL UND METHODEN 36 System-Kit (Invitrogen GmbH, Karlsruhe) nach Herstellerangaben. In der Regel wurden 25 ng DNA zur Markierung mit [α- 32 P]dATP eingesetzt. Nicht eingebaute Nukleotide wurden durch Reinigung über MicroSpin TM G-25 Säulchen (Amersham Pharmacia Biotech GmbH, Freiburg) nach Herstellerangaben entfernt. Für die Hybridisierung wurden 25 µl markierte Sonde pro Blot eingesetzt. Hybridisierung mit radioaktiven DNA-Sonden Auf Nylonmembran fixierte RNA wurde nach einer modifizierten Methode von Du Pont de Nemours Deutschland GmbH, Dreieich, hybridisiert. Der Blot wurde hierfür angefeuchtet und in ein Hybridisierungsröhrchen überführt. Die Prähybridisierung erfolgte bei 60 C für 2 h. Danach wurde die denaturierte Sonde zugesetzt und ÜN hybridisiert. Die Membran wurde anschließend in Waschlösung 1 und 2 (siehe 7.7) je 2x für 30 min bei 60 C gewaschen und in Frischhaltefolie eingewickelt. Je nach Stärke des Signals wurde der Blot für 1 h bis mehrere Tage an einer BAS-MP Phosphor Imaging -Platte (Fuji Photo Film Europe GmbH, Düsseldorf) autoradiographiert. Mit Hilfe des Bio Imager Fujix BAS 1000 und dem Programm Mac Bas 1000 Image Reader wurde das Signal digitalisiert und mit dem Mac Bas V Programm ausgewertet. 5x Hybridisierungspuffer: 1% (w/v) Rinderserumalbumin 1% (w/v) Polyvinylpyrolidon (K30) 1% (w/v) Ficoll mm Tris-HCl, ph 7,5 0,5% (w/v) Na-Pyrophosphat ad 100 ml H 2 O, ph 7,5; der Puffer wurde sterilfiltriert und in Aliquots eingefroren Hybridisierungspuffer: (für 1 Membran) 4 ml 5x Puffer 12 ml 16,6% Dextransulfat 2 ml 10% SDS nach Mischen der Komponenten 15 min auf 65 C erwärmen und anschließend 1,16 g NaCl zugeben

50 MATERIAL UND METHODEN Primer Extensio -Analyse Die Bestimmung der 5 -Enden von mrna erfolgte nach der Methode der Primer Extension basierend auf der Methode von Kellmann et al. (1990). Nach Anlagerung eines spezifischen IRD800 markierten Primers an der mrna wurde mit dem Enzym Reverse Transkriptase eine zu der mrna komplementäre cdna hergestellt. Über die Länge der cdna war es möglich, Rückschlüsse auf das 5 -Ende der mrna zu ziehen. Dazu wurden etwa 100 µg RNA mit Ethanol gefällt (siehe 6.7), an der Luft getrocknet, in 100 µl HP-Puffer resuspendiert und 5 pmol IRD-markierter Primer zugesetzt. Nach einem Denaturierungschritt für 10 min bei 95 C erfolgte die Primeranlagerung ÜN. Nach Zugabe von 300 µl H 2 O wurde der Ansatz ethanolgefällt (siehe 6.7) und mit 70% Ethanol gewaschen. Nach dem Trocknen des Pellets wurde dieses in 20 µl RTB-Puffer resuspendiert, in ein PCR-Tube überführt und für 2 min bei 37 C inkubiert. Nach Zugabe von 1 µl Mul-V-Reverse Transkriptase (MBI Fermentas, St. Leon-Rot) erfolgte die Umschreibung in cdna für 2 h bei 37 C. Die Reaktion wurde mit 1 µl 0,5 M EDTA gestoppt. Nach einem RNase- Verdau für 30 min bei 37 C wurde der Ansatz mit 150 µl TES-Puffer versetzt und erneut ethanolgefällt (siehe 6.7). Das Pellet wurde in 3 µl TE-Puffer resuspendiert und mit 3 µl Stop-Puffer aus dem SequiTherm EXCELII TM Long-Read TM Sequencing Kit-LC (Epicentre Technologies Corp., Madison, USA) versetzt. Die Analyse erfolgte auf einem Sequenziergel. 8.7 LI-COR-Analyse Zur Analyse von Primer Extension -Produkten mit gleichzeitiger Sequenzierung des entsprechenden Bereichs wurde ein LI-COR 4000L (MWG Biotech AG, E- bersberg) verwendet. Die Sequenzierreaktion wurde mit dem SequiTherm EXCELII TM Long-Read TM Sequencing Kit (Biozym Diagnostik GmbH, Hess, Oldendorf) nach Herstellerangaben durchgeführt. Zur Visualisierung im automatischen Sequenzierer LI-COR wurden für die Reaktion IRD800 markierte Primer eingesetzt. Die fertige Sequenzierreaktion konnte dann lichtgeschützt bei 20 C gelagert werden. 1 µl der Reaktion wurde nach 5-minütiger Denaturierung bei 95 C auf ein 6%-iges (w/v) Polyacrylamidgel (41 cm x 0,25 mm) aufgetragen und ÜN bei 1500 V, 37 ma, 50 W und 50 C aufgetrennt.

51 MATERIAL UND METHODEN 38 Polyacrylamidgel: 30 ml SequaGel XR* 7,5 ml SequaGel XR-Pufferlösung* 400 µl DMSO 300 µl APS (10% (w/v) in H 2 O) (* National Diagnostic, Hall, England) 9. Bestimmung von Enzymaktivitäten 9.1 ZellAufschluss mit dem RiboLyser Zellaufschlüsse von C. glutamicum wurden in der Regel mit dem RiboLyser (Hybaid GmbH, Heidelberg) durchgeführt. Die Zellen wurden hierbei durch die auf sie einwirkenden, starken mechanischen Kräfte aufgebrochen. Zellen aus Kulturen von 50 ml wurden in einem geeigneten Volumen des gewünschten Aufschlusspuffers suspendiert. Die Zellsuspensionen wurden in Schraubdeckelgefäße, die mit je 250 mg 'Glasbeads' ( µm, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) befüllt waren, zu je 800 µl verteilt. Der Zellaufschluss erfolgte im RiboLyser bei höchster Stufe (6,5) 4x für jeweils 25 s. Zwischen den Aufschlüssen wurden die Proben für je 5 min auf Eis gekühlt. Nach dem Aufschluss wurden die 'Glasbeads' und die Zelltrümmer durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge (13000 rpm, 4 C, 30 min) sedimentiert. 9.2 Zellaufschluss mittels Universalmischgerät Alternativ zum Zellaufschluss mit dem RiboLyser wurde ein Universalmischgerät (Silamat Plus, Vivadent Dental, Ellwangen) benutzt. Dieser ermöglichte einen sehr guten Zellaufschluss, war jedoch aufgrund der großen Hitzeentwicklung nur für eine geringe Anzahl an Proben geeignet. Dazu wurden 500 mg Glasbeads in Schraubdeckelgefäße gefüllt und 750 µl Zellsuspension dazugegeben. Der Aufschluss erfolgt 3x für 30s, wobei zwischendurch für 10 min auf Eis gekühlt wurde. Zelltrümmer wurden wiederum abzentrifugiert für 3 min bei rpm und 4 C.

52 MATERIAL UND METHODEN Proteinbestimmung nach Bradford (1976) Mit der Proteinbestimmung nach Bradford (1976) können Proteinkonzentrationen quantitativ bei einer Wellenlänge von 595 nm photometrisch bestimmt werden. Das Funktionsprinzip beruht auf einer Verschiebung des Absorptionsmaximums des Farbstoffes Coomassie Brilliant Blue 6250, der hauptsächlich mit Argininresten reagiert, von 465 nm auf 595 nm. Durch die Zugabe von Proteinen werden Aminosäuren an Coomassie Brilliant Blue 6250 gebunden. Dadurch wird die anionische Form des Farbstoffes stabilisiert und eine Verschiebung des Absorptionsmaximums hervorgerufen. Vor der eigentlichen Proteinbestimmung ist es nötig, eine Kalibriergerade mit BSA (Bovine Serum Albumine in einer Stammlösung von 1 mg/ml) in einem Konzentrationsbereich von 0-20 µg/ml zu erstellen. Dazu wurden 800 µl BSA-Probe in der entsprechenden Konzentration mit 200 µl Bradford-Reagenz (0,1 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue 6250, 4,8 % (v/v) Ethanol (96 %), 8,6 % (v/v) H 3 PO 4 (86 %)) versehen, gemischt und für 20 min bei RT inkubiert. Anschließend erfolgte die Extinktionsmessung bei einer Wellenlänge von 595 nm. Die Messungen der Proteingehalte der Rohextrakte verliefen ebenfalls nach diesem Prinzip. Der Gehalt der jeweiligen Proben kann anschließend anhand der Kalibriergeraden ermittelt werden. 9.4 Berechnung von spezifischen Enzymaktivitäten Die Berechnung spezifischer Enzymaktivitäten erfolgte mit nachfolgender Formel: spezifische E / min * Gesamtvolumen Aktivität [ U / mg] = ε * d * Probevolumen * mg Protein E/min = Extinktionsänderung pro Minute [min -1 ] ε = Extinktionskoeffizient [mmol -1 *cm -1 ] d = Schichtdicke der Küvette [cm]

53 MATERIAL UND METHODEN Bestimmung der Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex- und 2- Oxoglutarat-Dehydrogenase-Komplex-Aktivität Der Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (PDHC) katalysiert die oxidative Decarboxylierung von Pyruvat zu Acetyl-CoA unter Bildung von NADH 2. Die 2-Oxoglutarat- Dehydrogenase (OGDHC) katalysiert die oxidative Decarboxylierung von 2- Oxoglutarat zu Succinyl-CoA, wobei ebenfalls NADH 2 entsteht. Die verwendete Methode zur Bestimmung beider Enzymaktivitäten erfolgte nach Guest und Creaghan (1972). Der Testansatz enthielt in einem Volumen von 1 ml 100 mm Tris-HCl, ph 7,2, 1 mm Thiaminpyrophosphat (TPP), 5 mm Pyruvat (1,5 mm 2- Oxoglutarat), 3 mm L-Cystein, 10 mm MgCl 2, 2 mm NAD und 50 µl Zellextrakt. Nach Verfolgung des Vorlaufs wurde die Reaktion mit 25 µl einer 8 mm CoA- Lösung gestartet und die Reaktion für 2 min bei 30 C und 340 nm verfolgt (NADH- Bildung). Der millimolare Extinktionskoeffizient von NADH beträgt 6,22 mmol -1 *cm -1. Aufschlusspuffer: 100 mm Tris-HCl, ph 7,2 10 mm MgCl 2 3 mm L-Cystein 9.6 Bestimmung der Pyruvat-Decarboxylase-Aktivität (E1) (Schwartz und Reed, 1970) Die E1-Untereinheit des PDHC katalysiert die Decarboxylierung des Pyruvats unter Entstehung von Hydroxyethyl-TPP: Pyruvat + TPP Hydroxyethyl-TPP + CO 2 Die Messung der Untereinheit in dieser Form im Komplex ist nicht möglich. Die Messung der Aktivität erfolgt mit ungebunden vorliegendem Enzym, das dieselbe Reaktion wie die Pyruvat-Chinon-Oxidoreduktase katalysiert: Pyruvat + FAD Acetat + CO 2 + FADH 2

54 MATERIAL UND METHODEN 41 Die Aktivitätsbestimmung erfolgt enzymatisch durch Messung der Reduktion des künstlichen Elektronenakzeptors Kaliumhexacyanoferrat bei 430 nm. Zellen wurden in der logarithmischen Wachstumsphase (OD 600 =6) geerntet, zweimal mit 50 mm Tris-HCl, ph 7,5 mit 10 % Glycerin gewaschen und in 800 µl desselben Puffers wieder aufgenommen. Der Aufschluss erfolgte im Silamat S5. Der Test enthielt in einem Testansatz von 1 ml 50 mm Tris-HCl (ph 7,5), 10 mm MgCl 2, 0,2 mm TPP und 50 µl Rohextrakt. Die Reaktion wurde mit 5 mm Pyruvat gestartet. Der Test wurde bei 30 C durchgeführt. 9.7 Bestimmung der Dihydrolipoamid-Transacetylase-Aktivität (E2) (Schwartz und Reed, 1969) Die Dihydrolipoamid-Transacetylase (DHL) katalysiert die zweite Reaktion des PDHC. Die Reaktion ist im Folgenden aufgeführt: Hydroxyethyl-TPP + Lipoamid 6-S-Acetyldihydrolipoamid + TPP S-Acetyldihydrolipoamid + CoA Acetyl-CoA + Dihydrolipoamid Der Nachweis der DHL-Aktivität erfolgt enzymatisch nach folgendem Prinzip in unphysiologischer Richtung: Acetylphosphat + CoA PTA Acetyl-CoA + P i Acetyl-CoA + Dihydrolipoamid 6-S-Acetyldihydrolipoamid + CoA Zur Messung der DHL wurden Zellen aus der exponentiellen Wachstumsphase verwendet. Als Aufschlusspuffer diente 100 mm Tris-HCl, ph 7,5 (UV-rein) mit 10 % Glycerin. 1 ml Testansatz enthielt 100 mm Tris-HCl, ph 7,5, 10 mm Acetylphosphat, 0,1 mm Li-CoA, 50 µl Dihydrolipoamid (Stammlösung 25 mg/ml Ethanol) und 2 U PTA. Nach Messung des Blindwertes bei 240 nm und 30 C wurde die

55 MATERIAL UND METHODEN 42 Reaktion mit 50 µl sehr gut verdünntem (1:10) Rohextrakt gestartet und die Reaktion über 2 min verfolgt. Hierbei wird das gebildete S-Acetyldihydrolipoamid gemessen (millimolarer Extinktionskoeffizient 4,4 [mmol -1 *cm -1 ]). 9.8 Bestimmung der Dihydrolipoamid-Dehydrogenase-Aktivität Die Dihydrolipoamid-Dehydrogenase (E3) katalysiert in den Enzymkomplexen PDH und OGDH die Oxidation des Dihydrolipoamids unter Bildung von NADH 2. Zur Bestimmung der Enzymaktivität wurde eine Methode nach Guest und Creaghan (1974) angewandt. Der Testansatz enthielt in 1 ml Gesamtvolumen 100 mm Tris-HCl, ph 7,2, 2 mm NAD + und 50 µl Zellextrakt in geeigneter Verdünnung. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 25 µl Dihydrolipoamid-Lösung (25 mg/ml Ethanol) gestartet und die Extinktionszunahme des NADH (millimolarer Extinktionskoeffizient 6,22 mmol -1 *cm -1 ) bei 340 nm und 30 C verfolgt. Der für diesen Enzymtest verwendetet Aufschlusspuffer entspricht dem des PDHC-Tests (siehe 9.5). 9.9 Bestimmung der Pyruvat-Kinase (Gubler et al., 1994b) Die Pyruvat-Kinase katalysiert den energiegewinnenden Schritt von PEP zu Pyruvat, das dann nach Decarboxylierung als Acetyl-CoA in den Tricarbonsäure-Zyklus eingeht. Zum Nachweis wird ein Laktat-Dehydrogenase (LDH)-gekoppelter Test eingesetzt, der das von der Pyruvat-Kinase gebildete Pyruvat zu Laktat reduziert. In einem Volumen von 1 ml enthielt der Test 100 mm HEPES (ph 7,0), 100 mm KCl, 10 mm MgCl 2, 0,2 mm NADH, 1,5 mm ADP, 24 U LDH und 50 µl Rohextrakt. Nach Messung des Blindwerts wurde mit 10 mm PEP gestartet. Die Abnahme von NADH 2 (millimolarer Extinktionskoeffizient: 6,22 mmol -1 *cm -1 ) wird bei 340 nm und 30 C für 2 min verfolgt. Aufschlusspuffer: 100 mm Tris-HCl, ph 7,6 1 mm DTT 5 mm MgSO 4 0,1 mm EDTA 20 mm KCl

56 MATERIAL UND METHODEN % Glycerin 9.10 Bestimmung der PEP-Carboxylase Die Methode zur Messung der PEP-Carboxylase, die PEP zu Oxalacetat carboxyliert, erfolgt nach einer Methode von Ozaki und Shiio (1969). Die Messung wird bei 30 C durchgeführt, die Abnahme von NADH (millimolarer Extinktionskoeffizient: 6,22 mmol -1 *cm -1 ) wird bei einer Wellenlänge von 340 nm verfolgt. In einem Gesamtvolumen von 1 ml enthielt der Ansatz 100 mm Tris-HCl, ph 8,0, 10 mm MgCl 2, 25 mm NaHCO 3, 1 mm DTT, 0,2 mm NADH, 24 U Malat-Dehydrogenase und 50 µl Rohextrakt. Nach Messung des Blindwertes wurde die Reaktion mit 8 mm PEP gestartet und für 2 min verfolgt Bestimmung der PEP-Carboxykinase Die Messung der PEP-Carboxykinase beruht auf einer Methode von Bentle und Lardy (1976). Das Enzym katalysiert die reversible decarboxylierende Reaktion von Oxalacetat zu PEP. Der Testansatz enthielt in einem Volumen von 1 ml 100 mm HEPES (ph 7,0), 10 mm MnCl 2, 100 mm KHCO 3, 2 mm Glutathion (reduziert), 0,2 mm NADH, 24 U Malat-Dehydrogenase, 10 mm PEP und 50 µl Rohextrakt in geeigneter Verdünnung. Die Abnahme von NADH wird bei 340 nm und 30 C verfolgt (millimolarer Extinktionskoeffizient: 6,22 mmol -1 *cm -1 ). Nach Messung des Blindwertes wird die Reaktion mit 2 mm IDP (alternativ GDP) gestartet. Zur Hemmung der PEP-Carboxylase kann dem Ansatz 250 mm Aspartat zugesetzt werden. Aufschlusspuffer: 100 mm Tris-HCl, ph 7,0 20 mm KCl 5 mm MgSO 4 0,1 mm EDTA 2 mm DTT 30 % Glycerin

57 MATERIAL UND METHODEN Bestimmung der Pyruvat-Carboxylase Die Pyruvat-Carboxylase katalysiert die irreversible Carboxylierung von Pyruvat zu Oxalacetat unter Verbrauch von ATP. Das gebildete Oxalacetat wurde quantitativ durch zugesetzte Glutamat-Oxalacetat-Transaminase mit Glutamat zu 2- Oxoglutarat und Aspartat umgesetzt. Das Aspartat konnte über HPLC-Analyse (siehe 10.2) quantifiziert werden. Zur Herstellung von Rohextrakten für die Bestimmung der Pyruvat-Carboxylase- Aktivität wurden die Zellen in Aufschlusspuffer (100 mm Tris-HCl, ph 7,5, 10 % Glycerin) aufgenommen. Der Aufschluss erfolgte mit dem RiboLyser (siehe 9.1). Die Rohextrakte wurden direkt zur Bestimmung der Pyruvat-Carboxylase-Aktivität eingesetzt oder zur späteren Verwendung in flüssigem Stickstoff eingefroren. Der Enzymtest basiert auf der Aktivitätsbestimmung von permeabilisierten Zellen (Peters-Wendisch, 1998). In einem Volumen von 1 ml wurden 100 mm Tris-HCl (ph 7,5 mit 10 % Glycerin), 10 mm MgCl 2, 0,2 mm Pyridoxalphosphat, 10 mm Pyruvat, 4 mm ATP, 25 mm NaHCO 3, 2 mm Glutamat und 5 U Glutamat-Oxalacetat- Transaminase aus Schweineherz zugesetzt. Die Testansätze wurden 1 min bei 30 C vorinkubiert und anschließend die Enzymreaktion mit ca. 400 µg Protein gestartet. Aus dem Reaktionsansatz wurden alle 15 Sekunden Proben entnommen und die Reaktion durch Zugabe der Probe in 20 % (v/v) eiskalter Perchlorsäure sofort beendet. Nach Neutralisierung mit 5 M KOH und Zugabe von internem Standard (100 µm Ornithin) wurden die Proben zentrifugiert und die Überstände zur Quantifizierung des gebildeten Aspartat durch HPLC-Analyse verwendet Bestimmung der Pyruvat-Chinon-Oxidoreduktase (Cunningham und Hager, 1971) Die Pyruvat-Chinon-Oxidoreduktase katalysiert die Decarboxylierung von Pyruvat zu Acetat. Zellextrakte zur Bestimmung der Pyruvat-Oxidase wurden in der stationären Phase geerntet und zweimal in MES-Puffer, ph 6,0 gewaschen. Der Aufschluss erfolgte mit dem RiboLyser im selben Puffer (siehe 9.1). Die Pyruvat- Chinon-Oxidoreduktase-Aktivität wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 600 nm und 40 C ermittelt, indem die Reduktion des Elektronenakzeptors 2,6- Dichloroindophenol (DCPIP) gemessen wurde. Der Testansatz enthielt in 1 ml Gesamtvolumen 100 mm MES, ph 6,0, 10 mm MgCl 2, 0,1 mm TPP, 1% (w/v) Tri-

58 MATERIAL UND METHODEN 45 ton X-100, 300 µm DCPIP und Rohextrakt. Nach Vorinkubation des Ansatzes für 10 min bei 40 C wurde die Reaktion durch Zugabe von 100 mm Pyruvat gestartet. Der millimolare Extinktionskoeffizient beträgt 22 mm -1 *cm Bestimmung der Chloramphenicol-Acetyltransferase-Aktivität (Shaw, 1975) Nachdem die Zellen auf den gewünschten Medien gezüchtet wurden, wurden sie in 20 mm Tris-HCl, ph 7,6 gewaschen und in einem geeignete Volumen 1 M Tris- HCl, ph 7,6 aufgenommen. Der Aufschluss erfolgte mittels RiboLyser (siehe 9.1). Die Chloramphenicol-Acetyltransferase katalysiert folgende Reaktion: Chloramphenicol + 2 Acetyl-CoA Chloramphenicol-1,3-diacetat + 2 CoA Das reduzierte Coenzym A (CoA) wird in einer zweiten Reaktion mit 5,5 -Dithiobis- 2-nitrobenzoesäure (DTNB) weiter umgesetzt: CoA + DTNB Dithionitrobenzoyl-CoA + 5-Thio-2-nitrobenzoesäure Das Reaktionsendprodukt 5-Thio-2-nitrobenzoesäure besitzt einen millimolaren Extinktionskoeffizienten von 13,6 [mm -1* cm -1 ] bei 412 nm und läßt sich deshalb bei dieser Wellenlänge im Photometer nachweisen. Für den Test wurden zunächst 950 µl Reaktionsmischung (4 g DTNB/l, 100 mm Tris-HCl, ph 7,8, 0,2 mm Acetyl- CoA) in einer Plastikküvette auf 37 C temperiert. Nach Zugabe von 10 µl Zellextrakt einer geeigneten Verdünnung, wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 µl 5 mm Chloramphenicol gestartet und die Extinktionszunahme über 1 min photometrisch verfolgt.

59 MATERIAL UND METHODEN Detektion von Aminosäuren mittels HPLC-Analyse 10.1 Fermentationen und Probenahme zur Bestimmung von Valin mittels RP-HPLC Zur Fermentation von Valin-produzierenden Stämmen wurden diese unter entsprechenden Wachstumsbedingungen gezüchtet. Zu bestimmten Zeitpunkten (i.d.r. 24 und 48) wurde 1 ml Kultur zentrifugiert (13000 rpm, 20 min, RT) und die Kulturüberstände bis zur weiteren Verwendung bei 20 C eingefroren. Zur Analyse wurden diese Proben mit H 2 O entsprechend verdünnt, mit 100 µm Ornithin als internem Standard versetzt und erneut zentrifugiert, bevor die Probe mittels HPLC untersucht wurde RP-HPLC zur Quantifizierung von Aminosäuren Die in dieser Arbeit verwendete Methode basiert auf einer Methode von Schuster, 1988 zur Trennung von Aminosäuren nach Vorsäulenderivatisierung zu fluoreszierenden Derivaten und wurde zur Analyse von Valin und Aspartat eingesetzt. Für die Trennung, Identifizierung und Quantifizierung der Aminosäuren wurde eine LC 1100 Anlage (Firma Agilent Technologies Deutschland GmbH, Waldbronn) mit einem Fluoreszenzdetektor (HP G1321A) eingesetzt. Durch Vorsäulenderivatisierung mit ortho-phtaldialdehyd (OPA) und β-mercaptoethanol (Pierce, Rockford, USA) wurden alle primären Aminosäuren zu fluoreszierenden Isoindol-Derivaten umgesetzt (Ogden und Földi, 1986). Die Derivatisierung erfolgte unter normierten Bedingungen in einem automatisierten Derivatisierungsprogramm (Tabelle 4), um identische Aminosäurederivate zu gewährleisten (May und Brown, 1989). Die Trennung der Aminosäuren erfolgte über ein System bestehend aus Vor- und Hauptsäule (Vorsäule: C 18 -Hypersil, ODS-5µ, 40x4 mm, Hauptsäule: C 18 -Hypersil, ODS-5µ, 150x3 mm, Chromatographie Service GmbH, Langerwehe) unter folgenden Elutionsbedingungen: 40 C, Lösungsmittel A (100 mm Natriumacetat, ph 7,2), Lösungsmittel B (Methanol), Durchflußrate von 0,35-0,6 ml/min. Die Durchmischung der beiden Lösungen wurde wie im Folgenden dargestellt ü- ber ein HPLC-Programm gesteuert: 1 min wurde mit 25 % Lösungsmittel B bei 0,35 ml/min eluiert. Anschließend erfolgte in den nächsten 2 min ein linearer

60 MATERIAL UND METHODEN 47 Tabelle 4: HPLC-Programm zur automatisierten Vorsäulenderivatisierung von primären Aminosäuren mit OPA. Operation Volumen [µl] Reagenz Zweck draw 8.5 OPA Aufnahme von Derivatisierungsreagenz draw 2.5 sample Aufnahme der Probe draw 0.0 water Eintauchen der Nadel in demin. Wasser draw 9.0 OPA Aufnahme von Derivatisierungsreagenz min max. amount in seat Durchmischen von Probe und OPA wait for 1 min Reaktion der Aminosäuren mit OPA zu fluoreszierenden Derivaten inject 5.0 Injektion der Probe auf die Säule Anstieg des Anteils von Lösungsmittel B auf 45 % und einer Durchflußrate von 0,6 ml/min. Unter Beibehaltung der Durchflußrate wurde für weitere 4 min der Anteil an Lösungsmittel B linear auf 65 % erhöht. Die folgenden Schritte dienten zur Spülung und zur Regenration des Säulenmaterials, indem der Anteil an Lösungsmittel B bis auf 100 % erhöht und die Durchflußrate auf 0,35 ml/min reduziert wurde. Das System wurde mit dieser Durchflußrate für 8,5 min gespült bevor eine neue Aminosäurebestimmung erfolgen konnte. Die Detektion erfolgte mit einem Fluoreszenzdetektor bei einer Anregungswellenlänge von 230 nm und einer Emissionswellenlänge von 455 nm. Um die einzelnen Aminosäuren zu identifizieren, wurden diese einzeln injiziert und eine Regressionsgerade erstellt. Dazu wurde das Programm HP-Chemstation for LC Rev. A von Agilent Technologies verwendet.

61 MATERIAL UND METHODEN Bestimmung von Pantothenat (Sahm und Eggeling, 1999) Zur Bestimmung von Pantothenat aus Kulturüberständen, die nach 24 bis 48 h genommen wurden, wurde der Pantothenat-auxotrophe Stamm C. glutamicum R127 panc:pk18 mob panc eingesetzt. Vorkulturen dieses Stammes wurden in 50 ml 2x TY-Medium mit 25 µg Kanamycin/ml für 20 h bei 28 C inkubiert. Die Vorkulturen wurden vor Beimpfen des Hauptmediums (CGXII) 2x mit 0,9 % NaCl gewaschen, auf eine Initiations-OD von 0,5 angeimpft und für 28 h bei 28 C inkubiert. Dabei wurden zwei Kolben inokuliert, wobei einer kein Pantothenat enthielt (End-OD 600 von 25), der andere mit 0,5 mm Pantothenat supplementiert war (End-OD von 40). Nach 28 h wurden zu 700 µl Glycerin 1050 µl Kultur gegeben und diese bei 70 C in flüssigem Stickstoff eingefroren und gelagert. Anhand des in Tabelle 5 dargestellten Pipettierschemas wurde eine Kalibriergerade erstellt. Dazu wurde eine Stammlösung von 100 µg/l und konzentriertes CGXII-Medium hergestellt. Jedem Ansatz wurden 100 µl nicht Pantothenatsupplementierte Zellen zugesetzt und die Ansätze insgesamt für 48 h bei 180 rpm geschüttelt. Nach 24 und 48 h wurde die OD 600 ermittelt und anhand dieser Werte die Kalibriergerade angefertigt. Tabelle 5: Pipettierschema zur Erstellung der Kalibiergerade für die Pantothenatbestimmung. c Pantothenat Wasser [µl] Pantothenat- konzentriertes [ng/ml] stammlösung [µl] CGXII [ml]

62 MATERIAL UND METHODEN 49 Um das zur Pantothenatproduktion nötige β-alanin in ausreichendem Maße während der Fermentation zur Verfügung zu stellen, wurde den Stämmen, die auf die Produktion von Pantothenat untersucht wurden, 20 mm β-alanin während des Wachstums zugesetzt. Die Kulturüberstände wurden entsprechend verdünnt, sterilfiltriert und 1 ml in den Test eingesetzt. Konzentriertes CGXII-Medium: (NH 4 ) 2 SO 4 5 g/l Harnstoff 1,25 g/l MOPS 10,5 g/l K 2 HPO 4 0,25 g/l KH 2 PO 4 0,25 g/l MgSO 4 62 mg CaCl 2 (0,1 g/10 ml) 250 µl Spurenelemente-Lösung 250 µl Biotin (200 mg/l) 250 µl Kanamycin (50 mg/ml) 125 µl Glukose 4 % In 188 ml H 2 O lösen, auf ph 7,0 einstellen und sterilfiltrieren.

63 ERGEBNISSE 50 III. ERGEBNISSE 1. Analyse des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes (PDHC) in Corynebacterium glutamicum Der Pyruvatdehydrogenase-Komplex in C. glutamicum besteht aus den drei Untereinheiten Pyruvat-Decarboxylase (kodiert von acee), Dihydrolipoamid- Transacetylase (kodiert von acef) und Dihydrolipoamid-Dehydrogenase (kodiert von lpd). Der PDHC katalysiert die zentrale Reaktion der oxidativen Decarboxylierung von Pyruvat zu Acetyl-CoA bei gleichzeitiger Bildung von NADH 2. Im folgenden werden die spezifischen Aktivitäten des PDHCs im Wachstumsverlauf, die Spezifität bezüglich verschiedener Substrate und Kohlenstoffquellen sowie der K s - Wert für Pyruvat in Zellextrakten untersucht. 1.1 Spezifische Aktivitäten des PDHC im Wachstumsverlauf Um zu klären, in welcher Wachstumsphase der PDHC die höchste spezifische Aktivität aufweist, wurde der Wildtyp C. glutamicum auf Komplexmedium gezüchtet und pro Stunde 50 ml Zellen zur späteren Messung der spezifischen Aktivitäten geerntet. Wie aus Abbildung 4 hervorgeht steigen die spezifischen Aktivitäten bis zur exponentiellen Wachstumsphase an, in der ein Maximum von 0,057 U/mg Protein erreicht wurde. Mit dem Eintreten in die stationäre Phase nach 9 h Wachstum ist die Aktivität auf 31% (0,018 U/mg Protein) des Maximal-Werts gefallen, nach 24 h verbleibt lediglich eine Restaktivität von 0,007 U/mg Protein, die 12 % des Maximums entspricht. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden alle folgenden Experimente mit Zellextrakten der exponentiellen Wachstumsphase durchgeführt.

64 ERGEBNISSE ,06 OD , Zeit [h] 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 spez. PDHC-Aktivität [U/mg Protein] Wachstum PDHC-Aktivität Abbildung 4: Wachstumsabhängige Untersuchung spezifischer PDHC-Aktivitäten des Wildtyps C. glutamicum auf Komplexmedium ohne Glukose. 1.2 Charakterisierung der PDHC-Aktivität in Zellextrakten von C. glutamicum Um die Spezifität des PDHC zu analysieren, wurden aus Zellen der logarithmischen Wachstumsphase nach Wachstum auf Komplexmedium Zellextrakte hergestellt und die Enzymaktivitäten untersucht. Tabelle 6 zeigt, dass bei Durchführung des Enzymtests unter Standardbedingungen mit allen Reaktionskomponenten eine spezifische Aktivität von 0,11 U/mg Protein erreicht wurde. Wurden die Substrate Pyruvat, CoA oder NAD + weggelassen, waren keine Aktivitäten mehr bestimmbar, woraus geschlossen werden kann, dass diese Reaktionskomponenten essentiell sind. In Abwesenheit des Substrates MgCl 2 war mit 0,096 U/mg Protein eine um 13% verringerte Aktivität erkennbar, eine um 52 % verringerte Aktivität (0,053 U/mg Protein) in Abwesenheit von TPP. In einer früheren Arbeit (J. Schwinde, Doktorarbeit) konnte bereits ein positiver Einfluß auf die spezifische Aktivität der PDHC durch Hinzufügen des Reduktionsmittels Cystein zum Reaktionsansatz gezeigt werden. Dieser Effekt konnte in dieser Arbeit durch mehrmalige unabhängige Versuche widerlegt werden. So konnte ohne Cystein im Ansatz sogar eine um 10 % höhere spezifische Aktivität gemessen werden.

65 ERGEBNISSE 52 Tabelle 6: Spezifität des PDHC bezüglich der im Reaktionsansatz enthaltenen Komponenten mit Zellextrakten von auf Komplexmedium gewachsenen Zellen. Reaktionsansatz spez. Aktivität [U/mg Protein] relative Aktivität [%] vollständig 0, MgCl 2 0, TPP 0, Pyruvat <0,001 <0,01 - CoA <0,001 <0,01 - NAD + <0,001 <0,01 - Cystein 0, Weitere Hinweise auf die Spezifität des PDHC sollte ein Substrat-Test geben. Neben dem Pyruvatdehydrogenase-Komplex als decarboxylierendem Enzym existiert in C. glutamicum ein 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase-Komplex (OGDHC), der 2- Oxoglutarat zu Succinyl-CoA decarboxyliert. Für die Aktivität dieses Enzyms sind, abgesehen von 2-Oxoglutarat anstelle von Pyruvat als Substrat, die gleichen Reaktionskomponenten erforderlich wie für den PDHC. Um die Spezifität des PDHC für das Substrat Pyruvat zu beweisen, wurden Zellextrakte aus der exponentiellen Wachstumsphase untersucht, indem die Substrate Pyruvat und 2-Oxoglutarat getrennt voneinander und in Kombination in den Enzymtest eingesetzt wurden. Dabei wurden spezifische Aktivitäten der Enzyme PDHC und OGDHC auf unterschiedlichen Kohlenstoffquellen untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt. Die höchste spezifische PDHC-Aktivität mit 0,106 U/mg Protein wurde nach Wachstum auf Komplexmedium ohne Glukose gemessen. Die auf Komplexmedium mit Glukose bzw. auf Minimalmedium ermittelten Aktivitäten lagen im Bereich von 0,046 U/mg Protein (Komplexmedium mit Glukose) bis 0,057 U/mg Protein (Minimalmedium mit Glukose), was einer prozentualen Aktivität von 43 bis 54 % des Maximalwertes entspricht.

66 ERGEBNISSE 53 Tabelle 7: Spezifische PDHC- und OGDH-Aktivitäten nach Wachstum auf unterschiedlichen Kohlenstoffquellen mit den Substraten Pyruvat, 2-Oxoglutarat und beiden in Kombination. Kohlenstoffquelle spez. PDHC- Aktivität [U/mg Protein] spez. OGDHC- Aktivität [U/mg Protein] spez. Aktivität mit Pyruvat und 2-Oxoglutarat [U/mg Protein] KM 0,106 0,038 0,162 KM + 1 % Glukose 0,046 0,330 0,116 MM + 1 % Glukose 0,057 0,034 0,097 MM + 1 % Glukose + 1 % Acetat 0,048 0,026 0,085 MM + 1 % Acetat 0,049 0,050 0,080 Die spezifischen Aktivitäten der OGDHC verhielten sich auf allen Kohlenstoffquellen nahezu konstant mit Werten von 0,026 bis 0,038 U/mg Protein. Lediglich auf Minimalmedium mit Acetat war mit 0,05 U/mg Protein die Aktivität leicht erhöht. Wurden beide Substrate in Kombination eingesetzt entsprach die gemessene Aktivität der Summe aus den Aktivitäten der einzeln zugesetzten Substrate. Daraus kann geschlossen werden, dass sowohl die Aktivitäten des PDHCs als auch die des OGDHCs spezifisch für die jeweiligen Substrate sind. 1.3 Bestimmung des K s -Wertes von Pyruvat für den PDHC Abgesehen vom anaplerotischen Enzym Pyruvat-Carboxylase, das Oxalacetat aus Pyruvat bildet, existiert in C. glutamicum ein weiteres Pyruvat-umsetzendes Enzym neben der PDHC, die Pyruvat-Chinon-Oxidoreduktase, die die Umsetzung von Pyruvat zu Acetat katalysiert. Dieses Enzym wurde bereits gereinigt und biochemisch charakterisiert, eine genaue Funktion im Stoffwechsel kann diesem Enzym jedoch noch nicht zugeschrieben werden (M. Schreiner, persönliche Mitteilung). Da die Pyruvat-Chinon-Oxidoreduktase wahrscheinlich hauptsächlich in der stationären Phase aktiv ist und der PDHC, wie unter 1.1 gezeigt werden konnte,

67 ERGEBNISSE 54 seine höchste spezifische Aktivität in der exponentiellen Wachstumsphase aufweist, könnte ein Zusammenhang der beiden Enzyme bezüglich ihrer Funktion im Zentralstoffwechsel bestehen. Die Bestimmung des K m -Wertes ist nur mit gereinigtem Enzym möglich. Da der PDHC von C. glutamicum sehr geringe spezifische Aktivitäten besitzt und empfindlich auf diverse Salze (NaCl, KCl, (NH 4 ) reagiert, war eine Reinigung des Komplexes nicht möglich. Daher wurde die Michaelis- Menten-Konstante für das Substrat Pyruvat in Zellextrakten von exponentiell gewachsenen Zellen bestimmt. Wird bei einer gegebenen Menge Enzym die Konzentration eines Substrates sukzessive erhöht, liegt ab einer gewissen Substratkonzentration das gesamte Enzym in Form eines Enzym-Substrat-Komplexes vor. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit ist ab diesem Zeitpunkt erreicht. Dieser Zusammenhang kann in Form der Michaelis-Menten- und Lineweaver-Burk-Darstellung graphisch erfaßt werden. Die Michaelis-Menten-Gleichung ist im folgenden theoretisch beschrieben: v = v K max m + * [ S] [ S] v max v [S] K m = maximale Geschwindigkeit = Reaktionsgeschwindigkeit = Substratkonzentration = Michaelis-Menten-Konstante Die Michaelis-Menten-Konstante K S ist ein Maß für die Affinität eines Enzyms zu einem bestimmten Substrat. Bei einem hohen K S -Wert ist erst bei einer relativ hohen Konzentration die halbmaximale Geschwindigkeit erreicht. Ein Enzym wird bevorzugt jenes Substrat umsetzen, zu dem es eine möglichst kleine Konstante hat. Die Bestimmung dieses Wertes erfolgt häufig über die Lineweaver-Burk- Darstellung. Diese erhält man durch Umformung der Michaelis-Menten-Gleichung in ihre reziproke Form: 1 = v v K m max + [ S] = * [ S] K v m max * 1 [ S] + 1 v max

68 ERGEBNISSE 55 Um den K S -Wert für Pyruvat für die PDHC zu bestimmen wurde der Test mit unterschiedlichen Endkonzentrationen an Pyruvat im Bereich von 0 bis 5 mm im Test durchgeführt. In den Abbildungen 5a und 5b sind die entsprechenden Werte sowohl in Michaelis-Menten- als auch in Lineweaver-Burk-Darstellung gezeigt. Aus Abbildung 5a geht hervor, dass bei einer Endkonzentration von 1,77 mm Pyruvat im Test zunächst die maximale Aktivität (0,051 U/mg Protein) erreicht ist. Nachdem bis 2,5 mm Pyruvat über 5 Werte die spezifische Aktivität konstant blieb, stieg sie ab einer Konzentration von 2,75 mm wieder an. Es wurde bis 5 mm Pyruvat im Test gemessen, da diese Konzentration der im Standardtest eingesetzten Konzentration entsprach. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit läge somit bei 5 mm Pyruvat und 0,074 U/mg Protein. Im Gegensatz zu gereinigtem Protein können im Zellextrakt weitere Faktoren auf die Enzym-Aktivitäten einwirken, weshalb die Werte lediglich als Hinweis gesehen werden können. Eine konkrete Aussage darüber, ab welcher Konzentration der Komplex tatsächlich in gesättigter Form vorliegt, kann nicht getroffen werden. Abbildung 5b zeigt die Ergebnisse in Lineweaver-Burk-Darstellung. Aus dem Schnittpunkt der Regressionsgeraden mit der spez. Aktivität [U/mg Protein] 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0, Pyruvat [mm] Abbildung 5a: Spezifische PDHC-Aktivität in Zellextrakten von C. glutamicum aus auf Komplexmedium gewachsenen Zellen in Abhängigkeit von der Pyruvat- Konzentration (0-5 mm) in Michaelis-Menten-Darstellung.

69 ERGEBNISSE 56 1/spez. Aktivität [mg/u] 50 y = 17,571x + 9, ,5 0 0,5 1 1, /Pyruvat [1/mM] Abbildung 5b: Spezifische PDHC-Aktivität in Zellextrakten von C. glutamicum aus auf Komplexmedium gewachsenen Zellen in Abhängigkeit von der Pyruvat- Konzentration (0-5 mm) in Lineweaver-Burk-Darstellung. Ordinate läßt sich die maximale spezifische Aktivität ablesen, aus dem Schnittpunkt mit der Abszisse der K S -Wert für Pyruvat. Der Ordinatenschnittpunkt ergab eine maximale Aktivität von 0,099 U/mg Protein, der K S -Wert für Pyruvat beträgt 1,74 mm. Dies entsprach in etwa dem in dieser Arbeit zusätzlich ermittelten Wert von 2,6 mm. 2. Etablierung eines Enzymtests zum Nachweis der Pyruvat- Decarboxylase (E1-Untereinheit des PDHC) aus C. glutamicum Die Pyruvat-Decarboxylase (PDC) wird vom acee-gen kodiert, das von Mark Schreiner isoliert und deletiert wurde. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine Deletion im C. glutamicum Wildtyp zu einem Verlust der Fähigkeit, auf Komplexmedium und Minimalmedium mit Glukose zu wachsen, führte. Dieser Defekt konnte durch Zugabe von 0,5 bis 1 % Acetat auf beiden Medien wieder ausgeglichen

70 ERGEBNISSE 57 EcoR I EcoR I Pst I BamH I Pst I BamH I orf13 acee orf14 orf Abbildung 6: Restriktionskarte der kodierenden Region des acee-gens mit dem stromaufwärts liegenden Gen orf13 und den stromabwärts liegenden Genen orf14 und 15, die in entgegengesetzter Orientierung angeordnet sind. Das Gen acee kodiert für die E1-Untereinheit (Pyruvat-Decarboxylase) des PDHC, orf13 und orf15 kodieren für hypothetische Proteine und orf14 für einen putativen ABC- Transporter. werden. Abbildung 6 zeigt die genetische Organisation des acee-gens im Chromosom von C. glutamicum, wobei deutlich wird, dass die kodierenden Gene der anderen Untereinheiten des PDHC nicht in Nachbarschaft des acee-gens liegen. Die E1-Untereinheit des PDHC katalysiert die Decarboxylierung des Pyruvats unter Entstehung von Hydroxyethyl-TPP: Pyruvat + TPP Hydroxyethyl-TPP + CO 2 Die Messung der Aktivität dieser Untereinheit war jedoch nur mit nichtkomplexiertem Enzym, das dieselbe Reaktion wie die Pyruvat-Chinon- Oxidoreduktase katalysiert, möglich: Pyruvat + FAD Acetat + CO 2 + FADH 2

71 ERGEBNISSE 58 Tabelle 8: Spezifische PDC-Aktivitäten in Zellextrakten von auf unterschiedlichen Kohlenstoffquellen kultivierten Zellen. Kohlenstoffquelle spez. PDC-Aktivität [mu/mg Protein] KM 38,8 KM + Glukose 53 MM + Glukose 24 MM + Acetat <0,001 MM + Glukose + Acetat <0,001 Die Aktivitätsbestimmung erfolgt enzymatisch durch photometrische Messung der Reduktion des künstlichen Elektronenakzeptors Kaliumhexacyanoferrat bei 430 nm. Zur Etablierung des Enzymtests wurden Rohextrakte aus Zellen hergestellt, die auf Komplexmedium bis zur exponentiellen Wachstumsphase gewachsen waren. Als Negativkontrolle diente der Stamm C. glutamicum acee, der eine Deletion im acee-gen trägt. Es konnte eine maximale spezifische Aktivität von 38,8 mu/mg Protein für den Wildtyp C. glutamicum ermittelt werden, wohingegen für den Stamm C. glutamicum acee keine Aktivität detektierbar war. Durch die generell sehr niedrigen Aktivitäten war eine Messung in Korrelation zum Wachstum schwierig. Erste Versuche weisen allerdings darauf hin, dass auch für die E1-Untereinheit der PDHC die höchste spezifische Aktivität nach 6 h Wachstum auf Komplexmedium ohne zusätzliche Kohlenstoffquelle mit 27 mu/mg Protein erreicht wird. Die Untersuchung der spezifischen Aktivitäten auf unterschiedlichen Kohlenstoffquellen (Tabelle 8) zeigte, dass auf Minimalmedium mit Acetat oder Mischsubstrat gewachsenen Zellen keine Aktivität beobachtet werden konnte. Die auf Minimalmedium mit Glukose ermittelte Aktivität lag bei 24 mu/mg Protein, wohingegen auf Komplexmedium mit und ohne Glukose die höchsten Aktivitäten mit 53 und 38,8 mu/mg Protein meßbar waren. Ohne Pyruvat war keine Aktivität detektierbar. Eine Variation der Pyruvatkonzentrationen im Bereich von 0 bis 10 mm zeigte gleichbleibende PDC-Aktivitäten.

72 ERGEBNISSE 59 Wurde dem Testansatz kein MgCl 2 zugesetzt waren im höchsten Fall 12 mu/mg Protein zu messen, bei Weglassen von TPP maximal 6 mu/mg Protein. 3. Isolierung und Untersuchung der Dihydrolipoamid- Transacetylase (E2-Untereinheit) aus C. glutamicum Ein weiteres Ziel dieser Arbeit waren Untersuchungen zur Expression des acef- Gens, das für die Dihydrolipoamid-Transacetylase (DHL) kodiert. Dieses Gen konnte durch Sequenz-Vergleiche identifiziert werden und liegt auf dem Chromosom nicht benachbart zu den anderen für den PDHC kodierenden Gene. Das Gen acef liegt jedoch benachbart zu zwei Genen der Liponsäurebiosynthese. Da Liponsäure ein kovalent gebundener Bestandteil des PDHC ist, könnte es sich hier um eine funktionelle Einheit handeln. XhoI SalI SalI SalI SalI SalI SalI KpnI KpnI PvuI PvuI XhoI XhoI XhoI BamHI acef lipb lipa Abbildung 6: Restriktionskarte der kodierenden Region des acef-gens mit den stromabwärts liegenden Genen lipb und lipa. Das acef-gen kodiert für die E2- Untereinheit (Dihydrolipoamid-Transacetylase) des PDHC, lipb kodiert für eine Lipoyl-[Acyl-Carrier-Protein]-Protein-N-Lipoyltransferase und lipa für eine Lipoyl- Synthase B.

73 ERGEBNISSE 60 C. glutamicum MAFSVEMPELGESVTEGTITQWLKSVGDTVEVDEPLLEVSTDKVDTEIPSPVAGVILEIK 60 E. coli -AIEIKVPDIGADEVE--ITEILVKVGDKVEAEQSLITVEGDKASMEVPSPQAGIVKEIK B. subtilis A. vinelandii -SEIIRVPDIGGDG-E--VIELLVKTGDLIEVEQGLVVLESAKASMEVPSPKAGVVKSVS C. glutamicum AEEDDTVDVGGVIAIIGDADETPANEAPADEAP-APAEEEEPVKEEPKKEAAPEAPAATG 120 E. coli VSVGDKTQTGALIMIFDSADGAA----DA-----APAQAEE--KKEA-AP--AAAPA-AA B. subtilis A. vinelandii VKLGDKLKEGDAIIELEPAAGAAAAPAEAAAVPAAPTQAVD--EAEAPSPGASATPAPAA C. glutamicum AATDVEMPELGESVTEGTITQWLKAVGDTVEVDEPLLEVSTDKVDTEIPSPVAGTIVEIL 180 E. coli AAKDVNVPDIGSD--EVEVTEILVKVGDKVEAEQSLITVEGDKASMEVPAPFAGTVKEIK B. subtilis -AFEFKLPDIGEGIHEGEIVKWFVKPNDEVDEDDVLAEVQNDKAVVEIPSPVKGKVLELK A. vinelandii ASQEVRVPDIGSAG-KARVIEVLVKAGDQVQAEQSLIVLESDKASMEIPSPASGVVESVA C. glutamicum ADEDDTVDVGAVIARIGDANAAAAPAEEEAAPAEEEEPVKEEPKKEAAPEAPAATGAATD 240 E. coli VNVGDKVSTGSLIMVFEVAG-EAGA----AAPAAKQEAA---PA--AAP-AP-AAGVK-E B. subtilis VEEGTVATVGQTIITFD AP------GYE-D A. vinelandii IQLNAEVGTGDLILTLRTTGAQAQP----TAPAAAAAAS---PA--PAPLAPAAAGPQ-E C. glutamicum VEMPELGESVTEGTITQWLKAVGDTVEVDEPLLEVSTDKVDTEIPSPVAGTIVEILADED 300 E. coli VNVPDIGGD--EVEVTEVMVKVGDKVAAEQSLITVEGDKASMEVPAPFAGVVKEL----- B. subtilis LQFK--GSD ESDDAKTEA A. vinelandii VKVPDIGSAG-KARVIEVLVKAGDQVQAEQSLIVLESDKASMEIPSPAAGVVESV----- C. glutamicum DTVDVGAVIARIGDANAAAAPAEEEAAPAEEEEPVKEEPKKEEPKKEEPKKEAATTPAAA 360 E. coli -KVNVG---DKVKTGSLIMIFEVEGAAPAAA--PAKQEAAAPAPAAKAEAPAAAPAAKAE B. subtilis -QVQST---AEAGQ DVAKEEQAQE--PAK ATGAGQQDQAE A. vinelandii -AVQLN---AEVGTGDQILTLRVAGAAPSGP--RAR-----GSPGQAAAAPGAAPAPAPV C. glutamicum SATVSASGDNVPYVTPLVRKLAEKHGVDLNTVTGTGIGGRIRKQDVLAAANG---EAAPA 420 E. coli GKSEFAENDAYVHATPLIRRLAREFGVNLAKVKGTGRKGRILREDVQAYVKEAIKRAEAA B. subtilis VDP----N-KRVIAMPSVRKYAREKGVDIRKVTGSGNNGRVVKEDIDSFVNGGAQEAAPQ A. vinelandii GAP--SRNGAKVHAGPAVRQLAREFGVELAAINSTGPRGRILKEDVQAYVKAMMQKAKEA C. glutamicum EAAAPVSAWSTKSVDP-EKAKLRGTTQK-VNRIREITAMKTVEALQISAQLTQLHEVDMT 480 E. coli PAATGGGIPGMLPWPKVDFSKFGEIEEVELGRIQKISGANLSRNWVMIPHVTHFDKTDIT B. subtilis ETAAPQETAAKPAAAPAPEGEFPETREK-MSGIRKAIAKAMVNSKHTAPHVTLMDEVDVT A. vinelandii PAAGAASGAGIPPIPPVDFAKYGEIEEVPMTRLMQIGATNLHRSWLNVPHVTQFESADIT C. glutamicum RVAELRKKN-KPAFIEKHGVNLTYLPFFVKAVVEALVSHPNVNASFNAKTKEMTYHSSVN 540 E. coli ELEAFRKQQNEEAAKRKLDVKITPVVFIMKAVAAALEQMPRFNSSLSEDGQRLTLKKYIN B. subtilis NLVAHRKQF--KQVAADQGIKLTYLPYVVKALTSALKKFPVLNTSIDDKTDEVIQKHYFN A. vinelandii ELEAFRVAQ--KAVAEKAGVKLTVLPLLLKACAYLLKELPDFNSSLAPSGQALIRKKYVH C. glutamicum LSIAVDTPAGLLTPVIHDAQDLSIPEIAKAIVDLADRSRNNKLKPNDLSGGTFTITNIGS 600 E. coli IGVAVDTPNGLVVPVFKDVNKKGIIELSRELMTISKKARDGKLTAGEMQGGCFTISSIGG B. subtilis IGIAADTEKGLLVPVVKNADRKSVFEISDEINGLATKAREGKLAPAEMKGASCTITNIGS A. vinelandii IGFAVDTPDGLLVPVIRNVDQKSLLQLAAEAAELAEKARSKKLGADAMQGACFTISSLGH C. glutamicum EGALSDTPILVPPQAGILGTGAIVKRPVVITEDGIDSIAIRQMVFLPLTYDHQVVDGADA 660 E. coli LGTTHFAPIVNAPEVAILGVSKSAMEPVWNGKE----FVPRLMLPISLSFDHRVIDGADG B. subtilis AGGQWFTPVINHPEVAILGIGRIAEKAIVRDGE----IVAAPVLALSLSFDHRMIDGATA A. vinelandii IGGTAFTPIVNAPEVAILGVSKASMQPVWDGKA----FQPRLMLPLSLSYDHRVINGAAA C. glutamicum GRFLTTIKDRLETANFEGDLQL- E. coli ARFITIINNTLS--DIRRLVM-- B. subtilis QNALNHIKRLLN--DPQLILMEA A. vinelandii ARFTKRLGDLLA--DIRAILL-- Abbildung 8: Aminosäuresequenz-Vergleich der DHL aus C. glutamicum mit DHLs von E. coli, B. subtilis und A. vinelandii. Die identischen Bereiche sind rot hinterlegt. Bereiche zur Bindung des Dihydrolipoamids sind schwarz und eine potentielle E3-Bindedomäne ist grün unterstrichen.

74 ERGEBNISSE 61 In Abbildung 7 ist eine Restriktionskarte mit dem acef-gen und den stromabwärts liegenden Genen lipb und lipa dargestellt. Abbildung 8 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenz der DHL aus C. glutamicum zu DHLs anderer Organismen. Die DHL aus C. glutamicum besteht aus 675 Aminosäuren (AS) und hat eine vorhergesagte molekulare Masse von 70,9 kda. Der AS-Vergleich zeigte Identitäten zu möglichen E2-Untereinheiten anderer PDHCs und OGDHCs von bis zu 66 % (C. diphteriae). Abbildung 8 zeigt den AS-Vergleich zu den Organismen B. subtilis (22,4 % Identität) (Hemila et al., 1990), E. coli (31,4 % Identität) (Stephens et al., 1983) und A. vinelandii (27,6 % Identität) (Hanemaaijer et al., 1988), die bereits beschrieben und funktionell nachgewiesen sind. Mit Hilfe eines Computerprogrammes (SMART) konnten 3 Domänen von 76 AS für die Bindung von Dihydrolipoamid identifiziert werden (AS , AS , AS 4-79). Außerdem konnte ein Bindungsbereich für die Dihydrolipoamid-Dehydrogenase (E3-Binde- Domäne) vorhergesagt werden (AS ). Die DHL katalysiert die unten aufgeführten Reaktionen: Hydroxyethyl-TPP + Lipoamid + TPP Acetyldihydrolipoamid + CoA poamid 6-S-Acetyldihydrolipoamid Acetyl-CoA + Dihydroli- Der Nachweis der Enzymaktivität erfolgt enzymatisch nach folgendem Prinzip in nicht physiologischer Richtung: Acetylphosphat + CoA Acetyl-CoA + Dihydrolipoamid + CoA PTA Acetyl-CoA + P i 6-S-Acetyldihydrolipoamid

75 ERGEBNISSE 62 Tabelle 9: Spezifische DHL-Aktivitäten in Zellextrakten von auf unterschiedlichen Kohlenstoffquellen kultivierten Zellen. Kohlenstoffquelle spez. DHL-Aktivität [mu/mg Protein] KM 233 KM + Glukose 50 MM + Glukose 40 MM + Acetat 33 MM + Glukose + Acetat 39 Um die spezifische Aktivität der DHL zu bestimmen und ein geeignetes Nachweissystem zu etablieren, wurden Zellen aus der exponentiellen Wachstumsphase (OD 600 von 6) nach Wachstum auf Komplexmedium geerntet. Es konnte eine starke Abhängigkeit der Stabilität des Enzymtests von der CoA- Konzentration nachgewiesen werden. Bei einer Konzentration von 0,2-0,4 mm CoA im Test war keine Aktivität bestimmbar, ebenso beim Einsetzen unverdünnter Rohextrakte. Eine reproduzierbare Messung von etwa 120 mu/mg Protein war jedoch in 1:10 verdünnten Rohextrakten aus exponentiell gewachsenen Zellen bei einer CoA-Konzentration von 0,1 mm im Test möglich. Mit diesem Testsystem wurden die DHL-Aktivitäten wiederum nach Wachstum auf unterschiedlichen Kohlenstoffquellen analysiert. Die höchste Aktivität ergab sich mit 233 mu/mg Protein bei Zellextrakten aus auf Komplexmedium (ohne weitere Kohlenstoffquelle) gewachsenen Zellen. Auf allen anderen untersuchten Kohlenstoffquellen waren die Aktivitäten im Vergleich zum höchsten Wert (Komplexmedium) mit spezifischen Aktivitäten von mu/mg Protein durchgehend niedriger.

76 ERGEBNISSE Transkriptionsanalysen zur Expression der Gene acee und acef aus C. glutamicum Northern-Blot -Experimente der Gene acee und acef Es konnte für E. coli gezeigt werden, dass die Gene für die Untereinheiten des PDHC in einem Operon organisiert sind (Spencer und Guest, 1985). Wie schon unter III.2 und III.3 dargestellt, liegen die Gene acee, acef und lpd in C. glutamicum nicht benachbart auf dem Chromosom. Für das lpd-gen konnte durch Northern-Blot -Experimente bereits gezeigt werden, dass es monocistronisch transkribiert wird (Schwinde et al., 2001). Die Frage nach der Genorganisation sollte nun auch für die Gene acee und acef geklärt werden. Zellen von C. glutamicum wurden hierfür auf Komplexmedium und Minimalmedium mit Glukose gezüchtet, in der exponentiellen Wachstumsphase geerntet und die RNA isoliert. Für die Northern-Blot -Hybridisierungen von acee wurde ein 579 bp großes Fragment hergestellt, das durch EcoRI/PstI Verdau aus dem Vektor pdrive-acee hervorging und nach radioaktiver Markierung als Sonde eingesetzt wurde. Die Ergebnisse des Northern-Blots sind in Abbildung 9 dargestellt. Es konnte eine etwa 2,9-kb-Bande nachgewiesen werden, die auf eine monocistronische Organisation des acee-gens hinweist (Strukturgen: 2768 bp). Stromaufwärts und stromabwärts liegen zwei mit orf13 und orf14 bezeichnete Gene, die zum acee-gen eine intergene Region von 206 bp (orf13) und 77 bp (orf14) aufweisen. Da orf14 in entgegengesetzter Orientierung angeordnet ist und eine Terminationsstruktur am Ende des acee-gens gefunden wurde, entsprach die monocistronische Organisation den Erwartungen. Aus Abbildung 9 wird zudem ersichtlich, dass die Stärke des Signals mit steigender RNA-Menge zunimmt. Weiterhin ist die Transkriptmenge bei Wachstum auf Komplexmedium deutlich höher als auf Minimalmedium. Dies weist auf eine Regulation auf RNA-Ebene in Abhängigkeit von der Kohlenstoffquelle hin. Dieses Ergebnis korreliert mit den auf Komplexmedium etwa doppelt so hohen spezifischen Enzymaktivitäten des PDHC (siehe Kapitel III/1.2).

77 ERGEBNISSE 64 2,9 kb Abbildung 9: Northern-Blot -Analyse für das Gen acee mit RNA aus auf Komplex- und Minimalmedium gewachsenen Zellen. In den Spuren 1-5 ist die Komplexmedium-RNA in steigender Menge (0,7-11,2 µg), in den Spuren 6-10 RNA aus auf Minimalmedium gewachsenen Zellen derselben Menge aufgetragen. Für das Gen acef wurde ebenfalls die genetische Organisation geklärt. Da Versuche zur Deletion dieses Gens bislang erfolglos waren, lag die Vermutung nahe, dass die Gene acef und die stromabwärts gelegenen Gene lipb und lipa, die für Proteine aus der Liponsäurebiosynthese katalysieren, ein Operon bilden, wodurch beim Deletieren von acef aufgrund des fehlenden Lipoamids kein Wachstum mehr möglich ist. Um zu untersuchen, ob diese Gene ein Operon bilden, wurden Northern-Blot -Hybridisierungen mit RNA aus auf Komplexmedium und Minimalmedium gewachsenen Zellen aus der exponentiellen Wachstumsphase mit spezifischen Sonden durchgeführt. Als Sonde diente ein radioaktiv markiertes 617 bp- Fragment, das aus dem Vektor pekex2-acef durch PstI Verdau hervorging.

78 ERGEBNISSE 65 2 kb Abbildung 10: Northern Blot-Analyse für das Gen acef mit RNA aus auf Komplex- und Minimalmedium gewachsenen Zellen. In den Spuren 1-5 ist die Komplexmedium-RNA in steigender Menge (0,7-11,2 µg), in den Spuren 6-10 die RNA aus auf Minimalmedium gewachsenen Zellen derselben Menge aufgetragen. Da die intergene Region zwischen acef und dem stromabwärts gelegenen lipb- Gen lediglich 62 bp beträgt, wurde ein gemeinsames Transkript erwartet. Bei einer monocistronischen Organisation wäre das zu erwartende Transkript etwa 2 kb groß (Strukturgen: 2028 bp). Läge das acef-gen in einem Operon mit lipb oder lipb und lipa vor, hätten die erwarteten Transkripte eine Länge von 2,9 kb im ersten bzw. 4 kb im zweiten Fall. Die Ergebnisse des Northern-Blots sind in Abbildung 10 gezeigt. Es konnte eine 2-kb-Bande nachgewiesen werden, die auf eine monocistronische Organisation des Gens hinweist. Die Stärke des Signals nimmt, wie auch schon für acee gezeigt werden konnte, mit steigender RNA-Menge zu. Weiterhin ist die Transkriptmenge auf Komplexmedium deutlich höher als auf Minimalmedium. Dieses Ergebnis korreliert wiederum mit den auf Komplexmedium etwa doppelt so hohen spezifischen Enzymaktivitäten der PDHC.

79 ERGEBNISSE Promotoraktivitäten der Gene acee und acef im Wachstumsverlauf und auf unterschiedlichen Kohlenstoffquellen Durch die Bestimmung spezifischer PDHC-Aktivitäten im Wachstumsverlauf konnte bereits gezeigt werden, dass die maximale Aktivität in der exponentiellen Wachstumsphase (OD 600 ~ 6 nach Wachstum auf Komplexmedium) erreicht wird und anschließend auf 12 % des Maximalwerts in der stationären Phase absinkt. Um eine mögliche Korrelation zu den Promotoraktivitäten zu erhalten, wurden diese ebenfalls wachstumsabhängig für die Gene acee und acef untersucht. Der Stamm zur Untersuchung des acee-promotors (C. glutamicum pet2-acee) trug ein 391 bp Fragment mit der Promotorregion des Gens auf dem Plasmid pet2 (Promotor-Testvektor mit cat-gen zur Messung der Chloramphenicol- Acetyltransferase-Aktivität). Der Stamm C. glutamicum pet2-acef wurde zur wachstumsabhängigen Bestimmung der acef-promotoraktivitäten herangezogen. Dieser trug ein 411 bp großes Fragment, das den Promotorbereich des Gens a- cef umfaßt. Rohextrakte wurden für diesen Versuch aus auf Komplexmedium gewachsenen Zellen hergestellt, wobei bis zur stationären Phase pro Stunde eine Probe (50 ml) genommen wurde. Beide Kulturen zeigten identisches Wachstum und die spezifischen CAT- Aktivitäten nahmen für beide Gene wachstumsabhängig bis zur späten exponentiellen Phase zu, wobei für acee ein Maximum von 0,54 U/mg Protein, für acef ein Maximum von 0,23 U/mg Protein erreicht wurde (Abbildung 11). In der stationären Phase nahm die acee-promotoraktivität leicht ab, die acef-promotoraktivität blieb auf dem gleichen Niveau. Die zu Beginn der Experimente gemessenen spezifischen CAT-Aktivitäten sind auf die Vorkulturen zurückzuführen, die noch nahezu die maximale Aktivität besaßen. Vergleichsweise waren die Promotoraktivitäten des acee-gens 2-fach erhöht gegenüber denen des acef-gens.

80 ERGEBNISSE ,6 OD ,5 0,4 0,3 0,2 0,1 spez. CAT- Aktivitäten [U/mg Protein] 0, Zeit [h] Wachstum C. glutamicum pet2-acee Wachstum C. glutamicum pet2-acef spez. CAT-Aktivität C. glutamicum pet2-acef spez. CAT-Aktivität C. glutamicum pet2-acee Abbildung 11: Spezifische CAT-Aktivitäten der Stämme C. glutamicum-pet2- acee und C. glutamicum pet2-acef im Wachstumsverlauf. Um die auf unterschiedlichen Kohlenstoffquellen gemessenen spezifischen PDHC-Aktivitäten in Korrelation zu den CAT-Promotoraktivitäten der Gene acee und acef setzen zu können, wurden die spezifischen CAT-Aktivitäten der Stämme C. glutamicum pet2-acee und C. glutamicum pet2-acef nach Wachstum auf verschiedenen Kohlenstoffquellen untersucht. Dazu wurden die beiden Stämme auf Komplexmedium (+/- Glukose) und Minimalmedium (Glukose, Acetat, Glukose-Acetat-Mischsubstrat) bis zur exponentiellen Wachstumsphase gezüchtet und die spezifischen CAT-Aktivitäten bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 zusammengestellt. Die höchsten CAT-Aktivitäten konnten auf Minimalmedium mit Glukose gemessen werden mit 0,87 U/mg Protein für acee, während für die Promotorregion des acef- Gens die höchste spezifische CAT-Aktivität auf Komplexmedium mit 0,45 U/mg Protein ermittelt wurde. Es konnte wiederum auf allen getesteten Kohlenstoffquellen für acef eine um etwa 50 % verringerte Promotoraktivität gemessen werden. Deutlich geringere Promotoraktivitäten wurden nach Wachstum auf Komplexmedium mit Glukose mit 0,39 U/mg Protein für das acee-gen und 0,16 U/mg Protein

81 ERGEBNISSE 68 Tabelle 10: Spezifische CAT-Aktivitäten der Stämme C. glutamicum pet2-acee und C. glutamicum pet2-acef auf unterschiedlichen Kohlenstoffquellen nach Wachstum bis zur exponentiellen Wachstumsphase. C-Quelle spez. CAT-Aktivität [U/mg Protein] des Stammes C. glutamicum pet2-acee spez. CAT-Aktivität [U/mg Protein] des Stammes C. glutamicum pet2-acef KM 0,76 0,45 KM + Glukose 0,39 0,16 MM + Glukose 0,87 0,44 MM + Acetat 0,44 0,22 MM + Glukose + Acetat 0,41 0,23 für das acef-gen detektiert. Auf Minimalmedium mit Mischsubstrat oder Acetat wurden im Vergleich zu den maximal ermittelten Promotoraktivitäten der Gene acee und acef um 50 % erniedrigte spezifische CAT-Aktivitäten bestimmt. 4.3 Transkriptionsstartpunkt-Bestimmung von acee Zur Bestimmung der 5 - Enden der RNAs der Gene acee und acef wurde die Methode der nicht-radioaktiven Primer-Extension -Analyse (PEX) gewählt. Die hierfür verwendete RNA wurde aus C. glutamicum Stämmen isoliert, die die jeweiligen Promotor-Testvektoren (pet2-acee bzw. pet2-acef) trugen. Die Reaktion wurde mit ungefähr 100 µg RNA durchgeführt. Für die Primer-Extension - Reaktion wurden zwei unterschiedliche IRD800-markierte Primer (CM4 und CM5) eingesetzt, deren Sequenz zur Vektorsequenz stromabwärts der MCS homolog ist (CM4: Basen 20-39, CM5: Basen 9-26). Diese Primer lagern sich an die RNA an und werden durch Einsatz der Reversen Transkriptase verlängert bis zum 5 - Ende der Template-RNA. Das Extensionsprodukt kann im Licor-Gel gemeinsam mit einer Sequenzreaktion, für die dieselben Primer verwendet wurden, aufgetrennt und ausgewertet werden. Bei Durchführung der PEX mit dem Primer CM4 wurden zwei Signale detektiert, wovon eines stark ausgeprägt war und 121 bp stromaufwärts des Startcodons ATG lag. Daraus konnte eine Sequenz für die Promotorregion abgeleitet werden,

82 ERGEBNISSE 69 die der 10-Region des lpd-gens (TATCCT) entspricht (Abbildung 12). Dieses Signal konnte mit dem zweiten Primer CM5 nicht bestätigt werden. Dagegen wurde das zweite, 54 bp stromaufwärts des ATG gelegene, Signal mit den Primern CM4 und CM5 erhalten (Abbildung 13). Für C. glutamicum konnte eine Konsensussequenz für die 10-Region mit der Basenabfolge TA(T/C)AAT festgelegt werden (Patek et al., 2003). Eine mögliche 10-Region für das acee-gen mit der Sequenz TATCCT (Abbildung 12) wurde bereits genannt und stimmt in 4 bp mit der Konsensussequenz überein. Die zweite mögliche 10-Region geht aus Abbildung 13 mit der Sequenz AAGAAT hervor. Diese Sequenz stimmt ebenfalls in 4 Basen mit der Konsensus-Sequenz für C. glutamicum überein. Ausgehend von diesen potentiellen 10-Regionen konnten außerdem verlängerte 10- und 35-Regionen abgeleitet werden. Für das in Abbildung 12 dargestellte Signal lautet die verlängerte 10-Region CGTATCCTTG, die 35-Region 17+/-1 bp stromaufwärts der 10-Region lautet GTAAAACA. Die Ableitung einer verlängerten 10-Region aus dem in Abbildung 13 gezeigten Signal ergab die Sequenz CCAAGAATGG, die Sequenz der 35-Region lautet GGCGTGTC. Untersuchungen zu corynebakteriellen Promotoren führten zu der Festlegung einer Konsensussequenz für die 35- Region mit der Sequenz TTGGCA (Patek, 1996). Weiterhin scheinen Guanine 2 bp stromaufwärts und stromabwärts der 10-Region eine wichtige Rolle bei der Promotorfunktion zu spielen (Vasicova et al., 1999). Beide potentiellen 10- Regionen besitzen ein Guanin 2 bp stromabwärts der 10-Region. Die Übereinstimmung mit der Konsensussequenz der -35-Region ist für beide potentiellen Signale sehr schwach.

83 ERGEBNISSE 70 A C G T codogener Strang C A A C G C A T A G G A A C A A T T A T T G A A T Abbildung 12: Transkriptionsstartbestimmung (Signal 1) des acee-gens mittels nicht-radioaktiver Primer-Extension -Analyse mit dem IRD800-markierten Primer CM4; die Reaktion wurde mit 100 µg RNA aus auf Minimalmedium mit Glukose (C. glutamicum pet2-acee) gewachsenen Zellen durchgeführt und zusammen mit einer Sequenzierreaktion auf einem Licor-Gel aufgetrennt.

84 ERGEBNISSE 71 A C G T codogener Strang G C T G G T T C T T A C C C T G G C C C T T T G G Abbildung 13: Transkriptionsstartbestimmung (Signal 2) des acee-gens mittels nicht-radioaktiver Primer-Extension -Analyse mit dem IRD800-markierten Primer CM4; die Reaktion wurde mit 100 µg RNA aus auf Minimalmedium mit Glukose (C. glutamicum pet2-acee) gewachsenen Zellen durchgeführt und zusammen mit einer Sequenzierreaktion auf einem Licor-Gel aufgetrennt.

85 ERGEBNISSE Transkriptionsstartpunkt-Bestimmung von acef Für das acef-gen wurden die Primer-Extension -Reaktionen wie bereits für acee beschrieben durchgeführt. Es wurde hierfür ein Stamm verwendet, der ebenfalls das Plasmid pet2-acef zur Überexpression der Promotorregion trug (C. glutamicum pet2-acef). Die Primer-Extension -Reaktionen wurden wiederum mit den Primern CM4 und CM5 durchgeführt. A C G T codogener Strang G T G G T G T A G T G T T T A A C T T A G C C A T Abbildung 14: Transkriptionsstartbestimmung des acef-gens mittels nichtradioaktiver Primer-Extension -Analyse mit dem IRD800-markierten Primer CM4; die Reaktion wurde mit 100 µg RNA aus auf Minimalmedium mit Glukose (C. glutamicum pet2-acef) gewachsenen Zellen durchgeführt und zusammen mit einer Sequenzierreaktion auf einem Licor-Gel aufgetrennt.

86 ERGEBNISSE 73 Es konnten bei der Durchführung mit beiden Primern übereinstimmende Signale detektiert werden (Abbildung 14), woraus sich eine 10-Region mit der Sequenz TTGAAT ableiten läßt, die in 4 Basen mit der für C. glutamicum festgelegten Konsensussequenz (TA(T/C)AAT) übereinstimmt. Die daraus resultierende verlängerte 10-Region besitzt die Sequenz AATTGAATCG und ein Guanin 2 bp stromabwärts der 10-Region. Für die 35-Region lautet die Sequenz GACCCGAA, die mit der Konsensussequenz wiederum nur sehr schwach konform geht. 5. Valin- und Pantothenatproduktion mit rekombinanten Stämmen 5.1 Konstruktion rekombinanter Stämme Aus früheren Arbeiten gab es verschiedene Hinweise darauf, dass die Enzyme des PEP-Pyruvat-Oxalacetat-Knotenpunkts und deren Veränderung in C. glutamicum einen bedeutenden Einfluss auf die Produktion verschiedener Aminosäuren haben. So konnte durch Überexpression des Pyruvat-Carboxylase-Gens (pyc- Gen) eine Zunahme der Produktion der Aminosäuren Lysin, Glutamat und Threonin nachgewiesen werden, wohingegen die Deletion zu einer Abnahme der Produktion führte (Peters-Wendisch et al., 2001). Um den Einfluss der Enzyme, die an der Bildung der Vorstufen PEP, Pyruvat und Oxalacetat beteiligt sind, zu untersuchen, wurden teils bereits vorhandene Konstrukte zur Überexpression und Deletion bestimmter Gene eingesetzt. Als Grundlage für diese Versuche wurden zwei Ausgangsstämme gewählt, die durch Deletion von drei Genen des Valin-Pantothenat-Biosynthesewegs bereits eine erhöhte Valinproduktion im Vergleich zum Wildtyp von C. glutamicum aufwiesen. Diese Stämme werden nachfolgend als Val1 (C. glutamicum ilva) und Val2 (13032 ilva panbc) bezeichnet. Das Gen ilva codiert für eine Threonin- Dehydratase, die aus Threonin Oxobutyrat und Pyruvat bildet, das anschließend in mehreren Schritten zu Isoleucin umgesetzt wird. Dieselben Enzyme, die an der Isoleucinbiosynthese beteiligt sind, sind auch für die Umsetzung von Pyruvat zu Valin zuständig. Ab einer Konzentration von 5 mm Isoleucin im Medium wird die Threonin-Dehydratase reprimiert und alle nachfolgenden Gene nicht mehr expri-

87 ERGEBNISSE 74 miert, was zu einer geringeren Valinausbeute führen würde (Morbach et al., 1995). Durch die Deletion des ersten Gens im Isoleucinbiosyntheseweg wird die Bildung von Isoleucin verhindert, wodurch die Hemmung der Expression der Gene des Isoleucin- und Valinbiosynthesewegs unterdrückt und somit eine höhere Valinsynthese bewirkt wird. Weiterhin steht ein Molekül Pyruvat mehr zur Valinproduktion zur Verfügung. Der Stamm Val1 diente vorwiegend zur Untersuchung des Einflusses auf die Pantothenatproduktion. Im zweiten Stamm sind zusätzlich zum ilva-gen noch die zwei Gene panb und panc des Pantothenatbiosynthesewegs deletiert. PanB kodiert für eine Ketopantoat-Hydroxymethyl-Transferase, die Ketoisovalerat, das während der Valinbiosynthese entsteht, zu Ketopantoat umsetzt. Das panc-gen kodiert für eine Pantothenat-Synthetase, die im letzten Schritt des Pantothenatbiosynthesewegs Pantothenat aus Pantoat und β-alanin synthetisiert. Durch die Deletion dieser Gene wird die Pantothenatbiosynthese unterbrochen, das anfallende Ketoisovalerat wird nicht aus dem Valinbiosyntheseweg abgezogen und die Valinproduktion kann gesteigert werden. Außerdem steht weniger bzw. gar kein CoA, das aus Pantothenat gebildet wird, für den PDHC zur Verfügung. Dieser Stamm wurde zur Untersuchung der Valinsynthese eingesetzt. Zur Überprüfung der Bedeutung verschiedener Enzyme des anaplerotischen Knotenpunkts auf den Einfluss der Valin- und Pantothenatbiosynthese wurden Konstrukte zur Überexpression des PEP-Carboxylase-Gens (pmfα-ppc), des Pyruvat- Carboxylase-Gens (pvwex1-pyc), des PEP-Carboxykinase-Gens (pek0-pck), des Pyruvat-Chinon-Oxidoreduktase-Gens (PXT-poxB-Ex) und des Lipoamid- Dehydrogenase-Gens (pek0-lpda), die bereits vorlagen, in die Stämme Val1 und Val2 transformiert. Da auch insbesondere der Pyruvat-Kinase eine besondere Bedeutung bei der Beeinflussung des Pyruvat-Pools zugeschrieben wurde, wurde das Pyruvat-Kinase-Gen (pyk-gen) in den Vektor pekex2 kloniert. Die Überprüfung der Stämme erfolgte durch die Isolierung und entsprechenden Restriktionsverdaus der Plasmide sowie durch Aktivitätstests der einzelnen Enzyme (Tabelle 11). Des weiteren wurde im Stamm Val1 das pyc-gen und im Stamm Val2 das pck-gen deletiert. Beide Stämme wurden mittels PCR auf ihre Richtigkeit kontrolliert. Aus Tabelle 11 geht hervor, dass alle Stämme höhere spezifische Aktivitäten aufwiesen und somit alle Konstrukte in den Valinstämmen funktionell waren.

88 ERGEBNISSE 75 Tabelle 11: Kontrolle der rekombinanten Stämme durch die Bestimmung der spezifischen Aktivitäten der PEP-Carboxylase (Val1/2-ppc), der PEP- Carboxykinase (Val1/2-pck), der Pyruvat-Carboxylase (Val1/2-pyc), der Pyruvat- Chinon-Oxidoreduktase (Val1/2-pox), der Pyruvat-Kinase (Val1/2-pyk) und der Dihydrolipoamid-Dehydrogenase (Val1/2-lpdA). C. glutamicum Stämme spez. Aktivität [U/ml] Val1 0,045 Val1-ppc 0,690 Val2 0,049 Val2-ppc 0,590 Val1 0,039 Val1-pck 0,830 Val2 0,065 Val2-pck 1,010 Val1 1,980 Val1-pyc 6,600 Val2 1,690 Val2-pyc 5,590 Val1 0,037 Val1-pox 0,066 Val2 0,035 Val2-pox 0,046 Val1 0,570 Val1-pyk 1,600 Val2 0,64 Val2-pyk 2,30 Val1 0,11 Val1-lpdA 2,50 Val2 0,25 Val2-lpdA 1,08

89 ERGEBNISSE 76 Im Stamm Val2, der das Plasmid pek0-lpda zur Überexpression des Lipoamid- Dehydrogenase-Gens trägt, wurden zusätzlich die spezifischen PDHC-Aktivitäten ermittelt. Aus einer früheren Arbeit (J. Schwinde, Doktorarbeit) war bekannt, dass bei Überexpression dieses Gens sowohl die PDHC- als auch die OGDHC-Aktivität um etwa 50 % erniedrigt war. Da der PDHC durch seine Funktion zur oxidativen Decarboxylierung von Pyruvat eine bedeutende Rolle im PEP-Pyruvat-Oxalacetat-Knotenpunkt und zur Vorstufenbereitstellung von Pyruvat spielt, könnte durch die Erniedrigung der PDHC ein Einfluss auf die Valinsynthese erwirkt werden. Die Bestimmung der PDHC-Aktivitäten in den Stämmen Val1 und Val2 zeigten bei Überexpression des lpda-gens eine bis zu 20-fach geringere spezifische Aktivität im Vergleich zu den jeweiligen Ausgangstämmen. 5.2 Optimierung der Fermentationsbedingungen Um die für die Valinsynthese geeigneten Fermentationsbedingungen einzustellen, wurde der Einfluss der extern zugesetzten Parameter Isoleucin, Biotin und Pantothenat auf die Valinbildung untersucht. Die Kultivierung der Stämme Val1 und Val2 erfolgte hierfür in CgC-Medium mit 4% Glukose. Isoleucin gehört zu den verzweigtkettigen Aminosäuren, die häufig an der Regulation von Stoffwechselenzymen durch Rückhemmungs-Mechanismen beteiligt sind (Morbach et al., 1995; Eggeling et al., 1987). Es wurde daher untersucht, ob eine Modifikation der Isoleucinkonzentration im Bereich von 0,25 bis 1,0 mm Isoleucin Auswirkungen auf das Wachstumsverhalten oder die Valinbildung, z. B. durch Beeinflussung eines oder mehrerer zur Valinproduktion benötigter Synthese-Enzyme, hat. Bei variierenden Isoleucinkonzentration im Fermentationsexperiment war die Biotinkonzentration standardmäßig 0,2 mg/l. Da C. glutamicum nicht zur Biotin-Synthese fähig ist und zwei Biotin-abhängige Enzyme (Pyruvat-Carboxylase und Acetyl-CoA Carboxylase) besitzt (Jäger et al., 1996; Peters-Wendisch et al., 1997), die möglicherweise bei Variierung der Biotinkonzentration einen Einfluss auf die Valinproduktion haben, wurden Biotinkonzentrationen im Bereich von 0,1 bis 0,4 mg/l in die Fermentationsexperimente eingesetzt und die Valinbildung untersucht. Bei variierenden Biotinkonzentrationen wurde 1 mm Isoleucin eingesetzt.

90 ERGEBNISSE 77 Es wurden Wachstumskurven aufgenommen und die Valinwerte aus Überständen von Kulturen nach 48 h mittels HPLC bestimmt. Da sich die Stämme Val1 und Val2 bezüglich des Wachstumsverhaltens bei verschiedenen Isoleucinkonzentrationen nicht unterschiedlich verhielten, ist in Abbildung 15 exemplarisch das Wachstumsverhalten für den Stamm Val2 dargestellt. Aus dieser Abbildung geht hervor, dass eine Reduktion der Isoleucinkonzentration von 1,0 mm, die standardmäßig eingesetzt wurden, auf bis zu 0,25 mm keine negativen Effekte auf das Wachstum zeigte. Aus Abbildung 16 wird das Wachstumsverhalten der Stämme Val1 und Val2 bei variierenden Biotinkonzentrationen ersichtlich. Veränderte Konzentrationen an Biotin führten, wie aus der Abbildung 16 hervorgeht, zu keinen limitierenden bzw. verbesserten Wachstumsbedingungen. Die End-OD-Werte des Stammes Val2 sind durchgehend höher, was auch bei weiteren Versuchen bestätigt werden konnte OD , Zeit [h] Val2 1.0 Val Val2 0.5 Val Abbildung 15: Wachstum des Stammes Val2 bei Isoleucinkonzentrationen im Bereich von 0,25-1,0 mm.

91 ERGEBNISSE OD , Zeit [h] Val1 0.2 Val1 0.1 Val1 0.4 Val2 0.2 Val2 0.1 Val2 0.4 Abbildung 16: Wachstum der Stämme Val1 und Val2 bei Biotinkonzentrationen im Bereich von 0,1-0,4 mg/l. Tabelle 12 zeigt die ermittelten Valinwerte nach 48 h. Die Werte in Tabelle 12 zeigen keine signifikanten Veränderungen der Valinproduktion bei variierenden Isoleucinkonzentrationen. Daher wurde in allen folgenden Experimenten eine Isoleucinkonzentration von 1 mm gewählt. Für den Stamm Val1 bzw. Val2 konnte bei Wachstum auf 0,4 mg Biotin/l eine um 25 % bzw. 30 % verringerte Valinkonzentration vergleichsweise zum Wachstum auf 0,1 mg Biotin/l gezeigt werden. Daher wurden nachfolgende Versuche mit einer Biotinkonzentration von 0,1 mg/l durchgeführt.

92 ERGEBNISSE 79 Tabelle 12: Valinbildung nach Wachstum auf unterschiedlichen Isoleucin- bzw. Biotinkonzentrationen Stamm c [mm] nach 48 h Val1 mit 1,0 mm Isoleucin 8,72 Val1 mit 0,75 mm Isoleucin 9,07 Val1 mit 0,5 mm Isoleucin 8,49 Val1 mit 0,25 mm Isoleucin 8,7 Val2 mit 1,0 mm Isoleucin 8,83 Val2 mit 0,75 mm Isoleucin 8,99 Val2 mit 0,5 mm Isoleucin 8,21 Val2 mit 0,25 mm Isoleucin 7,62 Val1 mit 0,1 mg/l Biotin 8,97 Val1 mit 0,4 mg/l Biotin 6,86 Val2 mit 0,1 mg/l Biotin 8,93 Val2 mit 0,4 mg/l Biotin 6,31 Weiterhin wurden Fermentationsversuche zur Untersuchung des Wachstumsverhaltens und der Valinproduktion bei unterschiedlichen Pantothenatkonzentrationen durchgeführt. Hierfür wurde wiederum CgC-Medium mit 4% Glukose verwendet, dem 0,1 mg Biotin/l und 1 mm Isoleucin zugesetzt wurden. Die eingesetzten Pantothenatkonzentrationen variierten im Bereich von 0,1-5 µm. Eine Limitierung des Wachstums konnte dabei nicht festgestellt werden, die ermittelten Valinwerte sind in Tabelle 13 zusammenfassend dargestellt. Daraus geht hervor, dass bei steigender Pantothenatkonzentration die Konzentration an Valin abnimmt. Bei erhöhter Pantothenatkonzentration kann mehr CoA, das aus Pantothenat synthetisiert wird, gebildet werden. Dadurch steht mehr CoA für die PDHC zur Verfügung, wodurch möglicherweise mehr Pyruvat zu Acetyl-CoA oxidiert wird und daher ein verringerter Pyruvat-Pool zur Valinbildung vorhanden ist. Bei weniger Pantothe-

93 ERGEBNISSE 80 Tabelle 13: Ermittelte Valinwerte nach 24 und 48 h bei Wachstum auf unterschiedlichen Pantothenatkonzentrationen. Pantothenatkonzentration [mm] c [Valin] in mm nach 24 h c [Valin] in mm nach 48 h 0,0001 9,790 9,830 0, ,34 10,47 0,0007 8,400 8,570 0,0010 8,690 8,750 0,0020 5,640 5,700 0,0050 4,420 4,480 nat im Medium würde man daher eine gesteigerte Produktion an Valin erwarten, da weniger Pyruvat zu Acetyl-CoA oxidiert wird und somit ein höherer Pyruvat- Pool zur Valinbildung bereitsteht. 5.3 Valinsekretion rekombinanter C. glutamicum-stämme Um die rekombinanten Stämme hinsichtlich ihrer Produktion von Valin zu untersuchen, wurden diese auf CgC-Medium mit den unter 5.2 vorgestellten Bedingungen auf 4 % Glukose in einer 50 ml batch -Kultur für 48 h fermentiert. Nach 48 h wurden Proben zur Analyse von Valin mittels HPLC entnommen. Aus Abbildung 17 gehen die für die Ausgangs- und rekombinanten Stämme aus mehreren unabhängigen Fermentationen ermittelten Werte hervor. Wachstumsversuche zeigten dasselbe Wachstumsverhalten für alle untersuchten Stämme. Durch die zusätzlichen Deletionen in den Genen panbc ist die gebildete Menge an Valin im Stamm Val2 mit 9 mm um 22 % höher als in Stamm Val1 (7,01 mm). Die Überexpression der Gene ppc, pyc und pck in den Stämmen Val1 und Val2 hatten keinen Einfluss auf die Valinproduktion. Der Stamm Val1 zeigte bei Überexpression des pyk-gens eine um 100 % erhöhte Valinkonzentration (14,58 mm gegenüber 7,01 mm beim Ausgangsstamm). Dies konnte bei Überexpression dieses Gens im Stamm Val2 nicht bestätigt werden. Die Überexpression des pqo- Gens im Stamm Val1 führte bei allen durchgeführten Fermentationen zu einer Verminderung der Valinmenge um bis zu 53 % (3,03 mm), während im Stamm

94 ERGEBNISSE Valin [mm] Val1 Val1-ppc Val1-pyc Val1-pck Val1-pyk Val1-pqo Val1-lpdA Val1 delta pyc Valin [mm] Val2 Val2-ppc Val2-pyc Val2-pck Val2-pyk Val2-pqo Val2-lpdA Val2 delta pck Abbildung 17: Valinbildung der Stämme Val1 und Val2 in mm nach 48 h bei Ü- berexpression der Gene ppc, pck, pyc, pqo, pyk und lpda, sowie bei Deletion von pyc und pck.

95 ERGEBNISSE 82 Val2 die Reduktion des Valinertrages mit 23% (6,9 mm gegenüber 8,93 mm im Stamm Val2) deutlich geringer ausfiel. In den Stämmen Val1 und Val2 wurde nach Überexpression des lpda-gens kein verändertes Verhalten in der Valinproduktion detektiert. Weiterhin konnte bei Deletion des pyc-gens in Val1 eine um 56 % erhöhte Valinkonzentration (12,4 mm) nach 48 h Fermentation gemessen werden, während die Deletion in Val2 zu keiner Veränderung führte. Das Wachstumsverhalten aller rekombinanter Stämme entsprach dem der Kontrollstämme. 5.4 Pantothenatsekretion rekombinanter C. glutamicum-stämme Zur Untersuchung der Pantothenatproduktion von C. glutamicum wurden die im Stamm Val1 hergestellten rekombinanten Stämme herangezogen. Diese wurden in einer batch -Kultur auf CgC-Medium mit 4 % Glukose fermentiert. Hierbei war es nötig, die Kulturen mit 20 mm β-alanin, das zur Herstellung von Pantothenat notwendig ist, zu supplementieren. Generell wird Pantothenat aus 4,5 4 y = 0,0385x 3,5 3 OD 600 2,5 2 1,5 1 0, D-Pantothenat [ng/ml] Abbildung 18: Kalibriergerade im Bereich von ng Pantothenat/ml zur Ermittlung der Pantothenatkonzentration aus Kulturüberständen.

96 ERGEBNISSE 83 einem Molekül Pyruvat und einem Molekül Oxalacetat, aus dem β-alanin gebildet wird, synthetisiert. Das System zur Bestimmung von Pantothenat basiert auf einem biologischen Testsystem mit einer im panc-gen nicht mehr funktionstüchtigen Integrationsmutante (Sahm und Eggeling, 1999). Um die gebildeten Mengen Pantothenat zu bestimmen, war die Erstellung einer Kalibriergerade im Bereich von ng Pantothenat/ml notwendig (Abbildung 18). Anhand der abgebildeten Kalibriergeraden wurden nun alle rekombinanten Stämme untersucht. Dazu wurden nach 24 und 48 h Proben entnommenen und diese in geeigneter Verdünnung und sterilfiltriert in das biologische Testsystem eingesetzt. Die Messung der optischen Dichte erfolgte nach 48 h. In Abbildung 19 ist nur die Pantothenatproduktion der Stämme dargestellt, bei denen durch Überexpression bestimmter Gene eine Pantothenatbil Pantothenat [mg/l] Val1 Val1- ppc Val1- pck Val1- pqo Val1-pJC1 ilvbncd Val1-pECM3 ilvbncd Abbildung 19: Pantothenatproduktion in rekombinanten Stämmen nach 48 h Fermentation in CgC-Medium mit 4 % Glukose; die Konzentrationen sind in mg Pantothenat/l angegeben.

97 ERGEBNISSE 84 dung erwirkt werden konnte. Generell untersucht wurden die Effekte der Überexpression der Gene ppc, pyc, pck, pyk und lpda im Stamm Val1 sowie der Effekt Bei Deletion des pyc-gens. Als Positivkontrolle dienten die Stämme C. glutamicum ilva pjc1ilvbcnd und C. glutamicum ilva pecm3ilvbcnd, die Plasmide zur Überexpression der Gene ilvbncd des Valin-Pantothenat-Biosynthese-Wegs tragen und sich in der Resistenz der Plasmide unterscheiden. Als direkter Kontrollstamm diente der Stamm Val1. Aus Abbildung 19 geht hervor, dass drei der getesteten rekombinanten Stämme eine gesteigerte Pantothenatproduktion aufwiesen. Der Ausgangsstamm Val1 bildete nach 48 h Fermentation kein Pantothenat. Wie sich herausstellte lag die Produktion nach 96 h Fermentation bei 0,7 mg Pantothenat/l. Die Positivkontrollstämme bildeten beide Pantothenat zwischen 50 und 55 mg/l. Eine Pantothenatbildung durch gesteigerte spezifische Aktivitäten von Enzymen des Pyruvat- Oxalacetat-Knotenpunkts konnte bei Überexpression der Gene ppc (9,8 mg/l), pck (11,4 mg/l) und pqo (15,98 mg/l) erzielt werden. Die Überexpression der Gene pyk und lpd, sowie die Deletion des pyc-gens hatten keinen Einfluss auf die Produktion von Pantothenat. 6. Valinproduktion und Wachstumsverhalten von Deletionsmutanten im Gen acee Der PDHC spielt eine bedeutende Rolle in der Pyruvatbereitstellung. Es konnte bereits gezeigt werden, dass eine durch zufällige Mutagenese hergestellte Mutante mit geringerer Pyruvat-Dehydrogenase-Aktivität eine gesteigerte Lysinproduktion aufwies (Shiio et al., 1984). Des weiteren konnte von M. Schreiner ein Konstrukt zur Deletion des acee-gens hergestellt und dieses Gen im C. glutamicum Wildtyp deletiert werden. Dabei stellt sich heraus, dass die Deletion von acee in C. glutamicum zu einem vollständigen Verlust der PDHC-Aktivität führte und dieser Stamm nicht mehr in der Lage war, auf Glukose als alleiniger Kohlenstoffquelle zu wachsen (M. Schreiner, persönliche Mitteilung). Da die PDHC einen für die Pyruvatbereitstellung möglicherweise bedeutenden Schritt katalysiert, sollte das acee- Gen in bereits Valin-ausscheidenden Stämmen deletiert werden. Als Ausgangs-

98 ERGEBNISSE 85 stämme zur Untersuchung der Valinproduktion wurden hierfür die Stämme Val2, C. glutamicum ilvn/m13 und C. glutamicum panb ilvn/m13 gewählt. Das Gen ilvn kodiert in C. glutamicum für eine Acetohydroxy-Säure-Synthase, die durch die verzweigtkettigen Aminosäuren Leucin, Isoleucin und Valin gehemmt wird (Morbach et al., 2000). Da eine Feedback-Hemmung der Enzyme bzw. Gene des Valinbiosynthesewegs sich negativ auf die Valinproduktion auswirken würde, wurde der Stamm C. glutamicum ilvn/m13 konstruiert, der im Promotorbereich durch PCR mutagenisiert wurde und auf die Feedback-Hemmung durch die verzweigtkettigen AS nicht mehr reagiert (V. Elisakova, persönliche Mitteilung). Die Kontrolle dieser Stämme erfolgte sowohl durch PCR als auch durch Southern-Blot -Experimente (Abbildung 20) und Enzymtests. 6.1 Nachweise der Deletion des acee-gens im Chromosom von C. glutamicum Zur Kontrolle aller im Gen acee deletierten Stämme wurde chromosomale DNA von diesen wie auch den Referenzstämmen Val2, C. glutamicum ilvn/m13 und C. glutamicum panb ilvn/m13 isoliert, mit SalI verdaut und die DNA über Nacht auf einem 0,8 %-igen Agarosegel aufgetrennt. Nachdem die DNA auf eine Membran transferiert wurde, erfolgte die Hybridisierung mit einer Digoxigenin-markierten 580 bp großen Sonde. Diese wurde über PCR mit den Primern acee1 und acee3 hergestellt und umfasste einen sowohl im C. glutamicum Wildtyp als auch in den Stämmen mit deletierten acee-gen vorhandenen Bereich. Für die Stämme mit deletiertem acee-gen wurde ein um 2077 bp verkürztes Fragment erwartet. Das Ergebnis des Southern-Blots ist in Abbildung 20 dargestellt. Das erwartete Wiltypfragment wies eine Größe von 8270 bp auf, während für die Deletionsmutanten mit 6193 bp das acee-gen erwartungsgemäß um 2077 bp verkürzt war.

99 ERGEBNISSE ,2 kb 6,2 kb Abbildung 20: Southern-Blot -Analyse mit chromosomaler DNA von C. glutamicum-stämmen mit deletiertem acee-gen; als Kontrolle dienten die jeweiligen Ausgangsstämme. In den Spuren 1+2 ist die DNA der Stämme C. glutamicum ilva panbc und ilva panbc acee aufgetragen, in den Spuren 3+4 die der Stämme ilvn/m13 und ilvn/m13 acee und in den Spuren 5+6 die der Stämme ilva panb ilvn/m13 und ilva panb ilvn/m13 acee. 6.2 Pyruvat-Dehydrogenase- und Pyruvat-Decarboxylase-Aktivität in C. glutamicum Stämmen mit deletiertem acee-gen Im Wildtyp konnte bereits gezeigt werden, dass die Deletion des acee-gens zu einem vollständigen Verlust der PDHC- und PDC-Aktivität führt (M. Schreiner, persönliche Mitteilung). Dies sollte nun in allen zur Untersuchung der Valinproduktion hergestellten Stämmen untersucht werden, wobei der Wildtyp als Kontrolle diente. Dazu wurden Zellen auf Komplexmedium gezüchtet, in der exponentiellen Wachstumsphase geerntet und nach Aufschluss im RiboLyser auf Aktivität untersucht. Die erhaltenen Werte sind in Tabelle 14 dargestellt.