DNA Computing. von. Sandy Ebeling Sebastian Lampka. Seminar 2001 Institut Wissenschaftliches Rechnen TU Braunschweig

Transkript

1 DNA Computing von Sandy Ebeling Sebastian Lampka Seminar 2001 Institut Wissenschaftliches Rechnen TU Braunschweig

2 Inhaltverzeichnis 1. Einleitung 3 2. Historische Entwicklung 4 3. Biologische Grundlagen Einführung DNA als Informationsspeicher des DNA-Computing Operationen eines DNA-Computers 7 4. Hamiltonsches Pfadproblem Einführung Lösen des HPP mit Hilfe von kombinatorischem DNA-Computing Allgemeiner Algorithmus Umsetzung des Algorithmus mit DNA-Sequenzen Lösen des HPP mit Hilfe von self-assembly DNA Einführung Algorithmus zum Lösen des HPP Vergleich der Algorithmen DNA Rechenmodelle Das beschränkte Modell Das unbeschränkte Modell Das Generator Modell Das Surface Modell Ausblick und Bewertung des DNA-Computing Literaturverzeichnis 24 Institut für wissenschaftliches Rechnen - 2 -

3 1. Einleitung In den letzten Jahrzehnten hat die Entwicklung der Computer und derer Leistungsfähigkeit extrem zugenommen, die jedoch in den kommenden Jahren stagnieren wird. Sogennante unkonventionelle Computersysteme können hier Abhilfe verschaffen. Zu diesem Themenkomplex hat das Institut Wissenschaftliches Rechnen an der Technischen Universität Braunschweig im Rahmen eines Seminars verschiedene Themen vergeben. Diese Ausarbeitung zum Thema DNA-Computing ist im Rahmen eines Seminars am Institut für Wissenschaftliches Rechnen an der Technischen Universität Braunschweig entstanden. Nach einem kurzen geschichtlichen Umriss dieser neuen Technik, die durch Leonard M. Adleman begründet wurde, werden die notwendigen Biologischen Grundlagen vermittelt, die für das Verständnid des DNA-Computing grundlegend sind. Im Hauptteil dieser Ausarbeitung wird die Arbeitsweise eines DNA-Computers anhand zweier Beispiele erläutert. Im Abschluß daran werden die vorgestellten Methoden mit heutigen Computersystemen verglichen und in einem Ausblick die Möglichkeiten sowie die Grenzen des DNA-Computing aufgezeigt. Institut für wissenschaftliches Rechnen - 3 -

4 2. Historische Entwicklung Im Jahre 1993 ließ sich Leonard M. Adleman, bekannt als Mitbegründer des Publik-Key- Kryptosystems RSA, von Nickolas Chelyapov die Grundkenntnisse der Molekularbiologie beibringen. Diese brauchte er für seine Forschungen über AIDS, die ihm jedoch nicht zum erhofften Erfolg verhalfen. Doch seine Bemühungen sollten noch belohnt werden. In einem Grundstudium der Molekularbiologie eignete sich Adleman mit Hilfe des klassischen Buches Molekular Biology of the Gene, das unter anderem von James D. Watson verfaßt wurde, der zusammen mit Francis H.C. Crick 1953 die Doppelhelixstruktur der DNA postuliert hat [Plicht99], nötiges biologisches Grundwissen an. Durch das erlangte Wissen wurde Adleman klar, daß der DNA vergleichbar mit einem biologischen Datenträger ist. Dazu lernte Adleman die DNA-Polymerase (siehe Biologische Grundlagen, Seite 4) kennen, die aus einem einzelnen DNA-Strang einen komplementären DNA-Strang erzeugt und die beiden zu einer DNA-Doppelhelix zusammenführt. Aus diesen beiden Erkenntnissen schloß Adleman die Möglichkeiten des DNA-Computing. Seine theoretischen Überlegungen hat er durch die Lösung des Hamiltonian Path Problem praktisch bestätigt (siehe Lösen des HPP mit Hilfe des DNA-Computing, Seite xx) hat er seine Arbeit schriftlich in Molecular Computation of Solutions to Combinatorial Problems publiziert. In den folgenden Jahren haben sich viele Forscher dem DNA-Computing gewidmet. Daraus entstanden viele Modelle, die Adlemans Arbeit formalisieren und das DNA-Computing universell einsetzbar machen. Institut für wissenschaftliches Rechnen - 4 -

5 3. Biologische Grundlagen 3.1 Einführung Jeder Computer, sei er mechanisch, elektrisch oder biologisch, besteht aus - einem Informationsspeicher und - einer Menge von Operationen, die diesen Speicher manipulieren. 3.2 DNA als Informationsspeicher des DNA-Computing Die von Avery 1944 entdeckte DNA (desoxyribonucleic acid) ist der Grundbaustein der Natur. Sie befindet sich in jeder Zelle von Organismen, egal ob Pflanze, Tier, oder ähnliches. In ihr sind die Erbinformationen enthalten bzw. codiert. Diese Erbinformationen bestehen aus einer Aneinanderkettung von Nukleotiden. Ein Nukleotid ist immer zusammengesetzt aus Zucker (desoxyribose), Phosphorsäure (am C 5 Atoms des Zuckers) einer Base (am C 1 Atoms des Zuckers) (siehe nebenstehende Abbildung 1). Die bei der DNA vorkommenden Basen sind die Purinbasen Adenin und Guanin und die Pymiridinbasen Thymin und Cytosin (abgekürzt als A, T, G, C). Abb. 1: Atom-Schema eines Nukleotids Die Phosphatgruppe eines Nukleotids ist darin mit dem C 3 Atoms des nächsten Desoxyribosemoleküls verknüpft. So ergibt sich ein Einzelstrang einer bestimmten Richtung. Seine Enden werden nach den freien Gruppen der Desoxyribose benannt: Am 3 -Ende liegt eine freie Hydroxylgruppe, am 5 -Ende eine freie Phospatgruppe. Die DNA besteht aus zwei gleichlangen Polynukleotid- Einzelsträngen, die umeinander gedreht sind und einen, durch die Basen verbundenen, strickleiterartigen Doppelstrang bilden. Die Polynukleotid-Einzelstänge werden dabei als Rückgrat der DNA bezeichnet. Dieses Model wurde 1953 von Watson und Crick entwickelt und wird als α-doppelhelix-struktur bezeichnet. In Abb. 2: Schema der Bestandteile dieser Struktur bilden 10 Nukleotidpaare eine Drehung. Die Basen zeigen ins Innere der Doppelhelix und ordnen sich gegenüber immer so an, dass sie räumlich passen und sie Wasserstoffbrücken optimaler Länge und höchstmöglichster Zahl bilden (Abbildung 3). Aufgrund dieser Eigenschaften liegen immer Adenin und Thymin bzw. Guanin und Cytosin einander gegenüber, Adenin und Thymin bzw. Guanin und Cytosin sind komplementäre Basenpaare, d.h. sie ziehen sich aufgrund ihrer Ladungsverteilung gegenseitig an und können nur dann eine Bindung eingehen, wenn die beiden DNA- Einzelstränge entgegengesetzt gerichtet sind, d.h. der eine von 3 nach 5, der andere von 5 nach 3 läuft. Adenin und Thymin bilden dabei 2 Wasserstoffbrückenbindungen und Guanin und Cytosin bilden 3 Wasserstoffbrückenbindungen (siehe nebenstehende Abbildung 3). Abb. 3: Kombination der Basen Institut für wissenschaftliches Rechnen - 5 -

6 Die DNA erfüllt nach diesem Modell alle Forderungen, die an einen Informationsträger gestellt werden. Um Informationen zu kodieren ist mindestens 1 Zeichen nötig. Bei den heutigen Rechnern (von Neumann Architektur) wird z.b. ein Code (Zeichenkette) aus 2 Zeichen (0, 1) verwendet, das Buchstabenalphabet hingegen verwendet 26 Zeichen. In der DNA wird die (Erb-) Information durch 4 verschiedene Zeichen, die Basen kodiert. Die Basenabfolge (Basen-oder Nukleotidsequenz) innerhalb eines Einzelstrangs, verschlüsselt die (Erb-) Information wie Buchstaben hintereinander, die die Information von Wörtern ergeben. Mathematisch gesehen würde dies einem Alphabet X = {A, T, G, C} entsprechen, welches die doppelte Anzahl von Elementen gegenüber einem Alphabet X = {0, 1} eines herkömmlichen Computers wäre. Die Länge der aneinandergeketteten Nukletide ist dabei als unendlich zubetrachten. Die DNA eines Menschen z.b. ist ca. 1,8 2 Meter lang und besitzt 6 Milliarden Basenpaare. Dies entspricht etwa der Information von 500 verschiedenen Büchern mit 1500 Seiten. Institut für wissenschaftliches Rechnen - 6 -

7 3.3 Operationen eines DNA-Computers Um einen DNA-Computer funktionsfähig zu machen, müssen Operationen existieren, die auf dem Informationsspeicher (DNA) operieren. Im folgenden werden die wichtigsten Operationen vorgestellt, sowie deren Arbeitsweise erläutert. Amplifiying (Replikation) Annealing (Hybridization) Melting (Denaturation) Synthesizing Kopieren bzw. Verdoppeln eines DNA-Doppelhelix-Stranges, mit Hilfe der Polymerase Chain Reaktion (PCR). Bei der PCR wird die DNA zuerst entschraubt und dann durch das Enzym Helicase in ihre Einzelstänge aufgetrennt. Proteine heften sich an die freien Basen, damit sie sich nicht wieder eine Verbindung eingehen. Das Enzym DNA-Polymerase läuft dann entlang der Einzelstränge und verbindet freie Nukleotide mit dem Original - Einzelstrang. Die Polymerase lagert nur solche Nukleotide an, die zu denen des Originalstranges komplementär sind. Daher ergibt sich in dem neuen Dopplestrang dieselbe Basensequenz wie im ursprünglichen. Bei dem Anlagern der neuen Nukleotide, bildet sich durch Anziehungskräfte auf bereits replizierte DNA-Sequenzen eine 3-dimensionale Struktur. Da die beiden DNA-Doppelhelice jetzt aus einem neuen und einem alten Strang bestehen, werden die neuen DNA-Doppelhelix semikonservativ genannt. Die DNA-Polymerase kann die DNA allerdings nur in der 5 nach 3 Richtung replizieren. Die Polymerase-Ketten-Reaktion läuft nur dann, wenn dem zu kopierenden Strang eine kurze doppelsträngige DNA-Sequenz, die sogenannte Primer-Sequenz ( Starter ) vorausgeht, welche man auch künstlich, durch Erhitzen der Lösung, an bestimmte Positionen anlagern kann. Man beachte, daß der PCR-Kopiervorgang in der Regel nicht fehlerfrei verläuft. Die Kopiergenauigkeit liegt etwa bei einem Fehler pro 10 9 Nukleotiden, das wäre mindestens ein Fehler pro Replikation einer menschlichen DNA. Verbinden zweier einzelnen, komplementären DNA-Sequenzen (kleinere, ein-bis dreistellige DNA-Sequenzen werden auch Oligonukleotide gennant) durch Abkühlung der Lösung, in der sich die Sequenzen befinden. Trennen einer DNA-Doppelhelix in zwei einzelne, komplementäre DNA-Sequenzen durch Erhitzen der Lösung, in der sich Doppelhelix befindet. Ein gewünschten Strang bestimmter Länge synthetisieren. In der festphasigen DNA-Standardsynthese wird ein gewünschtes DNA- Molekül mit Hilfe einer sequentiellen Koppelung von Nukleotiden aufgebaut. Z.B. das erste Nukleotid (Monomere), A, befindet sich in einer Lösung, der eine zweite Lösung, die C enthält, hinzugegeben wird. A reagiert nun mit C, um einen Zweinukleotid (2-mer) zu bilden. Nachdem aus der Lösung überflüssiges C gefiltert wurde, kann man die Prozedur beliebig oft wiederholen um eine Kette 3-mer, 4-mer usw. zu erzeugen. Institut für wissenschaftliches Rechnen - 7 -

8 Mixing Separating Extracting Cutting Ligating Substituting Marking Verschiedene Lösungen mit DNA zusammenbringen, um eine Kombination der DNA zu errreichen. Trennen der DNA-Sequenzen der Länge nach. Hierbei verwendet man eine Technik genannt Geleletrophorese. Die Moleküle werden an den Anfang eines Gel gesetzt, an dem ein elektrisches Feld angelegt wird. Größere Moleküle wandern langsamer auf dem Gel. Nach einiger Zeit haben sich die Moleküle der Länge nach auf dem Gel verteilt bzw. sind der Länge nach sortiert. Filtern der Stränge, die ein bestimmtes Schema, zu vergleichen mit einer Teilkette, enthalten. Dies wird mit einer Affinitätsklärung erreicht. Dieser Prozess wird mit Hilfe von bestimmten magnetischen Kugeln erreicht. Die Stränge, die die bestimmte Teilkette enthalten, haften sich an die Kugeln und werden so später mit einem Gel herausgefiltert. Durchtrennen eines DNA-Doppelstranges an einer bestimmten Position mit Restriktionsenzymen. Restiktionsenzyme sind DNA spaltendende Nukleasen, die je nach Enzym auf bestimmte Positionen der DNA reagieren und sie dort trennen. Die DNA wird dabei entweder glatt oder versetzt durchtrennt. Eine versetzt getrennte DNA besitzt Einstrangenden, die sehr leicht mit anderen Enden reagieren. Diese Enden werden desshalb sticky ends ( klebrige Enden ) genannt. Eine glatt durchtrennte DNA besitzt nur blunt ends ( stumpfe Enden ). Zusammenfügen zweier kompatibler DNA-Stränge mit sticky ends durch DNA-Ligase Enzyme. Zu vergleichen ist dies mit einer Konkatenation von Zeichenketten. Ändern, Einfügen oder Löschen von DNA-Sequenzen durch genau gekennzeichnete, gezielte Veränderung von Nukleotiden und Einsatz der PCR. Dieses Verfahren ist eine Änderung der PCR, in dem die DNA-Sequenz durch induzierte Veränderung der Primer-Sequenz modifiziert wird. Die Primer-Sequenz kann so verändert werden, dass sie komplementär zu einer bestimmten Vorlage ist. Die PCR arbeitet dann erst ab dem veränderten Primer. Komplementäre Nukleotide werden mit einem DNA-Einzelstrang durch Hybridization verbunden, um einen Doppelstrang herzustellen. Nur die markierte Stelle ist doppelsträngig, der Rest bleibt einzelsträngig. Die umgekehrte Operation wäre Unmarking, wobei hier eine bestimmte Doppelstrangkette zu einem Einzelstrang durch Denaturing gemacht wird. Institut für wissenschaftliches Rechnen - 8 -

9 Destroying Detecting / Reading Auflösen von markierten Strängen durch Exonuclease Enzyme oder durch Cutting der markierten Stränge mit Restriktionsenzymen und herausfiltern der intakten Stränge durch Gelelektrophyse. Detecting ergibt eine positive Probe, falls sich in einer gegebenen Lösung ein DNA-Strang befindet, andernfalls gibt es ein negatives Ergebnis. PCR kann verwendet werden, um das Resultat zu verstärken und dann wird ein Prozeß names sequencing verwendet, um die Lösung wirklich zu lesen. Die Grundidee von allgemein verwendetem sequencing ist, PCR und Gelelektrophorese zu verwenden. Angenommen, man hat eine homogene Lösung d.h. eine Lösung, die hauptsächlich Exemplare der DNA-Sequenz enthält die wir lesen möchten und sehr weniger Verschmutzer (andere DNA-Sequenzen). Für die Abfragung der Positionen von beispielsweise Adenin in der DNA-Sequenz, wird ein Blockmittel benutzt, das verhindert, daß sich die neue DNA-Sequenz bei der PCR über Adenin hinaus verbindet. Resultierend aus diesem geänderten PCR wird eine Vielzahl von kleineren DNA-Sequenzen erzeugt. Jede Sequenz hängt mit einem Teil des Orignalstranges zusammen. Durch das Trennen der neuen DNA-Sequenzen der Länge nach durch Gelelektrophorese erhält man die Position an der Adenin im Originalstrang auftritt. Der Prozeß kann ebenso für Cytosin, Guanin und Thymin verwendet werden, um das Auftreten der Basen der gesamten DNA-Sequenz zu bestimmen. Neuere Methoden benutzen vier unterschiedliche Leuchtstofffärbungen, eine für jede Base, die erlauben, daß alle vier Basen gleichzeitig verarbeitet werden können. Da die Leuchtstoffmoleküle einen Detektor nahe der Unterseite des Gels berühren, werden die Daten direkt auf einem herkömmlichen Computer ausgegeben. Die oben erläuterten Bio-Operationen sind die Basis für Algorithmen eines biologischen Computers. Als Eingabe für einen solchen Algorithmus dient ein Gefäß, in dem die Eingabedaten in einer DNA-Sequenz kodiert vorliegen. Als Ausgabe liefert ein solcher Algorithmus wahr oder falsch oder eine Ausgabe, kodiert in einer DNA-Sequenz. Ein DNA- Computer besteht folglich aus einer Abfolge von biologischen Operationen angewendet auf ein Gefäß mit DNA-Strängen. Institut für wissenschaftliches Rechnen - 9 -

10 4. Hamiltonsches Pfadproblem 4.1 Einführung Das Hamiltonsche Pfadproblem ist ein Entscheidungsproblem. Gefragt ist nach einem Weg in einem gerichteten Graphen, der einen bestimmten Startknoten v S und einen Endknoten v E hat und der jeden Knoten genau einmal besucht. Sollte es einen Weg geben, der diese Restriktionen einhält nennt man ihn Hamilton-Pfad. Dieses Problem ist NP-vollständig, also ist nicht effizient lösbar und jedes andere NP- Problem läßt sich auf das Hamiltonsche Pfadproblem reduzieren. 4.2 Lösen des HPP mit Hilfe von Kombinatorischem DNA-Computing Allgemeiner Algorithmus Für seinen Versuch benutzte Adleman einen Graphen mit 7 Knoten und 14 gerichteten Kanten, bei dem es genau einen Hamiltonpfad gab. Sein allgemeiner, nicht-deterministischer Algorithmus [Adleman94] sieht wie folgt aus: 1. Erzeuge eine Menge von zufällig bestimmten Pfaden durch den Graphen. 2. Für alle Pfade in dieser Menge: a. Es wird überprüft, ob der Pfad mit dem Startknoten v S beginnt und mit dem Endknoten v E endet. Falls dies zutrifft, behalte den Pfad. b. Es wird überprüft, ob der Pfad genau V Knoten enthält (also die Anzahl der Knoten im Graph). Sollte dies der Fall sein, so wird der Pfad weiter verwendet. c. Es wird überprüft, ob alle Knoten im Pfad vorhanden sind. Falls nicht, entferne den Pfad aus der Menge. 3. Alle Pfade, die jetzt noch in der Menge sind, sind Lösungswege. Sollte die Menge leer sein, so existiert kein Weg. Der Algorithmus läßt sich in zwei Teile gliedern. Im ersten Teil (Punkt 1 des Algorithmus) werden alle Lösungen, richtige sowie falsche, erzeugt. Der zweite Teil umfaßt die Ausgliederung der falschen Lösungen. Es kann nicht eindeutig garantiert werden, ob das Ergebnis am Ende der Wahrheit entspricht. Entscheidend bei diesem Ergebnis ist der 1. Schritt, bei dem die Pfade erzeugt werden. Natürlich kann es sein, daß genau der richtige Lösungsweg nicht generiert worden ist. Institut für wissenschaftliches Rechnen

11 4.2.2 Umsetzung des Algorithmus mit DNA-Sequenzen Für die Umsetzung des eben beschriebenen Algorithmus kodierte Adleman seine Knoten und Kanten als DNA-Sequenzen, die jeweils aus einem Oligonukleotid mit 20 Basen bestehen [Adleman94]. Wenn die Sequenzen für zwei Knoten v und w aus je zwei 10-meren (Oligonukleotide der Länge 10) v L und v R bzw. w L und w R bestehen, so besteht die Sequenz für die Kante v w aus den Komplementären von w L und v R [Feldkamp99]. Abb. 4: Kodierung der Knoten und Kanten (oben), Hybridisierung der Knoten mit den Kanten (unten) Für Schritt 1 des Algorithmus gab Adleman dieser Moleküle (entsprechen also Knoten und Kanten) mit 100 Mikroliter in ein Reagenzglas. Jetzt werden sich die Knoten mit den komplementären Kanten hybridisieren. Dadurch entstehen Doppelstränge, die verschiedene Pfade durch den Graphen repräsentieren. Durch die Hinzugabe von Ligase, wurde das Rückgrat der DNA kovalent stabilisiert [Pflicht99], d.h. das der Knoten v an seinem 3 Ende mit dem 5 Ende des Knoten w verbunden wurde und die Kante v-> w mit diesem Strang eine komplementär Verbindung einging. Adleman nannte seinen flüssigen Computer TT-100: Testtube (Reagenzglas) mit 100 Mikroliter Kochsalzlösung [Kolata95]. Die Anzahl der Moleküle sollte ausreichen, um das Problem der Nichtgenerierung des Lösungsweges, zu umgehen. Denn schließlich haben sich 100 Billionen Moleküle miteinander verbunden. Abb. 5: Darstellung eines Pfades durch den Graphen Institut für wissenschaftliches Rechnen

12 Im nächsten Schritt mußten die falschen Wege aussortiert werden. Als erstes alle Wege, die nicht mit dem Startknoten v S beginnen und dem Endknoten v E enden (Schritt 2a). Dazu benutzte Adleman die Polymerase-Kettenreaktion (PCR: Poly Chain Reaction). Durch Erwärmung der Lösung ( Schmelzen der DNA bei 95 C) trennte er den DNA-Doppelstrang und gab anschließend Sequenzen des Startknoten und Komplementärsequenzen des Endknoten als Primer dazu. DNA-Polymerase vermehrte nun die Stränge mit richtigen Start- und Endknoten exponentiell. DNA-Stränge mit nur einem richtigen Knoten (Start oder Ziel) werden dabei verdoppelt. Sollte keine Entsprechung vorhanden sein, so wird der DNA-Strang gar nicht vermehrt. Nach mehren Zyklen des Erwärmens, wieder Abkühlens und Vermehrens entnahm er eine Probe, die jetzt in der großen Mehrheit Stränge mit richtigen Start und Ziel enthalten muß [Pflicht99]. Für Schritt 2b sollten nur noch die Wege übrig bleiben, die die richtige Länge haben. Dementsprechend bei diesem Versuch genau 140 bp (Basenpaare), das entspricht nämlich genau 7 Knoten a 20 Nukleotiden. Adleman ließ die DNA-Sequenzen elektrophoretisch über ein Agarose-Gel laufen und fand zu einer Referenz-DNA mit der entsprechenden Länge die korrekten DNA-Stränge heraus. Abschließend mußte noch überprüft werden, ob auch alle Knoten in den DNA-Sequenzen vorhanden sind (Schritt 2c). Dazu wurde das Verfahren der Auslese nach Affinität (affinity seperation) benutzt. Zuerst werden alle DNA-Doppelhelices wieder in Einzelstränge getrennt. An Eisenkugeln heftete Adleman DNA-Sonden: Einzelstränge, die die komplementäre Sequenz bestimmter Knoten enthielten. Unter Abkühlung, welche die Basenhybridisierung wieder begünstigte, banden die Einzelstränge mit dem Knoten v X an die Sonde; alle anderen; die v X nicht enthielten, wurden aus dem Reagenzglas entfernt, während die Eisenkugel samt dem daran befindlichen Material magnetisch an der Reagenzglaswand festgehalten wurden. Diesen Vorgang wiederholte Adleman für jeden Knoten, so daß jeder Einzelstrang, der die Sequenz eines Knoten nicht besaß, entfernt wurde [Pflicht99]. Im Schritt 3 konnte jetzt durch eine erneute PCR und anschließender Gelelektrophorese überprüft werden, ob sich noch DNA-Stränge im Reagenzglas befinden. Da das der Fall war, mußte es ein DNA-Strang sein, der den Lösungsweg repräsentiert, welches nach eingehender Untersuchung bestätigt werden konnte. Adleman hat mit diesem Experiment die erste Berechnung mit DNA vollbracht. Institut für wissenschaftliches Rechnen

13 4.2 Lösen des HPP mit Hilfe von self-assembly DNA Einführung Eine wesentliche Eigenschaft von DNA ist, dass, unter den richtigen Bedingungen, Watson- Crick komplementäre Regionen von einsträngiger DNA sich kreuzen und Doppelhelix- Strukturen bilden. Diese Eigenschaft kann die DNA dazu bringen eine Vielfalt geometrischer Formen anzunehmen. Ein Zelle zum Beispiel bildet verschiedenste geometrische DNA Gebilde unter anderem Zellwände, zellulare Superstrukturen und Transportstrukturen. Unter bestimmten, vereinfachten Umständen ist das Verhalten der Kreuzung ausreichend vorauszusagen, um als rechengestütze, primitive Funktion in Betracht gezogen zu werden, d.h. eine Funktion von anfangs kleinen DNA-Sequenzen (Oligonukleotide) bis letztlich supramolekularen Strukturen ist berechnet. Je nach Struktur bzw. Grösse und Dimension kann die DNA dabei für verschiedene Rechenmodelle benutzt werden. Eine DNA, die verschiedene Strukturen erzeugt wird in diesem Zusammenhang selfassembly DNA genannt, d. h. die Strukturen, die sich bilden, sind von selbst gebildete DNA-Strukturen. Um solche Strukturen zu erzeugen, startet man üblicher weise mit einer kleinen Anzahl synthetisierter Oligonukleotide und ended mit einer großen Vielfalt von self-assembled DNA-Strängen. Die Ergebnisstränge sind nicht willkürlich oder zufällig; sie haben bestimmte Bestandteile, die von Formen der originalen Oligonukleotide stammen und bestimmten Regeln der Kreuzung entsprechen und Anziehungskräften innerhalb der Sequenzen unterliegen. Wie bereits erwähnt, werden verschiedene Strukturen für verschiedene Rechenmodelle benutzt, genauer ist, dass verschiedene Strukturen zu Sprachen (Chomsky-Hierachie) gleichwertig sind. Zum Beispiel kann die self-assembly einer linear doppelten DNA-Sequenz eine reguläre Sprache, die self-assembly einer verzweigten DNA kann kontextfreie Sprachen erzeugen und die self-assembly von doppelten Crossover-Molekülen (2-dimensional oder 3- dimensional) ist sogar für universelle Berechnungen geeignet. Institut für wissenschaftliches Rechnen

14 Im nachfolgenden wird eine kleine Auswahl von Modelle/Strukturen vorgestellt und ihr Einsatz wird kurz erläutert. Der genaue Einsatz bzw. die Durchführung der Berechnungen wird allerdings nicht erklärt. Dies sind sogennante Small Bricks, d.h. es sind eine Art kleine Mauern, die sich nur mit anderen Mauern an bestimmten Positionen mit der gleichen Mauerfarbe verbinden können (durch Farben gekennzeichnet). Sie werden dazu benutzt um Sortier-und Suchalgorithmen durchzuführen. Dies ist eine Struktur namens TAO. Es ist eine triple Helix, mit Anti-parallelen Überkreuzungen und einer ungerade ( odd) Anzahl an spiralförmigen Halbdrehungen zwischen den Überkreuzungen. Mit dieser Stuktur lässt sich z.b. sehr einfach eine Xor Funktion darstellen. Dies ist ein Schema eines DAE, d.h. es ist eine doppel helix mit Anti-parallelen Überkreuzungen und einer gerade ( even) Anzahl von spiralförmigen Halbdrehungen zwischen den Überkreuzungen. Ein DAE kann z.b. für die Löung des HPP oder für eine Integer-Addition benutzt werden. Die verschiedenen Einsatzgebiete der Strukturen sind noch nicht vollständig geklärt, d.h. die vorgestellten Strukturen könnten noch für viele andere Berechnungen in Frage kommen. Institut für wissenschaftliches Rechnen

15 4.2.2 Algorithmus zum Lösen des HPP Als konkretes Beispiel der Nutzung von 2-dimensionaler self-assembly DNA für Berechnungen wird das gleiche Hamilton Path Problem gelöst (siehe Abbildung 6), dass Adleman bereits kombinatorisch gelöst hat. (Das HPP wurde bereits in 4.1 ausführlich erläutert) Der Algorithmus für das Lösen des HPP basiert auf folgenden Schritten: 1. Erzeugen aller Pfade von Knotenpunkt 1 zu Knotenpunkt N. 2. Sortieren der Knoten in jedem Pfad in ansteigender Ordnung. 3. Kontrolle für jeden Pfad, dass das Resultat genau 1,2, 3,...N ist. 4. Ausgabe jedes Weges, der den Test erfüllt, wenn es einen gibt. In einem vorbereiteten Schritt werden DNA-Sequenzen für den gegebenen Graphen modelliert und synthetisiert. Die Schritte 1-3 werden als ein einzelner self-assemply Schritt erscheinen, während Schritt 4 aus sequenzierter DNA bekannter Länge besteht Abb. 6: Darstellung des Graphen den Adleman für seine Lösung benutzte Für den Graphen (siehe Abbildung 6) [Adleman94] mit 7 Knoten und 14 Kanten, werden 68 Einheiten des DAE Typs benötigt. Die in Abbildung 7 gezeigten 20 Typen sind verantwortlich für den ersten Schritt des Algorithmus. Diese Einheiten sind analog zu den Oliginukleotiden in Adlemans kombinatorischer Lösung, wobei Adlemans Oligonukleotide für einzelne Kanten benutzt hat, in diesem Beispiel aber Paare von Kanten benutzt werden. Die DAE Einheiten bilden durch Annealing verschiedene Gitter, die immer mit dem Knoten 1 anfangen und mit dem Knoten 7 enden, da die DAE Einheiten, die den Knoten 1 bzw. 7 symbolisieren, nur 4 statt 8 sticky ends besitzen. Die DAE Einheiten dazwischen kodieren jeden möglichen Weg durch den Graphen, wobei die Länge beliebig und das doppelte Besuchen eines Knoten zulässig ist. Abb. 7: allgemeine Darstellung der Start -Einheiten Institut für wissenschaftliches Rechnen

16 Im folgenden werden die DAE Einheiten schematisch wie in der nebenstehenden Form dargestellt. Diese abgebildete DAE Einheit ist zum Beispiel eine Einheit der Start Einheiten. Sie kodiert die folgenden Informationen: - aktueller Knoten 4 (links unten) - Zielknoten 2 (oben rechts) - Überführungknoten 5 (oben links) - weiterer Verbindungsknoten 2 (unten rechts) Zu lesen ist diese Einheit in folgendem Sinne: Man befindet sich an Knoten 4 und erreicht den Knoten 2 über den Knoten 5, d. h. es existiert eine Verbindung von 4 nach 5 nach 2 in dem Graphen. Diese Einheit kann sich an dem 2 Ende nur mit einer nächsten Einheit verbinden, die einen Weg von der Knoten 2 an weiterführt.in Abbildung 7 sind alle diese Kodierungen der gültigen Wege in einer allgemeinen Form zusammengefasst. Festgelegt in den verschiedenen Start Einheiten sind nur der Start-und Endknoten. Im folgenden wird eine exemplarische Darstellung des 1. Schrittes des Algorithmus abgebildet. Dabei sind die jeweils die X und X Enden verbunden Abb. 8: Darstellung der Struktur nach dem 1.Schritt des Algorithmus Institut für wissenschaftliches Rechnen

17 Die weiteren, in Abbildung 9 gezeigten Einheiten (21 61), sind für den zweiten Schritt des Algorithmus verantwortlich; die Sortierung wird von dem Odd-Even Transposition Sort [Knuth73] vollendet. Bei der Sortierung wird die Struktur nach oben hin durch sich anlagernde Teile erweitert. Der Sortieralgorithmus vergleicht dabei immer 2 Werte und vertauscht diese gegebenenfalls so, daß der kleinere Wert immer vorne, der größere immer hinten steht. Zu vergleichen ist dies z.b. mit einem Bubblesort. Abb 9: Sortier -Einheiten Nachdem Sortieren würde die Anfangsstruktur aus Abbildung 8 wie in Abbildung 10 gezeigt aussehen. Das Sortieren ist abschlossen, wenn das Zeichen einmal von links nach rechts durchgeschoben wurde. Einheiten die 2 Werte tauschen sind in der Abbildung grau dargestellt Abb. 10: Abbildung der Struktur nach dem Sortieren Institut für wissenschaftliches Rechnen

18 Die letzten DAE Einheiten, gezeigt in Abbildung 11 sorgen dann durch ihre besondere Form für die Durchführung des dritten Schrittes des Algorithmus, d.h. der äußere Kreis des Gitters wird geschlossen, wenn kein Knoten doppelt besucht und kein Knoten ausgelassen wurde. Dabei ist eine Unterscheidung der 7 Types nötig: Es gibt 6 Einheiten die 6 sticky ends besitzen und eine spezielle DONE Einheit, die das Gitter komplettiert. Abb 11: Terminal -Einheiten Jeder terminale Komplex kodiert entweder einen gültigen Hamilton Pfad, in welchem der Komplex komplett ist und durch Ligation ein äußerer Ring geformt wurde, oder einen ungültigen Pfad, in welchem Fall der terminale Komplex angefüllte Lücken beinhaltet und keine kreisförmigeren Stränge druch Ligation entstanden sind. Die Abbildung 12 stellt einen gültigen Hamilton Pfad, die Abbildung 13 hingegen einen ungültigen Pfad nach dem Zusammenfügen der DAE Einheiten durch Annealing dar. Die schwarzen Punkte zeigen die Stellen an, an denen sich die einzelnen DAE Einheiten verbunden haben. Abb. 12: Gitter eines gültiges Hamilton Pfades ( ) Abb. 13: Gitter eines ungültiges Pfades ( ) Institut für wissenschaftliches Rechnen

19 4.2.3 Vergleich der Algorithmen Um einen Graphen mit N Knotenpunkten und E Kanten zu lösen, hat Adleman mit dem kombinatorischen Algorithmus N + E Oligonukleotide und N Laborschritte benötigt. Der E² Algorithmus mit self-assembly DNA würde grob + N² + N DX Einheiten und eine N konstante Anzahl von Laborschritten (Synthesizing, Annealing, Sequenzing) benötigen. Der Unterschied der Lösung des Algorithmus mit self-assembly DNA zu der kombinatorischen Lösung von Adleman ist, dass die self-assembly aufgrund ihrer Strukturformungen Pfade erzeugt. Diese sind dann entweder gültig oder nicht. Die sich selbstformende Struktur ist bei diesem Lösungsweg der Kernpunkt. Institut für wissenschaftliches Rechnen

20 5. DNA Rechenmodelle Im folgenden soll eine kleine Übersicht über verschiedene Modelle des DNA Rechnens gegeben werden, die von verschiedenen Forschern formalisiert wurden. 5.1 Das beschränkte Modell Eine erste Formalisierung eines Modells nach Adlemans Experiment fand 1995 durch Lipton statt [Lipton95]. Er entwickelte das beschränkte Modell, das seinen Namen dem Umstand verdankt, daß die verwendete DNA-Menge in der Berechnungsphase nicht mehr zunimmt, also durch die Initialisierungsmenge beschränkt ist. Dies schließt die Anwendung von PCR aus. In der Initialisierungsphase werden Bitvektoren kodierende Sequenzen erzeugt. Hierzu erstellte Lipton einen Graphen, dessen Knoten Nullen und Einsen enthalten. Mit einer Kodierung des Graphen, wie Adleman sie vorgeschlagen hat (eine Sequenz pro Knoten, also zwei Sequenzen für jede Bitposition), können nun Pfade von einem Start- zu einem Zielknoten erzeugt werden, die Bitvektoren einer bestimmten Länge repräsentieren. Abb. 14: Liptons Graph zur Erzeugung von Bitvektoren Der Vorteil dieser Kodierung liegt darin, daß man die Bitstrings auch zur Lösung anderer Probleme wiederverwenden kann, es muß nur die Berechnungsphase entsprechend geändert werden. In der Berechnungsphase werden folgende Operatoren verwendet: Extraction: Merge: Detection: Sequenzen, die eine bestimmte Subsequenz enthalten, und solche, die sie nicht enthalten, werden in zwei verschieden Reagenzgläser getrennt. Dies wird i. a. ähnlich durchgeführt wie Schritt 4 in Adlemans Lösungsalgorithmus für das HPP. Die Vereinigung zweier Mengen von DNA. Sie wird durch Vereinigung der Inhalte der beiden Reagenzgläser implementiert. Es wird getestet, ob sich überhaupt noch DNA im Reagenzglas befindet. Hierzu kann man z. B. eine PCR mit anschließender Gelelektrophorese durchführen. Institut für wissenschaftliches Rechnen

21 5.2 Das unbeschränkte Modell Adleman [Adleman96] erweiterte das beschränkte Modell um folgenden Operator: Amplify: Vervielfältigt den Inhalt eines Reagenzglases. Hierzu verwendet man i. a. die PCR. Durch diesen zusätzlichen Operator für die Berechnungsphase fällt die Mengenbeschränkung weg. Dadurch werden ggf. geringere Initialmengen von DNA benötigt, die PCR wird aber als eine wesentliche Fehlerquelle angesehen (s. u.). 5.3 Das Generator-Modell Da im Laufe der Berechnung im beschränkten Modell die Menge der verwendeten DNA immer mehr abnimmt und das unbeschränkte Modell zur Amplifizierung die fehlerbehaftete PCR verwendet, schlugen Bach et al. vor, bereits die Initialisierungsmenge effizienter zu nutzen [Bach96]. Indem man gezielt Wissen um die Problemlösungen in die Erzeugung der Initialisierungssequenzen einfließen läßt, kann man den Suchraum von vornherein einschränken und die vorhandene DNA-Menge vermehrt für sinnvolle Lösungskandidaten verwenden. Zu diesem Zweck gibt es folgende Operatoren für die Initialisierungsphase: Split: Append: Merge: Eine DNA-Menge wird so auf zwei Reagenzgläser verteilt, daß beide Gläser ca. die gleiche Menge enthalten. Dabei ist die Zuordnung einer Sequenz zu einem der beiden Gläser natürlich rein zufällig. Die in einem Reagenzglas enthaltenen Sequenzen werden um eine bestimmte Sequenz verlängert (durch Hybridisierung und Ligation entsprechend der Adleman schen Kodierung). Wie im beschränkten Modell werden hier die DNA-Mengen vereinigt. Mit iterativer Anwendung der Operatorensequenz Split - Append - Merge können so ebenfalls zufällige Bitvektoren erzeugt werden, aber durch Weglassen von Split und Merge an bestimmten Positionen haben alle Sequenzen an der entsprechende Position dieselbe Bitbelegung, der Suchraum hat damit eine Dimension weniger. Institut für wissenschaftliches Rechnen

22 5.4 Das Surface-Modell In diesem Modell bewegen sich die DNA-Sequenzen nicht frei in einer Lösung, sondern sie sind auf einer Oberfläche fixiert [Liu96, Cai96]. Somit sind die Vorgänge während der Initialisierungs-und Berechnungsphase wesentlich einfacher zu kontrollieren, allerdings engt man den Suchraum dadurch ein, daß man nur noch zwei statt drei Dimensionen für die Anordnung der Sequenzen zur Verfügung hat. Hauptsächlich soll dieses Modell auch eher dazu dienen, in Experimenten Erkenntnisse über die Vorgänge bei der Ausführung der Operatoren und die Fehler, die dabei auftreten, zu gewinnen, um damit auch die lösungsbasierten Ansätze verbessern zu können. Verwendet werden hier folgende Operatoren: Mark: Unmark: Destroy: Append: Erase: Die eigentlich einsträngigen Sequenzen, die eine bestimmte Bitbelegung haben, werden markiert, indem sie (mit Anlagerung und Polymerisation) doppelsträngig gemacht werden. Alle Markierungen werden gelöscht, indem die dsdna denaturiert wird. Da die Kandidatenstränge fixiert sind, lassen sich die Markierungsstränge problemlos entfernen (abspülen). Zerstört alle markierten bzw. alle unmarkierten Sequenzen. Dies wird mit Exonucleasen realisiert, die nur dsdna bzw. nur ssdna zerstören. An die markierten bzw. unmarkierten Sequenzen wird eine bestimmte Sequenz angehängt. Dies wird mit verschiedenen Arten von Ligation erreicht. Schneidet den Teil aller markierten Sequenzen ab, der mit einer vorhergegangenen Append-Operation angehängt wurde. Hierzu werden Restriktionsenzyme verwendet. Institut für wissenschaftliches Rechnen

23 6. Ausblick und Bewertung des DNA-Computing Vorteile des DNA-Computing [Adleman94]: Die hohe Parallelität der Berechnung. Für die Initialisierungsphase seines HPP- Experimentes hat Adleman Ligationen pro Sekunde veranschlagt, wies aber darauf hin, daß sich bis zu 2 70 in einem Reagenzglas befinden können, die parallel bearbeitet werden können. Der geringe Platzbedarf für die Speicherung von Informationen. Für die Speicherung von 1 Bit wird nur etwa 1 nm³ verbraucht. Laut Adleman speichert ein Gramm DNA die Datenmenge von einer Billion CD s. Das sind cirka 0,6*10 9 Terabyte. Die Energieeffizienz. Mit Aufwendung von 1 Joule können 2*10 19 Ligationen durchgeführt werden. Das theoretische Maximum liegt bei 34*10 19 Operationen 19 per Joule. Supercomputer schaffen mit dieser Energie gerade mal 10 Operationen (den Verbrauch der Kühlung nicht mitgerechnet). Nachteile des DNA-Computing: Die Programmierung bei konventionellen elektronischen Rechensystemen ist einfacher, die Ergebnisse sind schneller zu sehen und die Fehler leichter zu beheben. Einzelne Operationen wie zum Beispiel Ein- und Ausgabe (Kodierung der DNA-Sequenzen und Filtern der richtigen Lösung) sind sehr zeitintensiv. NP-Probleme bleiben auch in der Architektur des DNA-Computers NP- Probleme. Der exponentielle Aufwand verschiebt sich zwar von der Rechenzeit auf die Menge der DNA-Sequenzen, die zwar eine sehr kleine, doch von Null verschiedene Ausdehnung hat, sind dem DNA-Computing auch Grenzen bzgl. der Größe der zu lösenden Probleme gesetzt. Zum Beispiel würde ein HPP mit 70 Knoten mit Adlemans Verfahren ca kg DNA brauchen [Maley98] (zum Vergleich: die Erdmasse beträgt ca. 6*10 24 kg). Bestimmte Operationen wie zum Beispiel PCR weisen Fehler auf. Diese Fehler gilt es zwar schwer zu quantifizieren, doch kann man eindeutig sagen, daß die Berechnungen, die man durchführt, nicht mit vollkommender Gewißheit zum richtigen Ergebnis führen. DNA-Computing ist eine sehr interessante Forschungsrichtung, die es wert ist, sich damit zu beschäftigen und weiterhin auf diesem Thema zu forschen. Doch ist DNA- Computing für die nächste Zeit kein effizienter Ersatz für den herkömmlichen Computer. Aus zeitlichen und finanziellen Aspekten wird sich die Forschung auf theoretische Modelle und auf wissenschaftlich relevante Analyseverfahren reduzieren. Institut für wissenschaftliches Rechnen

24 6. Literaturverzeichnis Seminar DNA Computing 7. Literaturverzeichnis [Adleman94] Leonard M. Adleman in Science (Vol.266, 11. November 1994): Molecular Computation of Solutions to Combinatorial Problems [Adleman96] [Andres99] [Bach96] [Cai96] [Feldkamp99] [Knuth73] [Kolata95] [Liu96] [Lipton95] [Maley98] [Plicht99] Leonard M. Adleman (1996): On Cunstructing a Molecular Computer Annamaria Christina Andres (17. Dezember 1999): Rechnen mit DNA E. Bach (1996): DNA Models and Algorithms for NP-complete Problems W. Cai (1996): The Power of Surface-Based DNA Computation Udo Feldkamp (29. Oktober 1999): Ein DNA-Sequenz-Compiler Donald E. Knuth (1973): The Art of Computer Programming Volume 3: Sorting and Searching (2 nd ed) Gina Kolata in New York Times (11. April 1995): A Vat of DNA may become the fast Computer of the Future Q. Liu (1996): A Surface-Based Approach to DNA Computation R.J.Lipton (1995): DNASolution od Hard Computational Problems C. C. Maley in Evolutionary Computation (Vol. 6, No. 3, 1998): DNA Computation: Theory, Practice, and Prospects Björn Plicht (Januar 1999): Computing with DNA Die Arbeiten des Leonard Adlemans Institut für wissenschaftliches Rechnen