Pflanzenphysiologie Praktikum Sommersemester 2017

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1 Pflanzenphysiologie Praktikum Sommersemester 2017

2 Leitung: Dr. Jeannette Pfalz 1

3 Praktikum Pflanzenphysiologie Sommersemester 2017 Zum Pflanzenphysiologischen Praktikum im Sommersemester 2017 werden Ihnen 7 Praktikumskomplexe in vier Praktikumstagen vorgelegt. Anhand der verschiedenen Komplexe soll Ihnen eine Wiederholung des in der Vorlesung gebotenen Stoffes ermöglicht werden. Die Literaturangaben sollen Ihnen eine Vorbereitung auf die durchzuführenden Versuche ermöglichen. Eine Praktikumsanleitung, wie die Ihnen vorliegende, kann nicht die erforderlichen theoretischen Grundlagen liefern. Das Anliegen und die Versuchsdurchführung müssen Ihnen vor Beginn des Praktikums bekannt sein, da wir sonst Ihre Teilnahme nicht akzeptieren können. Einige Komplexe werden durch ein Gespräch mit einem zuständigen Tutor abgeschlossen. Während des Praktikums stehen Ihnen Betreuer zur Verfügung, deren Aufgabe auch darin besteht, Ihre Vorbereitung zu kontrollieren. Wir laden Sie ausdrücklich zu einem schöpferischen Umgang mit dem Praktikum ein: wenn Sie bestimmte Versuche im Rahmen der vorhandenen Möglichkeiten variieren wollen, so freuen wir uns darüber. Sprechen Sie das aber bitte mit uns ab. Das erste Praktikum beinhaltet die Komplexe 1 (Ernährung), 2 (Wachstum und Differenzierung) und 3 (Auxinwirkungen), das zweite Praktikum die Komplexe 4 (Phytohormone) und 5 (Pflanzeninhaltsstoffe), das dritte Praktikum den Komplex 6 (Enzyme) und das vierte Praktikum den Komplex 7 (Photosynthese und Respiration. Die Langzeitversuche werten Sie bitte in eigener Regie im Verlauf des Praktikums aus. Die Tutorien beziehen sich auf folgende Themen: Ernährung, Wachstum, Differenzierung (1. Praktikumstag), Phytohormone (2. Praktikumstag), Pflanzliche Enzyme und Enzymologie (3. Praktikumstag) und Photosynthese (4. Praktikumstag). Zu Beginn des Praktikums bitten wir einige Studenten, das Prinzip einiger Versuche zu erklären. Dies dient der Kontrolle der individuellen Vorbereitung. Jeder der drei Praktikumsdurchläufe umfasst 45 Unterrichtsstunden. In jeder zweiten Woche findet jeweils 18 Uhr s. t. ein Institutscolloquium statt. Dort werden Probleme der Forschung dargestellt, die sich auf die Arbeiten unseres Institutes beziehen. Wir laden Sie zur Teilnahme herzlich ein. Die Arbeit im Praktikum wird in Arbeitsgruppen aus jeweils 3 Studenten durchgeführt. Jede Gruppe erstellt ein Praktikumsprotokoll. Die Praktikumsprotokolle sind die Grundlage für die Bestätigung der erfolgreichen Teilnahme am Praktikum. Teile des Praktikums werden betreut von Dr. Jeannette Pfalz (Pflanzenphysiologie Jena). Viel Erfolg und Spaß Dr. Jeannette Pfalz; jeannette.pfalz@uni-jena.de 2

4 INHALTSVERZEICHNIS Seite Allgemeine Literatur:....4 Komplex 1: Ernährung von Pflanzen Biomonitoring Ernährung heterotropher Pflanzenorgane: Kultur isolierter Wurzeln in künstlicher Nährlösung. 8 Komplex 2: Wachstum und Differenzierung Verteilungsfunktion einer Population von Keimlingen Die Wirkung eines Herbizids - SAN 9789 (Norflurazon)...12 Komplex 3: Multiple Auxinwirkungen Untersuchungen an Coleussprossen Induktion des Streckungswachstums von Maiskoleoptilsegmenten durch Auxin Selektive Herbizidwirkung..16 Komplex 4: Wirkungen weiterer Phytohormone und das Phytochromsystem Zwergmutanten der Erbse und ihre Normalisierung durch Gibberellinsäure Einfluss von Abscisinsäure auf die Samenkeimung Ein klassisches Experiment zur Phytochromwirkung Komplex 5: Pflanzliche Inhaltsstoffe Quantitative Bestimmung von Gesamtproteinen Ein Vorversuch zur pflanzlichen Molekularbiologie: Isolierung von DNA Fett-Kohlenhydratumwandlung bei der Keimung fetthaltiger Samen Isolierung und Nachweis der Alkaloide des Schöllkrauts..28 Komplex 6: Pflanzliche Enzyme Operationale Kriterien der Enzymaktivitätsbestimmung - Fallstudie Fumarathydratase Die kinetische Charakterisierung eines Enzyms - Fallstudie Peroxidase Konkurrenz um Phosphat - die Wirkung von Phosphatasen Dissimilation von Speicherstärke durch Amylasen.35 Komplex 7: Photosynthese und Respiration Vergleich der Pigmente aus Chloroplasten und Chromoplasten Fluoreszenz von Chlorophyll in vitro und in vivo CO 2-Aufnahme bei C3- und C4-Pflanzen Demonstration & Messung des photosynthetischen Elektronentransports an isolierten Chloroplasten 41 Methodenanhang..39 Hydrokulturen von Pflanzen.. 42 Quantitative Bestimmung der Plastidenpigmente..43 Proteinbestimmung.44 Bestimmung von Kohlenhydraten 45 Anthocyane..46 Probit- und t-tabellen..44 Liste der im Pflanzenphysiologischen Praktikum verwendeten Pflanzen 45 3

5 Allgemeine Literatur: BUCHANAN/ GRUISSEM/ JONES. Biochemistry and Molecular Biology of Plants. Rockville, Maryland, USA KUTSCHERA, U.: Prinzipien der Pflanzenphysiologie. Spektrum Akademischer Verlag KUTSCHERA, U.: Grundpraktikum zur Pflanzenphysiologie. Quelle & Meyer, Wiesbaden METZNER, H.: Pflanzenphysiologische Experimente. Fischer, Jena WEILER, E, NOVER, L., NULTSCH, W: Allgemeine und molekulare Botanik. Thieme, Stuttgart SCHOPFER, P.: Experimentelle Pflanzenphysiologie. Einführung in die Methoden. Band I. Springer- Verlag, Berlin SCHOPFER, P.: Experimentelle Pflanzenphysiologie. Einführung in die Anwendung. Band II. Springer-Verlag, Berlin SCHOPFER, P und BRENNICKE, A: Pflanzenphysiologie. 7. Auflage, Spektrum, STRASBURGER. Lehrbuch der Botanik. A. Bresinsky, C. Körner, J.W. Kadereit, G. Neuhaus, U. Sonnewald. Spektrum Akademischer Verlag, TAIZ, L. und E. ZEIGER: Plant Physiology. Palgrave Macmillian, USA. 5th edition (Besonders empfohlen für das Gesamtgebiet: 1-3 ) 4

6 Komplex 1 Ernährung von Pflanzen 1.1 Biomonitoring Literatur: Schopfer/ Brennicke; Kutschera 1. Kurstag Dieser Versuch hat über die mineralische Ernährung hinausgehende Bedeutung. Die Versuchspflanzen (Wasserlinsengewächse = Lemnaceae, besonders Lemna minor) werden als Biotestsysteme zur Routineüberprüfung von Wasserqualität eingesetzt. und (23/03/2011) Materialien & Geräte: - Beschriftete Pipetten - Beschriftete Standzylinder 500 ml, 100 ml - Erlenmeyerkolben (100 ml) - Beschriftungsband - Wattestopfen - Glasstäbe, Impfösen, Wägeschälchen - Sterile Vorkultur von Wasserlinsen, z.b. Spirodela polyrhiza - ph-messgerät - Bunsenbrenner, Streichhölzer Chemikalien & Lösungen: - Glucose - Stammlösungen und Ersatzlösungen (vgl. Tabelle Pipettierschema im Text) Durchführung Es hat sich als günstig erwiesen, wenn Sie als Gruppen kooperieren, indem Sie gleich die doppelte Menge an Vollmedien herstellen. Bitte legen Sie ca. 450 ml Reinstwasser in einen Plastikzylinder vor und pipettieren Sie in der angegebenen Reihenfolge. Die Konzentration an Glucose soll 50 mm betragen (Festsubstanz einwiegen). Nach Zugabe der Komponenten zur Nährlösung (siehe Tabelle) mit einem Glasstab umrühren, am Schluss auf 500 ml auffüllen. Überführen Sie von jedem Ansatz 4 x 75 ml in 100 ml Erlenmeyerkolben. Der ph-wert muss vor dem Autoklavieren gemessen werden. Wegen der zugesetzten Glucose müssen die Erlenmeyerkolben autoklaviert werden. Diese Arbeit muss zu Praktikumsbeginn ausgeführt werden, damit unter Sterilbedingungen am gleichen Tag noch jeweils ein Triplett von Spirodela polyrhiza eingeimpft werden kann. Die Pflanzen werden bis zum letzten Praktikumstag kultiviert. Dazu wird das Fensterbrett im Praktikumsraum genutzt. Zum Ansetzen des Versuches: Überimpfen Sie 3 5 Sprosse in einen Kolben. Die Anzahl der Sprosse muss nach dem Überimpfen genau bestimmt werden, da es meist nur schwer möglich ist, genau eine Kolonie aus einem Triplett einzuimpfen (Was ist ein Lemnaceen-Spross?). 5

7 Stammlösungen 1. Kurstag Tabelle: Pipettierschema für die Medienvarianten (Angaben ml/ 500 ml): Voll-medium Mangelvarianten -N -P -S -K -Mg -Fe -Ca KH2PO4 (100 mm) 2,5 2,5-2,5-2,5 2,5 2,5 Ca(NO3)2 (0,2 M) 2,5-2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 - KNO3 (1,6 M) 2,5-2,5 2,5-2,5 2,5 2,5 MgSO4 (0,2 M) 2,5 2,5 2,5-2,5-2,5 2,5 H3BO3 (1 mm); 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 MnCl2 (2,6 mm); Na2MoO4 (80 μm) Fe (III) EDTA (5 mm) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5-2,5 Ersatzlösungen KCl (1,6 M) - x x CaCl2 (0,2 M) - x MgCl2 (1 M) - x NaH2PO4 (0,15 M) - x NaNO3 (1 M) - x x Na2SO4 (0,2 M) - x Na2EDTA (5 mm) - x Die in den Mangelvarianten fehlenden Gegenionen müssen durch die Ersatzlösungen in Form von Cl - oder Na + äquimolar ersetzt werden. Bitte machen Sie sich zur Berechnung kundig und berechnen Sie die mit Fragezeichen markierten Stellen für Ihre Ansätze v o r Beginn des Praktikums. Tabelle: Eine Vorgabe zur Aufteilung auf die Gruppen: Gruppe Vollmedium -N -P -S -K -Mg -Fe -Ca 1 x x 3 x x 5 x x 7 x x 9 x x 11 x x 13 x x Zur Auswertung im Verlaufe des Praktikums: Bitte beobachten Sie die Entwicklung Ihrer Pflanzen. In jeder Praktikumswoche müssen die Sprosszahlen bestimmt werden (solange die Zahl nicht so hoch wird, dass eine Zählung im geschlossenen Kolben nicht mehr möglich ist) und das Erscheinungsbild der Pflanzen beurteilt werden. Ähnlich umfassende Begutachtungen finden in der Pflanzenzüchtung statt und werden gewöhnlich als Bonitierung (lat. bonitas = gute Beschaffenheit, Güte), damit meint man eine visuelle Begutachtung, bezeichnet. Zur Auswertung am letzten Praktikumstag: Es sind erneut der ph-wert, letztmalig die Sprosszahl pro Kolben (zum Auszählen können große 6

8 1. Kurstag Petrischalen verwendet werden) sowie zum Abschluss das Frischgewicht zu messen. Sollten sich Turionen gebildet haben, so ist deren Zahl zu bestimmen. Ebenfalls soll eine Bonitierung stattfinden, wobei besonders der Chlorophyllgehalt (wie grün sind die Pflanzen?) und der Anthocyangehalt (wie rot sind die Pflanzen?) zu berücksichtigen sind. Biochemische Verfahren wie Protein-, Enzym- oder Pigmentbestimmung (Chlorophyll- und Anthocyangehalt; siehe Methodenanhang) könnten beim Biomonitoring folgen, sprengen aber den Rahmen eines Grundpraktikums. Zur schriftlichen Auswertung: Alle numerischen Daten (Sprosszahlen, Frischgewichte) sowie die Bonitierungsergebnisse sind anzugeben (Originaldaten). Zur Berechnung der Wachstumsraten werden die Ausgangszahlen und die Zahlen nach 3 Wochen Kultivierung verwendet. Mittelwerte und Standardabweichungen sind zu berechnen. Aus den Sprosszahlen (Z1, Z2) über die Zeit (t1, t2) werden die Wachstumsraten (WR) und die Verdoppelungszeit (Td) nach folgenden Formeln berechnet: WR= (lnz2 lnz1)/(t2 - t1). Td = ln2/ WR (Dimension beträgt Tage, falls t1 und t2 in Tagen verwendet wurden). Mittels t-test ist zu entscheiden, ob die Mangelvarianten signifikant von den Kontrollen verschieden sind. Verwenden Sie dazu die Wachstumsraten und nicht die Sprosszahlen. Warum ist diese Entscheidung wichtig? 7

9 1. Kurstag 1.2 Ernährung heterotropher Pflanzenorgane: Kultur isolierter Wurzeln in künstlicher Nährlösung Literatur: Schopfer/ Brennicke;.Schopfer I; Schopfer II. Materialien & Geräte: - Beschriftete Standzylinder - Erlenmeyerkolben (100 ml-weithals) - Große Petrischalen werden zusammen mit der Nährlösung im Praktikum autoklaviert - Wattestopfen - Glasstab, Impföse, Skalpell, Millimeterpapier in Plastikfolie - Axenisch vorkultivierte Wurzeln von Tomate - Klebeband und Marker ( Edding ) - Laminarbox - Autoklav (mit Prof. M. Mittag absprechen) - Trichter für Standzylinder Chemikalien & Lösungen: - Bäckerhefe oder Hefeextrakt - Die Hefesuspension wird im Praktikum filtriert und anschließend mit Wasser aufgefüllt - Stammlösungen (s. u.) - Von den Lösungen I - IX werden jeweils 500 ml hergestellt - Für alle Arbeiten wird de-mineralisiertes Wasser verwendet. Stammlösungen für die verschiedenen Nährlösungen nach White: Lösung I: MgSO4 (30 mm) Lösung II: Ca(NO3) 2 (12 mm) Na2SO4 (14 mm) KNO3 (8 mm) KCl (9 mm) NaH2PO4 (1,2 mm) Lösung III: Fe2(SO4)3 (60 μm) Lösung IV: MnSO4 (0,3 mm) ZnSO4 (94 μm) H3BO4 (0,24 mm) KI (45 μm) Lösung V: Saccharose (0,6 M) Lösung VI: Nicotinsäure (40 μm) Lösung VII: Pyridoxin (4,9 μm) Lösung VIII: Thiamin (3 μm) Lösung IX: Hefeextrakt (100 mg 100 ml -1 ). Wird im Praktikum hergestellt Durchführung 1. Ansetzen der Nährlösungen Ansatz 1 Ansatz 8: Jeweils 25 ml der Stammlösungen werden nach folgendem Plan vereinigt und auf 250 ml aufgefüllt (um Ausfällungen zu vermeiden, etwas Wasser vorlegen und Lösung I und II als letztes zugeben). Gut mischen! 8

10 1. Kurstag Ansatz 1 (nur anorganische Komponenten): Ansatz 2 (mit Saccharose, ohne Vitamine): Ansatz 3 (ohne Thiamin): Ansatz 4 (ohne Pyridoxin): Ansatz 5 (ohne Nicotinsäure): Ansatz 6 (Hefe statt Vitaminzusatz): Ansatz 7 (Vollmedium): Ansatz 8 (ohne anorganische Komponenten): Lösung I - IV Lösung I - V Lösung I VII Lösung I VI, VIII Lösung I - V, VII - VIII Lösung I - V, IX Lösung I IX Lösung V - IX Tabelle: Eine Vorgabe zur Aufteilung auf die Gruppen: Gruppe A 1 A 2 A 3 A 4 A 5 A 6 A 7 A 8 2 x x 4 x x 6 x x 8 x x 10 x x 12 x x 2. Herstellen der Kulturansätze: Pro Ansatz werden 3 Erlenmeyerkolben (100 ml) mit ca. 50 ml Medium gefüllt, mit einem Zellstoffstopfen verschlossen und autoklaviert. Unter sterilen Bedingungen werden 2 genau 1 cm lange Wurzeln pro Kolben übertragen. Unter die große Petrischale wird Millimeterpapier gelegt, um 1 cm-segmente mit dem Skalpell abschneiden zu können. Die Wurzelspitzen sind entweder vorher zu entfernen oder (bei ausreichendem Material) ausschließlich zu verwenden. Die Kultivierung über 3 Wochen erfolgt bei Raumtemperatur, die Lichtbedingungen sind unerheblich. Von 5 Wurzelsegmenten ist am Tag des Versuchsstartes das Frischgewicht zu bestimmen. Danach sind diese Wurzelsegmente insteril und können nicht mehr weiterverwendet werden. Auswertung Die Entwicklung der Wurzeln in den einzelnen Ansätzen wird wöchentlich registriert. Unsterile Kulturen werden aussortiert. Die Wurzelentwicklung wird wie folgt im Bezug zum Inoculum (vgl. dazu Ansatz 1) registriert: (A) nicht gewachsen (B) leicht gewachsen (C) stark gewachsen (D) stark gewachsen, Seitenwurzeln ausgeprägt. Nach drei Wochen Entwicklungszeit, d.h. am Ende des Praktikums, erfolgt eine 1. genaue Längenbestimmung aller Wurzeln in den 3 Proben und 2. Frischgewichtsbestimmung der Wurzeln (die 3 Proben einer Variante werden zuvor vereint) zur Quantifizierung der Biomassezunahme. Eine Bestimmung der Trockenmasse wäre eigentlich sinnvoll, lässt sich aber aus Zeitgründen im Praktikum nicht ausführen. Die Wurzellängen werden zu Mittelwerten und Standardabweichung verrechnet und der (einseitige, ungepaarte) t-test ist zum Vergleich der Variante mit den Kontrollen 1 (nur anorganische 9

11 1. Kurstag Komponenten) und den Kontrollen 2 (Vollmedium) einzusetzen. Vergleichen Sie Ihre Ergebnisse auch dann mit den Ansätzen 1 und 7, wenn Sie diese Ansätze nicht selbst untersucht haben. Treten Sie in kollegialen Kontakt mit einer geeigneten Gruppe, zitieren Sie aber die Herkunft der Daten im Protokoll. Arbeitszeit: 1. Teil: 40 Minuten; 2. Teil: Minuten 10

12 1. Kurstag Komplex 2: Wachstum und Differenzierung 2.1 Verteilungsfunktion einer Population von Keimlingen Literatur: Schopfer I, Schopfer II, Kutschera Der Versuch hat das Anliegen, Ihnen einen praktischen Zugang zum Kapitel Biostatistik zu ermöglichen. Bei der Protokollführung sollen Sie diese Methoden anwenden. Materialien & Geräte: - Maßstab (15 x 15 cm großes Millimeterpapier, mit Plastikfolie geschützt) - Pinzetten, - Probit-Tabelle (Anhang) - etiolierte und grüne Keimpflanzen von Raps oder Senf (je 140 Stück auf Filterpapier und Reinstwasser in großen Petrischalen im Dunkeln bzw. in Dauerweißlicht für ca. 5 d bei 25 C vorkultiviert) Chemikalien & Lösungen: keine Durchführung Die Keimlinge werden vorsichtig vom Keimpapier abgenommen und die Länge des Hypokotyls (Wurzelansatz bis Gabelung der Kotyledonen-Petioli) auf 0,5 mm genau (!) von 140 zufällig ausgewählten Keimlingen gemessen. Man hält dazu den Keimling mit einer Hand an der Wurzel auf der Messplatte fest, greift die Kotyledonen mit einer Pinzette und zieht den Hypokotylhaken gerade (ohne ihn abzubrechen). Die Messwerte x werden in eine Tabelle eingetragen. Jede Gruppe sollte entweder etiolierte oder grüne Keimlinge ausmessen. Zwei Gruppen sollen dann die Daten austauschen, damit ein Vergleich möglich ist. Die Partnergruppe ist im Protokoll anzugeben. Auswertung (siehe Schopfer I, Schopfer II) 1. Prüfen Sie zunächst mittels Probit-Transformation die Normalverteilung. Dazu müssen die Hypokotyllängen in Klassen eingeteilt werden. Mehr als 10 Klassen haben sich als nicht sinnvoll erwiesen. Beide Stichproben sollten in die gleiche Zahl von Klassen eingeteilt werden. Stellen Sie die Verteilung und die Summenverteilung (absolut und relativ) graphisch dar. Die Summenverteilung wird dann mittels einer Tabelle in einen Probitmaßstab umgerechnet und ebenfalls graphisch dargestellt. Daraus lässt sich auf die Normalverteilung schließen. 2. Berechnen Sie die Mittelwerte und die Standardabweichung und vergleichen Sie von zwei verschiedenen Kulturen die Mittelwerte der Hypokotyllängen durch den t-test. Arbeitszeit: 1 Stunde 11

13 1. Kurstag 2.2 Die Wirkung eines Herbizids - SAN 9789 (Norflurazon) Literatur: Schopfer II; Kutschera; Schopfer/Brennicke (dort weitere Hinweise) Materialien & Geräte: - Erlenmeyerkolben (100 ml), 2 Stück pro Gruppe - Wattestopfen - Impföse, Messzylinder für 50 ml - Etwa 14 d alte autotroph vorkultivierte Sprosse von z. B. Lemna minor oder eine andere Spezies. Chemikalien & Lösungen: - Autotrophe Nährlösung (siehe Methodenanhang) mit und ohne Norflurazon (10 µm; Molekulargewicht 269,1 g mol -1 ) Durchführung Zehn Sprosse werden mit einer Impföse unter insterilen Bedingungen (d. h. direkt am Arbeitstisch) in die Nährlösungen mit und ohne Norflurazon überführt (25 ml in 100 ml-kolben). Die Kultur wird im Tageslicht weiterkultiviert. Der Versuch ist nach einer Woche abzubrechen und auszuwerten. Eine Erweiterung des Versuches mit verringerter Hemmstoffkonzentration oder veränderter Lichtintensität (z.b. Abdunkeln mit Alu-Folie) ist leicht möglich und wird deshalb empfohlen. Die Norflurazonabfälle werden gesondert gesammelt und entsorgt. Auswertung Die Beschaffenheit der Sprosse (grün bzw. ausgebleicht) und ihre genaue Zahl ist nach einer Woche zu bestimmen und auf die Ausgangszahlen zu beziehen. Interpretation der beobachteten Ergebnisse mit Literaturhilfe (vgl. Schopfer/Brennicke). Arbeitszeit: 20 Minuten plus Auszählen nach einer Woche 12

14 1. Kurstag Komplex 3: Multiple Auxinwirkungen 3.1 Untersuchungen an Coleussprossen - Krümmung der Sprossachse, Verhinderung des Blattabfalls und Bildung von Adventivwurzeln Literatur: Schopfer II; Schopfer/ Brennicke. Für das Thema Phytohormone ist zurzeit das entsprechende Kapitel in Taiz/Zeiger (5. Auflage 2010) unübertroffen. Materialien & Geräte: - 3 Coleus-Pflanzen pro Gruppe - Schere - Spatel oder Streichhölzer - Beschriftungsband Chemikalien & Lösungen: Auxin- und Wasserpaste: Die Pasten werden im Mörser durch inniges Vermischen gleicher Teile von (wasserfreiem) Wollfett und Wasser bzw. wässriger Auxinlösung hergestellt. Lösungen bzw. Suspensionen 0,5 % IAA werden unter Vermittlung von wenigen Tropfen Ethanol bereitet. Durchführung Teil 1: Induktion von Adventivwurzeln Um junge und ältere Internodien einer Pflanze von Coleus wird Auxinpaste gestrichen, als Kontrolle dient Wasserpaste. Nach 3 Wochen wird der Versuch ausgewertet. Wenn Interesse besteht, so kann auch eine mikroskopische Analyse der Adventivwurzelbildung (Sprossquerschnitt) erfolgen. Teil 2: Auxin-induzierte Streckungsbewegung der Sprossachse An jüngeren Sprossachsenabschnitten gut gegossener Coleus-Pflanzen wird Auxinpaste einseitig aufgetragen. Kontrolle der sehr feucht, hell und warm zu haltenden Pflanzen (Kulturenraum) möglichst nach zwei Tagen (in Absprache mit dem Versuchsbetreuer) und nach einer Woche. Teil 3: Verhinderung der Abszission von Blättern durch Auxin An einer Coleus-Pflanze werden die Blätter wie folgt behandelt: a) Abtrennen der Blattspreite (Positivkontrolle) b) Abschneiden von 4/5 der Blattspreite (Negativkontrolle) c) Abschneiden der Blattspreite, Auftragen von Auxinpaste auf die Schnittfläche des Blattstieles (experimentelle Probe). Kontrolle erfolgt nach einer Woche. Auswertung (Bitte aber nicht ins Protokoll) 1. Welche Beziehung könnte zwischen Auxinwirkung und Phototropismus bestehen? 2. Diskutieren Sie die Wechselwirkung von Auxin und Ethylen beim Blattabfall! 13

15 1. Kurstag 3.2 Induktion des Streckungswachstums von Maiskoleoptilsegmenten durch Auxin Literatur: Kutschera Materialien & Geräte: - 8 Schalen etiolierte Maiskeimlinge 5 d bei 28 C auf feuchtem Filterpapier im Dunkeln angezogen (Die Keimlinge sollten zusätzlich 12 h vor Verwendung für 10 min mit Weißlicht bestrahlt werden, da dann die Koleoptile besser ausgebildet werden) - etwa 1 mm stumpfer Metallstift zur Entfernung des Primärblattes aus den Segmenten - Koleoptil-Schneidegerät (2 parallel im Abstand von 10 mm befestigte Rasierklingen) - Inkubationsapparatur mit elektrischer Pumpe. - Becherglas mit Wasser, Messpapier Chemikalien & Lösungen: - IAA-Stammlösung (1 mm) ist schon fertig. (Herstellung: 0,1 M Indolylessigsäure in 0,5 ml Ethanol vorlösen und auf 100 ml mit Aqua demin. auffüllen (kühl und dunkel etwa 1 Woche haltbar).) - Daraus Verdünnungen (= IAA-Testlösungen) 0,1 mm, 0,01 mm und 0,001 mm IAA herstellen. - Phosphatpuffer (5 mm) mit ph 3,0, 5,0 und 7,0; je 250 ml. Durchführung Aus geraden, etwa 25 mm langen Koleoptilen werden 30 Segmente von 10 mm Länge etwa 3 mm unter der Spitze herausgeschnitten und das darin befindliche Primärblatt vorsichtig herausgestoßen. Segmente in einem Becherglas mit Wasser sammeln. Je 10 Segmente fugenfrei auf die Nadel einer Messapparatur aufreihen und in demin. Wasser bei Raumtemperatur und kräftiger Belüftung aufbewahren. Nach 30 min (gerechnet ab Schneiden der Segmente) werden die Ansätze in 2 vorbereitete Reagenzröhrchen mit den IAA-Testlösungen umgesetzt. Die Längenmessung erfolgt zum Zeitpunkt t = 0 und dann über 3 h in 30 min-abständen. Die Nadel mit den Segmenten muss kurz herausgenommen und an ein Lineal angelegt werden (es ist darauf zu achten, dass zwischen den Segmenten während der Messung keine Fugen auftreten und die Segmente nicht überlappen). Jede Gruppe sollte 3 Varianten untersuchen: 1. Wasserkontrolle (Leitungswasser) 2. verdünntes Auxin 0,1 mm oder 0,01 mm 3. Eine in Absprache mit dem Versuchsbetreuer zu variierende Probe (siehe Varianten) Varianten: 1. Vergleich zweier IAA-Konzentrationen, also zusätzlich 0,001 mm 2. IAA-Konzentration (0,01 mm), jedoch nach einer Stunde Messung die IAA-Lösung durch Leitungswasser ersetzen und das Wachstum weiter verfolgen 3. Keine Auxinlösung verwenden, sondern Puffer mit den ph-werten 3,0, 5,0 oder 7,0. Bei Wunsch können auch nur diese Pufferlösungen miteinander verglichen werden. Auswertung Es ist der Wachstumsanstieg in Abhängigkeit von der IAA-Konzentration zu ermitteln (grafische Darstellung). Dazu muss darauf geachtet werden, dass die Messpunkte einen linearen Anstieg über 14

16 1. Kurstag die Zeit nehmen. Fragen zu Ihrer Vorbereitung (nicht für das Protokoll): 1. Was versteht man unter der Säure-Wachstumshypothese? 2. Warum dürfen die Koleoptile nicht zu alt sein? Arbeitszeit: 50 Minuten plus Messung aller 30 Minuten über 3 Stunden 15

17 1. Kurstag 3.3 Selektive Herbizidwirkung Literatur: Kutschera; R. Wejnar et al. (1994) Der Einfluss des selektiven Herbizids 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure auf Wachstum und Pigmentbildung bei mixo-, auto- und heterotroph kultivierten Lemna gibba-pflanzen. Angew. Bot. 68, Materialien & Geräte: 1. Je Gruppe 4-5 mit Komposterde gefüllte Blumentöpfe; Karyopsen von Getreide (Avena, Triticum) und Samen von Sinapis oder Kresse gemischt gesät (nicht zu dicht) und etwa 14 Tage im Gewächshaus vorkultiviert 2. Erlenmeyerkolben (100 ml), Impföse, Messzylinder (für 50 ml) 3. Sprühflaschen 4. große Plastikschale für jede Variante Chemikalien & Lösungen: 1. 0,05 %ige 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure-Lösung (wässrig) und 0,05 %ige IAA-Lösung zum Besprühen Wichtiger Hinweis: Die verwendeten Getreidearten und Lemnaceen gehören zu den Liliopsida, Senf und Kresse zu den Rosopsida. Durchführung Besprühen je eines Blumentopfes mit (i) dem Herbizid 2,4-D bzw. (ii) dem natürlichen Auxin IAA. (iii) Kontrolle: Besprühen mit Wasser. Vorsicht beim Besprühen mit Herbizidlösung, damit andere Pflanzen (und Menschen) nicht kontaminiert werden. Das Herbizid wird im Abzug versprüht. Variationsmöglichkeit: 0,005 % oder 0,0005 % IAA. Zusatzversuch: Mit 10 ml 0,05 % 2,4-D-Lösung gießen. Wie verhält es sich hierbei mit der Selektivität des Herbizides? Arbeitszeit: 30 Minuten plus Auswertung nach einer Woche 16

18 2. Kurstag Komplex 4: Wirkungen weiterer Phytohormone und das Phytochromsystem Noch einmal: Für das Thema Phytohormone ist zurzeit das entsprechende Kapitel in Taiz/ Zeiger (5. Auflage) unübertroffen. 4.1 Zwergmutanten der Erbse und ihre Normalisierung durch Gibberellinsäure Literatur: Kutschera Materialien & Geräte: Keimlinge von Pisum sativum Zwerg-Markerbsen z.b. Sorte Bördi, 2 Wochen im Gewächshaus vorkultiviert; Pro Gruppe 4 Töpfe mit jeweils mindestens 10 Pflanzen Plastikpipetten, Sprühflaschen Chemikalien & Lösungen: - Gibberellinsäure-Lösung (2 mm). - Für Teil 1: Vor Gebrauch die Stammlösung auf 0,2 mm verdünnen, - Für Teil 2: 1 mm, 0,1 mm, 0,01 mm, mit einer 0,1%igen Tween 20-Lösung vor Gebrauch aus der Stammlösung verdünnen Die Lösungen sind im Kühlschrank aufzubewahren. Durchführung Teil 1: Die vorkultivierten Kulturen werden (i) mit ca. 10 ml Lösung besprüht, (ii) mit ca. 10 ml GA3 gegossen bzw. (iii) nicht behandelt. Alle Töpfe sind hinreichend zu wässern. Die Auswertung erfolgt am folgenden Praktikumstag (Länge der Sprosse bis zur Knospe, Anzahl der Internodien). Bitte Mittelwerte und Standardabweichung angeben. Teil 2: Ein Tropfen der GA3-Verdünnungen (1 mm, 0,1 mm, 0,01 mm, 0 mm mit Tween = Kontrolle) wird auf die Apikalknospe von jeweils zwei oder drei Sprossen gegeben. Die Auswertung (siehe Teil 1) erfolgt nach einer und nach zwei Wochen. Hinweis: Tween ist ein nichtionisches Detergenz, das die Oberflächenspannung von wässrigen Lösungen herabsetzt. Auswertung nach einer und zwei Wochen: Von möglichst 10 Pflanzen werden die Mittelwerte und die Standardabweichung berechnet. Welche statistischen Tests können Sie ausführen? Hinweis: Vermiculit (Erklärung z.b. bei Wikipedia) ist ein hocherhitzter Dämmstoff aus der Bauindustrie. Als Ersatz für Boden sichert er eine ausgezeichnete Durchlüftung des Wurzelraumes. Er gibt von sich aus fast keine Nährstoffe ab, hat aber eine hohe Wasserspeicherkapazität. Arbeitszeit: 30 Minuten plus Auswertung nach ein und zwei Wochen. 17

19 2. Kurstag 4.2 Einfluss von Abscisinsäure auf die Samenkeimung Materialien & Geräte: - Samen von Sinapis alba (Senf) - Petrischalen - Filterpapier (autoclaviert) ml-bechergläser - Parafilm zum verschließen - 4 x 10 ml Standzylinder oder grad. Gläser Chemikalien & Lösungen: - Stammlösung 10-4 M ABA. - Lösungen von ABA: 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, jeweils 100 ml, plus Kontrolle (ohne ABA). Die Verdünnungen werden im Praktikum mit Leitungswasser hergestellt. Durchführung Die Petrischalen werden mit 3 Lagen Filterpapier belegt und jeweils 5 ml ABA-Lösung bzw. Wasser (Kontrolle) werden eingefüllt. Danach werden 30 Samen ausgelegt. Die Petrischalen werden mit Parafilm verschlossen und im Praktikumsraum oder im Gewächshaus aufgestellt. Auswertung 1. Die Keimprozente sind nach 7 Tagen zu bestimmen und gegen die Konzentration von ABA graphisch aufzutragen. 2. Die Keimfähigkeit der nicht gekeimten Samen ist zu überprüfen. Wie kann man das erreichen? Arbeitszeit: 15 Minuten plus Auswertung nach einer Woche. 18

20 2. Kurstag 4.3 Ein klassisches Experiment zur Phytochromwirkung Literatur: Kutschera; Schopfer/Brennicke Theorieteil: Skotomorphogenese und De-Etiolierung Vergleich verschiedener Entwicklungsstrategien Der eher theoretische erste Teil hat das Anliegen, die Eigenschaften etiolierter und grüner Pflanzen miteinander zu vergleichen. Da es sehr viele Unterschiede gibt (bitte frischen Sie Ihre Kenntnisse bei dieser Gelegenheit auf, so über unterschiedliche Phytochrome), könnten entsprechende Experimente fast beliebig erweitert werden. Der De-Etiolierungsprozess läuft bekanntlich auf allen Ebenen der Pflanze ab. Um Ihnen einen Überblick zu geben, sollen Sie in Ihrer Gruppe das Erscheinungsbild etiolierter und grüner Pflanzen gemeinsam mit einem Betreuer diskutieren. Materialien & Geräte: Pflanzenmaterial: Im Dunkeln und im Licht gewachsene Arabidopsis thaliana (auf Filterpapier) oder Tomate (auf Agar mit Nährmedium), 8 Tage alt, Ansatz in zwei Petrischalen aussäen. Falls sie verfügbar gemacht werden können, sollten photomorphogenetische Mutanten einbezogen werden, z.b. die aurea-mutante von Tomate. Diese Pflanzen werden für Sie vorkultiviert. Chemikalien & Lösungen: keine Praxisteil Experiment: Materialien & Geräte: - Lactuca-Achänen, Sorte Grand Rapid - Rundfilter, Messgläser - Petrischalen - Alu-Folie zum Verdunkeln - Dia-Projektoren mit Filtern für Rotlicht (R) und dunkelrotes Licht (FR), schwaches Grünlicht - Kisten zum Abdunkeln, Klebeband zum Beschriften Chemikalien & Lösungen: keine Durchführung In 6 Petrischalen mit 3 Lagen autoklaviertem Filterpapier wird so viel Leitungswasser gegeben, dass darauf ausgelegte Achänen gerade noch nicht wegschwimmen (etwa 5 ml). In jede Schale werden 30 Achänen gleichmäßig verteilt ausgelegt. Die Achänen werden nach der Quellung sehr rasch lichtempfindlich. Schalen nun sofort nach der Aussaat in Alufaolie einpacken und für 1h - 2 h ins Dunkle stellen (Holzkiste verwenden)! Die Schalen werden danach mit folgenden 6 Programmen bestrahlt: 19

21 2. Kurstag Ansatz 1: Ansatz 2: Ansatz 3: Ansatz 4: Ansatz 5: Ansatz 6: 2 min R + Dunkel 10 min FR + Dunkel 2 min R + 10 min FR + Dunkel 10 min FR + 2 min R + Dunkel Weißlicht (Tageslicht) Dunkel Bitte kombinieren Sie bei der Bestrahlung alle Varianten einer Bestrahlungsart so, dass insgesamt möglichst wenig Bestrahlungszeit benötigt wird. Die Auszählung erfolgt nach einer Woche. Als gekeimt gilt eine Achäne, wenn die Radicula die Achänenwand durchbrochen hat. Auswertung Die Keimprozente jeder Variante sind zu bestimmen und die Ergebnisse in Beziehung zum Phytochromsystem zu bringen. 20

22 2. Kurstag Komplex 5: Pflanzliche Inhaltsstoffe 5.1 Quantitative Bestimmung von Gesamtproteinen Müssen bei der Isolierung Detergentien eingesetzt werden, so versagt die übliche Bradford-Methode. Dies gilt z.b. für die Isolierung von Membranproteinen und damit auch, wenn eine Gesamtproteinbestimmung erforderlich ist. Materialien & Geräte: - Verschiedenes Saatgut, gemahlen - Vorrichtungen zum Homogenisieren - Eisbad - Tisch-Zentrifuge - Spektrophotometer - Koch-Wasserbad - Eppendorfpipetten mit Spitzen - Zentrifugenröhrchen - Vortexer - Kolbenpipetten (= automatische Pipetten) - Reagenzgläser, Pipetten Chemikalien & Lösungen: - Aceton - TRIS 50 mm, 20 g l -1 Na-Dodecylsulfat (SDS) - mit HCl auf ph = 8,3 einstellen; direkt vor der Verwendung im Praktikum (nicht vorher, auch wegen der Messelektrode) 10 ml l -1 Mercaptoethanol zugeben - TCA-Lösung (250 g l -1 Triochloressigsäure; Vorsicht, starke Säure! Hautkontakt vermeiden!) - Biuret-Reagenz - NaOH-Lösung (100 ml) - BSA-Stammlösung: 10 mg ml -1 Durchführung Jeweils eine Gruppe kann sich (muss aber nicht) auf eine Samen-(Karyopsen-)sorte beschränken. Von jeder Sorte sind 2 parallele Proben zu untersuchen. 1. Erstellen einer Eichkurve: Zunächst wird aus der Standardproteinlösung eine Verdünnungsreihe hergestellt um eine Eichkurve zu erhalten: 0,2/ 0,4/ 0,6/ 0,8 und 1 ml werden mit Wasser auf 1 ml aufgefüllt. Allen Ansätzen 4 ml Biuret-Reagenz zufügen, gut mischen und vor der Messung etwa 15 min warten. Die Referenzlösung enthält 1 ml Wasser + 4 ml Reagenz. Die klaren Lösungen werden gegen die Referenzlösungen photometrisch vermessen (1 cm Küvetten, 546 nm). 2. Homogenisation und Extraktion: Es werden 2 Proben zu genau 100 mg abgewogen. Mit 7 ml Extraktionspuffer versetzt, werden die Proben unter gelegentlichem Schütteln 10 min bei 100 o C in Zentrifugenröhrchen extrahiert. Nach dem Abkühlen erfolgt Zentrifugation (10 min bei 5000 rpm). 3. Fällung: Vom klaren Überstand werden jeweils 1 ml abgenommen und durch Zugabe von 1 ml TCA-Lösung im Eisbad gefällt. Nach 15 min den Niederschlag abzentrifugieren, mit 2 x 2 ml eiskaltem Aceton aufwirbeln und nochmals zentrifugieren. Aceton mit Kolbenpipette absaugen (Rest durch kurzes Erwärmen entfernen, es darf kein Lösungsmittel mehr vorhanden sein). Das Pellet wird in 1 ml 0,1 M NaOH gelöst und zur Proteinbestimmung wie bei der Erstellung der Eichkurve mit 4 ml Reagenz versetzt. 21

23 2. Kurstag 4. Colorimetrischer Test: Die Proben werden wie bei der Erstellung der Eichkurve bei 546 nm vermessen. Auswertung Ergebnisangabe: Proteingehalt pro Frischgewicht (achten Sie auf alle Verdünnungsschritte und auf die Angaben der Eichkurve!) Arbeitszeit: 90 Minuten plus 30 Minuten Eichkurve für die erste Gruppe 22

24 2. Kurstag 5.2 Ein Vorversuch zur pflanzlichen Molekularbiologie: Isolierung von DNA Materialien & Geräte: - Blattmaterial, z.b. Erbse - Reaktionsgefäße (2,0 ml, von Sarstedt) - Eppiständer - Pipetten - Eisbad - Schere - Tisch-Zentrifuge - UV-Spektrophotometer und UV-Küvetten (lila Markierung) - Nitrilhandschuhe (blau) - Vortex Chemikalien & Lösungen: - Lyse-Puffer - Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) - 75% Ethanol - Isopropanol alle Phenol/Chloroform-haltigen Sachen kommen in ein separates Abfallgefäß Isolation von DNA aus Pflanzen: 1) ~ 0,3 g Blattmaterial abwiegen (Gewicht aber genau notieren) und im Mörser auf Eis lagern 2) Blattmaterial mechanisch im Mörser in 1 ml Lyse-Puffer zerkleinern, auf zwei 2,0-ml-Reaktionsgefäße (Sarstedt) verteilen und anschließend für 5 min bei RT inkubieren 3) 600 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (steht im Kühlschrank) zugeben (im Abzug arbeiten!) 4) Proben kurz vortexen (jede Probe 5 sec ) 5) 5 min bei rpm bei RT zentrifugieren 6) Oberphase abnehmen, in neues 2 ml Eppi überführen (Abzug!) Hinweis: Die Interphase besteht aus Protein und darf nicht weiterverwendet werden. 7) 500 µl Chloroform/Iosamylalkohol zugeben (Abzug!) 8) Proben kurz vortexen (jede Probe 5 sec ) 9) 5 min bei rpm zentrifugieren 10) Oberphase abnehmen, in neues 2 ml Eppi überführen (Abzug!), 11) Chloroform/Isoamylalkohol-Extraktion noch 2x wiederholen 12) 1 Probenvolumen Isopropanol zugeben (vorgekühlt aus dem Kühlschrank) und gut mischen (Nicht vortexen!) 13) Proben 5 min auf Eis inkubieren, wenn möglich länger 14) 15 min bei rpm bei 4 C zentrifugieren 15) Flüssigkeit vorsichtig abnehmen bzw. abschütten 16) Pellet in 750 µl 75% EtOH (vorgekühlt aus dem Kühlschrank) waschen - Pellet muss schwimmen! 17) 5 min bei rpm bei 4 C zentrifugieren 23

25 2. Kurstag 18) Flüssigkeit vorsichtig abnehmen bzw. abschütten (nach einem kurzen Zentrifugationsschritt kann die restliche Flüssigkeit abpipettiert werden) [Vorsicht: Pellet nicht verlieren] 19) Pellet für min bei RT trocknen lassen 20) Pellet in 25 µl bis 50 µl dh 2O lösen (hängt von der Pelletgröße ab). 21) 25 μl dieser Lösung in eine Küvette mit 975 µl Wasser pipettieren, mischen und im Spektrophotometer messen Mit dem Programm DNA (Life sciences) wird die Konzentration und die Reinheit der DNA-Lösung gemessen. Es werden die Extinktionen bei 260 nm (Hauptextinktion von Nukleinsäuren), 280 nm (Hauptabsorption von Proteinen) und 230 nm (Gerbsäuren und Kohlenhydrate) gemessen. Zur Ermittlung der DNA-Reinheit werden die Quotienten E260/E280 und E260/E230 berechnet bzw. abgelesen (siehe dazu die oben genannten Hauptextinktionen). Wenn nur Absorptionswerte angezeigt werden: Extinktion 1 entspricht 50 µg dsdna ml -1. Fragen: 1. Welche DNA-Menge (total und pro Frischgewicht) haben Sie isoliert? 2. Was können Sie über die Reinheit Ihrer Präparation sagen? 3. Wie kann man RNA isolieren? (Die letzte Frage ist nur zu Ihrer Vorbereitung, nicht für das Protokoll). Arbeitszeit: 100 Minuten 24

26 2. Kurstag 5.3 Fett-Kohlenhydratumwandlung bei der Keimung fetthaltiger Samen Literatur: Schopfer II; Schopfer/Brennicke. Teil 1: Nachweis der Saccharosebildung: Materialien & Geräte: - 50 trockene Rapssamen sowie 50 Keimpflanzen (5-6 d nach Aussaat) - Präzisionswaage - Mörser - Quarzsand - Zentrifugenröhrchen (Hermle, verschließbar) - Zentrifuge mit swing-out-rotor - skalierte Glasröhrchen - Eppendorfgefäße (1,5 ml) - Pipetten + Spitzen - Wasserbad (100 C) - Spektrophotometer (578 nm) - Küvetten (1 cm) - Handschuhe Chemikalien & Lösungen: - Anthron-Reagenz (max. 2 Wochen alt; Vorsicht: konzentrierte Schwefelsäure!) - Saccharose-Stammlösung (50 mm) Durchführung: 1. Colorimetrischer Test: Zur Erstellung der Eichkurve wird die Saccharose-Stammlösung so verdünnt, dass folgende Mengen (Vorsicht: das sind keine Konzentrationsangaben!) in 200 µl Reinstwasser in Reaktionsgefäßen enthalten sind: 0, 2, 4, 6, 8, 10 µmol. Zu jedem Ansatz der Proben für die Eichkurve sowie zur Verdünnungsreihe der Messproben kommt 1 ml Anthron-Reagenz. Alle Proben werden dann 15 min im kochenden Wasserbad erhitzt und nach Abkühlung im Eisbad kräftig geschüttelt. Bei 578 nm wird gegen Luft (ohne Küvette im Vergleichsstrahlengang) vermessen. Die Nullprobe bedeutet Wasser plus Anthronreagenz, der sich dabei ergebende Wert muss subtrahiert werden. Bei Extinktionen über 0,9 muss entweder der Küvetteninhalt 1:10 verdünnt werden oder die Messungen mit der kleineren Konzentration erfüllen bereits das Kriterium. 2. Extraktion: Die ausgekeimten 50 Samen werden in Wurzeln, Sprosse und Kotyledonenpaare geteilt, auf Alu-Folie gewogen und anschließend in einem Mörser homogenisiert. Die 50 trockenen Samen werden ebenfalls gewogen und homogenisiert. Zur Homogenisation werden ca. 8 ml Reinstwasser und sehr wenig Sand mit den Proben in den Mörser gegeben. Das Homogenat wird in Zentrifugenröhrchen 5 min im kochenden Wasserbad erhitzt und anschließend 10 min bei 5000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wird sofort nach der Zentrifugation in skalierte Glasröhrchen überführt und auf genau 10 ml aufgefüllt. Diese werde mit Parafilm verschlossen und vorsichtig geschüttelt. Daraus werden je zweimal 10, 50 und 100 µl für eine Verdünnungsreihe in Eppendorfgefäße pipettiert und mit Reinstwasser auf 200 µl ergänzt (Leerwert 200 µl Reinstwasser). Dazu werden 1 ml Anthronreagenz (siehe Colorimetrischer Test) pipettiert und die Lösung wird gut gemischt. Danach kommt das Gemisch 15 min ins kochende Wasserbad, wird danach im Eisbad abgekühlt und die Extinktion gemessen. Auswertung Anhand der erstellten Eichkurve (nur eine Gruppe) ist die Saccharose-Konzentration zu berechnen. Arbeitszeit: 3,5 Stunden 25

27 2. Kurstag Teil 2: Triacylglycerinbestimmung: Materialien & Geräte - 50 trockene Rapssamen sowie 50 Keimpflanzen (5-6 d nach Aussaat) - Glycerol-UV-Test-Kit [R-Biopharm Nr. E ], Informationsblatt des Herstellers (Kopie) - verschließbare Röhrchen (10 ml) - normale Röhrchen - skalierte Glasröhrchen - Eppendorf-Reaktionsgefäße - Pipetten + Spitzen - Eisbad - Spektrophotometer (340 nm) - 3 ml-küvetten (1 cm) Chemikalien & Lösungen - Extraktionsmedium: 80 ml Chloroform + 40 ml Methanol - ethanolische KOH-Lösung (0,5 M): 1,4 g KOH in reinem EtOH lösen, auf 50 ml mit EtOH auffüllen - MgSO 4-Lsg. (0,15 M) Durchführung 1. Extraktion: Die ausgekeimten 50 Samen werden in Wurzeln, Sprosse und Kotyledonenpaare geteilt, auf Alu-Folie gewogen und anschließend homogenisiert. Die 50 trockenen Samen werden ebenfalls gewogen und homogenisiert. Zur Homogenisation werden ca. 6 ml Extraktionsmedium und sehr wenig Sand mit den Proben in den Mörser gegeben. Die Homogenate werden in verschließbare Röhrchen gefüllt, 20 min in ein Eisbad gestellt und gelegentlich kräftig geschüttelt. Nach Absetzen des Rückstandes (eine eventuell vorhandene Interphase wird nicht mitverwendet) wird der Überstand in skalierte Glasröhrchen überführt. Daraus werden 50 µl- Proben entnommen und in Eppendorfgefäße pipettiert. Eine Kontrolle (Extraktionsmedium ohne Pflanzenmaterial) wird analog den 3 Proben behandelt. 200 µl KOH-Lösung zugegeben, mischen (Schüttler) und 10 min bei Raumtemperatur stehen lassen. 500 µl MgSO4-Lsg. zugeben und erneut mischen (Schüttler). Anschließend 5 min bei 5000 rpm zentrifugieren. 2. Enzymatischer Test: Kopie (Die Lösung 1 wird zwecks Materialersparnis nicht mit 11 ml demin. H2O aufgefüllt, sondern 1,0 g abgewogen und mit 5,5 ml gelöst. Die Lösung soll etwa 10 min bei Raumtemperatur stehen. Die Lösungen 2 und 3 sind gebrauchsfertig. (Die Enzyme enthaltenden Lösungen während der gesamten Dauer des Testes - auf Eis belassen!) In die normalen Röhrchen werden pipettiert: oder in 2 ml Eppis: 1. Lösung 1: 1,00 ml 500 µl 2. demin. H2O: 1,50 ml 750 µl (900µl) 3. Probelösung (bzw. Kontrolle): 0,5 ml 250 µl (50µl) 4. Lösung 2: 0,01 ml 50 µl (5µl) mischen und anschließend 10 min bei 37 C im Wasserbad im Reagenzglasständer inkubieren bzw. im Inkubator in die Küvetten füllen und bei 340 nm gegen Wasser vermessen. Nach der Messung werden 0,01 ml von Lösung 3 zugegeben und sorgfältig gemischt. Nach 15 min 26

28 2. Kurstag bei Raumtemperatur wird die Extinktion bei 340 nm erneut gemessen. Hinweis: Die Teilreaktionen und die Extinktionskoeffizienten sind in Schopfer II beschrieben! Auswertung: siehe Schopfer und die Anleitung des Herstellers des Testbestecks. Die molare Glycerin(=Triacylglycerol-)Konzentration läßt sich mit Hilfe des Extinktionskoeffizienten von NADH (ε366 = 3.5 x 10 3 l x mol -1 cm) und der Verdünnungsfaktoren berechnen (LAMBERT- BEERsches Gesetz). Arbeitszeit: 4 Stunden 27

29 2. Kurstag 5.4 Isolierung und Nachweis der Alkaloide des Schöllkrauts Literatur: Schopfer I und II; Schopfer/ Brennicke Materialien & Geräte: - Frischer Spross von Chelidonium majus - TLC-Fertigfolien aus Kieselgel (in vier Teile aufteilen) - TLC-Tank, Pipetten, Kapillarröhrchen zum Auftragen - UV-Lampe, Schutzbrillen Chemikalien & Lösungen: - Berberin (feste Vergleichssubstanz), stark verdünnt einsetzen - Extraktionsmedium: 14 ml Methanol + 1 ml Essigsäure (Eisessig) - Laufmittel: 85 ml Chloroform + 15 ml Methanol + 1 ml demin. Wasser + 2 ml Essigsäure (Eisessig) Durchführung Ein Tropfen des bei frischen Pflanzen an der Schnittfläche austretenden Milchsaftes wird mit 100 μl Extraktionsmedium in einem 2 ml Reaktionsgefäß (Eppi) suspendiert. Es hat sich für praktisch erwiesen, dazu der Stängel direkt in das Eppi einzutaucht. Auf der Kieselgelfolie wird etwa 2 cm vom unteren Rand entfernt eine Bleistiftlinie gezogen. Nebeneinander werden mit einer Glaskapillare drei Tropfen dieses Gemisches auf die Linie aufgetragen, so dass eine Bande entsteht ( ). Zwischendurch trocknen lassen, damit die Bande nicht auseinanderläuft. Eine weitere Bande wird mit der doppelten Menge erstellt (auf jeden Punkt ein zweites Mal tupfen). Nach dem Trocknen der Flecken wird die Platte in den mit dem Laufmittel gefüllten Tank (Füllhöhe höchstens 0,5 cm) gestellt (im Abzug!). Kurz bevor die Laufmittelfront den oberen Rand der Platte erreicht hat, wird der Lauf abgebrochen (Laufzeit ca. 30 min). Sofort Laufmittelfront mit einem Bleistift markieren und die Rf-Werte ermitteln. Die Banden werden mit Bleistift markiert und die Farbe daneben notiert. Unter einer UV-B-Lampe (Dunkelkammer) werden die fluoreszierenden Banden ebenfalls mit der Farbe beschriftet. Zum Vergleich kann man z.b. Hylomecon japonicum, wie Schöllkraut ein Mohngewächs, benutzen. Achtung: Bitte Schutzbrille & Handschuhe unter UV-Licht tragen! Vergleichswerte: (s. Schopfer II) Die angegebenen Rf-Werte können nur eine grobe Orientierung sein, die Reihenfolge jedoch bleibt erhalten. - Sanguinarin (Farbe rot-orange; Fluoreszenz orange) Rf = 0,9 - Chelerythrin (Farbe goldgelb-zitronengelb; Fluoreszenz goldgelb) Rf = 0,8 - Berberin (Farbe zitronengelb; Fluoreszenz grün) Rf = 0,3 - Coptisin (Farbe gelb-gelbbraun; Fluoreszenz zitronengelb) Rf = 0,2 Es müssen auch die Fluoreszenzfarben zur Charakterisierung herangezogen werden. Anmerkungen 1. Ein Vergleich mit Rf-Werten aus der Literatur ist erfahrungsgemäß nur bedingt möglich. Das stellt jedoch kein Problem dar, weil der Vergleich von Absorptions- und Fluoreszenzfarbe eine eindeutige Zuordnung ermöglicht. 2. Als Vergleichssubstanz ist Berberin vorhanden. Um sie als Hilfe bei der Zuordnung einsetzen zu können, werden steigende Volumina auf die TLC-Folie mit aufgetragen. 28

30 2. Kurstag 3. Bitte nicht mehr als 5 Platten in ein Gefäß stellen, weil sich die Gruppen sonst gegenseitig durch zu häufiges Öffnen behindern. Arbeitszeit: 15 Minuten plus Minuten Laufzeit der TLC 29

31 3. Kurstag Komplex 6: Pflanzliche Enzyme 6.1 Operationale Kriterien der Enzymaktivitätsbestimmung - Fallstudie Fumarathydratase Literatur: Schopfer II, Schopfer/Brennicke Materialien & Geräte: - Keimlinge von Sinapis alba, 3 oder 4 d bei 25 C auf feuchtem Filterpapier angezogen, je Gruppe 2 Petrischalen mit mindestens 25 Keimlingen - Eisbad - Mörser - Quarzsand - Eppendorf-Zentrifuge mit Festwinkelrotor für U min -1 - Reaktionsgefäße (1,5 ml) - Peleusball und Glaspipetten - Spektrophotometer (240 nm, Kinetik), - 3 Quarzküvetten (1 cm, 3 ml), Stoppuhr oder Handy Chemikalien & Lösungen: - K-Phosphat-Puffer 50 mm, ph= 7,4 - L-Malatlösung (Na-Salz der Apfelsäure, 1,5 M; nicht mit Maleat verwechseln!) - Triton X Polyclar AT (PVP) (das ist unlösliches Polyvinylpyrrolidon!) - Dithioerythrit (CLELANDs Reagenz) 1 mm Durchführung Achtung! Vor Versuchsbeginn bitte die weiterführenden Experimente zur Kenntnis nehmen und nach Wunsch und in Absprache mit dem Versuchsbetreuer die eine oder andere Variante zusammen mit der Kontrolle einplanen. Alle Lösungen während der Präparation kalt halten (Eisbad). 1. Kotyledonen von 20 Keimlingen ernten und Frischgewicht bestimmen 2. Homogenisieren im Mörser mit wenig Quarzsand und 1 ml Puffer (ebenfalls eiskalt) im Eisbad. 3. Wenn keine Partikel mehr erkennbar sind, weitere 4,5 ml Puffer zugeben, gut durchmischen. Mit weiteren 4,5 ml nachspülen. Davon werden 2 ml in ein Reaktionsgefäß ( Eppi ) gegeben 4. Zentrifugation bei rpm für 10 min (gekühlte Tischzentrifuge) 5. Reaktionsgefäße vorsichtig aus dem Rotor nehmen und etwa 1 ml des klaren Überstandes unter der Fettschicht langsam absaugen (Pipette und Ball) 6. In eine Küvette (für kleinere Küvetten entsprechend herunterskalieren) wird pipettiert und auf Raumtemperatur temperiert: 2,8 ml Puffer 0,1 ml Malatlösung Jetzt wird der Leerwert gemessen. 7. plus 0,1 ml Enzymextrakt ( = Start der Reaktion) 30

32 3. Kurstag 8. Messung bei 240 nm gegen Puffer in Abständen von 1-3 min (je nach der Geschwindigkeit der Extinktionszunahme, d.h. der Enzymaktivität) über etwa 30 min. Weiterführende Experimente: 1. Ist das Enzym im Rohextrakt in der Kontrolle im Vergleich zum Ansatz maximal aktiv? (Welchen Effekt hat der Zusatz von Dithioerythrit (1 mm) auf die Enzymaktivität?) Zum Test dem Homogenisationspuffer Dithioerythrit zusetzen (1 ml Stammlösung herstellen auf Eis), ansonsten wie im Grundexperiment. 2. Gibt es Anhaltspunkte für Hemmstoffe im Extrakt? (Welchen Effekt hat eine Behandlung des Extraktes mit PVP?) PVP (10 mg) wird dem Puffer vor der Homogenisation zugesetzt. Achtung! PVP quillt im Puffer, dadurch nimmt das Extraktvolumen stark ab. Das Extraktvolumen muss bei der Berechnung der Enzymaktivität berücksichtigt werden. 3. Wird das Enzym durch die Extraktion optimal in Lösung gebracht? (Welchen Effekt hat der Zusatz von 0,5 ml Triton X-100 zu 100 ml Extraktionspuffer?) Auswertung Die Enzymaktivität von zwei unterschiedlich behandelten Proben (z.b. Kontrolle und Zusatz von Dithioerythrit) ist zu berechnen (siehe dazu Schopfer II) und zu vergleichen. Der Extinktionskoeffizient von Fumarat beträgt bei 240 nm 2, L mol -1 cm -1. Arbeitszeit: 2 Stunden 31

33 3. Kurstag 6.2 Die kinetische Charakterisierung eines Enzyms - Fallstudie Peroxidase Literatur: Schopfer II. Besonders bei diesem Versuch sollten Sie den entsprechenden Abschnitt vor Versuchbeginn gelesen haben. Materialien & Geräte - Meerrettichwurzel (im Kühlschrank aufbewahren für alle Kurse) - Messer, Mörser, Schneidbrettchen - Eisbad, Eppis 1,5 ml - Spektrophotometer (436 nm, 25 C) - Küvetten (1 cm) - Uhr - Glaspipetten, Peleusbälle - Tischzentrifuge - Schutzhandschuhe, Schutzbrille - Reagenzgläser (kurz) - Nitrilhandschuhe (blau) - Bechergläser 100 ml - Messzylinder 100 ml Chemikalien & Lösungen - Phosphatpuffer (50 mm, ph = 7,0) - Wasserstoffperoxid, 1 mm und 4 mm frisch verdünnen (die Perhydrol-Ausgangslösung enthält 30 Gew.-% = 9,8 M) - Guajakol (Lösung: 20 mm = 220 μl in 100 ml Reinstwasser, frisch ansetzen) Guajacol ist ein in Guajak-Bäumen vorkommender sekundärer Pflanzenstoff, der sich strukturell vom Anisol und vom Phenol ableitet. Guajacol ist einer der Aromastoffe von Whisky und Kaffee. Man macht auch Vanillin daraus. Sicherheitshinweis: Wasserstoffperoxid wirkt stark oxidierend, auch auf menschlicher Haut! Bitte Schutzhandschuhe und Schutzbrille beim Verdünnen tragen. Unverdünntes Guajacol sollte im Abzug gehandhabt werden. Es reizt Haut und Augen. Durchführung Herstellung des Enzymextraktes: 0,250 g fein zerschnittene Stückchen Meerrettich mit 1 ml Puffer und einer Prise Sand in einem Mörser auf Eis homogenisieren. Wenn keine Partikel mehr erkennbar sind, Suspension in Zentrifugenröhrchen (im Eisbad) gießen. Mörser mit 3 ml Puffer ausspülen, ebenfalls in das Röhrchen geben. 2 x 1,5 ml der Suspension in ein Reaktionsgefäß ( Eppi ) zum Zentrifugieren füllen. Danach Zentrifugation: Tischzentrifuge 10 min, rpm (= U min -1 ). Vom Überstand 1 ml abnehmen und mit 3 ml Puffer verdünnen (1+3-Verdünnung). Dies ist der Enzymextrakt. Hinweis: Die enzymatische Reaktion verläuft über verschiedene Teilreaktionen. Testansatz unter Verwendung von Teilreaktion 1: 32

34 3. Kurstag 0,4 ml Puffer + 1 ml Guajakol-Lösung + 0,05 ml Enzymextrakt in Küvette mischen (dann auf Raumtemperatur einstellen lassen). Leerwert messen. 0,05 ml H2O2-Lösung (1 mm) zugeben, mischen und Stoppuhr starten. Messung alle 10 s über 2 min. Testansatz unter Verwendung von Teilreaktion 2: Ebenfalls in eine Küvette pipettiert werden 1,4 ml Puffer, 0,025 ml Guajakol-Lösung, 0,05 ml Enzymextrakt. Die Reaktion wird mit 0,05 ml H2O2-Lösung (4 mm) gestartet und wie oben verfahren. Hinweis: Testansatz 1 sollte eine höhere Anfangsgeschwindigkeit haben als Testansatz 2. Warum ist das so? Die beiden vorverdünnten Wasserstoffperoxid-Lösungen (1 mm, 4 mm) sollten beim Einsatz nicht älter als 10 min sein. Wenn die Küvette durch Bildung eines Farbstoffes von innen beschlägt, dann bitte zwischen 2 Messreihen mit Aceton reinigen und mit Reinstwasser nachspülen. Auswertung Bestimmen Sie die Anfangsgeschwindigkeiten der beiden Enzymreaktionen und vergleichen Sie die Geschwindigkeiten miteinander (siehe Schopfer II). Arbeitszeit: ca. 30 min 33