Strukturaufklärung von Naturstoffen aus Bakterien der Gattung Streptomyces

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1 Strukturaufklärung von Naturstoffen aus Bakterien der Gattung Streptomyces vorgelegt von Diplom-Chemiker Jonny Nachtigall aus Hamburg Von der Fakultät II Mathematik und Naturwissenschaften der Technischen Universität Berlin zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Naturwissenschaften - Dr. rer. nat. - genehmigte Dissertation Promotionsausschuss: Vorsitzender: Erster Berichter: Zweiter Berichter: Prof. Dr. rer. nat. Thomas Friedrich Prof. Dr. rer. nat. Roderich D. Süßmuth Prof. Dr. rer. nat. Hans-Peter Fiedler Tag der wissenschaftlichen Aussprache: Berlin 2012 D 83

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5 Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit werden acht neue Naturstoffe aus vier verschiedenen Bakterienstämmen der Gattung Streptomyces in ihrer chemischen Struktur beschrieben. Zur Strukturaufklärung wurden umfangreiche massenspektrometrische und NMR-spektroskopische Analysemethoden eingesetzt. Bei den Naturstoffen handelt es sich zum einen um sieben Vertreter der Klasse I-Polyketide, zu anderen um einen Vertreter der Aranciamycine, welche aus einem kondensierten, hocharomatischen System der Klasse II-Polyketide bestehen. Die Bakterienstämme sind ausschließlich der Gattung Streptomyces zuzuordnen, wobei diese jedoch aus völlig unterschiedlichen Habitaten isoliert wurden. Während die eine Gruppe von Stämmen aus einem mitteleuropäischen Nadelwald isoliert worden ist, kommt ein weiterer Stamm aus der Atacamawüste, welche mit ihren extremen klimatischen Bedingungen eine der trockensten rte der Erde darstellt. Im Anschluss an ihre strukturchemische Charakterisierung wurden die Verbindungen in verschiedenen biologischen Testsystemen auf ihre Wirkung hin untersucht. Dabei zeigte sich ein breites Wirkspektrum der unterschiedlichen Substanzen bei antibakteriellen, antitumor- und enzyminhibierenden Testierungen. Die hierbei gewonnen Erkenntnisse tragen zu einem besseren Verständnis über Struktur und Wirkung von Naturstoffen bei. 5

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7 Teile der vorliegenden Arbeit wurden bereits veröffentlicht: D. Schulz, J. Nachtigall, J. Riedlinger, K. Schneider, K. Poralla, J.F. Imhoff, W. Beil, G. Nicholson, H.-P. Fiedler, R.D. Süssmuth, Piceamycin and its N-acetylcysteine adduct is produced by Streptomyces sp. GB 4-2 J. Antibiot., 2009, 62, J. Nachtigall, D. Schulz, W. Beil, R.D. Süssmuth, H.-P. Fiedler, Aranciamycin anhydride, a new anthracycline-type antibiotic isolated from Streptomyces sp. Tü 6384 J. Antibiot., 2010, 63, J. Nachtigall, A. Kulik, S. Helaly, A.T. Bull, M. Goodfellow, J.A. Asenjo, A. Maier, J. Wiese, J.F. Imhoff, R.D Süssmuth, H.-P. Fiedler, Atacamycins A-C, 22-membered antitumor macrolactones produced by Streptomyces sp. C38 J. Antibiot., 2011, 64, D. Schulz, J. Nachtigall, U. Geisen, H. Kalthoff, J.F. Imhoff, H.-P. Fiedler, R.D. Süssmuth, Silvalactam, a 24-membered macrolactam antibiotic produced by Streptomyces sp. Tü 6392 J. Antibiot., accepted 7

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9 Für meine Familie 9

10 Danksagung Herrn Prof. Dr. Roderich D. Süßmuth danke ich für die Aufnahme in die Arbeitsgruppe, die interessante Themenstellung, die sehr guten Arbeitsbedingungen sowie für die Betreuung der Arbeit. Herrn Prof. Dr. Hans-Peter Fiedler möchte ich herzlich für die sehr gute Zusammenarbeit bei allen gemeinsamen Projekten und für die Übernahme des Zweigutachtens danken. Des Weiteren möchte ich mich bei allen Mitarbeitern des Arbeitskreises von Prof. Fiedler herzlich für die freundliche und konstruktive Zusammenarbeit bedanken, insbesondere bei Dr. Dirk Schulz, Andreas Kulik und Nadine Horlacher. Herrn Prof. Dr. Thomas Friedrich danke ich für die bereitwillige Übernahme des Prufüngsvorsitzes. Bei Kati Winter möchte ich mich für die gute rganisation im Arbeitskreis Süßmuth bedanken. Bei Dr. Maria Schlangen und Christine Klose vom Institut für organische Chemie an der Technischen Universität Berlin möchte ich mich herzlich für die Unterstützung bei den hochauflösenden Massenspektrometrie- und den IR- Messungen bedanken. Dr. Reinhard Zeisberg und Dr. Jennifer Thuma danke ich für die tatkräftige Unterstützung bei den NMR-Experimenten. Prof. Dr. Johannes F. Imhoff vom Kieler Wirkstoffzentrum des IFM-GEMAR und seinen Mitarbeitern, insbesondere Dr. Heidi Zinecker, möchte ich für die Durchführung der Bioaktivitätsassays und die gute Zusammenarbeit danken. Dr. Graeme Nicholson von der Universität Tübingen möchte ich für die Durchführung der GC-MS-Analysen und der FT-ICR-MS-Messungen danken. Allen meinen Kollegen im Arbeitskreis Süssmuth möchte ich für die nette und kollegiale Arbeitsatmosphäre danken, besonders Dr. Soleiman Helaly, Dr. Joanna Krawczyk, Dr. Wolfgang Müller, Dr. Anne Hänchen, Dr. Georg Sambeth und Alexander Denisiuk. 10

11 Für ihre unermessliche Geduld, antreibenden Worte und die schöne Zeit während des Zustandekommens dieser Arbeit danke ich meiner Frau Stephanie Nachtigall. 11

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13 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Entwicklung der Naturstoffforschung, Entdeckung der Antibiotika und Resistenzbildung Grundlagen Chromatographische Trennmethoden Retentionsmechanismen Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) Massenspektrometrie [15-19] Aufbau eines Massenspektrometers Ionenerzeugung Elektrospray-Ionisation (ESI) Massenauftrennung [15-19] Detektion Kernresonanz-Spektroskopie Experimentelle Grundlagen Zielsetzung Strukturaufklärung des Piceamycins und seines N- Acetylcystein-Addukts aus Streptomyces sp. GB Herkunft und Taxonomie des Bakterienstammes Streptomyces sp. GB Chemisches Screening Fermentation und Isolierung Strukturaufklärung HPLC-ESI-MS Bestimmung der Summenformel Aminosäureanalytik NMR-Spektroskopische Untersuchungen Biologische Aktivität Diskussion Strukturaufklärung des Aranciamycin-Anhydrids aus Streptomyces TÜ

14 Inhaltsverzeichnis 5.1 Herkunft und Taxonomie des Bakterienstammes Streptomyces sp. TÜ Chemisches Screening Isolierung und Reinigung Strukturaufklärung HPLC-ESI-MS Bestimmung der Summenformel Zuckeranalytik NMR-spektroskopische Untersuchungen Biologische Aktivität Diskussion Strukturaufklärung der Atacamycine A, B und C aus Streptomyces sp. C Herkunft und Taxonomie des Bakterienstammes Streptomyces sp. C Chemisches Screening Isolierung und Reinigung Strukturaufklärung HPLC-ESI-MS Bestimmung der Summenformel NMR-spektroskopische Untersuchungen Biologische Aktivität Diskussion Strukturaufklärung von TÜ 6392 A2 und TÜ 6392 D aus Streptomyces sp. TÜ Herkunft und Taxonomie des Bakterienstammes Streptomyces sp. TÜ Chemisches Screening Isolierung und Reinigung Strukturaufklärung von TÜ 6392 A HPLC-ESI-MS Bestimmung der Summenformel NMR-Spektroskopische Untersuchungen Biologische Aktivität

15 Inhaltsverzeichnis 7.4 Diskussion Strukturaufklärung von TÜ 6392 D HPLC-ESI-MS Bestimmung der Summenformel NMR-Spektroskopische Untersuchungen Biologische Aktivität Diskussion Experimenteller Teil Chemisches Screening mittels HPLC-DAD HPLC-DAD-ESI-Massenspektroskopie GC-MS ESI-FT-ICR-Massenspektrometrie HPLC-ESI-FT-rbitrap-Massenspektrometrie NMR-Spektroskopie Anhang Abkürzungsverzeichnis Literaturverzeichnis NMR-spektroskopische Daten der in dieser Arbeit strukturaufgeklärten Verbindungen Piceamycin N-Acetyl-Piceamycin Aranciamycin-Anhydrid Atacamycin A Atacamycin B Atacamycin C TÜ 6392 A TÜ 6392 D

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17 Einleitung 1 Einleitung Naturstoffe sind aufgrund ihrer potenziellen Wirksamkeit seit jeher von großer Bedeutung. Seit der Entdeckung des Penicillins und dem Beginn der wissenschaftlichen Forschung auf dem Gebiet der Antibiotika sind in der Natur vorkommende Wirkstoffe aus unserem heutigen Verständnis von Pharmazeutika nicht mehr wegzudenken. Mehr als 75 % der in den letzten 30 Jahren eingeführten antibakteriellen Wirkstoffe und über die Hälfte aller zugelassenen Antitumormedikamente sind Naturstoffe oder Naturstoffderivate. [2] 1.1 Entwicklung der Naturstoffforschung, Entdeckung der Antibiotika und Resistenzbildung Noch vor 100 Jahren waren die Heilungschancen für die meisten aller Infektionskrankheiten verschwindend gering, bedeutete doch eine bakterielle Infektion meist den sicheren Tod des Patienten. Seit der Frühgeschichte sind immer wieder verheerende Epidemien überliefert, die gerade in den eng bebauten und hygienisch schlecht gestellten Armenvierteln der Städte in aller Welt einen Großteil der Bevölkerung dahinrafften. Mit der Verbesserung der Hygiene und der strikten Trennung zwischen Trink- und Brauchwasser konnten zunächst die Überlebenschancen der erkrankten Menschen verbessert werden und die Verminderung von Infektionskrankheiten im Allgemeinen erreicht werden. Die stärkste Waffe gegen Infektionskrankheiten wurde jedoch im Jahr 1928 entdeckt, als Sir Alexander Fleming aus dem Schimmelpilz Penicillium notatum das Penicillin als erstes eingesetztes Antibiotikum isolierte. [3] Mit diesem Medikament konnten zum ersten Mal verschiedene Arten von bakteriellen Infektionen geheilt werden, die ohne Medikation den sicheren Tod für den Patienten bedeutet hätten. Allerdings kannte und nutzte die Menschheit die Vielseitigkeit der Natur schon seit der Antike. [4] Meist wurden Extrakte aus Pflanzen als Schmerzhemmer, Aphrodisiakum oder Rauschmittel verwendet und bilden somit die antike Vorgeschichte der heutigen Pharmazie. [5] 17

18 Einleitung a) b) Penicillin G Sulfamidochrysoidin Abbildung 1: Strukturformeln von a) Penicillin G und b) Sulfamidochrysoidin. Zwar konnte die bakterizide Wirkung des Penicillins durch mikrobiologische Versuche rasch hinreichend bewiesen werden, die Struktur des Wirkstoffs hingegen konnte erst 1944 durch Dorothy Hodgkin mittels Röntgenstrukturanalyse aufgeklärt und somit für weitere semisynthetische Ansätze zur Verbesserung der Pharmakologie zugänglich gemacht werden (Abbildung 1). Dabei zeigte sich, dass die pharmakophore Gruppe des Penicillins ein β-lactam darstellt, wonach diese Wirkstoffgruppe β-lactam- Antibiotika genannt wurden. Antibakterielle Wirkstoffe sind jedoch nicht nur ausschließlich in der Natur zu finden. Gerhard Domagk entdeckte mit dem Sulfamidochrysoidin bereits 1935 einen gänzlich synthetischen Arzneistoff, indem er verschiedene Azofarbstoffe an mit Streptokokken infizierte Mäuse verabreichte. [6] Die Sulfonamide wirken jedoch im Gegensatz zu den β-lactam-antibiotika nur bakteriostatisch, weswegen sich bei den Sulfonamiden zügig eine Resistenz ausbilden kann und diese heutzutage im Gegensatz zu den Penicillin-Derivaten seltener als Wirkstoff in der Humanmedizin zu finden sind. Diese Meilensteine markieren den Anfang des wissenschaftlichen Forschens zur Entdeckung und Strukturaufklärung von biologisch aktiven Naturstoffen. Inzwischen sind insgesamt sieben große Gruppen von antibiotischen Wirkstoffen bekannt und ihre Anzahl wächst stetig weiter. [7] Dem gegenüber steht jedoch die ebenso steigende Zahl an resistenten bakteriellen Erregern. Schon Anfang der 50er Jahre wurden die ersten Penicillin-resistenten Bakterienstämme entdeckt, die durch natürliche Mutationen an den Penicillin-Wirkorten oder durch Penicillin- Inaktivierungsprozesse entstanden. [7, 8] Im Jahr 2005 infizierten sich allein in Europa drei Millionen Menschen an resistenten Keimen, die durch kein zugelassenes Medikament behandelt werden konnten davon starben. [9] 18

19 Einleitung a) H H2 N b) H 3 C H H CH 3 CH 2 H Cl H H H 2 C H NH H N H H Cl H N H H H N H H H N NH 2 H NH CH 3 NH H Vancomycin xacillin Abbildung 2: Strukturformeln der Antibiotika a) Vancomycin und b) xacillin. Zu den gefährlichsten humanpathogenen Erregern gehört der Stamm Staphylococcus aureus, von dem manche Arten bereits Resistenzen gegen die Antibiotika Vancomycin und xacillin ausgebildet haben und die vermehrt in Krankenhäusern gefunden werden können (Abbildung 2). Vancomycin und xacillin gehören zu der sogenannten Gruppe der Reserveantibiotika, welche nur gegen Infektionen verabreicht werden, die mit der Verabreichung von anderen Antibiotika nicht behandelt werden können. Somit kann xacillin als Endpunkt des therapeutischen Erfolgs der Klasse von β-lactam-antibiotika angesehen werden, sollte nicht noch ein wirksamer Nachfolger gegen multiresistente Erreger gefunden werden. a) b) Linezolid Tigecyclin Abbildung 3: Strukturformeln der Antibiotika a) Linezolid [10] und b) Tigecyclin [11]. 19

20 Einleitung Nach und nach verlieren ehemalige Reserveantibiotika ihre Stellung an neu entwickelte, wirksame Vertreter wie Linezolid [10], Tigecyclin [11] (Abbildung 3) oder Daptomycin [12] (Abbildung 4), welche heutzutage zur Ersttherapie gegen multiresistente Bakterienstämme verwendet werden, da gegen viele Erreger kein anderes Medikament noch Wirkung zeigt. [13] HN H N NH N H CNH 2 C 2 H H N N H H NH 2 N H H N C 2 H H N C 2 H H N N H NH 2 H N H 10 NH NH C 2 H Abbildung 4: Strukturformel von Daptomycin [12]. Somit ist ein Ziel der wissenschaftlichen Suche nach neuen Wirkstoffen auch das Streben nach einer möglichst hohen Anzahl an wirksamen Medikamenten, um den Wettlauf gegen die neuen multiresistenten Keime nicht zu verlieren. 20

21 Grundlagen 2 Grundlagen 2.1 Chromatographische Trennmethoden Die Chromatographie wurde zuerst von dem russischen Botaniker Michail Semjenowitsch Tswett im Jahr 1903 beschrieben, als er einen Chlorophyll-Extrakt aus Pflanzen mittels einer Säule aus Calciumcarbonat in seine Bestandteile auftrennte. Aufgrund der auftretenden farbigen Banden nannte er die neue Technik Chromatographie, nach den griechischen Worten chroma Farbe und graphein schreiben. Erstaunlicherweise blieben die Ergebnisse von Tswett lange von der Fachwelt unbeachtet. Anfang der 30er Jahre griff die Arbeitsgruppe von Richard Kuhn am Kaiser-Wilhelm-Institut für medizinische Forschung in Heidelberg diese Technik wieder auf, um ein Farbstoffgemisch aus Carotinoiden und Xanthophyllen aus Pflanzenextrakten aufzutrennen wurde Richard Kuhn der Nobelpreis für seine allgemeine Arbeit zu den Carotinoiden und Vitaminen verliehen. Seitdem wird die Entwicklung neuer Chromatographiemethoden stetig vorangetrieben. Archer J.P. Martin und Richard L.M. Synge erhielten 1952 den Chemie-Nobelpreis für die im Jahre 1941 vorhergesagte Verteilungschromatographie zwischen einer mobilen gasförmigen und einer stationären flüssigen Phase. Diese Entdeckung führte in den 1950er Jahren zu der Entwicklung von Gaschromatographen. In den 1960er Jahren erfolgte dann die Entwicklung der Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC). Hierzu wurden zunächst unpolare Alkanketten über eine Etherbindung an das Kieselgel-Trägermaterial geknüpft, um eine genügend unpolare stationäre Phase zu bilden. Durch diese Modifizierung konnte nun ein Großteil der organischen Substanzen auf dieser Art von Säulen retardiert werden, da für eine Wechselwirkung mit unmodifiziertem Kieselgel die meisten Naturstoffe zu unpolar waren. Des Weiteren wurde die Druckstabilität der Chromatographieanlagen enorm gesteigert, so dass nun eine höhere Trennleistung möglich war. Die andauernde Entwicklung der Technik und Methodik der Chromatographie hat diese zu einer Standardmethode für die Auftrennung von verschiedensten Substanzen werden lassen. Durch die Nutzung verschiedener 21

22 Grundlagen stationärer Phasen und Trenntechniken lässt sich heutzutage beinahe jedes Stoffgemisch durch die Chromatographie in seine Bestandteile auftrennen. Auch in der Zukunft wird daher die Chromatographie aus der Analytik insbesondere der Bioanalytik nicht wegzudenken sein Retentionsmechanismen Die Technik der chromatographischen Trennung beruht auf der unterschiedlichen Wechselwirkung des Stoffgemischs mit der stationären Phase. Die hierdurch hervorgerufene Retention kann anhand des dominierenden Mechanismus bei der Trennung charakterisiert werden, jedoch handelt es sich bei den meisten Verfahren um eine Kombination verschiedener Mechanismen. Die grundlegenden in dieser Arbeit angewendeten Mechanismen sollen hier kurz vorgestellt werden Verteilungschromatographie Die chromatographische Trennung bei der Verteilungschromatographie beruht auf dem Gesetz der multiplen Verteilung. Ein Analyt A ist in der stationären und der mobilen Phase unterschiedlich gut löslich, sodass sich nach dem Nernst schen Verteilungsgesetz ein Gleichgewicht einstellt. A M A S Daher kann für jede Substanz im Stoffgemisch eine Verteilungskonstante K c angegeben werden, welche sich aus der Konzentration eines Stoffs in der stationären Phase c S und der mobilen Phase c M zusammensetzt. K C c c S M Aufgrund der unterschiedlichen chemischen Struktur von Substanzen in einem Gemisch haben diese alle unterschiedlich große Verteilungskonstanten. Genau 22

23 Grundlagen dieser Effekt wird bei der Verteilungschromatographie ausgenutzt: Die Substanzen verteilen sich unterschiedlich in der stationären und mobilen Phase und werden somit aufgetrennt. Ein prominenter Vertreter dieser Trenntechnik ist die Gaschromatographie. Hierbei wird die unterschiedliche Löslichkeit der Analyten im Trägergas (mobile Phase) zu einem Flüssigkeitsfilm (stationäre Phase) ausgenutzt, um die Analyten voneinander zu trennen Adsorptionschromatographie Die Trennung der Analyten bei der Adsorptionschromatographie beruht auf der unterschiedlichen Bindung der Stoffe an eine feste stationäre Phase. Bei dieser Bindung kann es sich um Van-der-Waals-Kräfte, Wasserstoffbrückenbindungen, Dipol-Dipol-Wechselwirkungen oder Ionenbindungen handeln, weshalb hierbei auch häufig polare stationäre Phasen wie silikabasierende Materialien (Si 2 ) oder Aluminiumoxide (Al 2 3 ) zum Einsatz kommen. Die Auftrennung der Analyten erfolgt über die unterschiedlich starke Bindung der Analytmoleküle an die stationäre Phase Größenausschlußchromatographie Diese Trennmethode nutzt die unterschiedliche Größe der Analytmoleküle in Lösung aus. Bei dem Säulenmaterial handelt es sich um hochvernetzte, poröse Materialien mit einer je nach Substanzgemisch definierten Porenweite. Kleine Moleküle können in die Poren diffundieren, während großen Molekülen weniger Porenvolumen zur Verfügung steht und daher die Säule schneller passieren. Aufgrund dieses Retentionsprinzips eluieren große vor kleinen Molekülen, da diesen eine kürzere Wegstrecke in der Säule zur Verfügung steht Ionaustauschchromatographie Der Trennmechanismus bei der Ionaustauschchromatographie beruht auf der ionischen Wechselwirkung zwischen geladenen Analytmolekülen und entgegensetzt geladenen Ionen, welche zumeist an eine polymere Matrix gebunden sind. Aufgrund 23

24 Grundlagen der unterschiedlich starken Ausprägung der ionischen Wechselwirkungen zwischen den Analyten und der stationären Phase kommt es zu unterschiedlicher Retention der Analytmoleküle und somit zur Auftrennung Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) Die Abkürzung HPLC wurde ursprünglich für high pressure liquid chromatography gewählt, da bei der Entwicklung dieser Technologie die hohen Drücke bis 400 bar die entscheidende Neuerung darstellten. Inzwischen hat sich die HPLC als System weitestgehend etabliert, so dass man heutzutage von high performance liquid chromatography spricht, da durch den Einsatz von druckstabilen Säulen und Geräten ein wesentlich besseres Trennungsvermögen im Gegensatz zur normalen Säulenchromatographie erreicht wird. Neuerdings werden sogar Anlagen und Säulen bis 1200 bar eingesetzt. Hierbei spricht man von UHPLC (ultra high performance liquid chromatography), die durch den Einsatz von kleineren Partikelgrößen der Trennsäulen eine höhere Trennleistung und eine kürzere Analysenzeit bieten. Aufgrund der schnellen Analysenzeiten muss auch der Detektor eine genügend schnelle Messgeschwindigkeit besitzen, was jedoch zum jetzigen Zeitpunkt nicht von allen Massenspektrometern erreicht werden kann. Aufbau Eine HPLC-Anlage besteht im Wesentlichen aus vier Teilen (Abbildung 5): Pumpe Probenaufgabesystem Säule Detektor 24

25 Grundlagen Abbildung 5: Schematischer Aufbau einer HPLC-Anlage. Pumpe Die Pumpe fördert die zur Analyse benötigten Lösungsmittel aus den Vorratsgefäßen und baut den zur Trennung nötigen Druck auf. Um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, werden die Lösungsmittel zuerst von gelösten Gasen wie Stickstoff und Sauerstoff mittels eines online-entgasers befreit. Um die Trennung des Analyten zu optimieren, wird in der HPLC sehr häufig mit Gradientenelution gearbeitet, d.h. die Zusammensetzung der Lösungsmittelgemische ändert sich mit der Zeit der Messung. Dieses resultiert in einer steigenden Elutionskraft der mobilen Phase, schärferen Peaks und kürzeren Laufzeiten. Die Zusammenführung der Lösungsmittel findet zu meist hinter den Pumpen in einer Mischkammer statt. Probenaufgabe Die Probenaufgabe erfolgt im Allgemeinen über eine Probenschleife, auf die die flüssig vorliegende Probe aufgetragen und anschließend in die mobile Phase eingekoppelt wird. Die mobile Phase trägt dann die Probe im Fluss mit sich durch die Trennsäule. Im Speziellen wird dieser Vorgang entweder durch ein Sechswegeventil oder einen Autosampler realisiert. Bei einem Sechswegeventil spritzt man die Probe mittels einer Injektionsnadel in die Schleife, bei einem Autosampler wird die Probe in einem separaten Gefäß vorbereitet und automatisch in die Schleife injiziert. Dieses Prinzip ist aufgrund der hohen Automatisierbarkeit besonders gut geeignet, um hohe Durchsatzraten zu erzielen. 25

26 Grundlagen Säule Grundsätzlich lassen sich in einer HPLC-Anlage Säulen von allen Chromatographiearten betreiben, sofern die Säule selbst und das darin befindliche Säulenmaterial den erhöhten Druck widerstehen können. Allerdings bedeutet eine Trennung bei erhöhtem Druck nicht für jede Chromatographieart zwangsläufig einen Vorteil, weswegen sich die die HPLC-Trennung hauptsächlich adsorptionsbasierte Trennmechanismen eignen. Hierzu zählen zum einen die Normalphase (NP, normal phase), und zum anderen die Umkehrphase (RP, reversed phase). Eine Normalphasensäule enthält meist Kieselgel (Si 2 ), wobei diese stationäre Phase eine polare berfläche besitzt und somit als Laufmittel unpolare oder wenig polare organische Lösungsmittel benutzt werden. Zur Verbesserung der Trenneigenschaften ist die Form der Kieselgelpartikel meist sphärisch und besitzt eine geringe Größenverteilung. Der Trennmechanismus bei der Normalphase basierend auf Adsorptionswechselwirkungen ist mit dem einer herkömmlichen Kieselgelsäule vergleichbar. Aufgrund der besseren Stabilität und Permeabilität werden neuerdings auch monolithische Kieselgelsäulen als Säulenmaterial verwendet. [14] Die Umkehrphase hingegen besitzt eine unpolare stationäre Phase und eine polare mobile Phase. Das Säulenmaterial besteht aus einem oberflächenmodifizierten Kieselgel. Dabei werden die Hydroxygruppen an der berfläche der Kieselgelkugeln mit Alkylketten definierter Länge versehen. Je nach Polarität der Analyten werden mit ctadecyl- (C 18 ) ctyl- (C 8 ) oder Butylresten (C 4 ) modifizierte Säulen eingesetzt. Aufgrund der sehr guten Trenneigenschaften für kleine Moleküle ist die Umkehrphasechromatographie inzwischen zu der Standardtrenntechnik in der Bioanalytik avanciert. Detektor Die Detektion der getrennten Komponenten erfolgt meist über einen UV/Vis-Detektor oder einem leistungsstärkeren Diodenarraydetektor (DAD), in manchen Fällen erfolgt eine Kopplung mit einem Massenspektrometer. Das Prinzip eines UV/Vis-Detektors beruht auf der Lichtabsorption nach dem Lambert-Beer schen Gesetz, nach dem die Extinktion proportional zur Konzentration der Probe und zur Länge des Strahlengangs ist. Aus dem kontinuierlichen, elektromagnetischen Spektrum kann 26

27 Grundlagen durch einen Monochromator eine Wellenlänge herausgefiltert werden, so dass diese in Abhängigkeit von der Retentionszeit gemessen und daraus ein Chromatogramm erstellt werden kann. Ähnlich, jedoch leistungsfähiger, arbeiten Diodenarraydetektoren. Bei einem DAD ist es nicht nötig, eine bestimmte Wellenlänge herauszufiltern. Hier wird das Spektrum über einen Polychromator in seine einzelnen Wellenlängen zerlegt und über ein Diodenfeld detektiert. Somit erhält man alle Wellenlängen in Abhängigkeit der Retentionszeit. Eine weitere Möglichkeit zur Detektion ist der Anschluss eines Massenspektrometers an die HPLC. Dieses beruht heutzutage überwiegend auf dem Prinzip der Elektrospray-Ionisation (ESI), bei dem das Lösungsmittel verdampft und die Moleküle über eine geladene Metallkapillare ionisiert und in das Hochvakuum geleitet werden. Das Prinzip dieser massenspektrometrischen Technik wird im folgenden Kapitel ausführlich erklärt. 2.2 Massenspektrometrie [15-19] Aufbau eines Massenspektrometers Die Massenspektrometrie ist ein Verfahren zur Messung des Verhältnisses von Masse zu Ladung m/z von Teilchen. Ist die Ladung z bekannt, kann aus dem Verhältnis die Masse m des Teilchens berechnet werden. Dafür werden aus den zu untersuchenden Molekülen zunächst über verschiedene Methoden positive oder negative Ionen erzeugt, die anschließend nach ihrem Masse-/Ladungsverhältnis getrennt und schließlich nachgewiesen werden (Abbildung 6). 27

28 Grundlagen analysator Einlass- System Ionenquelle Massen- Vakuumsystem Detektor Daten- system Abbildung 6: Schematischer Aufbau eines Massenspektrometers Ionenerzeugung Während der Entwicklung der Massenspektrometrie wurde eine Vielzahl von Ionisationtechniken für unterschiedlich vorliegende Probenmoleküle entwickelt (Abbildung 7). Generell lässt sich die Ionisation mit fünf verschiedene Methoden erreichen, wovon hier die wichtigsten beschrieben sind. Ionenquelle Analysator Detektor - Elektronenstoß-Ionisation (EI) - Chemische Ionisation (CI) - Fast Atom Bombardment (FAB) - Elektrospray-Ionisation (ESI) - Matrix-unterstützte Laserdesorption (MALDI) - Atmospheric pressure chemical Ionisation (APCI) - Feldionisation (FI) - Felddesorption (FD) - Quadrupol (Q) - Magnetisches Sektorfeld - Elektrisches Sektorfeld - Flugzeitanalysator (TF) - Elektrische Ionenfalle (ion trap, rbitrap) -Elektromagnetische Ionenfalle (Ionencyclotron, ICR) - Faraday-Cup - Sekundärelektronen- Vervielfacher (SEV) - Szintillationszähler - Vielkanalplatte Abbildung 7: Übersicht über Ionisations-, Analysator- und Detektortechniken. Elektronenstoßmethoden 28

29 Grundlagen Zu dieser Methode gehören die heute weit verbreiteten Ionisationsmethoden Elektronenstoß- (EI) und chemische Ionisation (CI). Bei der Elektronenstoßionisation werden aus einem Filament heraus mittels einer angelegten Spannung Elektronen beschleunigt und durch die gasförmig vorliegende Probe geleitet. Dabei werden die Probenmoleküle ionisiert und zerfallen spontan in kleine Molekülfragmente, welche anschließend detektiert werden können. Bei der hiervon abgeleiteten chemischen Ionisation wird ein Primärgas durch Elektronenstoßionisation geladen, welches anschließend in einer Sekundärreaktion den Analyten ionisiert. Feldionisationsmethoden Bei der Feldionisation wird die Analyten zwischen zwei Elektroden durchgeleitet, an denen eine hohe elektrische Spannung (10 20 kv) angelegt ist. Die Analytmoleküle diffundieren in die fein verzweigte Struktur der Ionisationselektrode, wo sie durch das gebildete elektrische Feld ionisiert und in Richtung des Analysators geleitet werden. Liegt der Analyt gasförmig vor, so spricht man von Feldionisation (FI), liegt er flüssig oder als Lösung vor, von Felddesorption (FD). Teilchenbeschussmethoden Durch den Beschuss von flüssigen oder festen Analyten mit schnellen Atomen oder Ionen werden aus diesem Elektronen herausgeschlagen und es bilden sich detektierbare Ionen. Bei der Verwendung von Atomen nennt sich diese Technik fast atom bombardment (FAB), bei der Nutzung von Ionen spricht man von secondary ion mass spectrometry (SIMS). Photoionisationsmethoden Die gebräuchlichste Photoionisationsmethode in der Bioanalytik ist die Matrixunterstützte Laser-Desorption/Ionisation (MALDI). Hierbei wird der Analyt in eine Matrix mit definierter Anregungswellenlänge eingebettet und diese dann kokristallisiert. Die Matrixmoleküle sind zumeist aromatische Verbindungen (wie z.b. α-cyano-4-hydroxyzimtsäure oder 2,5-Dihydroxybenzoesäure), da diese besonders gut mittels Laserstrahlung angeregt werden können und relativ gut homogen kristallisieren. Bei der anschließenden Bestrahlung der Matrix mit Laserlicht absorbiert diese dann die Energie, was zur Verdampfung des Matrixmaterials und schließlich zum Herauslösen des ionisierten Analyten führt. 29

30 Grundlagen Sprühmethoden Die Sprühmethoden gliedern sich in zwei unterschiedliche Methoden zur Ionisation. Bei der Elektrospray-Ionisation (ESI) wird die Analytlösung zerstäubt, ionisiert und die Lösungsmittelreste entfernt, so dass der Analyt als Ion vorliegt. Aufgrund der herausragenden Bedeutung der Elektrospray-Ionisation für diese Arbeit soll diese im nächsten Kapitel ausführlich behandelt werden. Eine weitere Sprühmethode ist die atmospheric pressure chemical ionisation (APCI). Im Gegensatz zur ESI-Technik wird hier zuerst die Lösung verdampft, bevor der Analyt ionisiert wird Elektrospray-Ionisation (ESI) Elektrospray bezeichnet das Verfahren zur Zerstäubung einer Flüssigkeit mit Hilfe eines elektrostatischen Feldes. Das hierdurch generierte Aerosol setzt sich aus polar geladenen Tropfen mit monodisperser Größe zusammen. Zur Erzeugung wird die Analytlösung durch eine Metallkapillare geleitet, an die eine hohe elektrische Spannung angelegt ist. Die Analytlösung wird von dem elektrischen Feld durchdrungen und die sich in ihr befindlichen Ionen wandern auf die Gegenelektrode zu. Aufgrund der Anwesenheit von vielen gleichgeladenen Ionen an der Kapillarspitze bildet sich dort ein Taylor-Kegel aus, in dem die Analytlösung nun als Aerosol vorliegt. Durch zusätzlich eingebrachtes Trägergas wird das Lösungsmittel verdampft, die Tröpfchenanzahl vergrößert und die Stabilität des Aerosols bis an die Grenze geführt (Raleigh-Limit). Eine weitere Verkleinerung der berfläche führt zu einer stark erhöhten berflächenladung und somit zum Kollaps der Tröpfchen [16, 17] (Coulomb-Explosion). 30

31 Grundlagen Abbildung 8: Schematische Darstellung einer positiven Elektrospray-Ionisation. [15] Durch das mehrmalige Wiederholen dieses Vorgangs entstehen Tröpfchen mit ca. 10 nm Durchmesser. Anschließend erfolgt die Bildung der freien Analytionen, wofür es zwei verschiedene Modelle gibt. Bei dem charge residue model (CRM, Modell des geladenen Rückstandes) geht man davon aus, dass Tröpfchen von 1 nm Durchmesser entstehen, die nur ein ionisiertes Analytmolekül beinhalten. [16, 18] Das ion evaporation model (IEM, Ionenevaporationsmodell) nimmt an, dass aus größeren Tröpfchen bereits Analytionen in die Gasphase emmitiert werden. [16, 18] Liegen die Analytmoleküle als Ionen in der Gasphase vor, werden diese durch die Potentialdifferenz in das Massenspektrometer geführt (Abbildung 8). Der gesamte Ionisationsprozess ist bei der ESI-Ionisation im Gegensatz zu den vorher genannten Methoden sehr sanft. Somit können mit dieser Methode auch empfindliche Biomoleküle praktisch ohne Quellenfragmentierung ionisiert werden, was erstmals die massenspektrometrische Detektion von gelösten Proteinen 31

32 Grundlagen ermöglichte. [15] Ein weiterer, großer Vorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, Analytströme online zu ionisieren, also der Ionenquelle einen konstanten Strom an gelösten Analyten zuzuführen. Dieses ermöglicht eine Kopplung von ESI- Massenspektrometern mit HPLC-Systemen, welche die flüssige Probe vor der Detektion säulenchromatographisch auftrennen Massenauftrennung [15-19] Durch ionenoptische Bauteile werden die Ionen zum Massenanalysator hin beschleunigt und dabei durch das unterschiedliche Masse-zu-Ladungsverhältnis (m/z) ihrer Quasimolekülmasse nach aufgetrennt. Dafür werden bei den meisten Analysatoren elektrische oder magnetische Felder eingesetzt, um die Ionen aufgrund ihrer Massenträgheit bzw. der damit verbundenen längeren Flugzeit massenselektiv zu unterscheiden. Aufgrund der unterschiedlichen Anforderungen sind verschiedene Bauarten von Massenanalysatoren entwickelt worden: Magnet- (B)/ oder Sektorfeld (E/B) Bestimmung der Flugzeit (TF) Ionencyclotronresonanz (ICR) Ionenfalle (T) Quadrupol (Q) rbitrap Die wichtigsten Kenngrößen bei Massenanalysatoren sind Massenbereich, Auflösungsvermögen und Scangeschwindigkeit, welche für die benutzten Geräte verglichen werden. Die Auflösung R eines Massenanalysators ist gegeben durch die Formel R m m wobei m die Nominalmasse und d m die Differenz zwischen zwei gerade noch getrennten Massenpeaks darstellt. Bei den unterschiedlichen Analysatortypen 32

33 Grundlagen wurden allerdings unterschiedliche Definitionen zur Peaktrennung verwendet, so dass diese nicht direkt miteinander vergleichbar sind. a) b) Abbildung 9: Definition des Auflösungsvermögens eines Massenspektrometers, a) 10%- bzw. 50%-Tal-Definition, b) Full Width at Half Maximum (FWHM)-Definition. [15] Bei den sehr hochauflösenden Sektorfeld-Massenspektrometern wird die Peaktrennung über das 10%-Tal definiert (Abbildung 9, a), bei den Quadrupol- Massenspektrometern, die im Allgemeinen eine niedrige Auflösung bieten, gilt die 50%-Tal-Definition. Zur Messung der Auflösung eines Massenspektrometers anhand nur eines Peaks wird die Auflösung der Halbwertsbreite (FWHM, full width at half maximum) eines Massenpeaks m gemessen (Abbildung 9, b). Dies wird häufig bei den TF- und rbitrap-massenspektrometern angewendet und bietet den Vorteil, die Auflösung an nur einem Peak zu bestimmen Quadrupol-Analysator Der Quadrupol-Analysator arbeitet basierend auf dem Prinzip von Massenselektion und -detektion, bestehend aus einem Bauteil zur Selektion einer definierten Masse und dem Detektor zur Messung der Signalintensität. Der Massenfilter besteht aus vier parallelen, auf einem Radius r angeordneten Stäben entlang einer Achse z. An gegenüberliegenden Stäben liegt jeweils dieselbe Polarität einer Gleichspannung U an, welche durch die gleiche Polarität einer Wechselspannung (V cos2 f t) mit der Frequenz f moduliert wird (Abbildung 10). 33

34 Grundlagen Abbildung 10: Anordnung der Stabelektroden in einem Quadrupol-Massenfilter. [15] Die nebeneinander liegenden Stäbe besitzen eine um 180 versetzte Phase mit entgegengesetzter Polarität. Nahe der z-achse kann das Potential daher wie folgt beschrieben werden: ( x, y, t) U V cos2 f t 2 x 2 y r 2 mit r = Radius f = Frequenz x,y = Raumkoordinaten t = Zeit U = Gleichspannung V = Wechselspannung Durch eine anliegende Spannung von V erhalten die Ionen eine Translationsenergie entlang der z-achse. Die Bewegung in x- und y-richtung kann durch die beiden Gleichungen 2 d x dφ z e ma m ze ( U V cos 2 f t) x 2 dt dx r Fx 2 2 d y dφ z e ma m ze ( U V cos 2 f t) y 2 dt dy r Fy 2 34

35 Grundlagen mit m = Masse des Ions e = Elementarladung z = Anzahl der Ladungen a = Beschleunigung beschrieben werden. Durch die Einführung der beiden Definitionen a 2zeU m( f r) zev m( f r) 2 und q 2 können diese Gleichungen als Mathieusche Gleichungen beschrieben werden: 2 d x d( f t) 2 ( a 2q cos 2 f t) x 0 2 d y d( f t) 2 ( a 2q cos 2 f t) y 0 Diese beiden Differentialgleichungen definieren den stabilen bzw. den instabilen Bereich des Quadrupolfeldes für gegebene m/z-verhältnisse, abhängig von den Parametern a und q. Durch den Quotienten a/q ergibt sich 2 a 2zeU m( f r) 2U 2 q m( f r) zev V dass bei gleicher Ladung z alle Massen m auf der so genannten Arbeitsgeraden liegen. Abbildung 11: Stabilitätsdiagramm eines Quadrupolfeldes in x- und y-richtung. 35

36 Grundlagen Nun werden Gleichspannung U und Amplitude V der Wechselspannung unter Konstanthaltung von U/V und a/q entlang der Arbeitsgeraden so verändert, dass nacheinander Ionen unterschiedlicher Masse im stabilen Bereich des Quadrupolfeldes liegen. Somit kann der gesamte gewünschte Massenbereich gescannt und die Ionen detektiert werden (Abbildung 11). Moderne Quadrupol-Massenspektrometer bestehen häufig aus vier hintereinander liegenden Quadrupolen, sogenannten Triple-Quadrupol- oder Tandem- Massenspektrometern (Abbildung 12). Dieses ermöglicht die gezielte Strukturanalyse von Ionen durch die massenselektive Filterung vorgeschalteter Quadrupole. Q0 wird als reines ionenoptisches Bauteil ohne Gleichstrom-Komponente verwendet, um die davor erzeugten Ionen zu stabilisieren und für Q1 zu fokussieren. Der Q1 ist der erste Messquadrupol zum Scannen der Ionen. Q2 führt die Ionen durch eine Kollisionskammer, die mit inertem Kollisionsgas (Stickstoff, Helium oder Argon) gefüllt werden kann. Durch Kollision mit dem Gas fragmentieren die Ionen, wobei die Molekülmassen der entstandenen Fragmentionen in dem nachfolgenden Quadrupol Q3 analysiert werden können. Abbildung 12: Schematischer Aufbau eines Triple-Quadrupol-Massenspektrometers. [15] Mit einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer lassen sich nun neben dem einfachen Trennen und Detektieren von Ionen (full scan) weitere verschiedene, auch als MS/MS-Analysen oder Tandem-MS bezeichnete Experimente durchführen. Bei einer Produkt-Ionen-Analyse (daughter ion scan, Abbildung 13) werden im Quadrupol Q1 Ionen einer bestimmten Masse ausgewählt. [15] Diese Vorläuferionen werden im Q2 fragmentiert und die generierten Tochter- oder Produktionen 36

37 Grundlagen anschließend in Q3 analysiert. Aufgrund der charakteristischen Fragmentierung kann durch die Produkt-Ionen-Analyse gezielte Strukturinformation zu dem Zielmolekül gewonnen werden. Je nach Aufbau und Verbrückung eines Moleküls bilden sich unterschiedliche Fragmentspektren, die durch die Abstände der Produkt-Ionen zueinander interpretiert werden können. Aufgrund dieser Information ist die Produkt- Ionen-Analyse die am häufigsten genutzte massenspektrometrische Analyse bei der Strukturaufklärung von Biomolekülen. Abbildung 13: Prinzip einer Produkt-Ionen-Analyse. [15] Die Vorläufer-Ionen-Analyse verläuft von der Schaltung der Quadrupole genau entgegengesetzt der Produkt-Ionen-Analyse (Abbildung 14). [15] In Q1 wird das gesamte Massenspektrum transferiert und anschließend in Q2 sequenziell fragmentiert. Q3 ist auf eine bestimmte, ausgewählte Fragmentmasse eingestellt. Nun werden die durchgeleiteten Ionen in Q1 und Q3 verglichen und somit analysiert, welche Vorläufer-Ionen dasselbe Fragment in Q3 zeigen. Mit diesem Messmodus lassen sich Strukturanaloga aus komplexen Analyten identifizieren. Abbildung 14: Prinzip einer Vorläufer-Ionen-Analyse. [15] 37

38 Grundlagen Ähnlich funktioniert auch die Neutralverlust-Analyse (Abbildung 15). [15] Hierbei werden Q1 und Q3 in normalen Scan-Modus gestellt, Q2 arbeitet ebenso als Kollisionszelle. Q3 ist allerdings um die zu beobachtende Neutralverlustmasse kleiner eingestellt als Q1. Somit lassen sich diejenigen Ionen detektieren, welche bei Fragmentierung ein spezifisches Neutralteilchen abspalten. konstant Abbildung 15: Prinzip einer Produkt-Ionen-Analyse. [15] Die neueste der Tandem-Analysen ist das multiple reaction monitoring (MRM). [15] Es dient meist dem hochselektiven Nachweis von Analyten und nicht der Strukturbestimmung. Dabei werden Q1 und Q3 jeweils ausschließlich auf eine bestimmte Vorläufer- und Fragment-Masse eingestellt (Abbildung 16). Aufgrund dieser genauen Einstellung ist das MRM hochsensitiv gegenüber dem gewünschten Analyten. Bei der neuesten Entwicklung werden die MRM-Übergänge mit der Retentionszeit des gewünschten Analyten verknüpft, so dass sich mit dieser Methode praktisch unendlich viele Analyten mit einer chromatographischen Injektion detektieren lassen (scheduled MRM, smrm). 38

39 Grundlagen Abbildung 16: Prinzip des multiple reaction monitoring (MRM). [15] Quadrupol-Ionenfalle [16] Als ein weiterer Massenanalysator kann die Ionenfalle genutzt werden. Diese besteht aus einer Ringelektrode und zwei Endkappen, an die Wechselspannungen angelegt wird und zentriert Ein- und Austrittslöcher für die Ionen eingelassen sind (Abbildung 17). Bildlich lässt sich eine Ionenfalle als einen zum Kreis gebogenen Quadrupolstab vorstellen, dessen freie Seiten durch zwei gegenüberliegende Stäbe des Quadrupols begrenzt sind. Für die Entwicklung der Ionenfalle wurde an Wolfgang Paul und Hans Georg Dehmelt 1989 der Nobelpreis für Physik verliehen. Abbildung 17: Prinzipieller Aufbau eines Ionenfallenmassenspektrometers. [15] Das Funktionsprinzip der Ionenfalle ist vergleichbar mit dem eines Quadrupols. Die numerischen Lösungen der Mathieuschen Differentialgleichungen definieren auch hier den Bereich, in dem die Ionen stabile Bahnen innerhalb der Falle durchlaufen 39

40 Grundlagen (Abbildung 18). Im Stabilitätsdiagramm wird der stabile Bereich durch die beiden Endkappen und die Ringelektrode definiert. Anders als bei einem Quadrupol gibt es hier jedoch nicht nur stabile Bereiche für ausgewählte Ionen, sondern der gesamte Massenbereich kann gleichzeitig abgedeckt werden. Der größte Massenbereich kann erreicht werden, wenn a = 0 ist, d.h. keine Gleichspannung angelegt ist. Ionenfallen werden daher meist nur mit Wechselspannung betrieben. Durch Anlegen einer Wechselspannung an der Ringelektrode entsteht im Inneren ein quadrupolares Feld, welches durch eine räumlich ausgedehnte Potentialmulde die Ionen in der Mitte der Ionenfalle stabilisieren. Allerdings reichen diese elektrischen Felder zur Fixierung der einströmenden Ionen nicht aus. Um die stark beschleunigten Ionen bei dem Eintritt in die Ionenfalle abzubremsen und zu verhindern, dass diese auf der gegenüberliegenden Elektrode deionisieren, wird Helium bei einem Druck von ca. 3x10-6 bar in die Quelle geleitet. Durch die Kollision mit den Heliumatomen werden die Ionen abgebremst und können so effizient in der Falle eingefangen werden. Abbildung 18: Stabilitätsdiagramm der Mathieuschen Gleichungen für die Ionenfalle. [15] Zur Analyse werden während eines Zyklus die Ionen in der Falle gesammelt. Ist die Falle gefüllt, d.h. ist die Anzahl der Ionen optimal, so wird die weitere Aufnahme von Ionen durch eine Änderung des Potentials verhindert. Zur Detektion werden die 40

41 Grundlagen Ionen mit aufsteigender Molekülmasse mit Hilfe von Multipolfeldern aus der Austrittsöffnung zu einem Detektor (z.b. Sekundärelektronenvervielfältiger, SEV) hin herausgeschleust. Die Multipolfelder (z.b. kta-, Dekapole usw.) entstehen durch die Kopplung des quadrupolaren Feldes an der Ringelektrode mit einem dipolaren Feld an den speziell geformten Endkappen und induzieren mit dem Anstieg von q eine starke Resonanz der Ionen. Dadurch können die Ionen rasch kinetische Energie aufnehmen und schnell aus der Falle hinaus beschleunigt werden. In modernen Ionenfallenanalysatoren mit dieser Technik können so Scangeschwindigkeiten von bis zu unit/s erreicht werden, 20mal schneller als bei einem Quadrupolsystem. Des Weiteren kann das zum Abbremsen eingefüllte Heliumgas auch als Kollisionsgas verwendet werden. Unter Nutzung der angelegten Hochfrequenzspannung können die gewünschten Vorläufer-Ionen innerhalb der Falle isoliert werden rbitrap-ionenfalle [16] Die rbitrap besteht aus einer massiven, spindelförmigen Elektrode in der Mitte und einer ebenfalls spindelförmigen Elektrode als Umhüllung (Abbildung 19). [20] Durch das Anlegen eines den Ionen entgegengesetzten Potentials an der inneren Elektrode halten diese sich auf stabilen Kreisbahnen (rbits), wenn sich Zentrifugalkraft und Anziehungskraft gerade aufheben. Aufgrund der dezentralen Injektion der Ionen in die Kammer oszillieren diese relativ zu ihrer Molekülmasse entlang der Spindelelektrode. Die Frequenzen des harmonischen szillators sind unabhängig von der Ionengeschwindigkeit und induzieren einen Strom, der wiederum relativ zu ihrer Molekülmasse ist. Durch eine Fouriertransformation kann aus den überlagerten Frequenzen aller Ionen in der rbitrap ein Massenspektrum generiert werden. 41

42 Grundlagen Abbildung 19: Schematischer Aufbau eines rbitrap-massenspektrometers. [21] Aufgrund des Wegfalls der räumlichen Trennung von Massenselektion und Detektion sind diese Geräte - ähnlich wie FT-ICR-Massenspektrometer - äußerst empfindlich und besitzen zudem eine sehr hohe Massenauflösung. [22] Detektion Die Detektion von Ionen erfolgt über die Umwandlung des Ionenstroms in einen elektrischen Strom. Hierfür stehen verschiedene Detektoren wie Photomultiplier, Sekundärelektronenvervielfacher oder ein Faraday-Becher zur Verfügung. Bei den räumlich nicht getrennten Fouriertransformationsdetektoren wird der durch die Ionen induzierte Strom gemessen und anschließend zu einem Massenspektrum prozessiert. 2.3 Kernresonanz-Spektroskopie Die Kernresonanzspektroskopie beruht auf dem Phänomen, dass Atomkerne in einem homogenen Magnetfeld eine Aufspaltung ihrer Energieniveaus erfahren. Im Jahre 1924 wurde von Wolfgang Ernst Pauli zum ersten Mal die theoretische Grundlage für die NMR-Spektroskopie postuliert, nachdem manche Atomkerne einen ungeraden Spin haben und somit eine Aufspaltung im magnetischen Feld erfahren sollten. [23] Experimentell konnte die These 1933 durch das Molekularstrahlexperiment 42

43 Grundlagen von tto Stern nachgewiesen werden, bei dem ein Silberatom- bzw. ein Protonenstrahl durch ein Magnetfeld in zwei Gruppen entsprechend ihres Spinzustandes - geteilt wird. [24] Diese Arbeit wurde 1943 mit dem Nobelpreis für Physik ausgezeichnet. Im Jahre 1946 gelang es den beiden Arbeitsgruppen von Bloch und Purcell unabhängig voneinander, diese Aufspaltung im Magnetfeld durch die Energieabsorption elektromagnetischer Strahlung nachzuweisen. Für die Entdeckung erhielten Bloch und Purcell 1952 gemeinsam den Nobelpreis für Physik. Das von einem Atomkern erfahrene Magnetfeld ist allerdings nicht nur vom dem angelegten homogenen Magnetfeld abhängig, sondern unterscheidet sich auch durch die unterschiedliche chemische Anordnung eines jeden Kerns im Molekül. [25] Dadurch lassen sich von einem Spektrum Rückschlüsse auf die Molekülstruktur der Probe ziehen, was sich Chemiker in der Strukturbestimmung zu Nutze machen können wurde daher das erste kommerzielle Kernspinspektrometer der Firma Varian Associates auf den Markt gebracht. Durch die Entwicklung von immer stärkeren supraleitenden Magneten und die Entwicklung der Fouriertransformationsspektrometer (FT-NMR) durch Richard Robert Ernst 1964 konnte die Empfindlichkeit stark gesteigert werden, was zu einem zusätzlichen Bedeutungsgewinn für die Kernresonanzspektroskopie in der Strukturaufklärung führte. [26] Zum Anfang der Technik waren die Experimente auf eindimensionale Spektren beschränkt. Durch den steigenden Einsatz dieser Methode zur Strukturbestimmung in den 1970er Jahren wurden zweidimensionale Experimente entwickelt, was zu einer noch größeren Bedeutung in der analytischen Chemie führte. Aufgrund dieser technischen Weiterentwicklungen kann heutzutage mit der Kernresonanzspektroskopie neben der Strukturaufklärung beispielsweise die Faltung von Proteinen gemessen werden. [27] Experimentelle Grundlagen Das einfachste aller NMR-Experimente ist das eindimensionale (1D-)Experiment, welches sich aus den beiden Phasen Präparation und Detektion zusammensetzt (Abbildung 20, a). Während der Präparation wird durch elektromagnetische Manipulation das Spinsystem des Analyten in einen definierten Zustand gebracht, anschließend misst man bei der Detektion das Ergebnis des Experiments. 43

44 Grundlagen a) b) Abbildung 20: a) Schematische Darstellung einer eindimensionalen NMR-Pulssequenz, b) Wirkung eines 90 -Pulses auf z-magnetisierung. [15] Die Präparation des Spinsystems besteht im einfachsten Fall aus einem kurzen, starken Anregungsimpuls auf die Gleichgewichtsmagnetisierung M z aus der x- Richtung. Bei geeigneter Pulsdauer verändert sich die Magnetisierung entlang der z- Achse vollständig zur y-achse hin (Abbildung 20, b). Nach diesem so genannten 90 - Puls präzedieren die Kerne des Spinsystems mit ihren Lamorfrequenzen um die z- Achse und induzieren in dem Empfangsgerät eine Spannung. Aufgrund der transversalen Relaxation nimmt diese Spannung mit der Zeit ab, weshalb das aufgezeichnete Signal als FID (free induction decay, freier Induktionszerfall) bezeichnet wird. Nach der vollständigen Relaxation des Spinsystems in seinen Grundzustand kann das Experiment beliebig oft wiederholt und das Signal addiert werden, um die Empfindlichkeit des Gerätes zu verbessern. Anschließend wird aus dem FID (Zeitdomäne) mittels Fourier-Transformation das aufgenommene Spektrum (Frequenzdomäne) erzeugt. Aufgrund der häufig auftretenden Signalüberlagerung reichen 1D-Experimente zur Strukturaufklärung allein jedoch nicht aus. Daher wird zusätzlich die Technik der zweidimensionalen NMR-Experimente genutzt, bei der zu den beiden Experimentphasen Präparation und Detektion noch die indirekte Evolutionszeit t 1 und die Mischzeit hinzugefügt werden (Abbildung 21). 44

45 Grundlagen Abbildung 21: Schematische Darstellung der Pulssequenz eines 2D-NMR Experiments. [15] Während der Evolutionszeit t 1 können die Spins frei präzedieren. Hierbei wird gleichzeitig die Magnetisierung mit der chemischen Verschiebung des ersten Kernes verbunden. Anschließend wird durch die Mischsequenz zunächst der Zustand der Magnetisierung am Ende von t 1 abgefragt und weiterhin die Magnetisierung vom ersten Kern auf einen anderen Kern übertragen. Der Transfer der Magnetisierung erfolgt über zwei verschiedene Mechanismen: die skalare Kopplung oder die dipolare Wechselwirkung. Im Anschluss erfolgt dann die Datenakquisition, bei der die Magnetisierung mit der chemischen Verschiebung des zweiten Kerns markiert wird. Nach Fouriertransformation in t 2 -Richtung erhält man ein vom 1D-NMR-Experiment bekanntes Bild, das eine Momentaufnahme bei der Zeit t 1 darstellt. Nun werden verschiedene Einzelexperimente mit unterschiedlicher t 1 -Zeit aufgenommen, so dass die zeitliche Evolution des Spinsystems in einem Experiment abgebildet werden kann (Abbildung 22, a). Durch eine weitere Fouriertransformation in t 1 -Richtung entsteht so ein zweidimensionales Höhenkonturdiagramm. (Abbildung 22, b) 45

46 Grundlagen a) b) Abbildung 22: a) Zwischen den aufeinanderfolgenden 1D-Experimenten eines 2D- Experiments wird jeweils die t 1 -Zeit inkrementiert. Dadurch wird die indirekte Zeitdomäne schrittweise abgetastet. [15] b) Nach Fouriertransformation in t 2 entsteht eine Serie eindimensionaler Spektren, die in t 1 moduliert sind. [15] Je nachdem, ob es sich hierbei um eine Kopplung zwischen gleichen (homonuklearen) oder ungleichen (heteronuklearen) Kernen handelt, erhält man ein zur Diagonale symmetrisches oder unsymmetrisches 2D-Spektrum. 46

47 Grundlagen a) b) Abbildung 23: a) Schnitt durch die Daten aus Abbildung 22 parallel zu t 1 durch die jeweiligen Maxima der Signale. Dies entspricht einem free induction decay (FID) in der indirekten Zeitdimension [15]. b) Nach Fouriertransformation auch der indirekten Dimension (t 1 ) entsteht eine zweidimensionale Absorptionslinie, links in dreidimensionaler Darstellung, rechts in Aufsicht in der Darstellung als Konturplot mit Höhenlinien. [15] Aufgrund der großen Bedeutung der verschiedenen 2D-NMR-Experimente für die Strukturaufklärung sollen die wichtigsten ausführlich vorgestellt werden Das 1 H, 1 H-CSY-Experiment Das zweidimensionale homonukleare ( 1 H, 1 H)-korrelierte NMR-Experiment liefert NMR-Spektren, bei denen auf beiden Frequenzachsen 1 H-chemische Verschiebungen miteinander korreliert sind. [28] Hierbei erfolgt der Magnetisierungstransfer über skalare Spin-Spin-Wechselwirkungen. Im CSY- Experiment erhält man Information über 1 H- 1 H-Kopplungen, d.h. über Nachbarschaftsbeziehungen von Protonen. Allerdings sind bei diesem Experiment nur Signale von Protonen sichtbar, die maximal drei Bindungen voneinander getrennt sind ( 2 J- und 3 J-Kopplung). Bei dem einfachsten aller 2D-NMR-Experimente besteht 47

48 Grundlagen die Pulssequenz nur aus zwei durch eine Evolutionszeit t 1 getrennten 90 -Pulsen (Abbildung 24). Abbildung 24: Schematische Darstellung der Pulssequenz für das Experiment. [29] 1 H, 1 H-CSY- Da es sich bei dem CSY-Experiment um ein homonukleares NMR-Experiment handelt, zieht sich eine Diagonale durch das Spektrum, welche ein eindimensionales 1 H-Experiment abbildet. Zusätzlich gibt es so genannte Kreuzsignale beidseitig der Diagonalen, welche die Information aus dem CSY-Spektrum widerspiegeln. Für ein AX-System (zwei Kerne mit großer unterschiedlicher chemischer Verschiebung) können daher insgesamt 4 Signale beobachtet werden: die zwei Signale auf der Diagonalen mit den Koordinaten A, A bzw. X, X und die Kreuzsignale beidseitig der Diagonalen mit den Koordinaten A, X und X, A. Aufgrund der enormen Bedeutung des CSY-Experiments für die Strukturaufklärung sind eine Reihe von weiteren, ähnlichen Pulssequenzen entwickelt worden. Ein Nachteil des CSY-Experiments ist, dass bei geringer chemischer Verschiebung der Signale zueinander die interessanten Kreuzsignale durch die intensiveren Diagonalsignale überlagert werden. Bei Verbindungen mit vielen, sich überlagernden Signalen wird daher häufig das CSY-45-Experiment angewendet; hierbei wird der zweite 90 -Puls durch einen 45 -Puls ersetzt (Abbildung 25, a). Die Magnetisierung wird dabei so transferiert, dass die ungewünschten Diagonalsignale im Vergleich zu den Kreuzsignalen abgeschwächt werden. Allerdings geht dieser Vorteil auch mit einem Empfindlichkeitsverlust einher. Bei dem long-range CSY-Experiment wird vor und nach dem zweiten 90 -Puls eine definierte Wartezeit eingefügt. Während dieser Wartezeit können sich auch schwache Kopplungen zwischen weit entfernten Protonen entwickeln, die im eindimensionalen 1 H-NMR-Experiment keine skalare Kopplung zueinander zeigen (Abbildung 25, b). 48

49 Grundlagen Zur Unterdrückung störender Sigulettsignale im Spektrum, z.b. des Lösungsmittelsignals, wird häufig das DQF-CSY-Experiment (double quantum filtered) angewendet. Hierzu wird nach dem zweiten 90 -Puls eine kurze Wartezeit und ein weiterer 90 -Puls eingefügt. Dadurch werden die Magnetisierungsbestandteile von Singulettsignalen unterdrückt, während die Signale von Spinsystemen detektiert werden können (Abbildung 25, c). a) b) c) Abbildung 25: Schematische Darstellung der Pulssequenz für das a) CSY-45-Experiment b) Long-Range-CSY-Experiment c) DQF-CSY-Experiment [15] Das TCSY-Experiment Im TCSY-Experiment (Total Correlation Spectroscopy, vollständige Korrelationsspektroskopie) wird die Magnetisierung durch mehrstufigen sukzessiven Transfer über skalare J-Kopplung über das ganze Spinsystem verteilt, d.h. das TCSY korreliert alle Protonen eines Spinsystems miteinander. [28] Man erhält folglich Informationen über die gesamten Spinsysteme eines Moleküls. Das TCSY- Experiment wird häufig bei der Strukturaufklärung von Peptiden bzw. Proteinen eingesetzt, da beim TCSY-Experiment charakteristische Spektrenmuster entstehen, welche sich gut den enthaltenen Aminosäuren zuordnen lassen. Die TCSY-Pulssequenz ist vergleichbar mit der des CSY-Experiments, allerdings wird hier der zweite 90 -Puls durch ein Spin-Lock ersetzt. Während der Dauer des Spin-Locks befinden sich die Kerne nur im schwachen Hochfrequenzfeld B 1, die chemischen Verschiebungsdifferenzen der Protonen werden sehr klein und die 49

50 Grundlagen skalaren Kopplungen überwiegen. Nun können sich die Spinzustände mischen, Magnetisierung kann von einem zum anderen Kern übertragen werden und dieser Transfer als Signal detektiert werden. Die Reichweite der Magnetisierungsübertragung innerhalb eines Moleküls hängt direkt von der Dauer des Spin-Locks ab. Durch die Verkürzung oder Verlängerung des Spin-Locks lässt sich selektiv ein bestimmter Abschnitt eines Spinsystems anregen, wodurch die Strukturaufklärung von Molekülen mit vielen, überlagerten Protonen ermöglicht wird. Üblicherweise variiert die Dauer des Spin-Locks von wenigen 10 ms bis zu 300 ms. Die eindimensionale Variante des selektiven TCSY wird aufgrund der gezielten Anregung von Signalen auch seltcsy (selective Total Correlation Spectroscopy, selektive vollständige Korrelationsspektroskopie) genannt Das HMQC/HSQC-Experiment Das HMQC-Experiment [30] (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence) verwendet die Übertragung der Magnetisierung auf einen Heterokern und die Rückübertragung auf den Ursprungskern. [28] Es handelt sich um ein inverses, zweidimensionales, heteronukleares H,X-korreliertes NMR-Experiment (X = 13 C, 15 N). Charakteristisch für alle inversen Verfahren ist, dass Kohärenzen im Kanal der unempfindlichen Kerne ( 13 C, 15 N) erzeugt und dann auf die empfindlichen Kerne (im allgemeinen 1 H) übertragen werden, deren Resonanzen dann gemessen werden. Sehr ähnlich zu dem HMQC-Experiment ist das HSQC-Experiment (Heteronuclear Single Quantum Coherence, Abbildung 26). Im Gegensatz zum HMQC-Experiment, bei der sich die Magnetisierung des Heterokerns und des Protons während der Evolutionszeit ändern, ändert sich bei dem HSQC-Experiment nur die Magnetisierung des Heterokerns. Bei beiden Experimenten erhält man als Information die Korrelation zwischen direkt gebundenen Kohlenstoff- und Wasserstoffatomen ( 1 J-Kopplungen). 50

51 Grundlagen Das HMBC-Experiment Das HMBC-Experiment [31] (Heteronuclear Multiple Bond Correlation) unterscheidet sich von dem HSQC-Experiment lediglich durch eine größere Wartezeit zwischen dem ersten Protonenpuls und dem ersten Kohlenstoffpuls für die Entwicklung der heteronuklearen Kopplung. [28] Durch die Verlängerung der Wartezeit können sich während dieser Zeit Fernkopplungen über zwei bzw. drei Bindungen entwickeln. Diese Korrelation von entfernt liegenden Atomen ist gerade für die Strukturaufklärung von Naturstoffen von großer Bedeutung, da so die verschiedenen Strukturfragmente zu einem Strukturvorschlag zusammengeführt werden können. Des Weiteren kann mithilfe von HMBC-Experimenten auch die Lage von Heteroatomen bestimmt werden, sofern das Molekül genug Protonen für die inverse Detektion enthält. Um möglichst alle in einem Molekül vorhandenen Fernkopplungskonstanten (ca Hz) abzudecken, wird meist ein mittlerer Wert von 60 ms (ca. 8 Hz) gewählt. Des Weiteren verwendet man häufig einen so genannten low pass filter, um die störenden 1 J C-H -Kopplungen zu unterdrücken. [32] Abbildung 26: Schematische Darstellung der Pulssequenz für das HSQC- bzw. HMBC- Experiment, hier: 15 N-HSQC. [15] 51

52 Zielsetzung 3 Zielsetzung Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Strukturaufklärung von Sekundärmetaboliten durch massenspektrometrische und kernresonanzspektroskopische Analysen. Gesammelte Bakterienstämme aus verschiedenen Habitaten wurden zuvor in der Arbeitsgruppe von Prof. H.-P. Fiedler an der Eberhard-Karls-Universität Tübingen mittels der HPLC-DAD-Analytik charakterisiert. Anhand der arbeitskreisinternen UV/Vis-Datenbank konnten die zu identifizierenden Verbindungen gegen eine Vielzahl von bekannten Naturstoffen verglichen werden. [33] Hierbei wurden zahlreiche neue, nicht in der Datenbank enthaltene Verbindungen entdeckt, welche als uncharakterisierte Naturstoffe klassifiziert wurden. Nach der Isolierung dieser Substanzen in Reinform sollten diese im Folgenden strukturaufgeklärt werden, um Information über die Wirkstofffamilie und die chemische Struktur dieser neuen Stoffe zu erhalten. Ausgehend von der vorliegenden Struktur sollten mit Hilfe von Kooperationspartnern mit den aufgereinigten Stoffen verschiedene antibakterielle, antitumor- und enzymatische Testierungen durchgeführt werden, um Informationen über die Wirksamkeit zu erlangen. 52

53 Ergebnisse und Diskussion 4 Strukturaufklärung des Piceamycins und seines N- Acetylcystein-Addukts aus Streptomyces sp. GB Herkunft und Taxonomie des Bakterienstammes Streptomyces sp. GB 4-2 Zur Untersuchung von rhizosphären Bodenbakterien wurden in der Arbeitsgruppe von Prof. Karl Poralla an der Eberhard-Karls-Universität Tübingen Erdproben von der Rhizosphäre junger Fichten (Schönbuch, Tübingen) genommen. Als Rhizosphäre wird im Allgemeinen der Bereich um eine Pflanzenwurzel im Waldboden bezeichnet. Aufgrund der starken Interaktion zwischen der Pflanze und des umliegenden Waldbodens kommt es in diesem Bereich zu einer starken Häufung von Mikroorganismen, die sowohl pflanzenfördernder (auxiliar, symbiotisch) als auch pflanzenschädlicher (parasitär, pathogen) Natur sein können. [34, 35] Die hohe rganismendichte in diesem Lebensraum zwingt die Mikroorganismen verstärkt zur Bildung von Sekundärmetaboliten, um potentielle Konkurrenten zu bekämpfen und sich selbst gegen andere Arten zu behaupten. Aus diesen Erdproben wurde der Stamm Streptomyces sp. GB 4-2 isoliert und in der Arbeitsgruppe von Prof. Hans- Peter Fiedler von Dr. Julia Riedlinger [36] taxonomisch und von Dr. Dirk Schulz [1] bezüglich seiner Sekundärmetabolitproduktion untersucht (Abbildung 27). Abbildung 27: Lichtmikroskopische Aufnahmen von Stamm Streptomyces sp. GB 4-2 (Kolonien auf der Agarplatte). [1] 53

54 Ergebnisse und Diskussion Chemisches Screening Zur Identifizierung von möglichen Zielkomponenten wurde in der Arbeitsgruppe von Prof. Hans-Peter Fiedler der Bakterienstamm in unterschiedlichen Nährmedien angezogen und die Produktion der Sekundärmetabolite in Myzel- und Kulturfiltrat mittels HPLC-DAD-Analytik vermessen. Während des chemischen Screenings konnten insgesamt sechs Verbindungen charakterisiert werden, deren UV/Vis- Spektren keine Übereinstimmung mit bekannten Sekundärmetaboliten in der Datenbank zeigte. [33] Aufgrund der identischen UV/Vis-Spektren von fünf der sechs Verbindungen handelte es sich hierbei jedoch höchstwahrscheinlich um Stereoisomere. Diese wurden daraufhin als GB 4-2 A1 bis A5 bezeichnet, die sechste Verbindung als GB 4-2 B (Abbildung 28). Während der Bearbeitung des Stammes konnte beobachtet werden, dass die Verbindungen A2 bis A5 durch Lichteinwirkung aus der Verbindung A1 entstehen. Daher wurden nur die Komponente A1 mit der Retentionszeit von R t = 10.1 min und die Komponente B mit der Retentionszeit von R t = 8.2 min als Zielkomponenten identifiziert. 54

55 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 28: HPLC-DAD-Chromatogramm des Kulturfiltratextraktes des Stammes GB 4-2 und UV/Vis-Spektren der Verbindung GB 4-2 A1 und GB 4-2 B. [1] Die UV/Vis-Spektren zu GB 4-2 A2 A5 sehen fast identisch zu GB 4-2 A1 aus. 55

56 Ergebnisse und Diskussion Fermentation und Isolierung Bei der von Dr. Dirk Schulz durchgeführten Produktionsoptimierung mit den drei unterschiedlichen Nährmedien 500, SGG und M im Schüttelkolben zeigte sich, dass die gewünschten Metabolite in guten Ausbeuten in dem Nährmedium M gebildet wurden. [1] Die maximale Konzentration des Metaboliten GB 4-2 B konnte nach 166 h mit einer Ausbeute von 2.8 mg/l erreicht werden. Zur anschließenden Anzucht des Stammes im Bioreaktor wurden weiterhin fünf verschiedene Bioreaktoren (New Brunswick, Biostat S, Biostat E, Biostat b20) mit dem Stamm angeimpft und der Reaktor mit der höchsten Ausbeute bestimmt. Hierbei erwies sich der Bioreaktor New Brunswick mit einer Ausbeute von 3.9 mg/l als bester Bioreaktor zur Fermentation. Die Bioreaktoren Biostat S und Biostat E zeigten eine vernachlässigbar geringere Produktion der gewünschten Verbindungen an, so dass diese ebenfalls zur Fermentation des Stammes genutzt werden konnten. a) b) Schema 1: Isolierungsschema der Substanzen a) GB 4-2 A1 und b) GB 4-2 B. [1] 56

57 Ergebnisse und Diskussion Die Isolierung der Verbindung GB 4-2 A1 erfolgte analog zu Schema 1. Nach der Ernte wurde die Kulturbrühe zunächst mittels Druckfiltration in Kulturfiltrat und Myzel getrennt und das Myzel verworfen. Anschließend wurde das Kulturfiltrat zunächst auf ph 4 eingestellt und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden unter Vakuum bis zur Trockne eingeengt und der erhaltene Rohextrakt mit einem Stufengradienten von 0 %, 1 %, 2 % und 5 % an LiChroprep Diol chromatographiert. Die Elutionsfraktionen wurden nun wiederum bis zur Trockne eingeengt und anschließend ein 200 mg Aliquot an Sephadex LH-20 in Methanol aufgetrennt. Der dadurch erhaltene Rohextrakt wurde schließlich mittels präparativer RP-HPLC an C 18 -Material mit einem isokratischen Gradienten von 52 % Acetonitril aufgereinigt, wodurch 5 mg GB 4-2 A1 erhalten werden konnten. Aufgrund der starken Isomerisierung der Verbindung GB 4-2 A1 zu den isomeren Verbindungen A2 bis A5 bei Lichteinwirkung musste der gesamte Prozess der Isolierung möglichst unter Lichtausschluss erfolgen. Zur Isolierung der Verbindung GB 4-2 B wurde nach der Filtration eine Adsorptionschromatographie an Amberlite XAD-16 durchgeführt und die Elutionsfraktion anschließend bis zum wässrigen Rückstand unter reduziertem Druck eingeengt. Die wässrige Phase wurde nun auf ph 4 eingestellt und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Hierbei ging die Verbindung in die organische Phase über, das Lösungsmittel wurde anschließend unter reduziertem Druck entfernt. Der erhaltene Rohextrakt wurde nun in Methanol aufgenommen und an Sephadex LH-20 chromatographiert. Der nach der Einengung der Elutionsfraktionen erhaltene Rohextrakt II wurde anschließend in Methanol an Fractogel TSK HW-40 chromatographiert, wodurch 23 mg Rohprodukt erhalten werden konnten. Dieses wurde dann in einem letzten Aufreinigungsschritt mittels präparativer RP-HPLC an C 18 -Material mit einem linearen Gradienten von % Acetonitril mit 0.1 % Ameisensäure aufgereinigt. Hierdurch konnten 5.7 mg reines GB 4-2 B erhalten werden. 57

58 Ergebnisse und Diskussion 4.2 Strukturaufklärung HPLC-ESI-MS Mit Hilfe von HPLC-ESI-MS-Untersuchungen konnten zunächst die nominalen Molekülmassen der beiden Zielderivate bestimmt werden. Hierzu wurden Proben der reinen Verbindungen im positiven und negativen Ionisationsmodus untersucht. In beiden Modi war die Ionenausbeute zufriedenstellend. Daher wurde - sofern beide Ionisationmodi ein stimmiges Ergebnis ergaben - zur vereinfachten Darstellung nur der Positivionenmodus beschrieben. Das Derivat GB 4-2 A1 zeigte bei einer Retentionszeit von R t = 10.1 min ein Positiv-Molekülion [M+H] + bei m/z 432.1, das Derivat GB 4-2 B ein Positiv-Molekülion [M+H] + von m/z bei der Retentionszeit R t = 8.2 min. Die UV/Vis-Spektren und die Retentionszeiten stimmten mit den experimentellen Daten aus dem chemischen Screening überein Bestimmung der Summenformel Zur weiteren Strukturaufklärung wurde nach den HPLC-ESI-MS-Untersuchungen die Summenformel der beiden Zielderivate GB 4-2 A1 und GB 4-2 B mittels FT-ICR-MS bestimmt. Die Messung erfolgte durch Dipl.-Ing. Graeme J. Nicholson an der Universität Tübingen im Positiv-Ionenmodus. Für die Berechnung der Summenformel wurden die Elemente Kohlenstoff (C), Wasserstoff (H), Stickstoff (N), Sauerstoff () und Schwefel (S) zugelassen. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse ist in Tabelle 1 dargestellt. 58

59 Ergebnisse und Diskussion Tabelle 1: Physikochemische Eigenschaften von GB 4-2 A1 und GB 4-2 B. GB 4-2 A1 FT-ICR-MS gemessen [M+H] theoretisch = 0.07 ppm GB 4-2 B gemessen [M+H] theoretisch = 0.44 ppm Summenformel C 27 H 29 N 4 C 32 H 38 N 2 7 S UV max (MeH) 295, , 330 (sh) Aminosäureanalytik Zum Nachweis von Aminosäure-Einzelbausteinen wurde eine GC-MS-Analytik durch Dipl.-Ing. Graeme J. Nicholson an der Universität Tübingen durchgeführt. Hierzu wurde eine Probe beider Zielverbindungen zunächst säurekatalytisch hydrolysiert (6 M HCl, 110 C, 20 h), das getrocknete Hydrolysat zum N-(-)TFA/Ethylester derivatisiert und anschließend mittels chiraler GC-MS analysiert. Bei dem Derivat GB 4-2 A1 konnte kein Aminosäurebaustein nachgewiesen werden, GB 4-2 B wies hingegen die Aminosäure L-Cystein auf. Die Identifizierung erfolgte durch Retentionszeitvergleich zu L-Cystein und der Übereinstimmung des charakteristischen EI-Fragmentspektrums von Cystein NMR-Spektroskopische Untersuchungen Die weiterführende Strukturaufklärung der Zielkomponenten wurde mit Hilfe von einund zweidimensionalen kernresonanzspektroskopischen Experimenten durchgeführt. Zunächst konnten die durch die FT-ICR-MS-Untersuchungen gefundenen Summenformeln durch die 1 H- und 13 C-NMR-Spektren bestätigt werden. Die detaillierte Analyse der CSY-, HSQC- und HMBC-NMR-Spektren ermöglichte die Bestimmung aller in Abbildung 29 gezeigten 1 H- und 13 C-Signale. Die 1 H-, 13 C- und HSQC-NMR-Spektren der Zielkomponente GB 4-2 A1 (im weiteren Verlauf als Piceamycin bezeichnet) zeigten insgesamt 21 sp 2 -hybridisierte, zwei Methylen- und 59

60 Ergebnisse und Diskussion zwei Methyl-Kohlenstoffatome, zusätzlich dazu ein aliphatisches Methin- und ein aliphatisches, quartäres Kohlenstoffatom. Das Derivat GB 4-2 B (im weiteren Verlauf als N-Acetylcystein-Piceamycin bezeichnet) zeigte darüber hinaus zwei weitere sp 2 - hybridisierte Kohlenstoffatome, ein weiteres aliphatisches Methin-, ein weiteres Methylen- und ein weiteres Methyl-Kohlenstoffatom. a) 1' ' H 3 15 HN 17 3' 23 1' b) ' H 3 R 15 HN 3' :CSY :HMBC 19 1'' 19 R= S 5'' NH 3'' H :CSY :HMBC Abbildung 29: CSY- und HMBC-Korrelationen von a) Piceamycin und b) N-Acetylcystein- Piceamycin. Aus den CSY-NMR-Spektren konnten zwei zusammenhängende Spinsysteme für die Komponente GB 4-2 A1 (H-2 bis H-7, H-14 bis H-26 und H-3 ) und drei zusammenhängende Spinsysteme für die Komponente GB 4-2 B (zusätzlich H-1 bis NH-4 ) identifiziert werden. Mit Hilfe der HMBC-NMR-Spektren konnten die beiden Spinsysteme von Komponente A1 über die Korrelation des Amidprotons verbunden werden. Die Cyclopentenonstruktur konnte durch die gezeigten Signale von H-1 zu C-7, C-8, C-9 und C-12 und durch die Korrelation von H-9 zu C-1, C-7, C-8, C-10 und C-12 bestimmt werden. Die 13 C-NMR-chemischen Verschiebungen stehen in sehr guter Übereinstimmung zu einem in der Literatur beschriebenen α-hydroxy- Carbonylfragment [37] im Gegensatz zum einem β-hydroxy-carbonylfragment. [38] 60

61 Ergebnisse und Diskussion Durch die detaillierte Auswertung der CSY- und HMBC-Korrelationen konnte die gesamte Reihenfolge der Kohlenstoffatome mit Ausnahme von Korrelationen zwischen C-12 und C-13 bestimmt werden. Weiterführende 4 J-HMBC-Experimente mit erweiterten Mischzeiten und constant time inverse-detected gradient accordion rescaled-hmbc-experimente (J = 3-12 Hz und J = 3-8 Hz) zur Detektion einer Kopplung über die Bindung C-12/C-13 führten ebenfalls nicht zum Erfolg. [39] Allerdings konnte die charakteristische NMR-Verschiebung von C-12 (138.6 ppm) einem olefinischen Kohlenstoffatom in vicinaler Position zu einer Carbonyleinheit zugeordnet werden und die Verknüpfung somit indirekt abgeleitet werden. Zur Messung der Kopplungskonstanten von überlappenden Signalen wurden seltcsy- Experimente aller olefinischen Protonen mit einer Mischzeit von 70 bis 270 ms durchgeführt. Dadurch konnte die Konfiguration der Doppelbindungen bei GB 4-2 B als 2Z, 4Z, 6E, 16E, 18Z, 20E, 22Z und zusätzlich bei GB 4-2 A1 als 14E bestimmt werden. Aufgrund der Isolierung des Stammes aus einem Fichtenwald (Fichte, lat. Picea abies) wurde die Substanz GB 4-2 A1 Piceamycin und die Substanz GB 4-2 B N-Acetylcystein-Piceamycin genannt (Abbildung 30). a) b) 1' 9 5 (Z) (Z) (E) H 13 (E) 15 2' 1 17 (E) NH 3' (Z) 25 (E) 1' 23 (Z) 21 (E) (Z) ' H (Z) '' R (E) 1 17 NH 3' 21 (Z) (E) 23 (Z) R= S 5'' NH 3'' H Abbildung 30: Strukturformeln von a) Piceamycin und b) N-Acetylcystein-Piceamycin. 61

62 Ergebnisse und Diskussion 4.3 Biologische Aktivität Piceamycin und N-Acetylcystein-Piceamycin wurden am Kieler Wirkstoffzentrum KiWiZ am Institut für Meereswissenschaften IFM-Geomar in der Arbeitsgruppe von Prof. Johannes F. Imhoff gegen Gram-positive und Gram-negative Bakterien sowie gegen Eukaryoten und ausgewählte Enzyme getestet. Des Weiteren wurde in Zusammenarbeit mit Prof. Winfried Beil an der Medizinischen Hochschule Hannover Piceamycin gegen ausgewählte humane Krebszelllinien getestet. Dabei zeigte Piceamycin antibakterielle Aktivität gegen die Gram-positiven Bakterien Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. lentus und gegen das Gramnegative Bakterium Xanthomonas campestris (Tabelle 2). Tabelle 2: Minimale Inhibierungskonzentration von Piceamycin gegen Gram-positive Bakterien. rganismus MIC [µg/ml] MIC [µm] Bacillus subtilis DSM Bacillus subtilis DSM Staphylococcus aureus DSM Staphylococcus lentus DSM Staphylococcus epidermidis DSM Antifungale Aktivität von Piceamycin konnte gegen die Stämme Saccharomyces cerevisiae, Candida glabrata und Botrytis cinerea nachgewiesen werden. 62

63 Ergebnisse und Diskussion Tabelle 3: Wachstumsinhibierung von Piceamycin gegen ausgewählte humane Krebszelllinien. Zelllinie GI 50 [µg/ml] TGI [µg/ml] AGS HepG MCF GI 50 : 50% Wachstumsinhibierung; TGI: 100% Wachstumsinhibierung Des Weiteren zeigte das Piceamycin eine cytostatische Aktivität gegen verschiedene humane Krebszelllinien (Tabelle 3) und eine enzymhemmende Aktivität gegen die humane Tyrosin Phosphatase 1B (human recombinant protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B) mit einem IC 50 -Wert von 10.1 µm. [40] Kleine Moleküle zur Inhibierung der PTP1B sind aufgrund der potentiellen therapeutischen Anwendung gegen Diabetes, Adipositas und Krebs interessant. Interessanterweise konnte für das N-Acetylcystein-Piceamycin weder antimikrobielle, noch cytostatische oder enzymhemmende Aktivität nachgewiesen werden. 4.4 Diskussion Insgesamt konnten in dem Kulturfiltrat des Stammes Streptomyces sp. GB 4-2 sechs Verbindungen durch HPLC-DAD-Analysen nachgewiesen werden, welche aufgrund des negativen Abgleichs mit der UV/Vis-Datenbank als potentiell neue Naturstoffe angesehen werden konnten. [33] Während der zeitlichen Beobachtung der Fermentation stellte sich heraus, dass die Verbindungen GB 4-2 A2 A5 aus dem Piceamycin entstehen. Da die Verbindungen identische UV/Vis-Spektren zu Piceamycin zeigen, handelt es sich hierbei höchstwahrscheinlich um Stereoisomere zu dieser Verbindung, bei denen durch Lichteinfluss einer der cis-doppelbindungen des Makrolactamrings in die stabilere trans-form umgewandelt wird. Vermutlich ist jedoch nur die Umwandlung von einer Doppelbindung möglich, da für die Umwandlung von mehreren Doppelbindungen die Ringgröße des Makrolactams nicht ausreichend ist. Piceamycin enthält insgesamt vier cis-doppelbindungen, welches 63

64 Ergebnisse und Diskussion auch das Auftreten von vier Stereoisomeren hierzu erklären könnte. Aufgrund der nicht natürlichen Produktion der vier weiteren Isomere wurden diese nicht zur Strukturaufklärung aufgereinigt. Ein Literaturvergleich der aufgeklärten Struktur des Piceamycins mit anderen makrocyclischen Polyketiden ergab, dass eine strukturelle Verwandtschaft mit dem Hitachimycin vorliegt (Abbildung 31). Hitachimycin ist ein 19-gliedriges Makrolactamantibiotika, welches aus dem Kulturüberstand von Streptomyces scabrisporus isoliert wurde. [41] 4 2 H N H H Abbildung 31: Strukturformel von Hitachimycin aus Streptomyces scabrisporus. [41] Anstelle einer Methylgruppe an Position C-24 trägt das Hitachimycin jedoch einen Phenylrest und weist weitere Unterschiede im Makrolidrückgrat auf. Zum Einen ist ein Proton am C-8 durch eine Methyleinheit im Hitachimycin ersetzt, ebenso die Carbonyleinheit am C-10 durch eine Methoxygruppe. Zum anderen liegt die Kohlenstoffkette ab C-14 vollständig reduziert und an C-15 durch eine Hydroxygruppe substituiert vor. Dieser strukturelle Unterschied führt dazu, dass das Hitachimycin kein Michaelsystem an Position C-13 bis C-15 besitzt. Weitere Cysteinaddukte konnten im Kulturüberstand nicht gefunden werden, was dafür spricht, dass C-15 die am stärksten elektrophile Position des Piceamycins ist. Mit HPLC-MS untersuchte Mikroderivatisierungsversuche von Piceamycin mit L-Cystein zeigten, dass sich unter Standardbedingungen ein Cysteinaddukt bildet. Aufgrund dieser Ergebnisse konnte bewiesen werden, dass das oben genannte Michael- System für die antibakterielle und cytostatische Aktivität des Piceamycins verantwortlich ist. Ähnliche Beobachtungen konnten auch bei den Mycinamicinen gemacht werden. [42] Hierbei handelt es sich wie das Piceamycin ebenfalls um ein Makrolid, welches in seinem Kohlenstoffrückgrat ein Michaelsystem enthält (Abbildung 32). Zunächst 64

65 Ergebnisse und Diskussion wurde von Hayashi et al. Mycinamicin I und II aus Micromonospora griseorubida aufgeklärt, 11 Jahre später konnten N-Acetylcysteinderivate beider Verbindungen nachgewiesen werden. Bei den Mycinamicinen handelt es sich um 16-gliedrige Makrolide, welche an zwei Positionen glykosyliert vorliegen. An Position C-9 befindet sich eine Ketogruppe, welche zusammen mit der Doppelbindung an C-10 und C-11 ein Michaelsystem bildet. 9 5 H 1' N H 1'' R 14 1 CH 3 CH 3 Mycinamicin I: R = H Mycinamicin II: R = H Abbildung 32: Strukturformeln von Mycinamicin I und II. [42] Die später aufgeklärten Mycinamicine X und XI zeigen eine Addition eines N- Acetylcysteins an C-11, analog zu der Verknüpfung des N-Acetylcysteins am C-15 des Piceamycins (Abbildung 33). [43] H NH H R 1'' S H 1' N CH 3 CH 3 Mycinamicin X: R = H Mycinamicin XI: R = H Abbildung 33: Strukturformeln von Mycinamicin X und XI. [43] 65

66 Ergebnisse und Diskussion Auch die Mycinamicine X und XI zeigen gegenüber Gram-positiven Bakterien antibakterielle Aktivität, allerdings um ca. eine Größenordnung geringer im Vergleich zu den Mycinamicinen I und II. [43] Der deutliche Unterschied in biologischer Aktivität deutet auch bei den Mycinamicinen auf biologische Relevanz des Michaelsystems hin, welches bei den Mycinamicinen X und XI durch die N-Acetylcysteinaddition blockiert ist. Ein weiterer Vertreter der N-Acetylcystein-Antibiotika sind die Paldimycine. Deren Grundgerüst stellen die Paulomycine dar, welche 1982 aus Streptomyces paulus isoliert worden sind. [44] Diese enthalten eine Isothiocyanat-Gruppe mit einem elektrophilen Kohlenstoffatom, an das durch einen nukleophilen Angriff das Acetylcystein angreifen kann und eine Dithiocarbamat-Gruppe bildet. Die so entstandenen Verbindungen wurden später ebenfalls aus Streptomyces paulus isoliert und Antibiotic 273a 2α genannt. [45] Die Paldimycine entstehen durch eine erneute Addition eines Acetylcysteins an Antibiotic 273a 2α. Hierbei greift das nukleohile Thiolat-Anion jedoch an der Didehydrobutyrineinheit des Paulomycins an (Abbildung 34). H 3 C H R CH 3 H H CH NH 2 Paulomycin A: R= N C S Antibiotic 273a 2 R= HN S S HN Paldimycin A: HC S R= HN S CH S H N HN CH Abbildung 34: Strukturformeln von Paulomycin A, Paldimycin A und Antibiotic 273a 2α. [45] Des Weiteren sind mehrere Metabolite beschrieben, bei denen das N-Acetylcystein mit einem Aromaten verknüpft ist. [46] Als Beispiel ist Abbildung 35 in das Phenazin SB gezeigt, bei dem das N-Acetylcystein an das C-3 gebunden ist. 66

67 Ergebnisse und Diskussion a) b) CH CH S 3 N 3 N N H H 1 N H 1 N 9 CMe CMe CH 9 6 Abbildung 35: Strukturformel von a) SB und b) SB [46] Die Biosynthese von SB ist bis heute unbekannt. Da aus dem Kulturüberstand des produzierenden, nicht näher beschriebenen Streptomyceten ebenfalls die freie Verbindung isoliert werden konnte, kann eine Bildung von SB aus SB gegen Ende der Biosynthese vermutet werden. 67

68 Ergebnisse und Diskussion 5 Strukturaufklärung des Aranciamycin-Anhydrids aus Streptomyces TÜ Herkunft und Taxonomie des Bakterienstammes Streptomyces sp. TÜ 6384 Der Stamm Streptomyces TÜ 6384 wurde ebenfalls in der Arbeitsgruppe von Prof. Karl Poralla an der Eberhard-Karls-Universität Tübingen aus einer Erdprobe eines Fichtenwaldes bei Tübingen-Bühl isoliert. [1] Die weitere taxonomische Charakterisierung erfolgte von Dr. Julia Riedlinger [36] und die Untersuchung hinsichtlich der Sekundärmetabolitproduktion von Dr. Dirk Schulz [1] in der Arbeitsgruppe Arbeitsgruppe von Prof. Hans-Peter Fiedler. Die Kolonien auf der Agarplatte bilden ein hellbeiges Substratmyzel aus, das Luftmyzel und die Sporen sind weiß (Abbildung 36). Abbildung 36: Lichtmikroskopische Aufnahmen von Stamm Streptomyces sp. TÜ 6384 (links: Kolonie auf der Agarplatte; rechts: Myzelpellets in der Submerskultur). [1] Aufgrund der chemotaxonomischen und molekularbiologischen Charakteristika konnte der Stamm der Gattung Streptomyces zugeordnet werden. Aus dem Stoffwechsel konnte die LL-Diaminopimelinsäure, die Hauptmenachinone MK-9 und die gesättigten iso- und anteiso-fettsäuren mit einer C-15- und C-17-Kettenlänge 68

69 Ergebnisse und Diskussion bestimmt werden. Durch Partialsequenzierung der 16S-rRNA konnte ebenfalls die Gattung Streptomyces bestimmt werden Chemisches Screening Zur Untersuchung des Stammes TÜ 6384 auf Produktion von Sekundärmetaboliten wurde ein chemisches Screening durchgeführt. Der Stamm wurde zunächst in drei verschiedenen Kulturmedien fermentiert und anschließend mittels HPLC-DAD- Experimenten analysiert. [1] Bei dem Vergleich mit der UV/Vis-Stoffdatenbank ergab sich, dass der Stamm zunächst das bekannte Antibiotika SEK 43 (R t = 6.5 min) produziert. [47] Des Weiteren konnte bei einer Retentionszeit von R t = 10.4 min die Produktion eines weiteren, unbekannten Sekundärmetaboliten nachgewiesen werden, welcher in der Folge als TÜ 6384 A bezeichnet wurde (Abbildung 37). Das UV/Vis-Spektrum der Substanz zeigte eine sehr gute Übereinstimmung mit dem bekannten Metaboliten Aranciamycin, allerdings ergab die Retentionszeit von R t = 10.4 min keine Übereinstimmung. Aufgrund dieses Befunds wurde davon ausgegangen, dass es sich bei der Substanz TÜ 6384 A um ein Aranciamycin- Derivat handeln könnte. [48] 69

70 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 37: HPLC-DAD-Chromatogramm des Kulturfiltratextrakts des Stammes TÜ 6384 und UV/Vis-Spektrum der Verbindung TÜ 6384 A. 70

71 Ergebnisse und Diskussion Isolierung und Reinigung Zur Isolierung der Verbindung TÜ 6384 A wurde der Stamm zunächst im 10 Liter- Maßstab im Biostat-S Bioreaktor mit dem Kulturmedium M fermentiert. [1] Nach einer Inkubationszeit von 142 h wurde die Kulturbrühe zunächst mittels Druckfiltration in Kulturüberstand und Myzel getrennt und das Myzel verworfen (Schema 2). Schema 2: Isolierungsschema der Substanz TÜ 6384 A. Das Kulturfiltrat wurde anschließend an Amberlite XAD-16 mit Ethanol chromatographiert. Die Elution erfolgte nach dem Waschen mit 40 % Ethanol mit 100 % Ethanol. Der eingeengte Extrakt wurde anschließend an LiChroPrep Diol mit einem Stufengradienten von 0 % bis 5 % DCM in Ethanol weiter aufgereinigt. Ein 50 mg Aliquot des Rohextraktes wurde anschließend mittels einer präparativen RP- HPLC mit einem linearen Gradienten von 40 % auf 80 % Acetonitril chromatographiert. 71

72 Ergebnisse und Diskussion 5.2 Strukturaufklärung Augrund der starken Ähnlichkeit des UV/Vis-Spektrums mit Aranciamycin konnte zunächst davon ausgegangen werden, dass es sich bei der Substanz TÜ 6384 A um ein Derivat des Aranciamycins handelt (Tabelle 4). Das aufgenommene IR-Spektrum zeigte sowohl dem Aranciamycin zugehörige, als auch weitere, nicht dem Aranciamycin zugehörige Banden (Tabelle 4) HPLC-ESI-MS Die Auswertung von HPLC-ESI-MS-Untersuchungen ergab für das Derivat TÜ 6384 A ein Negativmolekülion [M-H] - von m/z und ein Positiv-Molekülion [M+H] + von m/z Diese Ergebnisse zeigten ebenfalls, dass es sich bei der Verbindung nicht um das schon literaturbekannte Aranciamycin handeln konnte, da dies eine Molekülmasse von m/z besitzt Bestimmung der Summenformel Zur Bestimmung der Summenformel wurde durch Dipl.-Ing. Graeme J. Nicholson an der Universität Tübingen eine massenspektrometrische Analyse an einem FT-ICR- Massenspektrometer durchgeführt. Für die Berechnung der Summenformel wurden die Elemente Kohlenstoff (C), Wasserstoff (H), Stickstoff (N) und Sauerstoff () zugelassen. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse ist in Tabelle 4 dargestellt. Im Vergleich zum Aranciamycin besitzt TÜ 6384 A ein zusätzliches C 8 H 6 4 -Fragment. 72

73 Ergebnisse und Diskussion Tabelle 4: Physikochemische Eigenschaften von TÜ6384 A. TÜ 6384 A Aussehen Rot-oranges Pulver Drehwert 20 a ] = + 82 (c = 0.05, MeH) [ D FT-ICR-MS Summenformel gemessen [M-H] berechnet [M-H] = 0.13 ppm C 35 H UV max (MeH) nm (log ε) 240 (4.48), 260 (4.44), 435 (4.08) IR ν max [cm -1 ] 3503, 2977, 2933, 1766, 1715, 1675, 1625, 1448, 1415, 1380, 1290, 1247, 1191, 1170, 1135, 1109, 1083, 1031, 1001, 957, 840, 758, Zuckeranalytik Zur Bestätigung der Stereochemie des in der Verbindung TÜ 6384 A enthaltenen Zuckerbausteins wurde eine GC-MS-Analytik durch Dipl.-Ing. Graeme J. Nicholson an der Universität Tübingen durchgeführt. Durch die vergleichende Analyse des Zuckerbausteins des Aranciamycins zur Verbindung TÜ 6384 A sollte die Stereochemie aufgeklärt werden. Hierzu wurde eine Probe von Aranciamycin und der Verbindung TÜ 6384 A zunächst säurekatalytisch hydrolysiert (6 M HCl, 110 C, 20 h), das getrocknete Hydrolysat zum N-()TFA/Ethylester derivatisiert und anschließend mittels chiraler GC-MS-Experimente analysiert. Durch einen Vergleich beider Analyseergebnisse konnte der in der Verbindung TÜ 6384 A enthaltene Zucker als β-2--methyl-l-rhamnose identifiziert werden. [49] 73

74 Ergebnisse und Diskussion NMR-spektroskopische Untersuchungen Die abschließende Strukturaufklärung von TÜ 6384 A wurde mit Hilfe von ein- und zweidimensionalen kernresonanzspektroskopischen Experimenten durchgeführt. Zunächst konnte die durch die FT-ICR-MS-Untersuchung gefundene Summenformel durch 1 H- und 13 C-NMR-Spektren bestätigt werden. Die detaillierte Analyse der CSY-, HSQC- und HMBC-NMR-Spektren ermöglichte die Bestimmung aller in Abbildung 38 gezeigten 1 H- und 13 C-Signale. Die 1 H-, 13 C- und HSQC-NMR-Spektren der Zielkomponente TÜ 6384 A zeigten insgesamt 30 an Kohlenstoff gebundene Wasserstoffatome, darunter fünf Methyl-, zwei Methylen- und elf Methin- Kohlenstoffatome. 12'' 11'' CH 3 H CH 3 H H CH 3 6'' 5'' 9'' H 3 C 1'' 3'' H 7'' CH 3 :CSY :HMBC Abbildung 38: CSY- und HMBC-Korrelationen von TÜ 6384 A. 2' 1' Im Vergleich zum Aranciamycin besitzt TÜ 6384 A daher fünf quartäre, zwei Methylen- und ein zusätzliches Methylkohlenstoffatom. Das CSY-Spektrum zeigte insgesamt vier isolierte Spinsysteme, darunter zwei Ethyl-, eine Phenyl- und eine Hexoseeinheit. Durch den Vergleich der zweidimensionalen NMR-Spektren (CSY, HSQC und HMBC) mit den literaturbekannten NMR-spektroskopischen Daten des Aranciamycin konnte zunächst die Struktur des Chromophors bzw. der Zuckereinheit bestimmt werden. Die Verbindung beider Einheiten konnte durch die wechselseitige HMBC-Korrelation zwischen Position 10 am Chromophor und der α-position 74

75 Ergebnisse und Diskussion (Position 1 ) des Zuckers nachgewiesen werden. Über die CSY-Kopplung von H-9 zu H-10 und die HMBC-Kopplungen von H-9 zu C-8, C-10, C-11 und H-10 zu C-8, C-14 und H-15 zu C-11, C-12 und C-13 konnte die in Abbildung 39 beschriebene Anhydrid-Struktur beschrieben werden. [50] Durch die HMBC-Korrelation von H-4 zu C-8 konnte die Verknüpfung der Anhydrid-Einheit mit dem Zucker nachgewiesen werden. Aufgrund der starken Ähnlichkeit mit dem Aranciamycin und der zusätzlichen Anhydrid-Struktur wurde die Verbindung Aranciamycin-Anhydrid genannt. 12'' 1 3 CH 3 9'' 11'' H '' H 3 C H H 5'' 3'' 12 1'' 7'' CH 3 2' CH 3 H 1' CH 3 Abbildung 39: Strukturformel von Aranciamycin-Anhydrid Biologische Aktivität Das antimikrobielle Wirkspektrum des Aranciamycin-Anhydrids wurde in einem Agardiffusionstest gegen die Stämme Bacillus subtilis DSM 10, Escherichia coli K12, Saccharomyces cerevisiae ATCC 9010 und Botrytis cinerea TÜ 157 mit einer Konzentration von 0.1 bis 1 mg/ml getestet. Ähnlich wie Aranciamycin zeigte das Aranciamycin-Anhydrid schwache antibakterielle Aktivität nur gegen Bacillus subtilis. Die Inhibierung des Wachstums von verschiedenen Tumorzellen wurde mit Aranciamycin selbst verglichen. Dabei wies Aranciamycin-Anhydrid eine schlechtere Aktivität auf (Tabelle 5). 75

76 Ergebnisse und Diskussion Tabelle 5: Wachstumsinhibierung von Aranciamycin-Anhydrid und Aranciamycin (µg ml -1 ) gegen ausgewählte humane Krebszelllinien. Aranciamycin-Anhydrid Aranciamycin Zelllinie GI 50 TGI GI 50 TGI HM > HepG2 7.2 > MCF 7 >10 > GI 50 : 50% Wachstumsinhibierung; TGI: 100% Wachstumsinhibierung 5.3 Diskussion Das Aranciamycin-Anhydrid stellt ein weiteres Mitglied der Anthracyclin-Familie dar, zu der noch weitere, auch in der Krebstherapie eingesetzte Verbindungen gehören. Zu erwähnen sind hier neben dem Aranciamycin das Daunorubicin, [51] das Doxorubicin [52] und das Epirubicin. Allen gemein ist eine charakteristische Anthrachinon-Einheit als pharmakophore Gruppe und die Isolierung aus Bakterien der Gattung Streptomyces. [53] a) b) CH 3 H H H CH 3 H H H 3 C H H CH 3 H 3 C H H 3 C H NH 2 Abbildung 40: Strukturformeln von a) Aranciamycin [48] und b) Daunorubicin. [51] 76

77 Ergebnisse und Diskussion Alle genannten Verbindungen werden in der Humanmedizin als Zytostatika eingesetzt, ihre primäre Wirkungsweise beruht auf ihrer Interkalation in die DNA und der damit verbundenen Inhibierung der DNA-synthetisierenden Topoisomerase IIα. Des Weiteren werden die Wirkstoffe im Körper transformiert, was zur Bildung von freien Radikalen und dies wiederum zur Spaltung der Doppelstrang-DNA führt. Aufgrund dieses Wirkmechanismus sind die Anthracycline sowohl stark cytotoxisch als auch mutagen. Durch die höhere Zellteilung von Krebszellen treten diese Wirkungen zunächst hier auf, jedoch sind davon auch alle anderen, nicht mutierten Zellen im Körper betroffen, was zu schweren, teils irreversiblen Beeinträchtigungen führen kann. Aufgrund dieser starken Nebenwirkungen werden alle Verbindungen dieser Klasse obwohl auch antibiotisch aktiv nicht als antibakterielle Wirkstoffe eingesetzt. Im Vergleich zu Aranciamycin besitzt das hier aufgeklärte Aranciamycin- Anhydrid eine ca. sechs- bis zehnfach verminderte Aktivität gegen humane Krebszelllinien. Dies mag zunächst verwundern, ist doch der einzige Unterschied zwischen beiden Verbindungen nur die zusätzliche Anhydrid-Einheit im Aranciamycin-Anhydrid. Das Anthrachinon als primäres Pharmakophor ist unverändert und in beiden Verbindungen identisch. Allerdings lässt sich die unterschiedlich starke Bioaktivität sehr gut anhand der Strukturanaloga Doxorubicin und Epirubicin aus derselben Wirkstoffklasse erläutern. Beide Stoffe sind konstitutiv identisch, unterscheiden sich jedoch an einem stereogenen Zentrum am Saccharid (Abbildung 41). Die Hydroxygruppe des Doxorubicins besitzt am Zucker eine S-, die des Epirubicins eine R-Konfiguration. a) H H H b) H H H H 3 C H (S) CH 3 H H 3 C H (R) CH 3 H NH 2 NH 2 Abbildung 41: Strukturformeln von a) Doxorubicin und b) Epirubicin. 77

78 Ergebnisse und Diskussion Dieser kleine strukturelle Unterschied äußert sich jedoch in einer wesentlich gesteigerten Verträglichkeit des Epirubicins im Vergleich zum Doxorubicin. Die Cardiotoxizität und somit die Verträglichkeit ist bei Epirubicin stark verringert. Somit kann die Anhydrid-Einheit beim Aranciamycin-Anhydrid durchaus für die verminderte Aktivität verantwortlich sein. Weitere bekannte Naturstoffe mit einer Anhydrideinheit stellen das Tautomycin bzw. sein Strukturanaloga Tautomycetin dar. [54, 55] Beide Naturstoffe wurden aus Streptomyceten isoliert und zeigen sehr ähnliche Bioaktivitäten (Abbildung 42). a) H H H b) H H H Abbildung 42: Strukturformeln von a) Tautomycin [54] und b) Tautomycetin. [55] Tautomycin und Tautomycetin sind nur sehr schwach aktiv gegen Bakterien, zeigen jedoch antifungale Eigenschaften und eine cytotoxische Wirkung gegen humane Leukämiezellen des Typs 562. [56] Der Anhydridteil beider Verbindungen ähnelt dem des Aranciamycin-Anhydrids, beim Tautomycin bzw. Tautomycetin ist jedoch formal ein Wassermolekül an die Doppelbindung addiert. Durch Fütterungsstudien mit markiertem Acetat, Propionat, Methionin, Isobutyrat, Glycin und Glutamat konnte der biosynthetische Ursprung von Tautomycin und Tautomycetin inklusive des Anhydridteils aufgeklärt werden. [57] Dabei stellte sich heraus, dass der Anhydridteil aus einer Propionat- und einer C 5 -Einheit zusammengesetzt wird. Aufgrund der unterschiedlich hohen Einbauraten der Kohlenstoffatome in der C 5 -Einheit wurde α- Ketoglutarat als Vorläuferbaustein vorgschlagen, welches aus Acetatbausteinen im Krebszyklus entsteht. Eine direkte Fütterung mit Glutamat, dem unmittelbaren Vorläufer von α-ketoglutarat, konnte diese These bestätigen. Als Biosyntheseschritte wird eine Aldolkondensation des α-ketoglutarats an die Methyleneinheit des Propionat-Coenzym A vorgeschlagen, gefolgt von einer Dehydratisierung zur Bildung 78

79 Ergebnisse und Diskussion des Maleinsäureanhydrids. Im Falle von Aranciamycin-Anhydrid erfolgt nun eine Dehydrierung, im Falle von Tautomycin bzw. Tautomycetin eine Hydratisierung zur Bildung des Maleinsäureanhydrid-Bausteins. Aufgrund der Ähnlichkeit des Anhydridteils von Aranciamycin-Anhydrid und Tautomycin bzw. Tautomycetin kann dieser biosynthetische Ursprung und Reaktionsweg ebenfalls für das Aranciamycin- Anhydrid postuliert werden. Das Antibiotikum SEK 43 wurde ebenfalls im Kulturfiltratextrakt des Stammes Streptomyces sp. TÜ 6384 gefunden. Dabei handelt es sich um ein Benzophenonderivat, welches zuerst 1995 von Bindseil et al. aus Streptomyces sp. P6417 isoliert worden ist. [58] Weitere Untersuchungen zur Biosynthese von Anthracyclinen zeigten, dass SEK 43 von denselben Enzymen wie die Anthracycline selbst produziert werden und durch eine alternative Zyklisierung des gleichen Vorläufers entstehen, aus dem auch die Anthracycline produziert werden. [59] H H H H Abbildung 43: Strukturformel von SEK 43. [58] 79

80 Ergebnisse und Diskussion 6 Strukturaufklärung der Atacamycine A, B und C aus Streptomyces sp. C Herkunft und Taxonomie des Bakterienstammes Streptomyces sp. C-38 Der Stamm Streptomyces sp. C-38 wurde aus einer Bodenprobe aus der Atacama- Wüste, Peru, isoliert. [60] Aufgrund der örtlichen Lage westlich der Anden am Humboldtstrom gilt die Atacamawüste als eines der regenärmsten Gebiete der Welt. [61] Diese extremen klimatischen Bedingungen bilden die Grundlage zur Produktion von neuartigen Wirkstoffen von extremophilen Bakterien. Die Kolonien des isolierten Stamms zeigten auf Agar-Festmedium ein beiges Substratmycel, weißes Luftmycel und graubraune Sporen. Die Partialsequenzierung der 16S-rRNA des Stammes ergab eine Zugehörigkeit zu der Gattung Streptomyces. Die phylogenetische Analyse des Stamms ergab eine große Ähnlichkeit zum Stamm Streptomyces griseosporus DSM [60] Abbildung 44: Lichtmikroskopische Aufnahmen von Stamm Streptomyces sp. C-38 (links: Kolonie auf der Agarplatte; rechts: Nahaufnahme einer Kolonie). [62] 80

81 Ergebnisse und Diskussion Chemisches Screening Zur Untersuchung des Stamms C-38 auf Produktion von Sekundärmetaboliten wurde von Andreas Kulik von der Arbeitsgruppe Fiedler an der Universität Tübingen ein chemisches Screening durchgeführt. Der Stamm wurde zunächst in drei verschiedenen Kulturmedien (SGG, M, 410) fermentiert und nach 168 h mittels HPLC-DAD analysiert. [1] Hierbei zeigte sich, dass der isolierte Stamm C-38 drei Verbindungen produziert, die keine Übereinstimmung mit bekannten Verbindungen in der UV/Vis-Datenbank zeigten (Abbildung 45). Aufgrund der späten Retentionszeit und den charakteristischen Signalen des UV/Vis-Spektrums wurde zunächst angenommen, dass es sich bei den drei Verbindungen um Polyketidantibiotika handelt. Die drei Zielverbindungen mit einer Retentionszeit von R t = 13.1 min, R t = 13.7 min und R t = 15.0 min wurden Atacamycin A, B und C benannt. 81

82 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 45: HPLC-DAD-Chromatogramm des Kulturfiltratextrakts des Stammes C-38 und UV/Vis-Spektrum der Verbindung Atacamycin A. Die UV/Vs-Spektren der Verbindungen Atacamycin B und C sehen fast identisch zu Atacamycin A aus. 82

83 Ergebnisse und Diskussion Isolierung und Reinigung Die Isolierung und Aufreinigung der drei Zielverbindungen wurde von Andreas Kulik von der Arbeitsgruppe Fiedler an der Universität Tübingen durchgeführt. Zur Isolierung der drei Zielsubstanzen wurde der Stamm im 10-Liter Biostat-S Bioreaktor mit dem Komplexmedium NL SGG fermentiert. Nach einer Wachstumszeit von 168 h wurde die Kulturbrühe durch Filtration in Myzel und Kulturüberstand getrennt und der Überstand verworfen (Schema 3). Das Myzel wurde dann mit einer 1:1-Mischung (v:v) Methanol/Aceton extrahiert, der konzentrierte Extrakt mit 3 N HCl auf ph 7 eingestellt und mit Cyclohexan extrahiert. Ein Aliquot des eingeengten Cyclohexanextrakts wurde anschließend an Sephadex LH-20 mit Methanol als mobile Phase chromatographiert, wobei 174 mg Rohextrakt erhalten werden konnten. Aus diesem konnten abschließend mittels präparativer HPLC die Atacamycine A, B und C erhalten werden. 650 g Myzel 2.58 L Myzelextrakt 3.1 g Rohextrakt I 174 mg Rohextrakt II 3x Extraktion mit 1 L 1:1 Methanol/Aceton Konzentration unter Vakuum Einstellen auf ph 7 mit 3 N HCl 2x Extraktion mit 250 ml Cyclohexan 1 g Aliquot Chromatographie an Sephadex LH-20 MeH RP-PHPLC an Reprosil Pur Basic, Wasser /Methanol mit 0.1% HCH linearer Gradient % 16 mg Atacamycin A 18 mg Atacamycin B 13 mg Atacamycin C Schema 3: Isolierungsschema der Atacamycine A, B und C. 83

84 Ergebnisse und Diskussion 6.2 Strukturaufklärung Die UV/Vis-Spektren aller drei Verbindungen zeigten zwar hohe Übereinstimmung untereinander, jedoch keine Übereinstimmung beim Abgleich mit der UV/Vis- Datenbank des chemischen Screenings. Aufgrund der Absorptionsmaxima bei = 310 nm wurde zunächst ein Polyketid-Grundkörper vermutet. Die starke Retention aller drei Verbindungen an einer C 18 -Phase deutet darauf hin, dass es sich um sehr unpolare Strukturen ohne ionische oder polare funktionelle Gruppen handelt HPLC-ESI-MS Über HPLC-ESi-MS-Untersuchungen konnte zunächst die Molekülmasse der drei Zielverbindungen ermittelt werden. Das MS-Spektrum von Atacamycin A wies ein Positiv-Molekülion [M+H] + von 501.2, Atacamycin B ein Positiv-Molekülion [M+H] + von und Atacamycin C ein Positiv-Molekülion [M+H] + von auf. Aufgrund der charakteristischen Molekülmassendifferenzen von 30 amu und 16 amu konnte davon ausgegangen werden, dass es sich bei Derivat B um ein Demethyl-deoxyatacamycin A und bei Derivat C um das Deoxy-atacamycin B handelt Bestimmung der Summenformel Die Summenformel der drei Verbindungen wurde am Institut für organische Chemie der TU Berlin mittels einer LTQ rbitrap XL bestimmt. Für die Berechnung der Summenformel wurden die Elemente Kohlenstoff (C), Wasserstoff (H), Sauerstoff () und Stickstoff (N) zugelassen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. 84

85 Ergebnisse und Diskussion Tabelle 6: Physikochemische Eigenschaften von Atacamycin A, B und C. Atacamycin A B C Aussehen weißes Pulver weißes Pulver weißes Pulver Molekülmasse Summenformel C 30 H 44 6 C 29 H 42 5 C 29 H 42 4 ESI-rbitrap-MS gemessen berechnet [M+Na] [M+Na] [M+Na] UV MeH max [nm] 221, , ,307 (ε[cm 2 µmol -1 ]) 20 [ ] D a (MeH) (c 0.6) +3.1 (c 0.1) -8.0 (c 0.7) IR v max (cm -1 ) 3460, 2964, 2930, 2875, 1700, 1606, 1452, 1375, 1263, 1094, 1068, , 2963, 2927, 2876, 1710, 1635, 1457, 1378, 1259, 1171, 1050, , 2960, 2935, 2873, 1713, 1626, 1457, 1376, 1270, 1171, 1103, 971 Die Ergebnisse der Summenformelbestimmung konnten die zunächst vermuteten strukturellen Unterschiede der Atacamycin-Derivate bestätigen. Im Vergleich zu Atacamycin B besitzt Atacamycin A eine weitere CH 2 -Einheit und Atacamycin C ein Sauerstoff-Atom weniger NMR-spektroskopische Untersuchungen Die Konstitution aller drei Polyketidverbindungen konnte abschließend über ein- und zweidimensionale NMR-Spektroskopie bestimmt werden. Durch die Auswertung der eindimensionalen Wasserstoff- und Kohlenstoff-NMR-Spektren konnte zunächst die über die hochauflösende Massenspektrometrie ermittelten Summenformeln bestätigt werden. Das Wasserstoff-NMR-Spektrum der Komponente C zeigte insgesamt vier Methyl-, vier Methylen-, fünf aliphatische Methin-, ein Methoxy-, und 13 olefinische Wasserstoffsignale. Ein weiteres, breites Signal konnte einer Hydroxygruppe zugeordnet werden. Im Vergleich dazu besitzt die Komponente B eine Hydroxygruppe mehr und anstelle der vier Methylen- und fünf Methingruppen drei 85

86 Ergebnisse und Diskussion Methylen- und sechs aliphatische Methineinheiten. Die Komponente A hingegen zeigte im Vergleich zu Komponente B anstelle einer Methyl- eine Methingruppe und eine weiteres Methoxysignal. Das eindimensionale Kohlenstoff- und das DEPT-NMR- Spektrum von Komponente C zeigte neben fünf CH 3 -, vier CH 2 - und 18 CH-Signalen nur ein quartäres, olefinisches und ein Carbonsäureester-Kohlenstoffatom. Daraus ergibt sich eine ungewöhnlich niedrige Anzahl an Heteroatomen im Vergleich zur Absolutanzahl der Kohlenstoffatome, welches ebenfalls die Vermutung bestätigt, dass die Verbindungen zu der Gruppe der Polyketide gehören. Das zweidimensionale CSY-NMR-Spektrum zeigte für die Komponenten B und C insgesamt drei isolierte Spinsysteme: ein Ethylensystem (C 5 ), ein C 13 -System und ein verzweigtes C 10 -System (Abbildung 46). Für die Komponente A wurden jedoch anstelle des C 10 -Systems zwei C 5 -Systeme angezeigt. Aufgrund der schon bei den Komponenten B und C sehr schwach zu ermittelnden Kopplung zwischen den beiden Protonen der jeweiligen C 5 -Systeme wurde zunächst davon ausgegangen, dass es sich auch bei Komponente A um ein zusammenhängendes C-10-System handelt und die Kopplung nur durch veränderte geometrische Einflüsse nicht gemessen werden konnte. a) 29 Me c) H H H Me b) H Me H 1 H- 1 HCSY HMBC Me Abbildung 46: CSY- und HMBC-Korrelationen von a) Atacamycin A, b) Atacamycin B und c) Atacamycin C. 86

87 Ergebnisse und Diskussion Durch die Auswertung der HMBC-Spektren der drei Verbindungen konnten die ermittelten CSY-Spinsysteme und alle weiteren singulären Einheiten miteinander verknüpft und die Struktur aufgeklärt werden. Beide Protonen der Ethyleneinheit (C- 2, C-3) zeigten einerseits Korrelation zu dem Carbonsäureester-Kohlenstoffatom (C- 1), andererseits konnte eine Verbindung zu dem quartären Kohlenstoffatom (C-4), zu einer weiteren olefinischen CH-Gruppe (C-5) und zu einer singulären Methyleinheit nachgewiesen werden. Diese zeigte ebenfalls wechselseitige Korrelation zur Ethyleneinheit, des Weiteren auch eine Korrelation zur endständigen CH-Gruppe aus dem C 10 -System und zu dem olefinischen Kohlenstoffatom. Durch diese bei allen drei Verbindungen sichtbare Korrelation konnten die ersten beiden Fragmente miteinander verbunden werden. Während der weiteren HMBC-NMR-spektroskopischen Auswertung wurde der erste Unterschied zwischen den Komponenten B, C und der Komponente A ersichtlich. Derivat B und C zeigten beide die zusammenhängende C 10 -Einheit, während Derivat A eine Kopplung weniger und dadurch formal zwei C 5 -Einheiten zeigte. An der Verbindung beider Teilstücke an C-9 besitzt Derivat A anstelle eines Protons eine Methoxygruppe, die durch die Kopplung von H-28 zu C-9 zugeordnet werden konnte. Die Verbindung des nächsten Fragments erfolgt über die HMBC-Kopplung von H-29 zu C-13. Hierbei stellte sich heraus, dass die Kopplung zwischen H-12 und H-13 ebenfalls im CSY-NMR-Spektrum hätte erwartet werden können. Die weitere Konstitution wurde anhand der CSY- und HMBC-NMR-Spektren aufgeklärt. Ein weiterer struktureller Unterschied von Atacamycin A und B zu Atacamycin C war die Präsenz einer Hydroxygruppe an C-14. Somit konnte durch NMR-Spektroskopie die Differenz der Summenformeln auch in der Struktur vollständig aufgeklärt werden (Abbildung 47). Durch die Kopplung von H-21 zu C-1 konnte die Ringverknüpfung des Makrolactons nachgewiesen werden. 87

88 Ergebnisse und Diskussion 29 (E) R 2 H (Z) 17 Me 11 R 3 R (E) (E) (E) (E) 20 B(2) 1 A(1) C(3) (E) (E) (E) Abbildung 47: Strukturformeln der Atacamycine A, B und C. R 1 R 2 R 3 Me H H H H H Die Stereochemie der Doppelbindungen der Komponenten sollte zunächst durch die in den 1 H-NMR-Spektren gezeigten Kopplungskonstanten der olefinischen Protonen bestimmt werden. Aufgrund der teilweisen Überlagerung mehrerer aufgespalteter Signale im olefinischen Bereich war die Bestimmung aller Doppelbindungskonfigurationen aus den 1 H-NMR-Spektren jedoch nicht möglich. Daher wurde zur Bestimmung der Kopplungskonstanten von überlagerten Signalen ein seltcsy-experiment durchgeführt. Dazu wurde zunächst die Einstrahlfrequenz eines Protons in räumlicher Nähe zu dem Proton gewählt, von dem die Kopplungskonstante bestimmt werden sollte. Hierbei ist es wichtig, dass die Einstrahlfrequenz keine Überlagerung mit weiteren Signalen zeigt, da dies sonst zu schwer interpretierbaren Ergebnissen führt. Daraus konnten die folgenden Kopplungskonstanten von J 2,3 = 15.5 Hz, J 6,7 = 15.2 Hz, J 10,11 = 15.8 Hz, J 16,17 = 10.7 Hz, J 18,19 = 14.7 Hz und J 22,23 = 15.7 Hz und die Konfiguration dieser Doppelbindungen als 2E, 6E, 10E, 16Z, 18E und 22E bestimmt werden. Zur Bestimmung der Stereochemie der Doppelbindung an C-4 und C-5 wurde ein NESY-Experiment durchgeführt. Eine Kopplung von H-3 zu H-5 zeigte dabei die 4E-Konfiguration der Doppelbindung (Abbildung 47). Zur Aufklärung der absoluten Stereochemie der sieben stereogenen Zentren des Atacamycin A wurde dies zunächst in verschiedenen Lösungsmitteln und -gemischen zur Kristallisation angesetzt. Leider konnten aus diesen Ansätzen auch bei verminderter Temperatur (4 C) keine für die Einkristallanalyse brauchbaren Kristalle erhalten werden. 88

89 Ergebnisse und Diskussion H * * * * H Me * Me * * Abbildung 48: Die drei stereochemischen Fragmente zur Berechnung der Stereochemie am Beispiel Atacamycin A. Experimente zur Bestimmung der relativen Stereochemie mittels NESY-Spektren und gleichzeitigen strukturchemischen Berechnungen wurden ebenfalls durchgeführt. Aufgrund der großen Anzahl an Stereozentren wurde die Modellverbindung Atacamycin A zunächst in drei Strukturfragmente aufgeteilt, da andernfalls die strukturchemischen Berechnungen zu umfangreich gewesen wären (Abbildung 48). Die experimentell beobachteten NESY-Kopplungen zwischen den für die Stereochemie relvanten Zentren waren jedoch nicht eindeutig einer Konfiguration zuzuordnen, so dass die Bestimmung der Stereochemie mit dieser Methode keine verlässlichen Aussagen geben konnte. Weiterführende Experimente mit NMR-spektroskopischen Ansätzen zur Aufklärung der absoluten Stereochemie des Atacamycin A nach Murata [63] wurden ebenfalls durchgeführt. Diese Methode basiert darauf, dass in azyklischen Systemen die Konformation von zwei benachbarten asymmetrischen Zentren durch gestaffelte ( staggered ) Rotamere bestimmt wird, und dass deren relative Stereochemie durch die Auswertung von Kohlenstoff-Proton-Spinkopplungskonstanten ( 2,3 J C,H ) und Proton-Proton-Spinkopplungskonstanten ( 3 J H,H ) aufgeklärt werden kann. Durch Vergleichen dieser Kopplungskonstanten kann das vorwiegende Rotamer aus den sechs möglichen Positionen für die threo- und erythro-form bestimmt werden. Die Anwendbarkeit dieser Methode für zyklische Systeme hängt jedoch stark von der Ringspannung des Moleküls ab. Ist die Ringspannung zu stark, ist eine freie Drehbarkeit der Rotamere nicht gegeben und die erhaltenen Kopplungskonstanten können nicht mit den in der Murata-Methode beschriebenen Kopplungen in 89

90 Ergebnisse und Diskussion Übereinstimmung gebracht werden. Bei den hier aufgeklärten Atacamycinen handelt es sich um 22-gliedrige Makrolactone mit einer hohen Anzahl an Doppelbindungen und asymmetrischen Kohlenstoffatomen im Ring. Sowohl Doppelbindungen als auch stereogene Zentren können zu einer hohen Ringspannung beitragen, weswegen die Methode vom Murata beim Atacamycin A als eine unsichere Methode betrachtet und nicht angewendet wurde. Eine weitere NMR-spektroskopische Analyseverfahren zur Bestimmung der Stereochemie ist die Methode nach Kishi [64]. Hierbei wird die zu untersuchende Verbindung in seine stereochemischen Fragmente (Abbildung 48) unterteilt und diese einzeln mit NMR-Spektroskopie charakterisierten, synthetischen Substanzen verglichen. Hierbei wird angenommen, dass stereochemische Einflüsse näherungsweise nur bis zu einem Abstand von einer Methyleneinheit beachtet werden müssen. Sind stereogene Zentren weiter entfernt voneinander, wird der gegenseitige Einfluss vernachlässigbar. Zum Vergleich der synthetischen Verbindungen mit dem Naturstoff werden nur die 13 C-chemischen Verschiebungen genutzt, und aus diesem Grund ist es unabdingbar, dass die Vergleichssubstanzen genau mit der Struktur der Fragmente übereinstimmen, da eine kleine strukturchemische Änderung eine große Änderung der 13 C-chemischen Verschiebung bedeutet. Beim Atamcamycin A handelt es sich um die Abfolge Methyl- Methoxy (C-8 und C-9) und Methyl-Hydroxy-Hydroxy-Methoxy (C-12, C-13, C-14 und C-15). Leider sind für diese Abfolgen keine synthetischen Vergleichssubstanzen erhältlich, so dass die Methode nach Kishi zur Aufklärung der Stereochemie der Atacamycine nicht angewendet werden konnte. Ebenfalls angewendet wurde eine relativ neue in der Strukturaufklärung von Naturstoffen eingesetzte NMR-spektroskopische Technik, welche die Präsenz von dipolarer Restkopplung (RDC, residual dipolar coupling) in einem asymmetrischen Molekül zu Konfigurationsanalyse nutzt. [65] Hierbei wird während des NMR- Experiments in dem Naturstoff eine dipolare Restkopplung erzwungen, die sich in die Konfiguration des jeweiligen stereogenen Zentrums umrechnen lässt. Aufgrund der Neuheit der Technik werden dafür NMR-Pulstechniken verwendet, die eine Avance- Konsole erfordern und aufgrund unkompatibler NMR-Spektrometer nicht an dem 500-MHz NMR-Spektrometer des Instituts für Chemie der TU Berlin durchgeführt werden konnten. 90

91 Ergebnisse und Diskussion 6.3 Biologische Aktivität Die Atacamycine gehören zu der Stoffklasse der Makrolactone, die häufig für ihre antiproliferative Wirkung gegen Tumorzellen bekannt sind. [66] Aufgrund dessen wurden Atacamycin A und B bei der Firma ncotest GmbH, Freiburg, gegen eine Vielzahl von Tumorzellen getestet. Die Ergebnisse der Testierung sind in Tabelle 7 zusammengefasst. Tabelle 7: Antiproliferative Aktivität der Atacamycine A (1) und B (2) gegen 42 humane Tumorzelllinien. IC 50 [µm] Typ des Tumors Zelllinie Atacamycin A Atacamycin B Harnblase BXF 1218L BXF 1352L BXF T Dickdarm CXF 269L CXF DIFI CXF HCT CXF HT CXF RK Magen GXF 251L GXF MKN Kopf und Nacken HNXF CAL Leber LIXF 575L Lunge LXF NCI-H LXFA 289L LXFA 526L LXFA 629L LXFL 1121L LXFL 529L Brust MAXF 401NL MAXF MCF MAXF MDA-MB

92 Ergebnisse und Diskussion Fortsetzung Tabelle 7: Melanom MEXF 1341L MEXF 276L MEXF 462NL Eierstock VXF 899L VXF NIH:VCAR Pankreas PAXF 1657L PAXF 546L PAXF PANC Prostata PRXF 22Rv PRXF DU PRXF LNCaP PRXF PC3M Mesotheliom PXF 1118L PXF 1752L PXF 698L Niere RXF 1781L RXF 393NL RXF 486L Sarkom SXF Saos SXF TE Gebärmutter UXF 1138L Mittelwert IC Beide Verbindungen zeigten überdurchschnittliche bis gute antiproliferative Wirkung gegen eine Vielzahl der getesteten Krebszelllinien. Die geringste mittlere inhibitorische Konzentration (IC 50 ) von Atacamycin A konnte gegen die Brustkrebszelllinie MAXF 401NL ermittelt werden. Des Weiteren zeigte es gute Werte gegen Dickdarm- (CXF DIFI) und Gebärmutterkrebszelllinien (UXF 1138L). Die höchste Hemmwirkung von Atacamycin B konnte gegen die Zelllinie CXF RK mit einer mittleren inhibitorischen Konzentration von 8.5 µm beobachtet werden. Im Vergleich beider Verbindungen zeigte Atacamycin B eine um Faktor 1.5 bis 2fach schlechtere Aktivität als Atacamycin A. Des Weiteren sollen die Atacamycine in ihrer Wirkung als Enzyminhibitoren getestet werden. Diese Testierung wird von der Arbeitsgruppe Imhoff am Kieler Wirkstoff- 92

93 Ergebnisse und Diskussion Zentrum, Leibniz-Institut für Meereswissenschaften, IFM-GEMAR, Kiel durchgeführt und war zum Zeitpunkt der Drucklegung der Dissertation noch nicht abgeschlossen. 6.4 Diskussion Die Atacamycine konnten in dieser Arbeit als neuartige Makrolidantibiotika in ihrer Struktur aufgeklärt werden. Die Grundstruktur der Makrolide ist eine kurze (C 7 ) bis sehr lange (C 61 ) Kohlenstoffkette, welche über eine Carbonsäureestereinheit zu einem Lacton verknüpft ist. [67] Durch die unterschiedliche Anordnung von Doppelbindungen und Methyl-, Hydroxy-, Methoxy-, Zucker- oder weiteren dekorativen Bausteinen ist ihre strukturelle Vielfalt nahezu unbegrenzt. Die Atacamycine zeigen hohe strukturelle Ähnlichkeit zu Dictyostatin, welches ebenfalls einen 22-gliedrigen Ring als Grundgerüst und ein ähnliches exozyklisches Fragment besitzt (Abbildung 49). [68] a) b) H H (E) (Z) H H Me R 1 (E) R 1 = (E) H H Me (E) (E) (E) Abbildung 49: a) Strukturformel von Dictyostatin aus einem Stamm der Gattung Spongia sp., b) zum Vergleich Atacamycin A. Dictyostatin zeigt Aktivität gegen humane Krebszelllinien im nanomolaren Bereich und wurde anfang der 90er Jahre aus einem marinen Schwamm der Gattung Spongia sp. isoliert. [69] Weitere Untersuchungen zeigten, dass die überaus starke Wirkung des Dictyostatins auf eine Hemmung des Abbaus der Mikrotubuli und dadurch verursachte Störung der Zellteilung zurückzuführen ist. [70] Dieser Wirkmechanismus wird aufgrund der ähnlichen Struktur und biologischen Wirksamkeit ebenfalls für die Atacamycine angenommen. Zur Klärung des genauen Wirkortes und mechanismus sind allerdings weiterführende experimentelle 93

94 Ergebnisse und Diskussion Untersuchungen nötig. Weitere bekannte Makrolide mit einem 22-gliedrigen Grundgerüst stellen die Wortmannilactone [71] dar, welche ebenfalls aus Schwämmen isoliert wurden (Abbildung 50). Das Swinholide [72] wird ebenfalls als ein 22-gliedriges Lacton synthetisiert, anschließend erfolgt die Konjugation von zwei Lactoneinheiten zu einem Dimer. Dadurch entsteht der aussergewöhnliche Naturstoff mit einer C 2 - Rotationsachse. a) H b) Me H H H H H H Me H Me H H H H Me Abbildung 50: Strukturformeln von a) Wortmannilacton A [71] und b) Swinholide A. [72] Die Swinholide zeigen ebenfalls ein dem Dictyostatin ähnliches Wirkspektrum. [73] Aufgrund der schwierigen und kostspieligen Gewinnung von Sekundärmetaboliten aus Schwämmen ist jedoch eine pharmazeutische Anwendung des Dictyostatins nicht abzusehen. Die ebenfalls sehr kosten- und zeitaufwendige Totalsynthese kann aufgrund der vielen Stereozentren nicht als einfache Alternative angesehen werden. Da es sich bei dem Produktionsstamm der Atacamycine um einen terrestrischen Actinomycetenstamm handelt, können diese Naturstoffe relativ einfach und in großen Mengen gewonnen werden. Leider konnte im Rahmen dieser Arbeit die Stereochemie der Atacamycine nicht aufgeklärt werden, obwohl unterschiedliche Ansätze hierzu verfolgt worden sind. Aufgrund ihrer hohen strukturellen Flexibilität ist eine Einkristallzüchtung von Makrolactonen nur schwer möglich. Zur Vermeidung von weiteren Substanzverlusten wurden daher die Versuche zur Kristallisation ohne Ergebnis eingestellt. Generell ist die Bestimmung der absoluten Stereochemie von Makrolactonen aufgrund der oben 94

95 Ergebnisse und Diskussion genannten Probleme schwierig und wird meist erst Jahre nach der ersten Veröffentlichung der Substanz beschrieben. Zwei der heute noch verwendeten Vertreter dieser Gruppe, das Nystatin [74] und das Erythromycin A, [75] wurden erst 31 bzw. 12 Jahre nach der ersten Erwähnung vollständig in ihrer Stereochemie beschrieben (Abbildung 51). [76, 77] Die erste Veröffentlichung des Dictyostatins enthält eine Strukturformel, die in einer späteren Publikation als inkorrekt widerlegt wurde. Letztendlich bleibt nur die Totalsynthese als finales Mittel, um sowohl die Konstitution als auch die Konfiguration des Naturstoffes abschließend zu klären. [78] a) b) Abbildung 51: Strukturformeln von a) Nystatin und b) Erythromycin A. 95

96 Ergebnisse und Diskussion 7 Strukturaufklärung von TÜ 6392 A2 und TÜ 6392 D aus Streptomyces sp. TÜ Herkunft und Taxonomie des Bakterienstammes Streptomyces sp. TÜ 6392 Der Stamm Streptomyces sp. TÜ 6392 wurde ebenfalls wie der Stamm Streptomyces sp. TÜ 6384 aus einer Erdprobe eines Fichtenwaldes bei Tübingen (Rammert, Bühl) isoliert. [1] Abbildung 52 zeigt eine lichtmikroskopische Aufnahme des Stammes auf der Agarplatte. Das Substratmyzel der Bakterien ist beige, das Luftmycel weiß und die Sporen sind ebenfalls weiß gefärbt. Die Sporenketten sind spiralförmig (Spira- Typ). Abbildung 52: Lichtmikroskopische Aufnahmen von Stamm Streptomyces sp. TÜ 6392 (links: Kolonie auf der Agarplatte; rechts: filamentöses Myzel in der Submerskultur). [1] Die taxonomische Charakterisierung des Stammes erfolgte durch Dr. Dirk Schulz, AG Fiedler, an der Universität Tübingen. In der Zellwand des Stammes konnte LL- Diaminopimelinsäure nachgewiesen und der Stamm daher chemotaxonomisch der Gattung Streptomyces zugeordnet werden. Des Weiteren konnten die Hauptmechaninone MK-9 (H6, H8), gesättigte und ungesättigte iso- und anteiso- 96