Auswertung PCR. Übersicht Nachweise mittels PCR. - mit dem Primer Fr2A: Bande oder Schmier im Bereich zwischen 240 und 280 bp

Transkript

1 Neuropathologie und Molekularpathologie Übersicht Nachweise mittels PCR Lfd.-Nr. Nachweis von: Elektrophorese/Photometrie/ 1. Beta-Globin (zum Nachweis der DNA- Qualität) Luminometrie/ Fragmentanalyse/Sequenzierung/ 267 bp Restriktionsanalyse 2. B-Lymphome (Immunglobulin- SchwerkettenRearrangement) 3. Borrelien Real-time-PCR (Flagellin-Gen-Sequenz von B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii, B. valaisiana)) 4. BRAF (real-time-pcr AMP) (Nachweis von Mutation V600 im BRAF-Gen auf Chromosom 7) 5. Chlamydien (cryptic plasmid von Chlamydia trachomatis) 6. c-kit Sequenzierung (Nachweis von Mutationen Chr. 4, Exon 9,11,13,17,18) 7. CMV Real time-pcr (Tib Molbiol) (Fragment des Glykoprotein B Genes) - mit dem Primer Fr2A: Bande oder Schmier im Bereich zwischen 240 und 280 bp - mit dem Primer Fr3A: Bande oder Schmier im Bereich zwischen 60 und 160 bp Pos. bei Cp-Wert unter 40 Pos. bei Cp-Werten unter 38,5 241 bp - zum Spezifitätsnachweis sequenzieren Ex 9, 11, 13, 17, 18: ca bp Sequenzierung zum Mutationsnachweis Pos. bei Cp unter Darmparasiten Real-time-PCR von RIDA Gene von r-biopharm (Nachweis von Giardia lamblia, entamoeba histolytica, Cryptosporidium parvum, Dientamoeba fragilis) Giardia lamblia: Filter465/510: Ktr Cp25+/-1 Entam. hist.: Filter 533/610: Ktr. Cp 26+/-1 Cryptosp.parv.: Filter 618/660: Ktr. Cp 27+/-1 Dientam. frag.: Filter 533/580: Schmelzkurve: Peak bei 85 C +/-1 C 01.15/rev. 10 Auswert_PCR 1 Seite 1 von 8

2 9. EBV real-time-pcr (TibMolbiol) pos. Bei Cp bis E. coli (Verotoxine, enteroinvasive E. coli, hitzelabiles und hitzestabiles Toxin) VT1: 130 bp VT2: 285 bp VT2v: 385 bp - zur Abgrenzung von VT2-Vatianten kann das Amplifikat von VT2 einer Restriktionsanalyse unterworfen werden (siehe Anhang S. 5) EIEC: 424 bp LT: 708 bp ST: 182 bp 11. EGFR (Exon auf Chr. 7) 1. real-time-pcr (AMP) 2. Sequenzierung 12. Endopredict (Myriad) RT-qPCR, Gen-Expression Prognose Mamma-CA 13. Entamoeba histolytica und dispar (18S rrna-gen) 14. GNAS1 (Nachweis von Wildtyp und Mutationen am Codon 210 am GNAS1-Gen [Guaninenucleotidebinding protein] bei polyostotischer und monoostotischer fibröser Dysplasie) 1. Pos. bei Cp zwischen 20 und 37 2.Sequenzierung Zum Mutationsnachweis Der Cp-Wert von RPL37A des QC-Streifens sollte unter 24 liegen Real-time-PCR: Pos. bei Cp bis 40 Amplifikatlänge: je ca. 372 bp WT-1: WT-2: gnascys/r201c gnasgly/r201g gnashis/r201h 01.15/rev. 10 Auswert_PCR 1 Seite 2 von 8

3 15. Hämochromatose (Nachweis von Mutation C282Y Cystein zu Tyrosin und H63D Histidin zu Asparaginsäure am HFEGen, einem zur MHC Klasse I gehörenden Protein) C282Y: 164 bp, Restriktion mit SnaBI: 164 bp (Wildtyp) 72 bp und 92 bp (Mutation) H63D: 161 bp Restriktion mit BclI: 94 bp und 67 bp ( Wildtyp) 161 bp (Mutation) 16. Helicobacter pylori real-time-pcr (23S rrna-gen) 17. Herpes-1 u. 2 Real-time-PCR (Nachweis des Glykoprotein D (gd)-genes von HSV-1 und des Glykoprotein G (gg)-genes von HSV-2) 18. Herpes zoster Real-time-PCR (Nachweis Polymerase-Gens von Varizella zoster)) 19. HPV nach LCD Array 3.5 C von Chipron (Primer MY09/11 und Mix 125) Hybridisierung nach PCR Sowie Zusatz-Chip HPV Plus HPV (L1-Region, Primer MY09/11 und Primer GP5+/6+)). sicher pos. bei Cp unter 40 sicher pos. bei Cp unter 40 sicher pos. bei Cp unter 40 Mit dem Chipron-Test 3.5 werden folgende HPV-Typen nachgewiesen: 6,11,16,18,31,33,35,39,42,44,45,51,52,53,54,56, 58,59,61,62,66,67,68,70,72,73,81,82,83,84,90,91 Mit dem Chipron-Test 2.0 werden folgende HPV-Typen nachgewiesen: 2,5,7,12,13,27,32,55,57 Ca. 450 bp (MY09/11) Ca. 150 bp (GP5+/6+) Sequenzierung zur Differenzierung der verschiedenen HPV-Typen 01.15/rev. 10 Auswert_PCR 1 Seite 3 von 8

4 21. HPV 16, 18 oder 33 (als nested PCR, E6 ORF) 1.Lauf: 307 bp 2. Lauf: HPV 16: 124 bp HPV 18: 188 bp HPV 33: 145 bp 22. HPV Haut L1 ORF, Consensus PCR für viele Haut-HPV s) 23. Hypermethylierung des MGMT-Promotors (Gliome) 480 bp (ggf. Sequenzierung) Methylierung und quantitative real-time-pcr Cp sollte unter 40 liegen, (Promotor-Hypermethylierung der O6-Methylguanine- Anteil der methylierten DNA sollte über 1% liegen. DNAMethyltransferase) 24. IDH1-Mutationen (Gliome) Sequenzierung (129 bp) (Codon 132, Chromosom 2) 25. JC-Virus (Large T-Antigen) Real-Time-PCR: Pos. bei Cp unter Kaposi-Sarkome (HHV-8) (nested PCR für ORF26 des humanen Herpes-Virus 8) 27. k-ras-mutations-nachweis 1. real-time-pcr (AMP) (Codon 12, 13, 59, 61, 117, 146 von Exon 2-4 k-ras-gen) 2. (Nested) PCR (Codon 12/13/59/61/117/146 von Exon 2-4 k-rasgen) 1.Lauf (KS-1 u. KS-2): 233 bp 2. Lauf (WH-1 u. WH-2): ca. 180 bp 1. Real-time-PCR: Pos. bei Cp unter 38,5 bzw (k-ras Extension) 2. Nested PCR (Codon 12/13): 1. Lauf: 179 bp 2. Lauf: 114 bp Sense- und Antisense-Strang sequenzieren 28. Leishmania ssp. (Nachweis konservierte Region der Minicircle kdna) 116 bp Sequenzierung 01.15/rev. 10 Auswert_PCR 1 Seite 4 von 8

5 30. Mikrosatellitenanalyse (Screening HNPCC) 1.Satz Primer: BAT26: bp (Mononucleotid Repeat) BAT40 : bp (Mononucleotid Repeat) MfD15 (D17S250): ca. 150 bp (DinucleotidRepeat) D2S123: bp (Dinucleotid-repeat) APC: bp (Dinucleotid-Repeat) 2. Satz Primer: Bat25: ca. 90 bp (Mononucleotid-Repeat) D10S197: bp (Dinucleotid-Repeat) D18S58: bp (Dinucleotid-Repeat) D18S69: ca. 110 bp (Dinucleotid-Repeat) MYCL1: bp (Tetranucleotid-Repeat) - Amplifikate jeweils von Normal (Blut- ) und Tumor- Probe gepaart vergleichen 31. Mykobakterien-Nachweis nach Chipron LCD MYCO-Direkt 1.7 (Nachweise von M. tuberculosis komplex, atyp. Mykobakterien mittels Multiplex-PCR) a) Nachweis von M. tuberculosis-komplex IS6110: 123 bp b) Nachweis von M. genus c) Nachweis von M. avium/intracellulare (MAI) M. kansasii M. xenopi M. abscessus M. gordonae M. peregrinum M. szulgai M. haemophilum M. xenopi M. marium/ulcerans M. simiae M. smegmatis 01.15/rev. 10 Auswert_PCR 1 Seite 5 von 8

6 32. Mykobakterien (Nachweise von M. tuberculosis komplex und atyp. Mykobakterien) Hybridisierung nach PCR b) Nachweis von M. tuberculosis-komplex IS6110: 123 bp Evt. zusätzlich Sequenzierung bei Vorhandensein eines Amplifikates c) Multiplex-PCR für M. gordonae (221 bp), M kansasii (292 bp) und M. fortuitum (144 bp) = Set A d) Multiplex-PCR für M. avium (216 bp), M. malmoense (236 bp) und weitere atypische Mykobakterien (16 SrRNA) ( 147 bp) = Set B 33. Mykobakterien (65 kda-antigen) 1. Lauf: 310 oder 231 bp 2. Lauf: 133 bp - zum Nachweis der Mykobakterien-Art dient eine Restriktionsanalyse (siehe Anhang S. 5) 34. Mykobakterien BCG 99bp bp: M. bovis BCG (Nachweis Spacer-Region bp: M. bovis, M. africanum I der Direct Repeat Region) Keine Bande: M. tuberculosis, M. africanum II 35. Mykosen (Aspergillose, Candidose) (ITS2-Region von Pilzen) Real-time-PCR 36. NRAS-Mutations-Nachweis 1. real-time-pcr (AMP) (Codon 12, 13, 59, 61, 117, 146 von Exon 2-4 NRAS-Gen) 2. PCR (Codon 117/146, Exon 3-4 NRAS- Gen) 37. Oligodendrogliome (Nachweis on 1p- und 19qDeletionen) 38. Parvovirus B19 (NS1-Gen) Pos. bei Cp zwischen 27 und Pos. bei Cp unter Ggf. sequenzieren Primer: D1S468, D1S508, D1S489, D1S200, D1S514; D1S507, D1S199, D1S2734, D1S211, D1S2696: D19S210, D19S219, D19S596, D19S1182, D19S412, D19S Lauf: 241 bp 2. Lauf: 217 bp - zum Spezifitätsnachweis ggf. sequenzieren 01.15/rev. 10 Auswert_PCR 1 Seite 6 von 8

7 39. PI3K Mutationen (PI3CA-Onkogen) real-time-pcr 40. SV-40 (Nachweis des der retinoblastoma (Rb-) pocket binding domain des SV-40Virus (real-time-pcr) Pos. bei Delta-Cp max. 7,2 (H1047R), 8,5 (E542K), 7,7 (E545K/D) Sicher positiv bei Cp unter T-Lymphome (Gamma-Rezeptor) Nested PCR (Nachweis der Gamma- RezeptorFamilien V 1-11 nach Lorenzen et al. 1994): 1. Lauf: 260 bp 2.Lauf: Bande oder Schmier im Bereich von 120 bp Mix PCR (Nachweis der Gamma-Rezeptor- Familien V 2 5, V 8 9, V nach Trainor et al. 1991): Bande oder Schmier im Bereich von bp 42. Toxoplasma gondii (Nachweis eines multicopy genomic fragmentes [529 bp DNA repetitive Region]) 43. Tropheryma whipplei (Nachweis Morbus whipple mittels real-time-pcr) 44. Yersinia enterocolitica (16 SrRNA) 162 bp - zum Spezifitätsnachweis sequenzieren Positiv bei Cp unter bp - zum Spezifitätsnachweis sequenzieren Erläuterungen: Bei der Beschreibung 1. Lauf und 2. Lauf handelt es sich jeweils um eine nested PCR, wobei der 2. Lauf der auszuwertende ist. Anhang Restriktionsanalyse für E. coli und Mykobakterien: 01.15/rev. 10 Auswert_PCR 1 Seite 7 von 8

8 Erstellt: Dr. K. Henneicke Geprüft: Dr. med. Schreiber Freigegeben: Dr. med. Schreiber Datum / Unterschrift Datum / Unterschrift Datum / Unterschrift 01.15/rev. 10 Auswert_PCR 1 Seite 8 von 8