Analysen zur Modulation des axonalen Transports und zur Dimerisierung Нрг APP-FamiliP Vom Fachbereich Biologie der Universität Kaiserslautern zur Verleihung des akademischen Grades Doktor der Naturwissenschaften" genehmigte Dissertation vorgelegt von Dipl Biol Nadine Schmidt Geboren in Simmern/Hunsrück Datum der wissenschaftlichen Ausspra^ 14 März 2016 Prüfungskommission Vorsitzender: Prof Dr. Thorsten Stoeck, Technische Universität Kaiserslautern Gutachter: 1. Prof. Dr Stefan Kins, Technische Universität Kaiserslautern 2. Prof Dr. Claus Pietrzik, Johannes Gutenberg-Universität Mainz Kaiserslautern, 2016 D386
Inhaltsverzeichnis 1 ZUSAMMENFASSUNG 2 EINLEITUNG... 2 2.1 Die Alzheim erdem enz... 2 2.2 - - 一... 6 2.3 -...8 2.4 Subzelluläre Lokalisation DER APP-Familie... 11 2.4.1 Subzelluläre Lokalisation in Neuronen und axonaler Transport von 13 2.4.2 Regulation der subzellulären Lokalisation: Die VpslOp Rezeptorfamilie...n...l4 2.4.2.1 Der Sortilin-verwandte und im Zen^alnervensystemexprimierte Rezeptor So٢CS m_.... 16 2.5 -...18 2.5.1 Funktion der Prozessierungsprodukte von APP... 19 2.6 Dimerisierung d erapp-familie... 20 3 ZIELSETZUNG""""""^ 4 ERGEBNISSE...24 4.1 Kupferfördertdiec^ - u n d ^ - D imerisierungderapp-genfa 4.1.1 Kupfer steigert die homotypische cis-interaktion von APP...24 4.1.2 Mutationen derkupferbindungsstellen in APP vermindern die homotypische APP cis- Dimerisierung...29 4.1.3 Der Einfluss von Kupfer aufdie homo und heterotypische Interaktion derapp-familie... 31 4.1.4 Einfluss von Kupfer aufdie trans-dimerisierung von ΑΡΙΡ2... 35 4.2 SorCSI nimmt Einfluss auf den axonalen Transport von APP... 40 4.2.1 SorCSl-Venus Fusionsproteine zeigen ein SorCSl typisches Lokalisations- und Interaktionsverhalten...40 4.2.2 APP undsorcslb bzw. SorCSlczeigen in verschiedenen ZeUtypen eine deutliche C 〇 m Lokalisation... 44 4.2.3 SorCSlb undsorcslc werden durch das schnelle axonale Transportsystem transportiert......46 4.2.4 Die Co-Expression mitsorcslc beeinflusst die Vesikelverteilung von 4.3 Die A P P intrazelluläredom änenim m teinflussaufdenaxonalentransport..........s1 4.3.1 Die APP intrazellulare Domänefiihrtzu axonalen Transportdeflziten in Loligo pealeii.... 51 4.3.2 AICD induziert die Phosphorylierung der schweren und leichten Kette von Kinesin...54
4.3.3 DieAICDfåhrtzurAktivierung der Kinase ρ38 und CK2... 56 4.3.4 Die transiente Überexpression deraicd nimmt keinen Einfluss aufden axonalen Transport von LRPl... 57 5 DISKUSSION...61 5.1 Kupfer moduliert die Interaktion der APP-Fa m ilie...61 5.1 1 Kupfer steigert die cis-dimerisierung derapprnfamiue...61 5.1.2 Kupfer moduliert die homotypische trans-interaktion von 66 5.2 Die Modulation des axonalen T ransports von APP IST ABHÄNGIG VON DER SorCSI Isoform....71 5.3 ModulationdesaxonalenTransportsdurchdieAICD...75 6 MATERIALUNDMETHOD^... 82 6.1 Material... 82 6.1.1 Tabellarische Auflistung derverwendeten Materialien...82 6.1.2 Bakterienstämme, ZelUinien und Tierstämme...91 6.1.2.1 Bakterienstämme... 91 6.1.2.2 Zelllinien... 91 6.1.2.3 Tierstämme...92 6.1.3 Puffer, Losungen und Medien...92 6.1.3.1 Puffer und Lösungen...92 6.1.3.2 Kultivierungsmedien für prokaryontische Zellen...97 6.1.3.3 Kultivierungsmedien für eukaryontische Zelllinien... 98 6.2 Methoden...100 6.2.1 Molekularbiologische Methoden...100 6.2.1.1 Generierung chemokompetenter E. coli Zellen...100 6.2.1.2 Transformation chemokompetenter E. coli Zellen... 100 6.2.13 Anzucht von E. coli Flüssigkulturen... 100 6.2.1.4 Aufreinigung von Plasmid-DNA aus E. coli XLl-blue Zellen... 101 6.2.1.4.1 Mini-Präparation...101 6.2.1.4.2 Maxi-Präparation...101 6.2.1.5 Sequenzierung...102 6.2.1.6 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von Plasmid-DNA...102 6.2.1.7 RestriMonsverdau...102 6.2.1.8 Agarose-Geleletoophorese.... 102 6.2.1.9 Gel-Extraktion...103 6.2.1.10 Ligation... 103 6.2.1.11 Ortsgerichtete P u n iu tag en ese... 103 6.2.2 ZeUbiologische Methoden... 104 6.2.2.1 Rekultivierung von eukaryontischen Zelllinien...104 Ó.2.2.2 Kultivierung von eukaryontischen Zelllinien und murinen kortikalen Primärneuronen... 104 6.2.2.3 Kryokonservierung von eukaryontischen Zelllinien...105
0.2.Ζ.4 Präparation muriner kortikaler Primärneuronen...105 Ó.2.2.5 Aussäen von eukaryontischen Zelllinien... 106 6.2.2.6 Transfektion...107 6.2.2.6.1 Transiente Transfektion von eukaryontischen Zelllinien mittels der Calcium-Phosphat (CaP 〇 4)-Methode...107 6.2.2.6.2 Transiente Transfektion von PCN mittels der Calcium-Phosphat-Methode...M.. 107 6.2.2.6.3 Transiente Transfektion von eukaryontischen Zelllinien mittels ;etprime... 108 6.2.2.Ó.4 Transiente Transfetóion von eukaryontischen Zelllinien mittels Lipofectømin2000...٠...l Ó.2.2.7 Kollektion von APLP2ex-Fc... 109 Ó.2.2.8 Behandlung mit Kupfer, Zink und Eisen... 109 Ó.2.2.9 Herstellung stabiler Zelllinien mittels Retrovirusinfetaon...109 6.2.2.10 Prozessierungsanalyse... 110 6.2.3 Biochemische Methoden...111 6.2.3.1 Zytotoxizitäts Analyse... 111 6.2.3.2 Zelllyse... 111 6.2.3.3 Co-Immunopräzipitation...112 6.2.3.4 Präparation von k p la sm e n aus Tintenfisch floligo pealeii) Riesenaxonen... 113 6.2.3.5 Radioaktive Markierung von Phosphorylierungsvorgängen in Tintenfisch Riesenaxonen 113 6.2.3.6 Immunopräzipitation von radioaktiv markiertem Kinesin...114 6.2.3.7 Bestimmung der Proteinkonzentration...115 6.2.3.8 Polyacrylamid-GeleleÉphorese [PAGE)... 115 6.2.3.9 Coomassie-Proteinfärbung von Acrylamidgelen... 116 6.2.3.10 Trocknen von SDS-Gelen und Autoradiographie...116 6.2.3.11 Western Blot und Immunodetektion... 116 6.2.3.12 Stippen von Nifrozellulosemembranen... 117 6.2.3.13 Densitometrische Quantifizierung der Proteinexpression... 117 6.2.3.14 Immunzytochemie immunocytochemistty; ICC... 117 6.2.4 Proteinbiochemische Methoden... 118 6.2.4.1 Heterologe Proteinexpression in E. coli Zellen... 118 6.2.Ą.2 Proteinaufreinigung aus E. coli BL21 Zellen (GST-Pulldown)...118 6.2.4.3 Aufreinigung von APLP2ex-Fc...119 6.2.4.4 Bead Aggregation Assay... 120 6.2.5 Mikroskopisch-Analytische Methoden...120 6.2.5.1 Perfusion und Video-Mikroskopie von Tintenfisch Riesenaxonen...120 β.2.5.2 Zeifrafferaufnahmen in Primärneuronen... 121 7 LITERATURVERZEICHNIS...123 8 APPENDIX... 147 8.1 W eitereabbildungen... 147 8.1.1 Ergänzung zu: Kupferfördert die cis- und trans-dimerisierung derapp-familie... 147 8.1.2 Ergänzung zu: Die Modulation des axonalen Transports durch dieaicd... 151 81.3 Abkürzungsverzeichnis...153 8.1.3.1 Nukleotide...153
8.1.3.2 Aminosäuren... 153 8.133 Verwendete griechische Buchstaben...153 8.1.3.4 Sonstige... 153 9 ERK^UNGZURBETEILIGUNGDW ^...158 10 DANKSAGUNG... 159 11 LEBENSLAUF... 160