TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN Lehrstuhl für Lebensmittelchemie Entwicklung verbesserter Methoden zur Beurteilung der Kleberqualität von Weizenmehlen Silvia Maria Thanhäuser Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Chemie der Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigten Dissertation. Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. Peter Schieberle Prüfer der Dissertation: 1. apl. Prof. Dr. Peter Köhler 2. Univ.-Prof. Dr. Michael Schuster Die Dissertation wurde am 29.01.2015 bei der Technischen Universität München eingereicht und durch die Fakultät für Chemie am 25.03.2015 angenommen.
Zusammenspiel I I Abkürzungsverzeichnis VI 1 Einleitung 1 1.1 Weizen 1 1.1.1 Weichweizen {triticum aestivum) 1 1.1.2 Inhaltsstoffe von Weizenmehl 2 1.1.3 Backqualitätsklassen 5 1.2 Weizenkleber 7 1.3 Zusammensetzung, Genetik und Struktur der Kleberproteine 9 1.3.1 Klassifizierung und Struktur der Weizenproteine 9 1.3.2 Molekulargewichtsverteilung der Kleberproteine 12 1.3.3 Endogene Einflussfaktoren: Genetischer Ursprung der Kleberproteine und deren Untereinheiten 15 1.3.4 Exogene Einflussfaktoren: Umwelt und Düngung 17 1.3.5 Aminosäurezusammensetzung der Weizenproteinfraktionen und -typen 19 1.3.6 Strukturmodell des Gluteninpolymers 21 1.4 Kleberquantität und -qualität - Relevanz für die Teigeigenschaften 23 1.4.1 Backqualität - von Kleberquantität und -qualität 23 1.4.2 Die Rolle der Kleberproteine wahrend der Teigentwicklung und des Backprozesses 25 1.5 Methoden zur Bestimmung der Kleberqualität 28 1.5.1 Indirekte Qualitätsparameter: Vorhersage der Backqualität 28 1.5.2 Standardcharakterisierung und bestehende Methoden 29 1.5.3 Backversuche 32 1.5.4 Chromatographische Bestimmung der Proteinzusammensetzung 32 1.5.5 Proteinspezifische Farbstoffe zur Proteinquantifizierung 35 1.5.6 Bedarf an neuen Analysenmethoden in der Qualitätskontrolle 40
II 2 Problemstellung und Zielsetzung 41 3 Ergebnisse und Diskussion 43 3.1 Proben 43 3.2 Grundbestimmungen 44 3.2.1 Feuchtigkeitsgehalt (ICC-Nr. 110/1) 44 3.2.2 Aschegehalt (ICC-Nr. 104/1) 45 3.2.3 Rohproteingehalt nach Dumas (ICC-Nr. 167) 46 3.2.4 Feuchtklebergehalt (in Anlehnung an ICC-Nr. 137/1) 47 3.2.5 Diskussion 48 3.3 Rheologie 49 3.3.1 Wasserabsorption und Teigentwicklungszeiten (in Anlehnung an ICC-Nr. 115/1) 49 3.3.2 Kleber-und Teigzugversuche 51 3.3.3 Diskussion 53 3.4 Sedimentationstests 54 3.4.1 Sedimentationstest nach Zeleny (ICC-Nr. U6) 54 3.4.2 SDS-Sedimentationstest nach Axford (in Anlehnung an AACCI-Nr. 56/70) 55 3.4.3 Diskussion 56 3.5 SDS-PAGE 57 3.5.1 Qualitative und semi-quantitative Zusammensetzung der HMW-UE 57 3.5.2 Diskussion 60 3.6 Backversuche im Mikromaßstab 62 3.6.1 Mikro-Rapid-Mix Test 62 3.6.2 Mikro Backtest 65 3.6.3 Diskussion 68 3.7 ReMix-Versuche 69 3.7.1 Rohproteingehalte der Weizenkleber 69 3.7.2 Backversuche 70 3.7.3 Diskussion 72
III 3.8 Modifizierte Osborne-Fraktionierung 73 3.8.1 Qualitative RP-HPLC-Analyse/Identifizierung der Weizenproteinfraktionen.. 73 3.8.2 Quantitative RP-HPLC-Analyse der Weizenproteinfraktionen 79 3.8.3 Diskussion 87 3.9 SDS/GMP-Fraktionierung 89 3.9.1 Qualitative RP-HPLC-Analyse/Identifizierung der Weizenproteinfraktionen.. 89 3.9.2 Qualitative GP-HPLC-Analyse/Identifizierung der Weizenproteinfraktionen.. 95 3.9.3 Quantitative RP-HPLC-Analyse der Weizenproteinfraktionen 107 3.9.4 Quantitative GP-HPLC-Analyse der Weizenproteinfraktionen 108 3.9.5 Verbrennungsanalytische Bestimmung des Gluteninmakropolymers 115 3.9.6 Gravimetrische Bestimmung des Gluteninmakropolymers 116 3.9.7 Diskussion 119 3.10 Analyse des GMP-Gehaltes an verschiedenen Punkten der Brotherstellung 125 3.10.1 Analyse der Proteinfraktionen und -typen mittels GP-HPLC 125 3.10.2 Diskussion 128 3.11 Isolierung und Charakterisierung von Referenzproteinen 129 3.11.1 Referenzen für G1.1A, GLUT, SDSL und GMP 129 3.11.2 Referenzen für HMW-UE und I.MW-Uli 132 3.11.3 Diskussion 133 3.12 Colorimetrie und Fluorimetrie 133 3.12.1 Acid orange 12 Assay 134 3.12.2 Bicinchoninsäure Assay 135 3.12.3 Bradford Assay 137 3.12.4 Fluorescamin Assay 141 3.12.5 Amidoschwarz Assay 149 3.12.6 Überprüfung der entwickelten Methode 153 3.12.7 Diskussion 156
IV 3.13 Statistischer Zusammenhang aller Ergebnisse 160 3.13.1 Statistischer Zusammenhang zwischen indirekten Qualitätsparametern und den Ergebnissen der Backversuche 161 3.13.2 Statistischer Zusammenhang zwischen den mittels Colorimetrie/ Fluorimetrie und HPLC bestimmten Proteinparametern 163 3.13.3 Statistischer Zusammenhang zwischen den mittels Amidoschwarz Assay bestimmten Proteinparametern und den Ergebnissen der Backversuche 164 3.13.4 Diskussion 165 4 Experimenteller Teil 171 4.1 Chemikalien, Reagenzien und Materialien 171 4.2 Herstellung von Mehl und Kleber 172 4.3 Grundbestimmungen 174 4.3.1 Feuchtigkeitsgehalt (ICC-Nr. 110/1) 174 4.3.2 Aschegehalt (ICC-Nr. 104/1) 174 4.3.3 Rohproteingehalt nach Dumas (ICC-Nr. 167) 174 4.3.4 Feuchtklebergehalt (in Anlehnung an ICC-Nr. 137/1) 175 4.4 Rheologie 176 4.4.1 Wasserabsorption und Teigentwicklungszeiten (in Anlehnung an ICC-Nr. 115/1) 176 4.4.2 Kleber- und Teigzugversuche 176 4.5 Sedimentationstests 177 4.5.1 Sedimentationstest nach Zeleny (ICC-Nr. 116) 177 4.5.2 SDS-Sedimentationstest nach Axford (in Anlehnung an AACCI-Nr. 56/70) 178 4.6 SDS-PAGE 179 4.7 Backversuche im Mikromaßstab 182 4.7.1 Mikro-Rapid-Mix Test 182 4.7.2 Mikro-Backtest 183 4.7.3 ReMix-Backversuche 183
V 4.8 Mehlfraktionierung 184 4.8.1 Modifizierte Osborne-Fraktionierung 184 4.8.2 SDS/GMP Fraktionierung 186 4.8.3 Isolierung von Referenzproteinen 189 4.9 Chromatographische Methoden 193 4.9.1 Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) 193 4.9.2 Gelpermeations-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (GP-HPLC) 194 4.10 ESI-Quadrupol-Time-of-Flight Massenspektrometrie (ESI-QTOF-MS)... 195 4.11 Weitere Quantifizierungsmethoden für das Gluteninmakropolymer 197 4.11.1 Verbrennungsanalytische Bestimmung des Gluteninmakropolymers 197 4.11.2 Gravimetrische Bestimmung des Gluteninmakropolymers 197 4.12 Analyse des GMP-Gehaltes an verschiedenen Punkten der Brotherstellung 198 4.13 Colorimetrie und Fluorimetrie 199 4.13.1 Acid orange 12 Assay 199 4.13.2 Bicinchoninsäure Assay 199 4.13.3 Bradford Assay 200 4.13.4 Fluorescamin Assay 201 4.13.5 Amidoschwarz Assay 202 4.13.6 Nachweis- und Bestimmungsgrenzen 205 4.14 Statistische Analyse 205 5 Zusammenfassung 206 6 Literaturverzeichnis 210 7 Anhang 220