Die Auswirkung physikalischen Stresses auf monoklonale Antikörper in der Formulierungsentwicklung Von der Fakultät für Wissenschaften der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation von Annette Eppler aus Tübingen
INHALTSVERZEICHNIS und Problemstellung 1 2. Allgemeiner Teil 3 2.1 Entwicklung monoklonaler Antikörper 3 2.1.1 Antikörperstruktur 3 2.1.2 Cetuximab 5 2.2 Instabilitäten von monoklonalen Antikörpern 7 2.2.1 Chemische Instabilitäten 7 2.2.2 Physikalische Instabilitäten 9 2.3 Formulierungen für monoklonale Antikörper 2.4 Analytische Methoden zur Detektion von Instabilitäten 14 2.4.1 Analyse der chemischen Instabilitäten 14 2.4.2 Analyse der physikalischen Instabilitäten 15 2.5 Stressarten 17 2.6 Aufkonzentrierung und Aufkonzentrierungstechniken 21 3. Material und Methoden 27 3.1 Materialien 27 3.1.1 Monoklonale 27 3.1.2 Hilfsstoffe, Reagenzien, Chemikalien 27 3.1.3 Verpackungsmaterialien 27 3.2 Methoden 30 3.2.1 Herstellung der Proben 30
3.2.2 Stressmethoden 32 3.2.2.1 Schüttelstress 32 3.2.2.2 Rührstress 33 3.2.2.3 Luft-Wasser-Grenzflächenstress (LWG-Strcss) 33 3.2.2.4 34 3.2.3 Analytische Methoden 35 3.2.3.1 Visuelle Kontrolle 35 3.2.3.2 Trübungsmessung über 350 um 35 3.2.3.3 Konzentrationsmessung 280 36 3.2.3.4 Lichtmikroskopie 37 3.2.3.5 Größenausschlusschromatographie 38 3.2.3.6 Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 39 3.2.3.7 Isoelektrische Fokussierung 40 3.2.3.8 Lichtblockade (PAMAS) 41 3.2.3.9 Oberflächenspannungsmessung 42 3.2.3.10 Viskositätsmessung 42 Dichtemessung 43 3.2.3.12 ph-messung 43 3.2.4 CFD-Simulation 43 3.2.5 Hochgeschwindigkeitsbilder 46 3.2.6 Statistische Versuchsplanung 46 3.2.7 Aufkonzentrierungs-Studien 49 3.2.7.1 Dialyse 50 3.2.7.2 Zentrifugalkonzentratoren 50 3.2.7.3 (TFF) 50 3.2.7.4 Rührzelle 51 4. Ergebnisse und Diskussion 52 4.1 Identifizierung geeigneter Stressbedingungen in der Präformulierung 52 Rührstress: Einfluss verschiedener Parameter auf die Stabilität eines monoklonalen Antikörpers 53 4.1.1.1 Rührgeschwindigkeit 53 4.1.1.2 Füllmenge innerhalb 55 4.1.1.3 Verstärkte Diskriminierung 57
4.1.1.4 Einfluss von Tween 80 58 4.1.1.5 Einfluss der Temperatur 60 4.1.1.6 Zusammenfassende Diskussion - Rührstress 62 4.1.2 Schüttelstress: Einfluss verschiedener Schüttel-Parameter die Stabilität eines monoklonalen Antikörpers 65 4.1.2.1 Füllmenge innerhalb der 65 4.1.2.2 Vialgröße und Vialtyp/verschiedene Antikörper 68 4.1.2.3 Schüttelgeschwindigkeit 72 4.1.2.4 Diskriminierende Bedingung 73 4.1.2.5 Einfluss der Temperatur 77 4.1.2.6 Zusammenfassende Diskussion - Schüttelstress 80 4.1.2.7 Vergleich Rühren mit Schütteln 81 4.2. Untersuchungen zur Ursache für Instabilitäten während des mechanischen Stresses 84 4.2.1 Versuch der Erklärung der Schüttelstressergebnisse anhand einer CFD-Simulation 84 4.2.1.1 Problemstellung, Vorgehens- und Auswertungsweise der CFD-Simulation 84 4.2.1.2 Simulation von verschiedenen Schüttelintensitäten 89 4.2.1.3 Simulation von verschiedenen Füllmengen 92 Vergleich der Simulation mit der Realität anhand von Hochgeschwindigkeitsbildern 94 4.2.1.5 Zusammenfassende Diskussion 99 4.2.2 Erklärungsversuch der Schüttelstressergebnisse anhand zweier Stressmethoden: Scherstress und Luft-Wasser-Grenzflächenstress 101 4.2.2.1 Vergleich von Scherstress mit Luft-Wasser-Grenzflächenstress 101 4.2.2.2 Einfluss von Tween 80 auf den Antikörper während der verschiedenen Stressbedingungen 108 4.2.2.3 Zusammenfassende Diskussion 4.3 Arbeiten mit hochkonzentrierten Antikörperlösungen 4.3.1 Schüttelstressversuche mit hochkonzentrierten Antikörperlösungen Vergleich von hochkonzentrierter Antikörperlösung mit gering konzentrierter Antikörperlösung 4.3.1.2 Schütteln von hochkonzentrierten bei verschiedenen Schüttelintensitäten 4.3.1.3 Zusammenfassende Diskussion 4.3.2 Statistische Versuchsplanung verschiedene Konzentrationen beim Schütteln 124 4.3.2.1 Versuchsplans 124
4.3.2.2 Auswertung mit Hilfe von 4.3.2.3 Zusammenfassende Diskussion 4.3.3. Aufkonzentrierungstechniken für Antikörperlösungen im Vergleich 4.3.3.1 Verschiedene Membrantypen 4.3.3.2 Verschiedene 4.3.3.3 Verschiedene Startkonzentrationen 4.3.3.4 Machbarkeits-Studie für verschiedene Aufkonzentrierungstechniken 4.3.3.5 Stabilitäts-Studie für verschiedene Aufkonzentrierungstechniken 4.3.3.6 Zusammenfassende Diskussion 134 5. Abschlussdiskussion 6. Zusammenfassung Literaturverzeichnis Anhang 165 179 Trübungsmessungen an A2 Lichtblockademessungen A3 Simulation und Hochgeschwindigkeitsaufnahmen I A4 Anteil löslicher Aggregate (ausgewählte Ergebnisse) A5 Ausgewählte SDS-PAGE-Ergebnisse A6 Ausgewählte Bilder der visuellen Kontrolle A7 Statistische Versuchsplanung Vergleich von Aufkonzentrierungstechniken