HIV-Infektion: Diagnostik
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- Damian Kurzmann
- vor 8 Jahren
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1 HIV-Infektion: Diagnostik Hartwig Klinker Schwerpunkt Infektiologie Medizinische Klinik und Poliklinik II der Universität Würzburg
2 HIV-Infektion: Diagnostik Grundzüge virologischer Diagnostik Diagnostik der HIV-Infektion Erweiterte Basisdiagnostik Diagnostik ausgewählter opportunistischer Infektionen Spezielle therapiebegleitende Diagnostik Therapeutisches Drug Monitoring Resistenztestung
3 HIV-Infektion: Diagnostik Grundzüge virologischer Diagnostik Diagnostik der HIV-Infektion Erweiterte Basisdiagnostik Diagnostik ausgewählter opportunistischer Infektionen Spezielle therapiebegleitende Diagnostik Therapeutisches Drug Monitoring Resistenztestung
4 Virologische Diagnostik - Wann was? Abhängig von Virus und Krankheitsbild Fragestellung Untersuchungsmaterial Krankheitsbeginn Testkosten und Testdauer
5 Virologische Diagnostik Antikörpernachweise Nachweis der Immunantwort: IgG, IgM, IgA Methoden: Enzymimmunoassay Immunfluoreszenztest Westernblot, Immunoblot Komplementbindungsreaktion Hämagglutinationshemmtest Neutralisationstest Virusdirektnachweise Nachweis von Virusbestandteilen: Partikel Antigene Genom Infektiosität? Methoden: Zellkultur Elektronenmikroskopie Enzymimmunoassay Immunfluoreszenztest PCR
6 Virologische Diagnostik: Wann was? Antikörpernachweise bei generalisierten Infektionen bei langer Inkubationszeit nicht bei Immunsuppression Virusdirektnachweise bei lokalen Infektionen bei kurzer Inkubationszeit bei Reaktivierungen bei Immunsuppression
7 Virologische Diagnostik: Antikörpernachweise Material: Serum (oder Plasma) Lagerung: bei 4 C für einige Tage, bei -20 C für Jahre Nachweis einer akuten Infektion durch IgM-Nachweis in Einzelprobe durch Titeranstieg in Serumpaar Keine Normalwerte für IgG-Antikörpertiter Antikörperteste bisher wenig standardisiert
8 Antikörpernachweise Konventionelle biologische Methoden (Flüssigphasenteste) Hämagglutinationshemmtest (HHT) Neutralisationstest (NT) Komplementbindungsreaktion (KBR) Hämolysis-in-Gel (HIG)-Test Immunoassays (Festphasenteste) Immunfluoreszenztest (IFT) Enzymimmunoassay (EIA) Immunoblot, Western Blot Radioimmunoassay (RIA)
9 Virologische Diagnostik: Virusdirektnachweise Aus jeder Körperflüssigkeit und jedem Gewebe Nach Möglichkeit Material von betroffenem Organ, z. B.: Enzephalitis/Meningitis - Liquor Pneumonie - Respirationstraktmaterial Durchfall - Stuhlprobe Lagerung: kurzzeitig bei 4 C
10 Virologische Diagnostik: Virusdirektnachweise Methode Lichtmikroskopie Elektronenmikroskopie Virusanzucht in Zellkultur Kurzzeitzellkultur mit Antigennachweis EIA, IFT im Originalmaterial PCR, Hybridisierung Resistenzteste (phänotypisch, genotypisch) Nachweis von Einschlußkörper Viruspartikel, Virusbestandteile Infektiöses Virus Infektiöses Virus Virusantigene (z. B. Proteine) Virusgenom Medikamentenresistenz
11 Indikationen für Virus-PCR Indikation ZNS-Infektionen Hepatitis B/C HIV Immunsuppression Auge Schwangerschaft Material Liquor Plasma/Serum Plasma Plasma, etc. Konjunktivalabstrich Kammerwasser Fruchtwasser, Amnionzottenbiopsie Virus HSV, VZV, Enteroviren HBV, HCV (qual. und Viruslast) HIV (Viruslast) CMV (qual. und Viruslast) Adenoviren, HSV HSV, VZV, CMV Rötelnvirus, CMV, VZV, Parvovirus B19, etc.
12 CMV-Infektion nach Transplantation
13 HIV-Infektion: Diagnostik Grundzüge virologischer Diagnostik Diagnostik der HIV-Infektion Erweiterte Basisdiagnostik Diagnostik ausgewählter opportunistischer Infektionen Spezielle therapiebegleitende Diagnostik Therapeutisches Drug Monitoring Resistenztestung
14 HIV-Diagnostik Immer 2 unabhängige Serumproben untersuchen! HIV-Antikörpersuchteste (Elisa) zur Abklärung der Frage, ob eine HIV-Infektion vorliegt Suchteste der 4. Generation erfassen sowohl Antikörper als auch HIV-Antigen Sehr hohe Sensitivität und Spezifität (>99,9 %) Westernblots zur Bestätigung von reaktiven Antikörpersuchtesten Viruslastbestimmungen (z. B. PCR) als prognostischer Parameter und als Verlaufskontrolle zur Überwachung des Therapieerfolgs
15 HIV Westernblot
16 HIV-Infektion: Diagnostik Grundzüge virologischer Diagnostik Diagnostik der HIV-Infektion Erweiterte Basisdiagnostik Diagnostik ausgewählter opportunistischer Infektionen Spezielle therapiebegleitende Diagnostik Therapeutisches Drug Monitoring Resistenztestung
17 Diagnostik bei HIV-Erstdiagnose Blutbild, Leberwerte, Nierenwerte, Elektrolyte, Gesamteiweiß, Elektrophorese, IgA, IgM, IgG, CRP Hepatitis-Serologie (HBV, HCV), Lues-Serologie, Toxoplasmose-Serologie, CMV-Serologie HIV-Viruslast Lymphozytendifferenzierung Sonographie Röntgen-Thorax Konsile Dermatologie, Neurologie, Ophtalmologie
18 HIV-Infektion: Diagnostik Grundzüge virologischer Diagnostik Diagnostik der HIV-Infektion Erweiterte Basisdiagnostik Diagnostik ausgewählter opportunistischer Infektionen Spezielle therapiebegleitende Diagnostik Therapeutisches Drug Monitoring Resistenztestung
19 Verlauf der HIV - Infektion Labor- Stadium 1 Helfer-Zellen (/µl) 500 Gürtelrose Mundsoor Tuberkulose Kaposisarkom Pneumocystose Geschwindigkeit wird bestimmt durch: Viruslast Toxoplasmose AIDS Kryptokokkose Kryptosporidiose Atyp. Mykobak. Cytomegalie Lymphom 5 Jahre A B C Klinisches Stadium
20 AIDS-free survival by human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) RNA category among groups with different baseline CD4 + lymphocyte counts I = < 500 copies/ml II = III = IV = V = > copies/ml Mellors et al., Ann Int Med 1997;126:
21 Bedeutung von HI-Viruslast und Helferzellen Geschwindigkeit Entfernung Viruslast im Blut 1 Helfer - Zellen Zeit bis zum Vollbild AIDS
22 V i r u s v e r m e h r u n g Helferzellproduktion HIV J a h r e H e l f e r z e l l produktion
23 Therapie der HIV-Infektion Therapieziele: Minimierung der HI-Virusmenge Stabilisierung/Erhöhung der T-Helferzellzahl Vermeidung HIV-bedingter Erkrankungen Erhaltung/Verbesserung der Lebensqualität Verbesserung der Lebenserwartung
24 HIV-Diagnostik HIV-Antikörpersuchteste (Elisa) zur Abklärung der Frage, ob eine HIV-Infektion vorliegt Suchteste der 4. Generation erfassen sowohl Antikörper als auch HIV-Antigen Sehr hohe Sensitivität und Spezifität (>99,9 %) Westernblots zur Bestätigung von reaktiven Antikörpersuchtesten Viruslastbestimmungen (z. B. PCR) als prognostischer Parameter und als Verlaufskontrolle zur Überwachung des Therapieerfolgs
25 HIV-Diagnostik Viruslastbestimmung mittels quantitativer PCR
26 Vermehrung von HIV in der Helferzelle Ausgangs-Viruslast Kopien/ml Therapieziel:Viruslast < 50 (20) Kopien/ml HIV- Eintritt und Fusion HIV Fusionshemmer/FI X X Helfer - Zelle HIV X HIV X HIV Reverse Transkriptase Reverse Transkriptasehemmer/ NRTI, NNRTI Integrase Protease Proteasehemmer/PI
27 HIV-Diagnostik T-Helferzellbestimmung mittels Durchflusszytometrie
28 HIV-Diagnostik T-Helferzellbestimmung mittels Durchflusszytometrie
29 400 Helferzellen nach 3 Jahren (Änderung zum Ausgangswert, Lopinavir/r + d4t + 3TC) 356 cells/mm cells/mm All Patients Week A Landay, et al., XIV Intl. AIDS Conf., Barcelona, 2002, Poster #B4439
30 Behandlung der HIV-Infektion Rückgang opportunistischer Infektionen Neu aufgetretene Erkrankungen pro 100 Patientenjahre Atypische Mykobakteriose 89% Zytomegalievirus-Infektion 88% Jahr der Diagnose Die Behandlung der HIV-Infektion erfolgt weit überwiegend ambulant! Cohn D, et al. XIV Int AIDS Conference, Barcelona 2002, #1443
31 HIV-Infektion: Diagnostik Grundzüge virologischer Diagnostik Diagnostik der HIV-Infektion Erweiterte Basisdiagnostik Diagnostik ausgewählter opportunistischer Infektionen Spezielle therapiebegleitende Diagnostik Therapeutisches Drug Monitoring Resistenztestung
32 HIV-Infektion: Diagnostik Grundzüge virologischer Diagnostik Diagnostik der HIV-Infektion Erweiterte Basisdiagnostik Diagnostik ausgewählter opportunistischer Infektionen Spezielle therapiebegleitende Diagnostik Therapeutisches Drug Monitoring Resistenztestung
33 HIV- Behandlung 2007: - Bewährtes und Neues - Therapiebegleitende Diagnostik Blutbild, Blutsalze, Leber-/Nierenwerte etc. HI-Viruslast T-Helferzellen Medikamentenspiegel Ggf. Resistenztest
34 Eine lange Halbwertszeit der Medikamente hat große Vorteile Plasmakonzentration Pharmakokinetik Medikament A Medikament B Bereich potentieller Virusvermehrung Zeit (Stunden) 48 Nach David Back, Lissabon ECCATH 1999
35 Pharmakologische NRTI < NNRTI <PI Wechselwirkungen
36 Pharmakologische Interaktionen in der HIV-Therapie Dezember 2004: Atazanavir/rtv 300/100 mg darf aufgrund der Reduktion der Atazanavir- Expositionsspiegel nicht gleichzeitig mit Omeprazol angewendet werden Februar 2005: Wegen medikamenteninduzierter Hepatitiden soll Rifampicin nicht bei Patienten angewendet werden, die gleichzeitig Saquinavir/rtv als Teil ihrer antiretroviralen Therapie erhalten
37 Häufigkeit der Einnahme von Säureblockern bei Patienten unter PI-haltiger HAART Inzidenz ösophagogastraler Beschwerden/Erkrankungen bei Patienten mit HIV-Infektion: Sodbrennen Refluxösophagitis Ulcera 62% 29,5% 13%
38 Interaction Between Atazanavir + Omeprazole N = 48 HIV- subjects ATV exposures substantially reduced by coadministration with OMP Not corrected by increased ATV dose or 8 oz cola OMP exposures not significantly altered Do not coadminister Atazanavir Trough (ng/ml) 10,000 ATV/RTV 300/100 ATV/RTV 300/ mg omeprazole ATV/RTV 300/ mg omeprazole + cola ATV/RTV 400/ mg omeprazole Time (h) Agarwala S, et al., CROI 2005, Abstract 658.
39 Johanniskraut Süddeutsche Zeitung,
40 Protease-Inhibitoren - Kontraindizierte Medikamente -
41 Therapeutisches Drug-Monitoring (TDM) von Protease-Inhibitoren (PI) und Nicht-Nucleosidischen Reverse Transcriptase-Inhibitoren (NNRTI) Schwierigkeiten mit der regelmäßigen Medikamenteneinnahme Gestörte Darmfunktion (z. B. Durchfall), gestörte Leberfunktion Einnahme vieler Medikamente (Wechselwirkungen) Unzureichender Therapieeffekt HAART bei Kindern, HAART während der Schwangerschaft PI-/NNRTI-bedingte Nebenwirkungen once daily Therapien, klinische Studien Medizinische Klinik und Poliklinik II, Universität Würzburg, Infektiologie
42 HPLC/GC-Analysis of protease-inhibitors and non-nucleoside-reverse-transcriptase-inhibitors Medical Policlinic, University of Würzburg, Division of Infectious Diseases
43 Therapeutisches Drug-Monitoring (TDM)
44 HIV-Infektion: Diagnostik Grundzüge virologischer Diagnostik Diagnostik der HIV-Infektion Erweiterte Basisdiagnostik Diagnostik ausgewählter opportunistischer Infektionen Spezielle therapiebegleitende Diagnostik Therapeutisches Drug Monitoring Resistenztestung
45 HIV- Behandlung 2007: - Bewährtes und Neues - Blutbild, Blutsalze, Leber-/Nierenwerte etc. HI-Viruslast T-Helferzellen Medikamentenspiegel Ggf. Resistenztest
46 Viruslast Resistenz ist das Ergebnis aus viraler Replikation, Mutationen und Selektionsdruck Ursprüngliche Virus-Population Selektionsdruck durch Medikamente Neue Virus- Population Resistenter Klon Zeit
47 Viral dynamics and drug resistance VIRAL LOAD wild type virus (drug susceptible) mutant virus (drug resistant) TIME
48 Viral dynamics and drug resistance VIRAL LOAD DRUG PRESSURE wild type virus (drug susceptible) mutant virus (drug resistant) TIME
49 Clinical applications? VIRAL LOAD DRUG PRESSURE wild type virus (drug susceptible) mutant virus (drug resistant) TIME
50 Virale Resistenzentwicklung MINIMAL INKOMPLETT MAXIMAL Suppression der Virus-Replikation Wahrscheinlichkeit der Selektion resistenter HBV Mutanten
51 Combined Analysis of Baseline Abacavir Susceptibility vs HIV-1 RNA Response at Week 4 (n=92) 1 0 Change in HIV-1 RNA from Baseline (log 10 copies/ml) Treatment Status Experienced Naive Baseline Abacavir Susceptibility (Fold-increase in IC 50 ) ESTIMATED REGRESSION LINE:Change in Viral Load from Baseline (log copies/ml)= *baseline Abacavir Susceptibility (R=0.51)
52 Mutations selected by NRTIs/NTRTIs Zidovudine M 41 L E 44 D D K N R V 118 I L T K W YF QE Stavudine Didanosine M 41 L E 44 D K 65 R K 65 D K N R L 74 V 118 I L T K W YF QE R V Zalcitabine K 65 R T 69 D L 74 V M 184 V Abacavir Lamivudine Emtricitabine Tenofovir E 44 D K 65 R K 65 R K 65 R K 65 R L 74 V Y 115 F V 118 I M 184 V M 184 VI M 184 VI V. A. Johnson et al., Topics HIV Med. 2004
53 Zeitlicher Verlauf der Resistenzentwicklung gegen HAART 10, 54, 71 Viruslast 184 RT L90M Zeit
54 Resistenztest-Methoden Phänotypischer Resistenztest Direkte Messung der Replikation eines Virusisolates von einem Patienten oder der Funktion eines Virusenzyms in der Gegenwart von verschiedenen Medikamentenkonzentrationen in vitro Genotypischer Resistenztest Bestimmung von genetischen Veränderungen (Mutationen) im Virusgenom, die mit einer verminderten Sensitivität gegenüber Medikamentenwirkungen assoziiert
55 Vergleich der HIV-Resistenzverfahren Genotypische Teste Vorteile Nachteile Schneller, einfacher, billiger Indirekte Resistenzmessung Standardmethoden Komplexe Interpretation Limitierte Quantifizierbarkeit Erfordert Kenntnis der Mutationen Limitierte Erfassung von Interaktionen Limitierte Erfassung von Minoritätenpopulationen Vorteile Direkte Messung der Resistenz Verständliches Ergebnisformat (IC50) Quantifizierbar Erfaßt auch unbekannte Mutationen Erfaßt Interaktionen zwischen Mutationen Phänotypische Teste Nachteile Aufwendig, langwierig Wenig standardisiert Klinisch relevante Cut-offs noch nicht definiert Limitierte Erfassung von Minoritätenpopulationen
56
57
58 Multi- Resistenz
59 18 Häufigkeit von Mutationen (%) Häufigkeit von Resistenzen gegen HIV- Medikamente (USA) Patienten vor Behandlung Alle Klassen NRTI NNRTI PI % Drug resistance Gesamte Population At least 48% 76% 71% Patienten mit HIV RNA >500 Kopien/mL NRTI 41% PI 25% 48% 13% Any drug Any drug NNRTI 3 class 2 class No Drug resistance detected nach Novak RM et al. CID 2005;40: nach Richman D et al. AIDS 2004;18:
60 HIV- Behandlung 2007: - Bewährtes und Neues - Durchführung von Resistenztests Nach Primärinfektion Vor Therapiebeginn Therapieumstellung Bei frühem Therapieversagen Bei spätem Therapieversagen Schwangerschaft Postexpositionsprophylaxe
61 HIV-Therapie 2007 HIV-Infektion: Es gibt keine einfache Strategie für alle Patienten, eine behandelbare, aber viele gute Möglichkeiten chronische für den individuellen Patienten! Nicht zuletzt dank immer besserer Diagnostik!! Infektion (-skrankheit)
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