Übungen zum Modul Molekularbiologische Charakterisierung bakterieller Gene

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1 1 Westfälische Wilhelms-Universität Institut für Molekulare Mikrobiologie und Biotechnologie Übungen zum Modul Molekularbiologische Charakterisierung bakterieller Gene Übungen (Typ B) (4 Wochen) Prof. Dr. A. Steinbüchel Dr. M. Arenskötter Dr. M. Wältermann Dipl. Biol. Daniel Bröker

2 2 Benotung wie folgt: Modulabschlußprüfung 75 Punkte Test zu den Übungen 75 Punkte Protokolle und Laborbuch 25 Punkte Seminarvortrag 25 Punkte Die Protokolle sollten bei Frau Mersmann (Sekretariat) abgegeben werden und müssen dort spätestens bis zum eingegangen sein. Später eingegangene Protokolle werden nicht akzeptiert. Klausur: Nachholklausur/Kolloquium: Uhrzeit: 10:30 (Seminarraum) Bei Bedarf nach Absprache

3 3 Versuche: A Amplifizierung der 2,3-Butandiol-Dehydrogenase aus Gesamt-DNA von Ralstonia eutropha und deren Expression in Escherichia coli B Knock-out-Mutagenese C "error prone" PCR

4 4 Aufbau eines Protokolls Es werden Einzelprotokolle angefertigt! Versuchsüberschrift, Versuchszeitraum, Name. Einleitung Mit eigenen Worten das behandelte Thema darlegen. Kurzer Abriß des allgemeinen Kenntnisstandes, wofür die im Skript oder vom Betreuer angegebene Literatur heranzuziehen ist. Es ist deutlich zu machen, durch welche Publikation bestimmte Aussagen belegt werden. Keine Abschriften aus Lehrbüchern, keine ausführliche historische Einleitung. Umfang: ca 1 Seite. Versuchs- Abschrift der Versuchsanleitung ist nicht notwendig, nur Änderungen durchführung werden mitgeteilt. Umfang: 1Zeile - 1Seite. Ergebnisse Text auf das Notwendigste beschränken. Aber alle Beobachtungen und Zwischenergebnisse (wichtig bei der Fehlersuche!), Zahl der Proben/Ansätze sind zu protokollieren. Ergebnisse möglichst in Tabellenform bringen, zusätzliche graphische Darstellungen sind erwünscht. Vorbilder für graphische Darstellungen finden sich in Zeitschriften. Umfang: 1-2 Seiten. Diskussion Das Versuchsergebnis wird vor dem Hintergrund der theoretischen Erwartung ausführlich diskutiert. Beurteilen Sie die Aussagekraft des Experiments. Mögliche zusätzliche Diskussionspunkte: Wo können die Ursachen für eventuelle Abweichungen liegen? Können Versuchsaufbau und -durchführung nach Ihren Erfahrungen verbessert werden? Umfang: 1-2 Seiten. Literatur: Alle im Text zitierten Publikationen müssen im Literaturverzeichnis enthalten sein und umgekehrt. Sie werden mit Numerierung alphabetisch nach den Namen der Autoren geordnet. Die Zitierung erfolgt am einfachsten in der Form, wie sie auch im Skript benutzt wird.

5 5 Versuch A Ziel dieses Versuches ist die Amplifikation eines Gens aus Gesamt-DNA von Ralstonia eutropha, welches für das stoffwechselphysiologisch wichtige Enzym 2,3- Butandiol-Dehydrogenase codiert. Das Strukturgen soll sowohl mit Hilfe einer Proof Reading Polymerase (Fehlerquote ~1:5000) durch Polymerasekettenreaktion amplifiziert werden. Die amplifizierten DNA-Fragmente sollen dann kloniert, sequenziert, und in einen Expressionsvektor (pet23a) umkloniert werden, der eine heterologe Expression des Ralstonia-Gens in Escherichia coli ermöglicht. Durch Wahl verschiedener Primer während der PCR-Reaktion sollen sowohl die nativen Gene amplifiziert als auch Fusionsgene erzeugt werden, welche am C-terminalen Ende sechs zusätzliche Codone für die Aminosäure Histidin tragen. Dieser His 6 -tag beeinträchtigt die enzymatische Aktivität des ausgehend von dem Fusionsgen translatierten Enzyms nicht, jedoch erlaubt der Tag eine leichte und effiziente Aufreinigung des Proteins über eine Nickel-NTA-Affinitätschromatographie. Die zu erzeugenden rekombinanten Klone sollen dem nachfolgenden Proteinkurs als Ausgangsmaterial zur Isolierung und Aufreinigung des Enzyms dienen. 1. In vitro-amplifikation von DNA Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR, engl. polymerase chain reaction) lassen sich Nukleinsäuresequenzen in vitro amplifizieren. Dies kann zwecks Analyse der DNA-Region erfolgen und/oder zur direkten Subklonierung in Vektoren. Die Reaktion ist abhängig von der Spezifität zweier Oligonukleotide (Primer), welche antiparallel zueinander an die beiden Stränge der zu amplifizierenden DNA (Template-DNA) hybridisieren. Für die Stringenz der Primer ist zusätzlich die Hybridisierungs- (engl. annealing-) Temperatur und die Magnesiumionen- Konzentration ausschlaggebend. Die durch Hitzedenaturierung (94 Celsius) entstandene einzelsträngige Template-DNA hybridisiert bei Erreichen der Annealing- Temperatur mit den im Überschuß zugegebenen Primern. Nach einer anschließenden Temperaturerhöhung auf 68 C erfolgt, ausgehend vom 3 - Hydroxylende der Oligonukleotide, die DNA-Neusynthese des jeweils komplementären Template-Stranges mit Hilfe einer thermostablien DNA-Polymerase. Die im Kurs verwendete Pfx-Polymerase bildet "blunt-ended" DNA-Fragmente, welche im Gegensatz zur häufig verwendeten Taq-Polymerase keine 3 -A- Überhänge bildet. Die so synthetisierte doppelsträngige DNA läßt sich erneut

6 6 thermisch denaturieren und durch Wiederholung der zuvor beschriebenen Schritte exponentiell amplifizieren. 1.1 Durchführung Zur Amplifikation der 2,3-Butandiol-Dehydrogenase aus Ralstonia eutropha werden folgende Primer eingesetzt. Von jeder Gruppe werden zwei unterschiedliche PCR- Produkte hergestellt: eines welches die Expression des nativen Enzyms in E. coli ermöglicht und eines, welches die Expression eines Enzyms mit 6 Histidinresten am C-terminus ermöglicht. Dieser His 6 -tag ermöglicht die schnelle und effiziente Aufreinigung eines Proteins aus Kulturlysaten. Hierbei wird ausgenutzt, das Hexahistidin-Fusionsproteine sehr stark und selektiv an Nickel-NTA Agarosematrices binden. Hierzu wird ein C-terminaler Primer ohne Stop-Codon verwendet. Die Codons für die Translation der 6 Histidinreste und das danach benötigte Stop-Codon werden vom Expressionsvektor pet23a zur Verfügung gestellt. Zur Klonierung in den Expressionsvektor pet23a wurden an den Primern NdeI und XhoI-Schnittstellen angebracht (unterstrichen).

7 7 Abb. 1. Strategie zur Klonierung des 2,3-Butandiol-Dehydrogenase-Gens aus R. eutropha. Unter Verwendung spezifischer Primer sollen die codierenden Bereiche des Gens amplifiziert und nach einem A-Tailing in den kommerziell verfügbaren T- Vektor pgem-t Easy kloniert werden.

8 8 Von jeder 3er- Gruppe benötigt Nur 3er- Gruppen 1A, 2A und 3A Nur 3er- Gruppen 1B, 2B und 3B Primerbezeichnung ADH_N_NdeI ADH_CSTOPXhoI ADH_CHISXhoI Sequenz 5 -CATATGACCGCAATGATGAAAGCCGC-3 5 -CTCGAGTCAGTGCGGCTTGATGGCGATC-3 5 -CTCGAGGTGCGGCTTGATGGCGATCTTC-3 Pipettierschema zur Amplifikation eines DNA-Fragmentes mit der Platinum Pfx-DNA- Polymerase Platinum Pfx- 10 µl Primer 1 (10pmol µ l-1 ) Polymerasereaktion 10 µl Primer 2 (10 pmol µl -1 ) 10 µl dntp-mix (je 2,5 mm) 10 µl 10 x Pfx-Amplifikationspuffer 2,5 µl MgSO 4 (50 mm) 10 µl Glycerin 1-10 µl template -DNA ( 2ng) 0,5 µl Platinum Pfx DNA- Polymerase (1U µl- 1 ) ad 100 µl H 2 O bidest

9 9 Die PCR-Ansätze werden folgendem Temperaturprogramm unterzogen: 1.) Denaturierung 5 min 94 o C 2.) Denaturierung 30 sec 94 o C 3.) Annealing 30 sec minimale Schmelztemperatur der Primer 3 o C 4.) Elongation x sec 68 o C (Pfx DNA-Polymerase) 5.) 30 35fache Wiederholung der Schritte 1.) 4.) Zur Kontrolle und Konzentrationsabschätzung der PCR-Ansätze wird jeweils ein Aliquot der Ansätze in einer Agarosegelelektrophorese mit 1% (w/v) Agarose bei 150 V getrennt. 1.2 Auftrennung von DNA durch Agarosegelelektrophorese Bringt man geladene Moleküle in ein elektrisches Feld, so wandern sie gemäß ihrer Ladung zur Anode oder Kathode (Prinzip der Elektrophorese). Die Wanderungsgeschwindigkeit hängt dabei von der Ladung und Form der Moleküle ab. Durch die negative Ladung des Zucker-Phosphat-Rückgrats wandern DNA-Moleküle immer zur Anode. Führt man die Elektrophorese in einer Gelmatrix durch, lassen sich DNA-Moleküle nach ihrer Größe auftrennen. In den meisten Fällen werden Agarose- Gele eingesetzt. Agarose ist ein dreidimensional vernetztes Algenploysaccharid, das als Molekularsieb wirkt. Je kleiner ein DNA-Molekül ist, desto besser kann es die Gelporen passieren. Größere Moleküle werden stärker zurückgehalten und wandern entsprechend langsamer. Durch Variation der Porengröße (0,5 2,5%) läßt sich die Porengröße und damit die Auflösung des Gels variieren. Zur Größenbestimmung der DNA-Moleküle läßt man im Gel einen Molekulargewichtsmarker (z.b. Lambda/PstI) mitlaufen. Die Größe eines unbekannten Fragments läßt sich durch einen Vergleich mit den Markerbanden abschätzen oder anhand einer Eichgerade ermitteln: innerhalb gewisser Grenzen (0,4 23 kb) ist die elektrophoretische Beweglichkeit eines DNA-Moleküls umgekehrt proportional zum Logarithmus der Anzahl der Basenpaare. Für Fragmente oberhalb von 23 kb sind spezielle Elektrophoresetechniken (z.b. Pulsfeldelektrophorese)

10 10 erforderlich. Sehr kleine DNA-Moleküle (bis zu 1000 bp) lassen sich besser in Polyacrylamid-Gelen auftrennen (vergleiche Sequenzierreaktion!). Fragmentgrößen von restriktionsgespaltener λ-dna [bp] (Sambrock et al., 1982) ungeschnitten EcoRI HindIII PstI Die unterstrichenen Fragmente der λ-dna lagerten sich aufgrund der Wechselwirkungen der kohäsiven Enden zusammen, so das die fettgedruckten Fragmente entstanden Üblicherweise wird die Agarose-Gelelektrophorese in Horizontalapparaturen durchgeführt: sie bestehen aus einer Wanne, die mit TAE- oder TBE-Puffer gefüllt wird, und dem Spannungsgeber. In der Wanne befindet sich ein Steg, auf den der Gelträger aufgelegt wird. Das Gel wird so orientiert, das sich die Geltaschen (=Aussparungen zum Auftragen der Proben) auf der Kathodenseite befinden. Da die DNA während der Elektrophorese nicht sichtbar ist, wird den Proben ein Farbstoff (Bromphenolblau) zugesetzt, der schneller wandert als die meisten DNA- Moleküle. Auf diese Weise kann die Elektrophorese ständig überwacht und rechtzeitig abgebrochen werden. Nach der Elektrophorese wird das Gel in eine Ethidiumbromid-Lösung gelegt, um die DNA-Banden anzufärben. Ethidiumbromid ist ein interkalierender Farbstoff, der unter UV-Licht eine rötliche Fluoreszenz zeigt (Vorsicht! Krebserregend!!). Aus der Fluoreszenzintensität läßt sich die DNA- Konzentration grob abschätzen. Die Lage der Banden wird photographisch dokumentiert. Die kompletten PCR-Ansätze werden anschließend einer präparativen Agarosegelelektrophorese unterzogen und die PCR-Produkte anschließend aus dem Gel isoliert.

11 11 TBE-Puffer 50 mm Tris 50 mm Borsäure 2,5 mm EDTA (Na 2 -Salz) Stop-Mix 4 M Harnstoff 50 mm EDTA (Na 2 -Salz) 50 % Saccharose (w/v) 0,1 % (w/v) Bromphenolblau 1.3 Reinigung der PCR-Produkte Die PCR-Produkte sollen mit Hilfe des Nukleotrap-Reinigungskits (Macherey und Nagel, Düren) gereinigt werden und anschließend in 20 µl Elutionspuffer (Kit) gelöst werden. Die Aufreinigung erfolgt gemäß der mitgelieferten Anleitung des Herstellers. 1.4 Klonierung der amplifizierten DNA-Fragmente Eine schnelle Methode DNA-Fragmente zu klonieren, ist die TA-Kloning-Methode. Amplifiziert man DNA mit einer Taq-Polymerase, hängt diese an die Enden des PCR- Produktes 3'-A-Überhänge. Dies ermöglicht direktes Klonieren von PCR-Produkten unter Verwendung einer Topoisomerase in einen linearisierten Vektor mit einem 3'-T- Überhang. Zur Klonierung der erzeugten Taq-PCR-Fragmente können diese direkt in den Vektor pgem TEasy ligiert und nach Escherichia coli TOP10 transformiert werden. Die im Kurs mit der proofreading Pfx-Polymerase generierten Fragmente können auf diese Weise nicht kloniert werden, da ihnen 3 -A-Überhänge fehlen. Diese sollen jedoch durch ein A-tailing erzeugt werden. Im Anschluß daran werden diese PCR-Produkte in den Vektor pgem TEasy kloniert.

12 A-Tailing Zur Erzeugung von 3 -A-Überhängen an die Pfx-PCR-Fragmente werden die aufgereinigten Fragmente wie folgt behandelt: A-tailing gereinigte PCR-Fragmente 6 µl 2 mm ATP 1 µl MgCl 0,3 µl Taq-DNA-Polymerase 1 µl (Invitrogen 5 U/µl) 10x Tag Amplification 1 µl Puffer Der Ansatz wird 30 min bei 72 C inkubiert 1.6 Ligation der PCR-Fragmente in den Klonierungsvektor pgem T Easy (Promega) Die Ligation der PCR-Produkte in den Vektor pgem Teasy wird gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt. Hierbei ist nur der Puffer und die Ligase zu verwenden, welche im Klonierungskit mitgeliefert wird (keine Exonukleaseaktivität der mitgelieferten Ligase!)

13 Transformation von Escherichia coli Unter Transformation versteht man in der Gentechnologie allgemein die Übertragung gereinigter, auch rekombinanter DNA, auf Bakterien oder höhere Zellen. Die meisten Bakterienarten können DNA aus dem Medium aufnehmen, tun dies jedoch nur mit geringer Effizienz. Um die Transformationseffizienz zu steigern, muß man die Zellen einer physikalisch/chemischen Vorbehandlung unterziehen (=Herstellung kompetenter Zellen). Nach der Transformation werden die Zellen auf Selektiv-Nährböden, die ein Antibiotikum (hier Ampicillin) enthalten, ausplattiert. Das Antibiotikum bewirkt, das nur transformierte Zellen auf dem Nährboden wachsen, da nur sie die Plasmid-codierte Antibiotikaresistenz ausprägen. Die Anwesenheit einer Antibiotikaresistenz bedeutet nicht, das alle transformierten Klone über einen Vektor mit dem gewünschten Insert verfügen. Um nur Klone mit inserierten PCR-Produkt zu isolieren bedient man sich der Blau-Weiss Selektion. Bakterien, welche einen zur Blau-Weiß-Selektion fähigen Vektor wie pgem T Easy enthalten, besitzen eine funktionsfähige β -Galaktosidase, die sich aus einem Plasmid-kodierten Anteil (dem α-peptid) sowie eine allein nicht funktionsfähige genomisch codierte β-galaktosidase zusammensetzt. Diese Bakterien bzw. deren nun funktionstüchtige β -Galaktosidasen setzen X-Gal (5-Brom- 4-Chlor-3-Indolyl- β -D-Galaktosid) enzymatisch um und bilden Galaktose und den blauen Farbstoff 5-Bromo-4-Chloro-3-Indol, durch den die Kolonien blau erscheinen.

14 14 Der Einbau eines DNA-Fragmentes in die MCS (multiple cloning site, liegt innerhalb eines 5 -Abschnitts des α-peptides des lac Z-Gens) zerstört das Leseraster das lac Z-Gens, so dass keine funktionsfähige β-galaktosidase mehr gebildet werden kann. Die betreffenden Bakterien-Kolonien bleiben dementsprechend in Gegenwart von X- Gal farblos (weiß). Das IPTG (Isopropyl-thio-galaktosid) dient als Induktor für die β- Galaktosidase, wird jedoch nicht durch die β-galaktosidase zersetzt. Dies bedeutet, daß auf den benutzten Nährböden nur diejenigen Bakterien Kolonien bilden können, welche auch durch die Transformation ein amp R -Gen erhielten. Sind die Zellkolonien durch X-Gal blau gefärbt, ist die β-galaktosidase noch funktionsfähig, d.h. es wurde bei der Ligation keine Fremd-DNA in den Vektor eingebaut. Sind die Zellkolonien nicht gefärbt, so ist die β-galaktosidase nicht funktionsfähig, d.h. es wurde Fremd-DNA in den Vektor eingebaut, und dadurch das Gen für das α-peptid der β-galaktosidase zerstört. Dieses gentechnische Verfahren wird auch als Blau-Weiß-Selektion bezeichnet Herstellung dauerhaft kompetenter Zellen von Escherichia coli (Hanahan, 1983) Die zu transformierenden E. coli-stämme werden in 50 ml LB-Medium bis zu einer OD 600nm von 0,3 bei 37 o C kultiviert. Als Inokulum dient 1 ml einer übernacht gewachsenen Vorkultur). Nach einer Inkubation von 15 min auf Eis werden die Zellen in einer Megafuge 1.0R (Heraeus Sepatech GmbH, Osterode) bei 4000 Upm für 15 min bei 4 o C sedimentiert. Anschließend wird das Zellpellet in 18 ml RF1-Lösung resuspendiert. Nach 30 min Inkubation auf Eis erfolgt ein weiterer Zentrifugationsschritt, nachdem die Zellen in 4 ml RF2-Lösung aufgenommen werden. Die Zellsuspension wird zu jeweils 200 µl auf 1,5 ml Reaktionsgefäße verteilt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Anschließend können die Aliquots bei 70 o C gelagert werden. RF1-Lösung 100 mm RbCl 50 mm MnCl 2 30 mm Kaliumacetat mit konz. Essigsäure auf ph 5,8 einstellen

15 15 RF-2-Lösung 10 mm RbCl 10 mm MOPS 75 mm CaCl 2 x 6 H2O 15 % (w/v) Glycerin mit NaOH auf ph 5,8 einstellen Durchführung der Transformation von Escherichia coli Zellen Je 200 µl kompetente E. coli-zellen ( ) werden mit µg zu transformierender DNA (Ligationsansatz) gut durchmischt und 30 min auf Eis inkubiert, wobei die DNA an die Zelloberfläche adsorbiert. Zur Aufnahme der DNA werden die Zellen für genau 90 s einem Hitzeschock von 42 o C ausgesetzt. Anschließend wird der Ansatz kurz auf Eis abgekühlt, bevor 600 µl LB-Medium zugesetzt werden. Zur Regeneration der Zellen nach dem Hitzeschock und zur Ausprägung der plasmidcodierten Antibiotikaresistenz erfolgt eine Inkubation bei 37 o C für 90 min. Daraufhin werden µl Aliquots auf Selektivagar ausplattiert und zur Isolierung rekombinanter Klone über Nacht bei 37 o C bebrütet. Zur Kontrolle wird ein Ansatz ohne DNA-Zugabe mitgeführt. Luria-Bertani (LB)-Medium (Sambrook et al., 1989) NaCl Trypton Hefeextrakt H 2 O bidest 10 g 10 g 5 g ad 1000 ml X-Gal-Medium LB-Medium mit den folgenden Zusätzen: 1 M IPTG 0,2 ml l -1 4 % (w/v) X-Gal in DMSO 1,0 ml l -1

16 16 Zur Herstellung von Festmedien (Agarplatten) wird den Medien vor der Autoklavierung 18 g/l Agar zugesetzt. Nach dem Autoklavieren wird den Medium 50µg/ml Ampicillin aus einer zuvor sterilfiltrierten Stammlösung (1000x konzentriert) zugegeben. Die auf den über Nacht bebrüteten Platten gewachsenen weissen Kolonien werden in ausreichender Menge frisch auf neue Ampicillin-haltige LB-Agarplatten ausgestrichen und wieder unter Selektionsdruck über Nacht bebrütet. Von diesen plasmidtragenden Klonen werden im Anschluß die Plasmide durch eine Mini-prep isoliert und die enthaltenen Inserts sequenziert. 1.8 Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli (Mini prep) (Birnboim und Doly, 1979) Jeweils eine Impföse der Bakterienmasse werden in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß in 100 µl eiskalter GET-Lösung resuspendiert. Der Zellaufschluß erfolgt durch Zusatz von 200 µl frisch angesetzter SDS-Lösung. Nach ca. 5 min auf Eis zeigt das vollständige Aufklaren der Lösung die Lysis der Zellen an. Durch Zugabe von 150 µl eiskalter K-Acetat-Lösung werden chromosomale DNA und Proteine gefällt und nach 5 min auf Eis zusammen mit Zelltrümmern durch Zentrifugation für 15 min bei 1300 Upm (Biofuge 13, Fa. Heraeus Instruments GmbH, Osterode) sedimentiert. Der Überstand wird in ein neues Reaktionsgefäß überführt und durch eine Phenol/Chloroform-Extraktion gereinigt (1.8.1). Anschließend wird die Plasmid-DNA mit Isopropanol gefällt und das getrocknete Pellet in einem geeigneten Volumen TE- Puffer mit 0,01 % (v/v) RNase-Lösung rehydratisiert. Die Lagerung der DNA erfolgt bei 20 o C. GET-Lösung 25 mm Tris/HCl (ph 8,0) 10 mm EDTA (Na 2 -Salz) 50 mm Glucose SDS-Lösung 200 mm NaOH 1 % (w/v) SDS

17 17 K-Acetat-Lösung 60,0 ml K-Acetat 11,5 ml Essigsäure 28,5 ml H 2 O bidest ph 4,8 TE-Puffer 1 mm EDTA (Na 2 -Salz) 10 mm Tris/HCl (ph 8,0) RNase-Lösung 10 mm Tris/HCl (ph 7,5) 15 mm NaCl 10 mg ml -1 RNse A Durch 15 min Inkubation bei 80 o C wird die Lösung DNase-frei gemacht. Lagerung bei 20 o C Reinigung der Plasmid-DNA mit Phenol/Chloroform Die Deproteinierung der DNA erfolgt durch sukzessive Extraktion der DNA-Lösung mit jeweils ½ Phenol (Tris/HCl-gepuffert) und Chloroform/Isoamylalkohol (24:1, v/v). Nach der Durchmischung der Suspension erfolgt zur Beschleunigung der Phasentrennung ein Zentrifugationsschritt (30 s, Upm). Die DNA-haltige wässrige Oberphase wird in ein neues Gefäß überführt und die Extraktion zweimal wiederholt. 1.9 DNA-Sequenzierung (Dideoxy-Sequenzierung nach Sanger et al., 1977) Die enzymatische DNA-Sequenzierungs-Methode nach Sanger et al. (1977) verwendet eine DNA-Polymerase und ein synthethisches Oligonukleotid als Primer, um eine komplementäre Kopie einer einzelsträngigen DNA-Vorlage (Template) zu erstellen. Die Kettenverlängerung erfolgt am 3 -Ende des Primers, der an die Template-DNA angeheftet wird. Die in die wachsende Kette eingebauten Desoxynukleotide werden durch die Basenpaarung mit der Template-DNA bestimmt. Das Kettenwachstum beeinhaltet die Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen der 3 -OH-Gruppe des wachsenden Endes der Primerkette und der 5 -Phosphatgruppe des

18 18 eingebauten Desoxynukleotides. Daraus ergibt sich die 5-3 -Orientierung der wachsenden Kette. Werden 2,3 -Didesoxynukleosid-Triphosphate (ddntps) eingebaut erfolgt keine Kettenverlängerung mehr und die Reaktion endet, da die wachsende Primerkette keine 3 -OH-Gruppe mehr besitzt. Um die vier basenspezifischen Sequenzleitern zu erhalten, wird nur jeweils eine der vier möglichen ddntps in die vier Reaktionen eingesetzt. Das Verhältnis der ddntps zu den dntps wird so eingestellt, daß es an jeder Position, an der die jeweilige Base (G, A, T oder C) auftritt, zu statistischen Abbrüchen in der Primerkette kommt. Auf diese Weise enthält jede der vier basenspezifischen Reaktionen eine Population von verlängerten Primerketten, die alle dasselbe, durch den Primer definierte 5 -Ende besitzen, und durch die spezifischen Abbruchnukleotide ein variables 3 -Ende und somit eine unterschiedliche Länge aufweisen. Die Produkte jeder Reaktion werden in einer hochauflösenden Polyacrylamidgel-elektrophorese, unter Bedingungen aufgetrennt, die es erlauben zwischen DNA-Spezies zu unterscheiden, die sich in der Länge nur um ein Basenpaar voneinander unterscheiden. Die Detektion erfolgt je nach verwendeter Markierung durch Autoradiographie oder durch Chemilumineszenz DNA-Sequenzierung mit dem SequiTherm EXCEL II Long Read Kit LC (Biozym) Beim "cycle sequencing" werden wiederholte Zyklen von Denaturierung, Primeranlagerung und Verlängerung durchgeführt. Die sich daraus ergebende lineare Amplifikation der Sequenzierungsprodukte erlaubt die Verwendung von geringeren Template-Mengen (150 fmol). Außerdem werden Kompressionen beruhend auf stabilen Sekundärstrukturen der DNA weitestgehend durch die hohe Extensionstemperatur von 70 o C vermieden. Sequenzierung mit fluoreszenzmarkierten Primern Für die nichtradioaktive Sequenzierung mit Hilfe des IR-Fluoreszenz-Farbstoffs IRD800 und dem automatischen Sequenzer der Firma LI-COR (Alabama) werden für die Markierung die 5'-markierten Oligonukleotide 5 d[agggttttcccagtcacgacgtt]-3 (-40 M13 UNI-CS-IR-

19 19 Sequenzierungsprimer) und 5 -d[gagcggataacaatttcacacagg]-3 (-40 M13REV-CS-IR-Sequenzierungsprimer) eingesetzt. Durchführung der Sequenzreaktionen: Für die Sequenzreaktionen wird das SequiTherm EXCEL Kit (Biozym) verwendet µl IRD800-markierter Primer (2 pmol) + 7,2 µl 3,5x SequiTherm Excel II Sequ.-Puffer fmole "template" DNA (dsdna oder ssdna) + steriles Wasser (dest.) ad 16 µl + 1 µl DNA Polymerase (5U/µl ) 2. Je "template" beschrifte 4 x 0,5 ml E-Cups mit je A, C, G, T und pipettiere je 2 µl des Terminationsmixes in das entsprechende E- Cup (auf Eis) 3. Pipettiere je 4 µl des Ansatzes aus 1. in je ein E-Cup mit Terminationsmix (auf Eis) µl Mineralöl je Reaktionsansatz 5. Die E-Cups werden nun in einen Thermocycler gestellt und folgenden Temperaturzyklen unterzogen: - 5 min 95 o C - 30x: - 30 s 95 o C - 15 s 50 o C - 1 min 70 o C µl Loading Puffer min > 70 o C (i) - 1,5-2 µl auf das Gel geben Polyacrylamid-Gelelektrophorese Li-Cor Modell 4000L Die gelelektrophoretische Trennung der Sequenzierungsansätze erfolgt in einer Sequenzgel-Apparatur (LI-COR), deren Trennstrecke 41 cm (66 cm) beträgt. Nach dem Gießen des Gels, liegt ein 0,25 mm dünnes und 6 %iges (w/v) Polyacrylamidgel vor. Die zur Herstellung des Gels benötigten 5 mm-glas-scheiben werden vor Gebrauch mit dest. Wasser und Isopropanol gründlich gereinigt.

20 20 Li-Cor Modell 4200 Die gelelektrophoretische Trennung der Sequenzierungsansätze erfolge in einer Sequenzgel-Apparatur (LI-COR), deren Trennstrecke 41 cm beträgt. Nach dem Gießen des Gels, liegt ein 0,2 mm dünnes und 5,5 %iges (w/v) Polyacrylamidgel vor. Die zur Herstellung des Gels benötigten 5 mm-glas-scheiben werden vor Gebrauch mit dest. Wasser und Isopropanol gründlich gereinigt. Zusammensetzung des Gels: Als Gelmatrix wird das Sequagel XR (National Diagnostics, Georgia) Zweikomponenten-system verwendet. 30 ml der Sequagellösung wird mit 7,5 ml des Sequagel Complete-Pufferreagents und 3,1 ml 1x TBE-Puffer gemischt. Die Polymerisation erfolgt durch Zugabe von 75 µl 40 %iger (w/v) Ammoniumpersulfat- Lösung. Anschließend wird die Gellösung mit Hilfe einer Spritzflasche oder Pipette blasenfrei in die Gelkammer gegossen. Zur Formung des oberen Gelrandes wird ein Abstandhalter eingesetzt, der vor dem Auftragen der Proben durch einen Haifischzahnkamm ersetzt wird. Nach mindestens 1 h Polymerisationszeit wird eine Vorelektrophorese bei einer konstanten Leistung von 31,5 W für 1 h in TBE-Seq-Puffer durchgeführt. Vor dem Auftragen der Proben müssen diese 3 min bei > 70 C denaturiert werden. Die Trennung der DNA erfolgt bei konstanter Leistung von 31.5 W ( V) in 8-10 h. TBE-Seq.-Puffer: 10 x TBE-Lösung: 121,1 g Tris (Sequenz-PAGE) 55,0 g Borsäure 7,4 g EDTA Umklonierung der PCR-Produkte aus pgem TEasy in den Expressionsvektor pet23a Restriktion und Ligation von DNA Restriktion und Ligation von DNA gehören zu den Grundprinzipien der molekularen Klonierungstechnik. Man unterscheidet heute 3 Arten von Restriktionsendonukleasen, die als Typ I-, II- und III-Endonucleasen bezeichnet werden: sie schneiden die DNA an spezifischen Erkennungsstellen (hydrolytische Spaltung). Die Erkennungssequenzen sind Tetra- bis Oktamere und besitzen meist

21 21 eine zweizählige Symmetrieachse (palindrome Sequenzen). Je nach Restriktion erfolgt die Spaltung entweder in der Mitte der Erkennungsstelle (=glatte [blund] Enden) oder versetzt (=klebrige [sticky] Enden). Die 3 -Enden besitzen immer eine OH-Gruppe, die 5 -Enden eine Phosphatgruppe. Für eine optimale Aktivität der Enzyme ist die Wahl der Reaktionsbedingungen und eine hohe Reinheit der zu schneidenden DNA wichtig. Neben ph-wert und Temperatur spielen Ionenstärke und Mg 2+ -Konzentration (alle Typ II- Restriktionsendonukleasen benötigen Mg 2+ als Cofaktor) eine entscheidende Rolle. Zur Verknüpfung von DNA wird eine Klasse von Enzymen verwendet, die als Ligasen bezeichnet werden. Ligasen katalysieren die Ausbildung von Phosphodiester- Bindungen zwischen benachbarten 3 -Hydroxy- und 5 -Phosphatgruppen doppelsträngiger Moleküle. Die vom Phagen T4 codierte Ligase ist ein Dalton grosses Protein. Sie benötigt ATP als Energiequelle und Mg 2+ als Cofaktor. Der besondere Vorteil des Enzyms liegt darin, daß es nicht nur sticky ends sonder auch blunt ends miteinander verknüpft. Da bei Ligationen auch unerwünschte Nebenprodukte entstehen können, z.b. Religate des Vektors, müssen die Reaktionsbedingungen entsprechend gewählt werden. Bei Plasmid-Klonierungen sollte das molare Verhältnis von Vektor zu Insert möglichst zugunsten des Inserts verschoben sein. Die Ligationseffizienz kann durch Zugabe von Polyethylenglykol (PEG 8000; Bildung makromolekularer Aggregate) zusätzlich gesteigert werden Isolierung hochreiner Plasmid-DNA Aus den nach der DNA-Sequenzierung als richtig identifizierten Klone werden die Plasmide hochrein aufgereinigt. Der für die folgenden Klonierungsexperimente benötigte Vektor pet23a wird ebenfalls hochrein aufgereinigt. Hierzu wird das QIAprep Kit der Firma Qiagen verwendet. Die Durchführung erfolgt nach den Angaben des Herstellers.

22 Durchführung Die über die AT-Methode in den Vektor pgem T Easy ligierte DNA (unsere PCR- Produkte) wird durch Restriktion mit NdeI und XhoI ausgeschnitten (Vergleiche Restriktionskarte pgem T Easy und die Sequenz der benutzten Primer zur Amplifikation der PCR-Produkte!) und anschließend über präparative Agarosegelelektrophorese aufgereinigt (1.3). Die Restriktion der Plasmid-DNA erfolgt durch sequenziellen Verdau (zuerst NdeI) und dazwischenliegender Isopropanolfällung. Zur Fällung der DNA aus den Restriktionsansätzen ist darauf zu achten, das vor der Zugabe von Isopropanol die Ionenstärke in dem Restriktionsansatz mit 4M LiCl auf 0,4% eingestellt wird. Danach erfolgt eine Umklonierung in den Vektor pet23a durch Ligation. Dieser wird vorher ebenfalls mit NdeI und XhoI restringiert, so das das Insert in der gewünschten Orientierung (colinear zum T7-Promotor, siehe Restriktionskarte) ligiert wird. Die Ligationsansätze werden über Transformation (1.7) in E. coli TOP 10 transformiert. Leider verfügt pet23a nicht über eine Selektionsmöglichkeit zur Identifizierung von Klonen die ein Insert enthalten. Aus diesem Grund werden von jeder Gruppe ca. 12 Klone ausgestrichen und eine Plasmidminiprep durchgeführt, die anschließend einem analytischem Restriktionsverdau unterzogen werden. Klone mit dem richtigen Insert (Größe im Agarosegel abschätzen) werden einer DNA-Sequenzierung unterzogen (1.9).

23 23 Beispiel für einen Restriktionsansatz 1 µl DNA (~1 µg/µl) 1 µl Restriktionspuffer (10x) 1 µl Restriktionsenzym (1 U/µl) Aqua dest ad 10 µl Die Restriktionsansätze werden mindestens 2 h (analytisch) oder über Nacht (präparativ) bei 37 C inkubiert. Beispiel für einen Ligationsansatz 6 µl Insert-DNA (0,1 µg/ml) 1 µl pet23a (0,1 µg/µl) 10 µl Aqua dest 1 µl T4-DNA-Ligase (1 U/µl) 2 µl Ligase-Puffer (10x) Die Ligationsansätze werden über Nacht bei 14,5 C inkubiert (bester Kompromiß zwischen Stabilität des Enzyms und Aktivität) 1.11 Expression der Fusionsproteine Endziel des Versuches ist es, mit Hilfe der konstruierten Expressionsvektoren eine Überexpression der 2,3-Butandiol-Dehydrogenase aus Ralstonia eutropha in E. coli

24 24 zu erreichen. Mit Hilfe der von uns konstruierten Expressionvektoren ist in E. coli TOP10 allerdings keine Expression zu erreichen, weil dieser Stamm über keine T7- RNA-Polymerase verfügt. Der T7-Promotor ist von natur aus nicht regulierbar. Er ist aber sehr spezifisch, und wird nur von der RNA-Polymerase aus dem Bakteriophagen T7 erkannt. Daher werden Gene, die vom T7 Promotor kontrolliert werden in nicht-infizierten Bakterien nicht exprimiert, da die spezifische RNA- Polymerase fehlt. Für die Expression mittels des von uns verwendeten pet-systems wird ein E. coli Stamm verwendet, der eine T7-RNA-Polymerase unter Kontrolle des induzierbaren lac-promotors im Genom codiert trägt (E. coli BL23, ein DE3-Stamm). Hierzu werden die aus den rekombinanten E. coli TOP10 isolierten Expressionsvektoren über eine Plasmidminiprep isoliert und über Transformation in kompetente E. coli BL23 überführt. Die rekombinanten Stämme von E. coli BL23 werden dann zur Expression der nativen und His 6 getagten Enzyme benutzt.

25 25 Abb. 2. Umklonierung der Gene aus dem Vektor pgem-t Easy in den Expressionsvektor pet23a. Nach der Restriktion des Vektor pgem-t Easy, in welchen zuvor die entsprechenden Gene inseriert worden sind, mit NdeI und XhoI sollen die resultierenden DNA-Fragmente unter Kontrolle des T7-Promotors in den Expressionsvektor pet23a kloniert werden.

26 Durchführung und Kontrolle der Expression Hauptkulturen der rekombinanten E. coli BL23-Zellen, die die entsprechenden pet23a-derivate enthalten, werden aus einer gut bewachsenen Vorkultur beimpft. Eine Kultur, die nur den Vektor pet23a enthält wird als Kontrolle mitgeführt. Bei einer OD 600nm von 0,5 0,7, die in der Regal nach 3 Stunden erreicht wird, werden diese Kulturen durch Zugabe von Isopropyl-β-thiogalactopyranosid (IPTG, Endkonzentration 1 mm) induziert. Die induzierten Kulturen werden für 3 Stunden bei 37 C weiterkultiviert und anschließend durch Zentrifugation geerntet und die Zellen aufgeschlossen. Hierzu werden die Zellen im doppelten Volumen 50 mm Na-P- Puffer, ph 7,4 resuspendiert und durch Ultraschall mit einem Sonopuls GM200 aufgeschlossen. Ein Aliquot der Zelllysate wird zur Kontrolle der Expression in einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt. Sofern die Zeit es zuläßt, werden aus den Lysaten mit den His 6 -getagten Enzymen die Proteine über eine Nickel-NTA- Affinitätschromatographie aufgereinigt. Na-P-Puffer (50 mm, ph 7,4) NaH 2 PO 4 25mM Na 2 HPO 4 25mM SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) zur Trennung von Proteinen (Laemmli, 1970) Die Proteinmustern der verschiedenen induzierten rekombinanten E.colis werden unter denaturierenden Bedingungen mit Hilfe einer SDS- Polyacrlamidgelelektrophorese in einem diskontinuierlichen System durchgeführt. Das Gelsystem besteht aus einem Sammelgel (4,5 %, w/v, Acrylamid) zur Fokussierung der Proteine und einem Trenngel (11,5 %, 12,5 % oder 16 %, w/v, Acrylamid) zu ihrer Trennung aufgrund des Molekulargewichts. Die Separierung erfolgt in 1 mm starken Plattengelen. Als Puffersystem dient Tris/Glycin.

27 27 Herstellung des Trenngels: Trenngel-Puffer Acrylamid-Lösunug (30 %, w/v) H 2 O bidest 11,5 % (w/v) 10,4 ml 16 ml 15,2 ml Der Gellösung wird eine Spatelspitze Natriumsulfit zugegeben und gut durchmischt, Sofort nach dem Starten der Polymerisation durch Zugabe von 20 µl N,N,N,N - Tetramethylethylendiamin (TEMED) und 40µl 40 % (w/v) Ammoniumpersulfatlösung (APS) wird die Lösung blasenfrei in eine Gelkammer gegossen und mit 0,5 ml Isopropanol überschichtet. Nach 1 h Polymerisationszeit wird das Isopropanol abgesaugt und das Sammelgel vorbereitet. Herstellung des Sammelgels: 4,5 % (w/v) Sammelgel-Puffer Acrylamid-Lösunug (30 %, w/v) H 2 O bidest 1,56 ml 0.94 ml 3,75 ml Der Gellösung wird ebenfalls eine Spatelspitze Natriumsulfit zugegeben und gut durchmischt. Sofort nach dem Starten der Polymerisation durch Zugabe von 2,2 µl TEMED und 4,4 µl 40 % (w/v) APS wrde die Lösung blasenfrei über das Trenngel geschichtet und zur Formung der Geltaschen ein Kamm in das noch flüssige Sammelgel eingesetzt. Nach einer Polymerisationszeit von 1 h ist das Gel gebrauchsfähig.

28 28 Lösungen: Acrylamidlösung 146 g Acrylamid (30 %, w/v) 4 g N,N -Methylen-bisacrylamid ad 500 ml H 2 O bidest Trenngelpuffer 90,75 g Tris 2 g SDS ad 500 ml H 2 O bidest mit HCl auf ph 8,9 einstellen Sammelgelpuffer 30,23 g Tris 2 g SDS ad 500 ml H 2 O bidest mit HCl auf ph 6,8 einstellen Elektrodenpuffer 14,4 g Glycin 3 g Tris 1 g SDS ad 1000 ml H 2 O bidest, ph 8,5 Zur Vorbereitung wueden die Proben mit der Hälfte ihres Volumens mit SDS- Denaturierungspuffer versetzt und 5 min bei 95 o C denaturiert. Nachdem das Anoden- und Kathodenpufferreservoir mit Elektrodenpuffer gefüllt und die Geltaschen nach Entfernung des Kamms mit Elektrodenpuffer gespült sind, werden pro Spur 1 25 µl Proteinlösung ( 50 µg Protein) aufgetragen. Bis zum Eindringen der Bromphenolblaufront in das Trenngel wird eine konstante Stromstärke von 10 ma, danach von 20 ma angelegt. Das relative Molekulargewicht der Proteine wird mit Hilfe von mitgeführten Proteinreferenzen bestimmt. Für den Bereich von 14,4 kd bis

29 29 96 kd wird der Low Molecular Weight Calibration -Kit (Pharmacia, Uppsala, Schweden) verwendet, der folgende Eichproteine beinhaltet: Phosphorylase b (aus Kaninchenmuskel) M r Rinderserumalbumin (BSA) M r Ovalbumin (aus Hühnereiweis) M r Carboanhydrase (aus Rindererythrocyten) M r Trypsininhibitor (aus Sojabohne) M r α-lactalbumin M r Um Proteine in Polyacrylamidgelen sichtbar zu machen, werden diese in der Regel unspezifisch mit Coomassie Brilliant Blue angefärbt. Die Proteine in SDS- Polyacrylamidgelen werden für 30 min in Färbelösung inkubiert, und anschließend so lange in Entfärbelösung gelegt, bis die Proteinbanden deutlich sichtbar werden. Die SDS-Polyacrylamidgele werden anschließend in 10% (v/v) Essigsäure aufbewahrt. Die gefärbten Gelen werden auf einem Leuchtschirm fotografiert. Färbelösung 4 g Serva Blau R ml Methanol 90 ml Essigsäure 460 ml H2O bidest Gelentfärbelösung 330 ml Methanol 100 ml Essigsäure ad ml H 2 O bidest 1000 Membranentfärbelösung 900 ml Methanol 20 ml Essigsäure 80 ml H 2 O bidest

30 30 SDS-Denaturierungspuffer 8,0 g SDS 20 % (v/v) β-mercaptoethanol 37,2 mg EDTA (Na 2 -Salz) 40 % (v/v) Glycerin 5,0 mg Bromphenolblau ad 100 ml 100 mm Tris/HCl (ph 6,8)

31 31 Versuch B: Im Rahmen dieses Versuches soll eine KDPG-Aldolase-negative Deletionsmutante von Ralstonia eutropha H16 konstruiert und entsprechend ihres Phänotyps charakterisiert werden. Die KDPG-Aldolase (E.C ) übernimmt in R. eutropha eine Schlüsselrolle im gleichnamigen Stoffwechselweg (Entner-Doudoroff-Weg), da dieser Abbauweg essenziell bei der Verwertung der Zucker Fruktose und Na-Gluconat genutzt wird. Hierbei wird durch die KDPG-Aldolase die Umsetzung von 2-Keto-3-desoxy-phosphogluconat zu Pyruvat katalysiert. Das für die KDPG-Aldolase codierende Gen, welches üblicherweise mit der Abkürzung eda bezeichnet wird, eignet sich besonders gut zur Demonstration einer Knockout-Mutagenese, da dieses Gen im Gegensatz zu den anderen Genen, die für Enzyme des Entner-Doudoroff- Weges codieren, lediglich in einer Kopie im Genom von R. eutropha vorhanden ist. Insgesamt besteht das Genom von R. eutropha H16 aus insgesamt drei zirkulären Replikons, zwei Chromosomen mit einer Größe von 4,1 und 2,9 Mb und einem Megaplasmid (phg1) von 452 kb. Da das für die KDPG-Aldolase codierende eda Gen lediglich mit einer Kopie auf Chromosom 2 lokalisiert ist, führt eine Deletion oder Disruption dieses Gens phänotypisch zum Verlust die Kohlenstoffquellen Fruktose oder Na-Gluconat zu verstoffwechseln. Phänotypisch kann somit eine erfolgreiche Deletion des eda Gens daran erkannt werden, dass entsprechende Mutanten nicht mehr mit Fruktose oder Gluconat als einziger Kohlenstoffquelle wachsen können. Prinzip der Knockout-Mutagenese mittels homologer Rekombination Die Konstruktion einer KDPG-Aldolase negativen Mutante von R. eutropha H16 soll durch homologe Rekombination erfolgen, wobei der komplette codierende Bereich des eda-gens deletiert wird. In diesem Fall soll somit keine Disruption des Gens durch Insertion eines anderen DNA-Fragmentes, wie z.b. eines Antibiotikaresistenzgens, erfolgen, sondern eine Marker-freie Deletion des gesamten Gens. Das Prinzip der Knockout-Mutagenese mittels homologer Rekombination ist in der folgenden Abbildung schematisch dargestellt.

32 32 Abb. B1: Schematische Darstellung der Knockout-Mutagenese mittels homologer Rekombination. Im Prinzip soll es durch homologe Rekombination mit einem doppelten "Cross-over" Ereignis zu einem gezielten Austausch des mutagenisierten DNA-Fragmentes mit dem Wildtyp-Fragment kommen und dadurch das KDPG-Aldolase Gen (eda) gezielt deletiert werden. Hierzu wurde im Vorfeld des Kurses ein entsprechendes Suizidplasmid konstruiert, das lediglich die flankierenden DNA-Bereiche des eda-gens enthält (Abb. B2). Gleichzeitig befinden sich auf dem Suizidplasmid pjqmp18- Tc r ::Δeda H16 ein Tetrazyklin-Resistenzgen sowie ein Gen, dass für eine Laevan- Saccharase codiert. Das Tetrazyklin-Resistenzgen (Tc r ) dient dabei zur Selektion der heterogenotischen Transkonjuganten, die nach einem ersten Cross-over Ereignis das komplette Suizidplasmid im Genom integriert tragen, während zur Selektion der Homogenoten die Aktivität der Laevan-Saccharase, welche durch das sacb Gen codiert wird, genutzt werden soll. Dabei werden die Heterogenoten durch die Aktivität der Laevan-Sacharase, die die im Medium enthaltene Saccharose enzymatisch umsetzt, stark in ihrem Wachstum gehemmt, während die Homogenoten nicht in

33 33 ihrem Wachstum inhibiert werden. Gleichzeitig sollten die potenziellen homogenotischen Transkonjuganten auf MSM-Agarplatten mit Gluconat oder Fruktose als einziger Kohlenstoffquelle auf einen KDPG-Aldolase negativen Phänotyp untersucht werden, da mit dem zweiten Cross-over Ereignis theoretisch der Wildtyp Genotyp wiederhergestellt werden kann, d.h. keine Deletion des eda Gens stattfindet, sondern lediglich eine Excision des integrierten Suizidplasmides. Abb. B2: Schematische Darstellung der Konstruktion eines Suizidplasmides zur Deletion des KDPG-Aldolase Gens (eda) in R. eutropha H16. Relevante Restriktionsschnittstellen sind angegeben. Abkürzungen: Amp r, Ampicillin Resistenzgen; cole1 ori, Replikationsursprung in E. coli; eda, KDPG-Aldolase Gen; f1 (-) ori, Replikationsursprung in Helferphage f1; lacz, β-galaktosidase-strukturgen aus E. coli; mob, Mobilisierungsstelle; sacb, Laevan-Saccharase Gen; Tc r, Tetrazyklin-Resistenzgen.

34 34 Durchführung: Herstellung einer eda-deletionsmutante Zur Herstellung einer eda-deletionsmutante von R. eutropha H16 wird das Suizidplasmid pjqmp18-tc r ::Δeda H16, welches eine homologe bis identische DNA- Sequenz zu dem zu deletierenden KDPG-Aldolase Gen (eda) aufweist, durch Konjugation in den jeweiligen Rezipienten-Stamm (R. eutropha H16) transferriert. Die auf dem Plasmid codierte Antibiotikaresistenz (Tetrazyklin) dient zur Selektion der Heterogenoten. Dazu wird nach dem Abschwemmen des Spot-Matings die Zellsuspension auf NB-Nährböden mit dem jeweiligen Antibiotikum (Tetrazyklin) ausplattiert, so dass auf Zellen von R. eutropha, die das Plasmid enthalten, selektiert werden kann. Zusätzlich wird den Nährböden Gentamycin zugesetzt, um Wachstum von plasmidtragenden E. coli Zellen zu vermeiden. Nach 48 h Inkubation bei 30 C können die als Einzelkolonien gewachsenen Heterogenoten mit sterilen Zahnstochern abgenommen werden. Die Kolonien werden anschließend in Reagenzgläser mit 10 ml NB-Medium überführt, um die Zellen weiter zu propagieren und eine zweite Rekombination zu ermöglichen. Aus jeder Kultur wird nach Inkubation über Nacht 10 μl auf NB-Saccharose-Nährböden ausplattiert, um auf Homogenoten zu selektieren. Die nach h gewachsenen Kolonien werden anschließend mit einem sterilen Zahnstocher abgenommen und parallel auf NB- Tc/Gm-, NB-Saccharose- und MSM-Gluconat-Agarplatten ausgestrichen. Diejenigen Kolonien, die kein Wachstum auf NB-Tc/Gm- und MSM-Gluconat-Agarplatten zeigen, aber auf NB-Saccharose-Agarplatten wachsen können, entsprechen den Kriterien einer Homogenote. Zur weiteren Überprüfung dieser potentiellen Deletionsmutanten können spezifische PCR-Reaktionen durchgeführt und das amplifizierte Produkt sowohl durch Restriktionsanalyse als auch durch DNA-Sequenzierung näher charakterisiert werden. Gleichzeitig kann die erfolgreiche Deletion des eda-gens sowohl durch wachstumsphysiologische Untersuchungen mit Gluconat als einziger Kohlenstoffquelle erfolgen als auch durch Nachweis der KDPG-Aldolase-Aktivität mittels eines optisch-enzymatischen Tests. Konjugation (FRIEDRICH et al., 1981) Die durchzuführende Konjugation soll nach dem Spotmating-Verfahren durchgeführt werden. Als Donor dient E. coli S17-1, der zuvor das Hybridplasmid

35 35 (pjqmp18-tc r ::Δeda H16 ) durch Transformation erhalten hat. Als Rezipient wird R. eutropha H16 eingesetzt. Der plasmidhaltige Donor wird hierzu für ca. 6 h in 10 ml LB-Medium mit entsprechendem Antibiotikum bei 37 C angezogen, der Rezipient dagegen für ca. 24 h in 10 ml NB-Medium bei 30 C inkubiert. Die Kulturen werden anschließend steril bei 4 C abzentrifugiert (Megafuge 1.0R, 15 min, Upm), einmal mit NB-Medium gewaschen und in jeweils 0,5 ml NB-Medium aufgenommen. Für die Konjugation werden Aliquots der Zellsuspensionen im Verhältnis 1 : 1 (v/v) gemischt. Jeweils 0,2 ml des Kreuzungsgemisches und der Kontrollen (Donor und Rezipient ungemischt) werden auf zwei Tage alte, dick gegossene NB-Agarplatten als Spot aufgetropft und für h bei 30 C inkubiert. Die Zellen werden entweder mit 3 ml 0,1 M KP-Puffer (ph 7,0) oder 0,9 % (w/v) NaCl (Saline) von der Agaroberfläche abgeschwemmt und in einer geeigneten Verdünnungsstufe auf Selektivagar (NB-Tc/Gm-) ausplattiert. Nach 48 h Inkubation bei 30 C können die als Einzelkolonien gewachsenen Transkonjuganten mit sterilen Zahnstochern auf die gewünschten Festmedien übertragen werden. Auf den Kontrollen sollte kein Wachstum erfolgt sein. Medien: Die Medien werden, wenn nicht anders angegeben, für 20 min bei 121 C und 2 x 10 5 Pa autoklaviert. Feste Nährmedien werden durch Zusatz von 1,8 % (w/v) Agar zu der entsprechenden Nährlösung hergestellt. Mineralmedium (SCHLEGEL et al., 1961) Na 2 HPO 4 x 12 H 2 O 9 g KH 2 PO 4 1,5 g NH 4 Cl 1 g MgSO 4 x 7 H 2 O 0,2 g CaCl 2 x 2 H 2 O 0,02 g Fe(III)NH 4 -Citrat 1,2 mg Spurenelementlösung SL6 (Pfennig, 1974), 100-fach0,1 ml H 2 O bidest ad 1000 ml; ph 6,9

36 36 Kohlenstoffquelle in Form von Fruktose oder Na-Gluconat werden dem Mineralmedium in einer Konzentration von 1 bis 2 % (w/v) zugesetzt. Für die Herstellung von Mineralmedium-Agarplatten werden Agar-Lösung und Nährlösung jeweils doppelt konzentriert angesetzt, getrennt autoklaviert und dann vereinigt. Spurenelementlösung SL6 (PFENNIG, 1974) ZnSO 4 x 7 H 2 O 10 mg MnCl 2 x 4 H 2 O 3 mg H 3 BO 3 30 mg CoCl 2 x 6 H 2 O 20 mg CuCl 2 x 2 H 2 O 1 mg NiCl 2 x 6 H 2 O 2 mg Na 2 Mo 4 x 2 H 2 O 3 mg H 2 O bidest ad 1000 ml Luria-Bertani (LB)-Medium (SAMBROOK et al., 1989) NaCl 10 g Hefeextrakt 5 g Trypton 10 g H 2 O bidest ad 1000 ml; ph 7,5 NB-Medium (SAMBROOK et al., 1989) Nutrient Broth 8 g H 2 O bidest ad 1000 ml Zur Herstellung von festen Nährmediuen zur Selektion von homogenotischen Transkonjuganten wird dem NB-Agar eine Konzentration von 10 % (w/v) Saccharose zugesetzt.

37 37 Antibiotika Die Antibiotika-Stammlösungen werden nach SAMBROOK et al. (1989) angesetzt, sterilfiltriert und in Aliquots bei -20 C aufbewahrt. Die Antibiotika werden den autoklavierten Nährmedien nach Abkühlen auf ca. 50 C in folgenden Endkonzentrationen zugesetzt: Antibiotikum Stammlösung Endkonzentration (mg/ml) E. coli R. eutropha Tetracyclin 12,5 in EtOH (50%) 12,5 25 (-Hydrochlorid) Gentamycin 10 in H 2 O bidest 10 --

38 38 Versuch C Es gibt verschiedene Möglichkeiten, um in DNA-Sequenzen Mutationen einzufügen. Generell unterscheidet man Zufallsmutagenesen und gerichtete Mutationen. Während bei der gerichteten Mutagenese spezifische Nukleotide ausgetauscht oder deletiert werden und der Effekt der Mutation studiert werden kann, werden nach einer Zufallsmutagenese die resultierenden Mutationen normalerweise in vivo selektiert und anschließend mittels DNA-Sequenzierung genau ermittelt. Eine Möglichkeit der Zufallsmutagenese stellt die Error Prone PCR dar. Error Prone PCR-Protokolle sind modifizierte Standard-PCR-Protokolle, welche die natürliche Fehlerrate von DNA- Polymerasen verändern und erhöhen. Aufgrund der hohen natürlichen Fehlerrate wird häufig Taq-DNA-Polymerase für die Error Prone PCR eingesetzt, welche bevorzugt GC zu AT-Austausche vornimmt. Für Error Prone PCR wird typischerweise auch die MgCl 2 -Konzentration erhöht und das Verhältnis der Nukleotide kann verändert werden. In diesem Versuch soll jeweils eine Error Prone PCR von dem in Versuch A klonierten Gen durchgeführt werden. Anschließend sollen die PCR-Produkte mit dem Vektor pgem-t Easy ligiert und nach E. coli Top10 transformiert werden. Durch die Sequenzbestimmung soll demonstriert werden, dass durch modifizierte PCR- Bedingungen gehäuft Mutationen in amplifizierter DNA auftreten. Pipettierschema für Error Prone PCR 10 µl Primer 1 (10pmol µ l-1 ) 10 µl Primer 2 (10 pmol µl -1 ) 10 µl dntp-mix (je 2,5 mm) 0,75 µl dctp (100 mm) 0,75 µl dttp (100 mm) 10 µl 10 x Taq-Amplifikationspuffer 14 µl MgCl 2 (50 mm) 10 µl Glycerin 1-10 µl template -DNA ( 2ng) 1,0 µl Platinum Taq DNA- Polymerase (5 U µl- 1 ) ad 100 µl H 2 O bidest

39 39 Wie unter 1.1 beschriben, werden die PCR-Ansätze dem Cyclerprogramm für Taq- DNA-Polymerse unterzogen. Die PCR-Produkten werden wie unter 1.3 beschrieben aufgereinigt. Da Taq-DNA-Polymerase 3 A überhängende Enden produziert, kann das PCR-Produkt direkt mit dem Vektor pgem-t Easy ligiert (1.6) und nach E. coli Top10 transformiert werden (1.7). Jeweils 12 der resultierenden auf X-Gal-Medium weißen E. coli-klone (1.7.2) sollen dann auf das Vorhandensein in den Vektor inserierter DNA überprüft werden (1.8). Anschließend sollen jeweils 6 der Klone, welche das amplifizierte Gen im Vektor pgem-t Easy enthalten, sequenziert werden. Pipettierschema für die Sequenzreaktionen 2 µl Reaktionsmix BD v µl 5x Sequenzierungspuffer 1-3 µl Plasmid-DNA 1,5 µl Primer (1 µm) ad 10 µl H 2 O Cyclerprogramm 1x 96 C 4 min 96 C 20 sek 35x 50 C 10 sek 60 C 2 min Nach Durchführung der Sequenzreaktion werden die Sequenzen im Zentrallabor ermittelt und sollen im Rahmen des Protokolls ausgewertet werden.

40 40 Literatur Friedrich, B., Hogrefe, C. und Schlegel, H. G. (1981) Naturally occuring genetic transfer of hydrogen-oxidizing ability between strains of Alcaligenes eutrophus. J. Bacteriol. 147: Pfennig, N. (1974) Rhodopseudomonas globiformis sp. nov., a new species of the Rhodospirillaceae. Arch. Microbiol. 100: Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. Schlegel, H. G., Kaltwasser, H. und Gottschalk, G. (1961) Ein Submersverfahren zur Kultur wasserstoffoxidierender Bakterien: Wachstumsphysiologische Untersuchungen. Arch. Mikrobiol. 38: Hanahan, D. (1983) Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J-. Mol. Biol. 166: Birnboim, H.C and Doly, J (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acid Res. 7: Sanger, F., Nicklen, S. and Coulsen, A. R. (1977) DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proc. Nattl. Acad. Sci. USA 74: Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:

41 41 Zeitplan 1. Woche Montag, PCR zur Amplifizierung der 2,3-Butandiol-Dehydrogenase mit und ohne HisTag von bereitgestellter Gesamt-DNA von Ralstonia eutropha mittels Pfx-Polymerase (1.1) Error Prone PCR AXI-Agarplatten (Ampicillin, X-Gal, IPTG) gießen (1.7.2) Vorkulturen für kompetente Zellen (E. coli Top10, Vor- und Hauptkolben autoklavieren und anschließend Vorkulturen beimpfen) (1.7.1) Kontrolle der PCR-Produkte (Error Prone) im Agarosegel (1.2) Nucleotrap Pfx-PCR-Produkte (1.3) Dienstag, A-Tailing Pfx-PCR-Produkte der Strukturgene und anschließende Fällung (1.5) Ligation der PCR-Produkte pgem TEasy (A-Tailing und Error Prone PCR) (1.6) Herstellung kompetenter Zellen von E. coli Top10 (1.7.1) Transformation (1.7.2) NB-Agarplatten (1. ohne AB; 2. mit Tc/Gm; 3. mit Saccharose) sowie MSM-Agarplatten mit Gluconat ansetzen LB- und NB-Flüssigmedium ansetzen und je 20 ml auf 100 ml Kolben aufteilen Mittwoch, Kontrolle Transformationsplatten und je Gruppe 6 weiße Klone von jedem Ansatz ausstreichen Animpfen von R. eutropha H16 und E. coli S17-1 (pjqmp18tc::δeda H16 ) Donnerstag, Plasmidminipreps (1.8) und Restriktionsverdau (1.10.1)) Isolierung pet23a (1.10.2) Restriktion der richtigen Klone und des Plasmids pet23a mit NdeI (1.10.1) Konjugation von R. eutropha H16 und E. coli S17-1 (pjqmp18tc::δeda H16 ) Freitag, Fällung der Restriktionsansätze Kontrolle Verdau der richtigen Klone und pet23a: Verdau mit zweiten Enzym (XhoI) über Nacht DNA-Sequenzierung (sowohl Pfx als auch errror prone für Sequenzierung im Zentrallabor) (1.9.1) Ausplattieren des Konjugationsansatzes auf NB-Tc/Gm- Agarplatten zum Screening auf Heterogenoten