Einführung in die genetische Epidemiologie: SNPs, HWE, LD usw.

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1 Einführung in die genetische Epidemiologie: SNPs, HWE, LD usw. Dr. Silvia Selinski Leibniz-Institut für Arbeitsforschung an der TU Dortmund

2 Outline Genetische Grundlagen SNPs Risikofaktoren Linkage Disequilibrium Haploblock und Haplotype Recombination Hotspot LD Maße LD Maps SNP Chips Neighbourhood of disease SNPs Fragen?

3 Genetische Epidemiologie Individuelle Suszeptibilität Exogene Faktoren Lebensstil Genetische Variabilität Beruf Höheres Erkrankungsrisiko von Personen mit bestimmten Genvarianten unter Schadstoffbelastung Andere Faktoren z.b. Medikamente Umweltschadstoffe

4 Genetische Grundlagen Das Genom: Gesamtheit der Erbinformationen eines Menschen 23 Chromosomensätze im Zellkern der Zellen: 22 Paare (diploid) X Y (Mann) oder X X (Frau) Vererbung: Je 1 halber (haploider) Chromosomensatz von Vater und Mutter

5 Gen, DNA, RNA DNA: Doppelhelix aus komplementären Basenpaaren, aus der Abfolge der Basen ergibt sich die genetische Information RNA: Einfacher Strang, Uracyl statt Thymin Information der RNA wird in den Ribosomen (ausserhalb des Zellkerns) zur Bildung von Proteinen verwendet Gen: Ein Segment der DNA - Protein codierendes Gen - RNA codierendes Gen Das Genom enthält ca Gene (2% des Genoms)

6 DNA Doppelhelix komplementäre Basen A T(U) G - C NatWis, Chemie und Biologie Wikipedia

7 Codon und Aminosäure Triplet, Codon: Das Code-Wort für eine Aminosäure besteht aus drei Nucleotiden (z.b. Startcodon: AUG). Einige Aminosäuren werden durch mehrere Triplets codiert. Proteine: Bestimmen die Struktur und Funktion jeder Zelle und bestehen aus einer Aminosäurekette (es gibt 20 Aminosäuren) AUG GCA AAU... Met Ala Asn

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9 Aufbau eines Gens Intron: nicht-codierender Bereich innerhalb eines Gens Exon: codierender Bereich eines Gens Enhancer: Transkriptionsverstärker Promotor: enthält den Abschnitt, durch den die RNA- Polymerase erkennt, wo das Gen beginnt

10 Von Gen zum Genprodukt Durch das Herausschneiden von Exons, die zwischen zwei Introns liegen, können durch ein Gen verschiedene Proteine hergestellt werden Wikipedia

11 Translation trna: transfer-rna mrna: messenger-rna rrna: ribosomale RNA Wikipedia

12 Genetische Grundlagen Phänotyp: Eine beobachtbare Eigenschaft/Ausprägung wie z.b. Augenfarbe, Krankheit oder Blutgruppe Genotyp: Eine Genvariante, die genetische Information, die den Phänotyp bestimmt Genlocus: Position einer DNA-Sequenz auf einem Chromosom Allel (allgemein): Variante der genetischen Information an einem Genort Major / Minor allele: häufigere /seltenere Variante eines Gens in einer Population Mutation: Abänderung einer DNA-Sequenz Polymorphismus: Mutation, die in > 1% einer Population auftritt Haplotyp: Kombination der Sequenzvarianten mehrerer Loci auf einem Chromosom

13 Allele und Genotypen 2 Allele bei Genlocus: A und a + Diploider Chromosomensatz (1 Chromosom vom Vater und 1 Chromosom von der Mutter) 3 mögliche Genotypen: Homozygot mit Allel A: Heterozygot: Homozygot mit Allel: AA Aa aa

14 Vererbung Dominanter Erbgang homozygot dominant heterozygot homozygot rezessiv Rezessiver Erbgang Intermediärer Erbgang

15 Genetische Grundlagen Mitose: normale Zellteilung, diploider Chromosomensatz Meiose: Zellteilung zur Bildung von Keimzellen, haploider Chromosomensatz Cross-over: Stückaustausch von homologen Chromosomen während der Meiose Rekombination: In der Meiose auftretende Kreuzung der Chromosomen von Vater und Mutter Linkage: Zwei oder mehrere Genloci, die gemeinsam vererbt werden Je näher zwei Genloci, desto häufiger werden sie gemeinsam vererbt

16 Sequenzvariationen Punktmutationen: Veränderungen eines einzelnen Nukleotids Art der Veränderungen Substitution: Insertion: Deletion: ATTAG ATAAG ATTAG ATTTAG ATTAG ATAG Inversion: ATTAG AGATT Veränderungen der Sequenz: Mutation in weniger als 1% der Bevölkerung Polymorphismus in > 1% der Bevölkerung

17 Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) Einzelnukleotid-Polymorphsimen SNPs: - Punktmutation mit Substitution - Polymorphismus, also in mehr als 1% der Bevölkerung Beispiel: NAT2 481 T>C (T Referenz, C Variante) SNP-Ausprägung: homozygot referent (TT) heterozygot (TC) homozygot variant (CC)

18 Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) Einzelnukleotid-Polymorphsimus Exchange of a single base pair present in at 1% of the population, e.g. C -> T Major allele = more frequent nucleotide Minor allele = less frequent / variant nucleotide ~ 10 million SNPs

19 Notation bei SNPs Referenz häufigere Variante major allele wild type Variante seltenere Variante minor allele Mutation Homozygote Referenzsequenz 0 (homozygous major allele) Heterozygot 1 (heterozygous) Homozygote Variante 2 (homozygous minor allele)

20 Single-Nucleotid-Polymorphismen (SNPs) Was bewirkt der SNP? Gen Protein Referenz Aminosäureaustausch Stopcodon eingefügt Frameshift durch fehlendes Nukleotid

21 Welche Auswirkungen hat ein SNP? regulatorischer Bereich nicht-codierender Bereich codierender Bereich Änderung der Genregulation? Austausch Insertion/Deletion Änderung eines Tripletts Änderung aller nachfolgenden Tripletts Stoppcodon Austausch einer Aminosäure kein Austausch einer Aminosäure Veränderung der nachfolgenden Aminosäuresequenz Verkürzung des Genprodukts Änderung des Genprodukts an einer Stelle? evt. Stabilität der mrna Veränderung des Genprodukts

22 Genetische Epidemiologie Inhalt der Genetischen Epidemiologie ist die Aufdeckung des Einflusses genetischer Faktoren und ihrer Interaktionen mit äußeren Belastungen bei der Entstehung von Krankheiten. Genetische Einflussvariablen Exogene Einflussvariablen Informationen aus Datenbanken

23 Komplexe Krankheiten Multifaktorielle Ursachen Interaktion von genetischen und Umweltfaktoren Genetische Faktoren haben einen modulierenden Einfluss Grundidee: Zusammenwirken von mehreren bis vielen niedrig penetranten genetischen Varianten bewirkt bei Vorliegen bestimmter exogener Faktoren eine Erhöhung des Krankheitsrisikos

24 Risikofaktoren für Krebs Lebensweise: Ernährung Medikamente Rauchen Alkoholkonsum Umwelt: Feinstaub Schadstoffe am Arbeitsplatz und in Luft, Wasser, Nahrung Entwicklung von Tumoren Endogene Faktoren: Genetische Prädisposition Enzympolymorphismen

25 Beispiel: Harnblasenkrebs Schadstoff Transferase A Transferase A* Transferasen B - XY Stoffwechselprodukt A Stoffwechselprodukte B - XY Stoffwechselprodukte B - XY Harnblasenkrebs

26 Statistische Methoden Zusammenhang SNPs-Krankheit Linkage Studien Assoziationsstudien Odds Ratios Multiples Testen Klassifikation Variablenselektion Zusammenhang SNPs Linkage Disequilibrium Haplotypenschätzung

27 Linkage vs. Assoziations-Studien

28 Odds Ratio Beispiel Harnblasenkrebs Anteil p ij GSTT1 positiv GSTT1 negativ Gesamt 1 2 Fälle (krank) F p 11 p 12 p 1. Kontrollen (gesund) K p 21 p 22 p 2. Gesamt p.1 p.2 p Verhältnis zweier odds (Chancen) Erkrankungschance der Gruppe 1 : Erkrankungschance der Gruppe 2 OR + Anteil Fälle in Gr. T1 Anteil Kontrollen in Gr. T1 p11 = p 21 - Anteil Fälle in Gr. T1 : Anteil Kontrollen in Gr. T1 p12 : p =

29 Definitionen Haplotyp Allel: Zustandsform einer DNA-Sequenz (i.d.r. Gen) Haplotyp: Beobachtbares Muster untersuchter Varianten auf einem Strang (praktisch synonym zum Allel) A C C T T G G C G A A T G A Gen auf einem Chromosom mit rot markierten SNP-Loci Nur die SNP- Loci des Abschnitts

30 Haplotyp Haplotyp: Beobachtbares Muster genotypisierter Varianten auf einem Strang A T G A Problem: Heterozygote SNPs; Haplotypen sind mit SNPs nicht immer eindeutig bestimmt AA A A A A AT kann A T sein, oder T A. G G G G GG G A G A GA

31 Chromosom 1 Chromosom 2 Locus A Locus B doppelt heterozygote Haplotypen A 1 B 1 A 2 B 2 Mögliche Nachfahren doppelt homozygote Haplotypen A 3 B

32 Genotypfrequenzen und Allelfrequenzen Genotypfrequenzen: Häufigkeiten von AA p AA = f(aa) Aa p Aa = f(aa) aa p aa = f(aa) in der Studienpopulation Allelfrequenzen: Beispiel Häufigkeiten von [A] p A = f(a) [a] p a = f(a) in der Studienpopulation

33 Hardy-Weinberg Equilibrium Gibt es einen Zusammenhang zwischen Allelfrequenzen und Genotypenfrequenzen? Prinzip: Vergleich von erwarteten Genotypfrequenzen mit beobachteten Genotypfrequenzen bei gegebenen Allelfrequenzen ( z.b. χ 2 1 Test, Exakter Test) Lehnt der Test ab, so ist die Stichprobe nicht im Hardy-Weinberg-Equilibrium (HWE)! Qualitätssicherung von Labordaten

34 Hardy-Weinberg Equilibrium Sind die Allelfrequenzen von zwei Allelen a und A in einer Population durch f(a)=p und f(a)=q (=1-p) gegeben, sind die Genotypfrequenzen ab der zweiten Generation mit f(aa)= p 2 f(aa)= 2pq f(aa)= q 2 konstant. Annahmen: Zufällige Partnerwahl, Infinite Population, keine Mutation, keine Selektion, keine Migration Beispiel

35 Linkage Disequilibrium (LD) Association of alleles, e.g. common occurrence of [A] at locus 1 and [G] at the nearby locus 2 Due to frequently joint transmission of neighbouring loci alleles occure not independently SNP C provides information about nearby SNPs A, B, D, E, F, G and the low variant bases pairs between them bpa-9 bpa-1 bpa1 bpa7 SNP A SNP B SNP C SNP D SNP E SNP F SNP G LD varies across genomic regions and depends only partly on the genomic distance between two loci Biological determinants of LD: rates of recombination that may vary across the genomic regions, mutation,

36 Haploblock and Haplotype Haploblock = Block of high LD Region without substancial recombination of the ancestors of the current population Blocks of variable length Loci within the same block are in high LD Only a few common haplotypes are observed Loci within the same exon of a gene can be assumed to be in high LD Haplotype = Set of representative SNPs on one chromosome Combination of alleles at multiple loci that are transmitted together on the same chromosome Set of nearby, statistically associated SNPs on a single chromatid that are representative for all polymorphic sites in that region Haplotype loci in high LD Example: 7 most important SNPs of NAT2 gene that define together the main NAT2 alleles

37 NAT2 example NAT2*4 = GCTCGAG (wild type)

38 Tagging SNP Due to high LD tagsnps should represent their surrounding very well and capture most of the genetic variation Search algorithms for tagging SNPs Measure few SNPs instead of many SNPs Example: Reduce 7 NAT2 SNPs to 4 most informative SNPs Common haplotypes capture most of the genetic varation across sizable regions and can be represented by a small number of representative SNPs (haplotype tag SNPs = htsnps)

39 Recombination Hotspot Small regions in the genome that exhibit highly elevated rates of meiotic recombination (exchanges between sister chromatides). 1.5 to 2.0 kb wide Over 25,000 hotspots in humans identified so far SNPs in regions with evidence of recombination are not in LD

40 Haploblocks and Recombination Hotspots Haploblocks loci in this region are in LD less frequent crossing over in the meiotic division Recombination hotspots loci in this region are not in LD very frequent crossing over in the meiotic division A and B in LD a and B not in LD

41 Summary Haplotype A C A T C No LD Recombination hotspot LD block LD block bpa-9 bpa-1 bpa1 bpa7 SNP A SNP B SNP C SNP D SNP E SNP F SNP G Tagging SNPs Haplotype: (ACATC), Diplotype: (ACATC), (ACTAG), Genotype: (AA, CC, AT, AT, CG)

42 Measures of LD Measures of association between pairs of SNPs Usually D and r² are both given and mapped A a B b Σ p AB p A p a D = (p AB p A p B ) Σ p B p b D =D/D max with D max scaling factor depending on allele frequencies and D r² = D²/ (p A p a p B p b ) D max = min( p min( p A A p p b B, p a, p a p p B b ), if ), if D D > < 0 0 Usually D > r² or even D >>> r² Problem: p AB unknown Beispiel

43 LD Maps Map pairwise LD (D, r²) between all measured SNPs in a specific region Regions of high LD, haploblocks (dark coloured) Regions of low LD (light coloured) Regions of frequent recombination (white) Algorithms of determining haploblocks and recombination hotspots depending on estimated of D and r² Depending on data sets and density of measured SNPs in a region Differences of LD maps between study groups and SNP chips

44 SNP Chips Not every SNP on a chip Not always the interesting SNP on a the chip Different sets of SNPs on different chips, e.g. Illumina and Affymetrix may result in differences in LD maps esp. in regions with different densitiy of tagsnps Chip A Chip B Chip A Lower LD bpa-9 bpa-1 High LD bpa1 bpa7 SNP A SNP B SNP C SNP D SNP E SNP F SNP G

45 Find SNPs on a Chip Newly discovered association between disease (bladder cancer) and a SNP C in another study group the SNP C is on our Affymetrix SNP chip check association directly (p value) the SNP C is not on our Affymetrix SNP chip determine the exact position of the chromosome (data base) determine the most proximate SNP(s) on the chip (position information) check association of the neighbour SNP(s) (p values) and the LD structure in this region (potential relevance of p values)

46 Example I: rs (Kiemeney et al., 2008) rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs D = 1.0 r² = 0.02 upstream c-myc Recombination Other Strong LD downstream c-myc rs is not on the chip (Chr. 8, position ) Next to rs on the chip: rs ( ), P uncorr = rs ( ) P uncorr = D = 0.39, r² = 0.02 rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs

47 Example I: rs (Kiemeney et al., 2008) rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs D = 1.0 r² = 0.02 upstream c-myc r² downstream c-myc light coloured blocks difficult to detect algorithm for automatic haploblock detection very useful rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs

48 rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs Example II: rs (Kiemeney et al., 2008) dark coloured D blocks difficult to detect algorithm for automatic haploblock detection very useful rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs

49 rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs27064 rs27061 rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs27052 rs27053 rs31491 rs27059 rs rs36987 rs rs36967 rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs Example III: rs (Rafnar et al., 2009) Recombination Other Strong LD Directly on the chip p = in strong LD with rs and rs (also no significant) rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs27064 rs27061 rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs27052 rs27053 rs31491 rs27059 rs rs36987 rs rs36967 rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs

50 Example IV: NAT2-SNPs rs and rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs8695 rs Upstream NAT2 NAT2 Recombination Other Strong LD Downstream NAT2 C481T = rs P uncorr = G590A = rs P uncorr = D = 1.0, r² = 0.31 rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs

51 Different research groups - different results Not significant in a validation study: Discovered SNP is a artefact Differences in study populations (life style, environmetrics, genomics) Case number Neighbour SNPs not significant: SNP is not in a haploblock Neighbour SNPs on the chip not in LD/ too far away LD maps look different: Different chips/data base => different SNPs, different spacing,... Different populations, e.g. Utah, Iceland (more related individuals, more LD)

52 Neighbourhood of well known and new SNPs 12 SNPs localised directly or indirectly on our Affymetrix 5.0 SNP chip None genomewide significant Most bladder cancer SNPs not in large LD blocks Due to representation of Affy SNPs in the region (?)

53 Questions?

54 Danke schön! Thank you!