nanoximet (Oxidant generating capacity as a metric to allow grouping of nanomaterials and prediction of human health effects)

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1 nanoximet Oxidantien-Bildungspotential als Maß für die Gruppierung von Nanomaterialien und Voraussage von gesundheitlichen Auswirkungen auf den Menschen (Oxidant generating capacity as a metric to allow grouping of nanomaterials and prediction of human health effects) Bryan Hellack, Leticia Aragao-Santiago, Sonja Boland, Armelle Baeza-Squiban, Andrea Neumeyer- Sickinger, Catrin Albrecht, Roel Schins & Thomas Kuhlbusch Institut für Energie- und Umwelttechnik e. V., Duisburg, Deutschland Leibniz-Institut für Umweltmedizinische Forschung, Düsseldorf, Deutschland Universität Paris Diderot Paris, Frankreich

2 OXIDANTIEN-BILDUNGSPOTENTAL GESUNDHEITSSCHÄDIGENDE EFFEKTE Zielsetzung Azellulär Zellulär H 2 O 2 OH Fe, Zn, Cu ONOO O 2 O 2 UV 1 O 2 ROS Oxidativer Stress OH O 2 e - NO H 2 O 2 O 2 Nanopartikelgruppierung nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 2

3 AP 1 Management und Dissemination Konzept Partikelherstellung, -charakterisierung in versch. Flüssigkeiten AP 2 AP3 OXIDANTIEN-BILDUNSGFÄHIGKEIT Intrinsisches ROS Bildungspotential + Oxidantienbildung / Oxidativer Stress in Zellen AP 4 OXIDATIVER STRESS EVALUIERUNG Stufe 1 Antioxidantien Stufe 2 Entzündung Stufe 3 Zytotoxizität Sichere NM Modelierung (Risikovorhersage) AP 6 Gefährliche NM nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 3

4 AP 1 Management und Dissemination Konzept Partikelherstellung, -charakterisierung in versch. Flüssigkeiten AP 2 AP3 OXIDANTIEN-BILDUNSGFÄHIGKEIT Intrinsisches ROS Bildungspotential Oxidantienbildung / Oxidativer Stress in Zellen - Insbes. Vergleich zwischen intrinschem und zellulärem ROS - Harmonisierung der unterschiedlichen Methoden - Vereinfachung der Nanomaterialtestung + OXIDATIVER STRESS EVALUIERUNG AP 4 ROS / Effekte als Datengrundlage zwecks Gruppierung von NM hinsichtlich Stufe 3 Risikopotential Stufe 1 Stufe 2 Antioxidantien Entzündung Zytotoxizität Sichere NM Modelierung (Risikovorhersage) AP 6 Gefährliche NM nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 4

5 Materialien und Charakterisierung Material Name / Lieferant Ø in nm (REM o. BET*) TiO 2 NM100 / JRC TiO 2 NM101 / JRC 6 TiO 2 NM103 / JRC 20 TiO 2 NM104 / JRC 20 Zn NM110 / JRC 42 CeO 2 NM212 /JRC 10 Al 2 O 3 Sigma Aldrich 13 Ag Skyspring Nanomaterial Skyspring Nanomaterial 100 Ag Au Nanamor BaSO 4 Solvay Cu Sigma Aldrich Fe(III) 2 O 3 Sigma Aldrich < 50 Ni Sigma Aldrich < 100 C Printex C Lampblack * Durchmesser aus BET errechnet Abb. 1 Schema zur Dispersionsherstellung Ultraschallbehandlung 200 W, 10 Min., Puls 2/8 Konzentration 1 mg/ml in dh 2 O, RPMI (+ HEPES + GlutaMax) und DMEM (+ HEPES) Medium nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 5

6 Materialien und Charakterisierung Charakterisierungsparameter Größe und Oberfläche: Dynamische Lichtstreuung, Rasterelektronenmikroskop, H-Kernspin (NMR), BET (Herstellerangaben und Eigenmessungen), Spraycharakterisierung (Nebulizer) Form (REM), ph Wert (ph Sonde), Zetapotential (Zetasizer), Redoxpotential (Redox-Kathode), Löslichkeit an ausgewählten Metallen (nach 72 h ICP-OES bzw. ICP-MS) ROS Bildungspotential: Elektronenspinresonanz (DMPO und CPH Ansatz), Fluoreszensspektroskopie (DCFH Methode), Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC / Antioxidantien Ansatz) in: deionisiertem Wasser (dh 2 O) Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) + HEPES RPMI 1640 Medium + HEPES und GlutaMax nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 6

7 Charakterisierung - Bsp. ROS intrinsisch Intrinsisches Oxidantien / ROS Bildungspotential H 2 O O 2 H 2 O 2 e- O 2 - Fe, Zn, Cu OH Elektronenspinresonanz Spektroskopie (ESR) (DMPO) (CPH) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) Antioxidantien in synthetischer Lungenflüssigkeit (Ascorbin-, Harnsäure, Glutathion) Fluoreszenzspektroskopie Dithiothreitol (DTT) und/oder Dichlorofluorescin (DCFH) nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 7

8 Charakterisierung - ESR ESR Ergebnisse - Hydroxylradikal (OH ) Bildung (nach Standardarbeitsanweisung, SAA) H 2 O 2 DMPO OH DMPO-OH (5,5-dimethyl-1-pyrrolidin-N-oxid) OH Bildung Tabelle 1: Beispiel dh 2 O und RPMI Medium Verhältnis zum Blindwert dh 2 O RPMI n ratio to blank ratio to blank NM NM NM NM NM NM Ag Ag Al2O Au BaSO Cu Fe2O Ni P in Bearbeitung LB in Bearbeitung Kontrolle nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 8

9 Charakterisierung - DTT Dithiothreitol Verbrauch reduziert DTT oxidiert DTT + + H + + O 2 2O 2 - NM Suspension mit und ohne DTT 30 Min. bei 37 C Zentrifugation R-SH + DTNB TNB Absorption von TNB bei 405 nm Überstand (DTT) + DTNB Absorption 405 nm nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 9

10 Nicht oxidiertes DTT (µm) Nicht oxidiertes DTT (µm) Charakterisierung - DTT Konzentration (µg/ml) Lamp black Fe 2 O 3 Au ZnO Ag 100 nm Ag nm Cu Printex90 TiO 2 NM 100 TiO 2 NM 101 TiO 2 NM 103 TiO 2 NM CeO 2 BaSO Konzentration (µg/ml) Al 2 O 3 nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 10

11 Charakterisierung - HPLC Synthetische Lungenflüssigkeit 200 µm Ascorbinsäure 200 µm Harnsäure 200 µm Glutathion ph 7.4, in 0.9% NaCl Antioxidantien Abreicherung c c 4 h Inkubation bei 37 o C 0.22 µm Zellulosefilter Nanopartikel Suspension 50 µl Quantifizierung mittels HPLC nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 11

12 GSH in µm GSSG ( M) Harnsäure in µm GSH ( M) Ascorbinsäure in µm Charakterisierung - HPLC Ascorbinsäure Glutathion MixGSH-PDA p90 cu Harnsäure 50 0 Printex 90 Cu MixGSSG-PDA p90 cu GSSG Glutathion (GSH) Glutathion Printex 90 Cu Glutathion dissulfid (GSSG) 4 µg/ml 8 µg/ml 16 µg/ml 32 µg/ml 64 µg/ml 128 µg/ml 256 µg/ml nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 12

13 Charakterisierung - Übersicht (vorläufig) Beispiel spez. Oberfläche (m 2 g 1 ) NM in dh 2 O spez. spez. Oberfl. spez. Oberfl. spez. Oberfl. spez. Oberfl. Oberfl. nach berechn. aus berrechn. aus Hydrodyn. spez. Oberfl. nach NMR nach BET BET mittl. Größe Primärpartikelgröße Ø via DLS berrechn. aus (IUTA) (IUTA) (Hersteller) (Hersteller) (Hersteller) (IUTA) DLS (IUTA) Ag Nm n. v Ag100 4 Nm n. v Au 13 Nm n. v Al2O P LB BaSO NM NM NM NM NM NM Nm Ni nicht messbar Nm n. v nicht messbar nicht messbar Cu nicht messbar Nm n. v Fe2O3 nicht messbar Nm n. v n. v. = nicht vorhanden, Nm = Nachmessung notwendig nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 13

14 Toxikologische Untersuchungen - Übersicht Methode Zelluläre Oxidantien-bildung via DCFH Assay Zellen Zelluläre Oxidantien-bildung via ESR (DMPO, teilweise CPH) DNA Schädigung via Comet Assay, H2AX (Immunohistochemie) Glutathion (GSH) Konzentration Zytotoxizität via WST-1 NR8383 Alveolarmakrophagen der Ratte A549 humane Alveolarepithelzellen NCI-H292 humane Lungenepithelzellen THP-1 humane Makrophage Genexpression induziert durch oxidativen Stress nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 14

15 Zytotoxizität Zellen 48 h, 70 % Konfluenz WST-1(wasserlösliches Tetrazoliumsalz) Zellviabilität 2x Belastung 24 h 100 µl Zellmedium Inkubation mit WST-1 2x 100 µl 0.5% Triton X-100 NR8383 Alveolarmakrophagen der Ratte A549 humane Alveolarepithelzellen NCI-H292 humane Lungenepithelzellen THP-1 ausdifferenziert (PMA) zu Makrophagen Absorption (nach Vietti et al. 2013, leicht geändert) nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 15

16 Mitochondriale Aktivität (relativ zur Kontrolle in %) Mitochondriale Aktivität (relativ zur Kontrolle in %) Zytotoxizität - Ergebnis NCI-H µg/cm µg/cm µg/cm µg/cm 2 5 µg/cm 2 10 µg/cm 2 20 µg/cm 2 40 µg/cm THP µg/cm µg/cm µg/cm 2 5 µg/cm 2 10 µg/cm 2 20 µg/cm 2 40 µg/cm 2 nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 16

17 Zytotoxizität - Ergebnis Dosis-Response Probit Analysis LC 50 (µg/cm 2 ) Nanopartikel A549 Zellen NR8383 Zellen TiO 2 / NM TiO 2 / NM101 >1000 >1000 TiO 2 / NM TiO 2 / NM >1000 Zn / NM CeO 2 / NM Al 2 O 3 >1000 >1000 BaSO 4 >1000 >1000 Ag nm >1000 Ag 100 nm >1000 Au >1000 >1000 Cu Fe(III) 2 O Ni Lamp Black 101 > Printex 90 > NR8383: Zellen pro Well = 0,32 cm 2 A549: Zellen pro Well = 0,32 cm 2 Getestete Konzentrationen: 1, 2, 5 10, 20, 40 und 80 µg/cm 2 Toxizität Hoch Moderat Keine / Gering nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 17

18 Toxizität - weitere Ergebnisse (vorl.) DCF Assay z.b. starke Fluoreszenz (ROS Bildung) für Printex 90, LB101 und beide Silberpartikel sowie moderate für die Metalle und teilweise auch TiO 2 ESR mit DMPO (NR8383) TiO 2 keine Effekte aber z.b. Ni und Cu Stufen der oxidativer Stressresponse: Nrf2 Signalweg (Tier 1): Induktion der mrna-expression von Gamma Glutamylcystein Synthetase ( -GCS) und Hemeoxygenase-1 (HO-1) z. B. durch CuO und ZnO (NM110) NF- B Signalweg (Tier 2): Induktion der mrna-expression von z. B. inducible Nitric Oxide Synthase (inos) durch ZnO, CuO und CeO 2 bei höheren Konzentrationen und Ausschüttung der Zytokine IL-8 und TNFα z.b. für Carbon Black (Printex90), ZnO (NM110) und CuO nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 18

19 Laufende Arbeiten Abschließende Grundcharakterisierung toxikologische Untersuchungen: - Oxidatives Potential (ESR) - Weitere Untersuchungen verschiedener oxidativer Stressmarker (z.b. Glutathion, Dihydroethidium, Monobromobiman) - Lipidperoxidation (Bodipy 665/667) - mrna/proteinexpressionanalysen - DNA Schädigung (Comet Assay und H2AX ) - Apoptose - JC-1 (Mitochondriale Membran), Vybrant FAM (Caspase) - Kalziumlevel - Fura-2 - Untersuchung der Bedeutung des Nrf2 Signalwegs (sirna, primären Knochenmarksmakrophagen aus Wildtyp- und Nrf2-knockout-Mäusen) Datenanalyse Gruppierung z.b. über Rang-, Korrelations-, Cluster- und Regressionsanalyse nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 19

20 Danke! Institut für Energie- und Umwelttechnik e. V., Duisburg, Deutschland Leibniz-Institut für Umweltmedizinische Forschung, Düsseldorf, Deutschland Universität Paris Diderot Paris, Frankreich nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 20