Dünnschichtchromatographie

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1 Dünnschichtchromatographie Teil der Vorlesung: Chromatographische Methoden in der Organischen Chemie Die Lernunterlagen können auch von dieser Adresse heruntergeladen werden: Allgemeines Vorläufer der DC : Geschichte der DC Kapillarbilder (= Zirkularchromatogramme) von Farbstoffen (Runge, 1822) 2 1

2 Name für CHROMATOGRAPHIE M. S. TSWETT (Russ. Botaniker, 1903) - Auftrennung von Pflanzenfarbstoffen (Carotinoide, Chlorophylle) an Calciumcarbonatsäulen chromatos = Farbe 3 graphein = schreiben Rückblende: Grundpraktikum Säulenchromatographie von Pflanzenfarbstoffen: Auftrennung und DC-Untersuchung von Spinat 4 2

3 Entwicklung der DC Kuhn et al. (1931): Adsorptionschromatographie als Analysenmethode (Trennung von Carotinoiden) Izmailov, Schraiber: Ringchromatogramme auf Al 2 O 3 als Analysenmethode in der Pharmazie 5 Entwicklung der DC Martin, Synge (1944, Nobelpreis 1952): Verteilungschromatographie (Papierchromatographie) von Aminosäuren Stahl (1958): Durchbruch der DC, Namensgebung (engl.: TLC) 6 Halpaap, Ripphahn (1975): High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC). 3

4 Anwendung der DC - WANN schwerflüchtige Substanzen polare und unpolare Substanzen kostengünstige Bearbeitung großer Probenanzahl in kurzer Zeit wenn Probenmaterial GC- und LC-Säulen beschädigen würde 7 Anwendung der DC - WANN wenn Detektion mit GC und LC nicht möglich oder sehr aufwendig sein würde wenn auch nach der Chromatographie alle Probenbestandteile erkennbar sein müssen (z.b. an Start oder Front) wenn getrennte Bestandteile einzeln nachgewiesen oder detektiert werden müssen (z. B. Drogenscreening) 8 wenn keine elektrische Energie vorhanden ist 4

5 Anwendung der DC - WO Pharmazie und Drogenkunde klinische, forensische und Biochemie Kosmetologie (Farbstoffe, Konservierungs-, Parfüminhaltsstoffe, Tenside) Analytik (Lebensmittel-, Umwelt-A.) Prozess- und Reinheitskontrolle im organischen Syntheselabor 9 Methoden und Anwendungsformen Analytische Methoden: qualitative bzw. quantitative Identifizierung mit DC (oder Papierchromatographie = PC) Präparative Methode: Präparative Schicht- Chromatographie (PSC): Isolierung der Einzelkomponenten durch Extraktion aus Schicht 10 Vorteile der DC: rein physikalische Methode - kein Abbau, Verlust, Umwandlung - Rückgewinnung des Analysengutes nach DC 5

6 Literatur Dünnschichtchromatographie (E. Hahn- Deinstrop), Wiley-VCH 1998 Qualitative und Quantitative Dünnschichtchromatographie (H. P. Frey, K. Zieloff) Wiley- VCH Dünnschichtchromatographie (H. Jork, W. Funk, W. Fischer, H. Wimmer) Wiley-VCH 1993 Literatur Chromatographie (J. Becker), Vogel- Buchverlag, Würzburg, 1997 (auch für die anderen Teile der Chromatographievorlesung geeignet). Chromatographische Trennmethoden (G. Schwedt) Thieme

7 2. Trennprinzipien Allgemeine Begriffe Mobile Phase (= Lösung eines Substanzgemisches in Lösungsmittel/Gemisch) 13 strömt über stationäre Phase (= oberflächenreicher Feststoff oder stationäres Lösungsmittel) + Substanzgemisch. Ursache der Trennung Substanzen haben unterschiedliche Affinität zur mobilen/stationären Phase Resultat: unterschiedliche Laufstrecken = Auftrennung in Einzelkomponenten 14 7

8 Konzentration Zusammenhang zwischen Stoffmengenkonzentration in der stationären Phase (c s ) und der mobilen Phase (c s ): c s /c m = K (gilt nur für geringe Stoffmengen) 15 Je größer K, desto größer ist Affinität zur stationären Phase = langsamere Laufgeschwindigkeit Konzentration Bei der Sättigungskonzentration der stationären Phase: Gerade knickt ab Laufstrecke ändert sich! 16 8

9 Trennprinzip ADSORPTION Adsorption an der Oberfläche der stationären Phase: diese besteht aus feingepulverten polaren Materialien, z. B. aus Kieselgel Aluminiumoxid 17 Wirkungsweise der Adsorption durch polare Adsorbenzien werden Adsorbate (= Trenngut) umso stärker zurückgehalten, je polarer sie sind 18 9

10 Einfluss von Laufmittel und Trenngut auf die Laufstrecke und Trennung Desaktivierung der stationären Phase: - durch Wasser - oder stark polare organische Lösungsmittel 19 Reihenfolge von Trenngut und Laufmittel 20 Geordnet nach steigender Polarität: unpolar polar Alkane < Aromaten < Halogen < O-Alkyl < NO 2 < NR 2 < COOR < CR=O < NH 2 < OH 10

11 Trennprinzip VERTEILUNG Verteilung zwischen 2 nicht-mischbaren Flüssigkeiten. Eine davon auf Träger fixiert (= stationäre Phase) 21 Verteilung - stationäre Phase Träger für Flüssigkeit, die stationäre Phase bildet: Filterpapier Cellulosepulver Dextran-Gel Polyamid 22 11

12 Beschreibung des Laufverhaltens Zur Beschreibung des Laufverhaltens der aufgetrennten Substanzen dient der R f -Wert - retarding factor - relate to front 23 Bestimmung des R f -Werts a... Laufstrecke des Laufmittels b... Laufstrecke der Substanz - bis zum Mittelpunkt des Substanzflecks b R f = a 24 bei unregelmäßigen Flecken: Angabe von R f -Bereichen 12

13 Aussagekraft von R f -Werten Brauchbare R f -Werte liegen zwischen 0.2 und 0.8 (Frontläufer und Sitzenbleiber sind unbrauchbar) R f -Werte sind in der DC nur Richtwerte 25 Daher: Immer mit Standard vergleichen Einflüsse auf Laufverhalten R f -Werte sind z. B. auch von der Konzentration abhängig 26 Immer vergleichbare Konzentration vergleichen 13

14 Trennqualität Trennleistung = Zonenverbreiterung eines Substanzfleckes entlang der Trennstrecke Selektivität = R f -Wert- Unterschied für die aufgetrennten Substanzen 27 Auflösung beide Einflüsse für die praktische Anwendung entscheidend : Trennleistung + Selektivität = Auflösung Streudiffusion + Molekulardiffusion + Ad/Desorption bewirken breitere, unscharfe Flecken. 28 Quantitative Beziehung: Van-Deemter-Gleichung = Zusammenhang zwischen Trennstufenhöhe und Zonenverbreiterung 14

15 Empirische Einflussgrößen für die Trennung 1. Stationäre Phase: Aktivität, Korngröße, Korngrößenverteilung, Bindemittel, Mobile Phase: Laufmittelgradient, Verunreinigungen, Kammer: Kammertyp, Konditionierung, Sättigung, Weitere Einflussgrößen: Fleckengröße, Abstand Start-Laufmittel, Trennstrecke, Temperatur, Luftfeuchtigkeit, Die stationäre Phase DC als Routinemethode (= gleichbleibende Qualität in Art und Aktivität): Kommerzielle Sorbenzien Polare (hydrophile) Phasen: straight / normal phases Unpolare (hydrophobe) Phasen: Umkehrphasen, reversed phases (RP) mittelpolare Phasen: modifizierte Sorbenzien 30 15

16 Chemische Zusammensetzung und Struktur CHEMISCHE Struktur beeinflusst SELEKTIVITÄT Sorbenzien mit praktischer Bedeutung Kieselgel, modifizierte Kieselgele Aluminiumoxid Polyamid Cellulose, modifizierte Cellulose 31 Kieselgel 32 für 90% aller Trennungen meist Kieselgel 60 (60 = mittlerer Porendurchmesser in Angström) Kieselgel = vermahlte, ausgefällte Kieselsäure, amorphes Pulver mehrere SiOH-Gruppen pro nm 2 an der Oberfläche. Bildet mit Trennsubstanzen H-Brücken reagiert schwach sauer. 16

17 Modifiziertes Kieselgel Durch Reaktion mit Silanen hydrophob gemachtes Kieselgel (RP): NH 2 -, Diol, -CN, Cl-Gruppen Chirale Kieselgele durch Reaktion mit optisch aktiven Verbindungen 33 PROBLEME mit Kieselgel: Isomerisierung, Kondensation von Aceton Käufliche Fertigschichten (am Beispiel von Kieselgel-Platten) 34 17

18 Aluminiumoxid Aluminiumoxid für DC = ähnliches Material wie für Säulenchromatographie: neutral - basisch - sauer Aktivitätsstufen I - V: durch Belegen (= Desaktivieren) der aktivsten Stellen mit Wasser (0-18%) PROBLEME: Verseifung von Estern, Autoxidation von Fettsäuren, Wanderung von C=C-Doppelbindungen, Kondensation von Aceton, Isomerisierungen 35 Polyamid Verteilungschromatographie Bindung von Lösungsmittelanteilen an Polyamid durch polare Wechselwirkungen (H-Brücken) 36 18

19 Cellulose Ähnlich wie Papierchromatographie: Verteilungschromatographie 37 Typische Anwendungsbeispiele: Aminosäuren, Kohlenhydrate Acetylierte Cellulose (RP): für polycyclische Aromaten, Chinone, Carbonsäuren Cellulose-Ionenaustauscher für Peptide, Enzyme, Nucleotide, Nucleoside Vergleich Cellulose - Papierchromatographie Vorteile der Cellulose-DC: DC viel schneller bessere Trennung auch mit agressiven Lösungsmitteln besprühbar Vorteile der Papierchromatographie : bessere Archivierung große Papierauswahl 38 19

20 Korn- und Porencharakteristik GEOMETRISCHE Struktur beeinflusst TRENNLEISTUNG Kleiner Partikeldurchmesser + enge Korngrößenverteilung = gute Trennleistung 39 Oberfläche (~500 m 2 pro Gramm) + Porenvolumen (6 nm) = Adsorptionskraft Partikelform Kornstruktur von Standardmaterial: gebrochenes Material (durch Verreiben) 40 Neue Entwicklung: HPTLC-LiChrospher (sphärische Partikel) - deutlich gesteigerte Trennleistung 20

21 Schichteigenschaften Schichtdicke: HPTLC: µm DC: 250 µm - 1 mm PSC: bis zu 2 mm Konzentrierungszonen - kleinere Flecken Plattenmaterial: meist ALUMINIUM (platzsparend, Größe zuschneidbar) weiters: Größen: meist 20x20 cm GLAS (säurestabil) KUNSTSTOFF 41 Binder: meist Gips, auch organische Polymere Schichtzusätze 42 Fluoreszenzindikatoren: zur Detektion mittels Fluoreszenzlöschung - manganaktiviertes Zinksilikat = GRÜNE FLUORESZENZ - säurestabile Wolframate = BLAUE FLUORESZENZ Imprägnierungen: Zur schnellen Detektion (z. B. Coffein für polycyclische Aromaten) 21

22 4. Die mobile Phase Grund für Strömen des Fließmittels Durch Kapillardruck strömt Fließmittel von ebener Oberfläche im Vorratsgefäß in kapillare Hohlräume = kleinerer Krümmungsradius = Verringerung der Oberfläche. 43 Wahl des Laufmittels Laufmittel hat entscheidenden Einfluss auf Trennung. Je polarer Laufmittel ist desto stärker wird Laufmittel vom Sorbens adsorbiert 44 desto größer ist Elutionskraft = großer R f -Wert der Substanz 22

23 Wirkung des Laufmittels Konkurrent um aktive Adsorptionsstellen Solvatisierung von Substanzen = Lösung im Laufmittel 45 Zusammensetzung Laufmittel - mobile Phase Achtung: Zusammensetzung des Laufmittels muss nicht mit der tatsächlichen mobilen Phase identisch sein: auch Laufmittel wird chromatographiert (β-fronten) - Verdunstungseffekte (Verarmung des niedrigsiedenden Anteils) 46 23

24 Eluotrope Reihe für die Adsorptionschromatographie Empirische Ordnung der Laufmittel nach steigender Elutionskraft (gilt nur für Kieselgel und Aluminiumoxid) Eluotrope Reihe enspricht ca. den Dielektrizitätskonstanten 47 Eluotrope Reihe Cyclohexan Tetrachlormethan Toluen Chloroform Dichlormethan Acetonitril 2-Propanol Essigester Aceton Ethanol Dioxan THF Methanol Pyridin Wasser unpolar mittelpolar stark polar 48 24

25 Laufmittel für Reversed Phases 49 Umkehrung der eluotropen Reihe Wasser Ethanol Aceton Essigester 2-Propanol Cyclohexan schwach mittel stark Laufmittel für die Verteilungschromatographie Laufmittelsystem: Zusammenstellung nach der mixotropen Reihe = eluotrope Reihe + Mischbarkeit untereinander

26 Laufmittelzusammensetzung Laufmittelgemisch enthält: - unpolaren organischen Anteil - polaren Anteil (meist Wasser, oder Glykol,DMF) Polarer Anteil wird am Träger (Papier, Cellulose, Polyamid) festgehalten = Stationäre Phase Rest = Mobile Phase (wird lipophiler!) Dadurch Auftrennung stark polarer Verbindungen Kammersättigung Ohne Kammersättigung: Teil des Laufmittels verdampft in Frontnähe mehr LM notwendig R f -Werte steigen gut für Substanzen mit niedrigem Rf-Wert

27 Kammersättigung Mit Kammersättigung: R f -Werte linear... gut für große R f - Werte Laufmitteleinfluss auf Trennproblem 54 n-hexan Toluen Toluen/ Chloroform Aceton Chloroform 27

28 Ermittlung geeigneter Trennbedingungen Wechselwirkung der folgenden Faktoren Untersuchungsgut Trennprinzip stationäre Phase mobile Phase Hydrophil Adsorption inaktiv (-/RP) polar (-/RP) hydrophil Verteilung hydrophil (+) unpolar (+) lipophil Adsorption aktiv (+) unpolar (+) lipophil Verteilung lipophil (-/RP) polar (-/RP) 55 Laufmittelauswahl Schwierige Frage - bei komplizierten Problemen vor Beginn eigener Versuche Literaturrecherche Toxische Komponenten (z.b. Benzen) durch Analoga aus eluotroper Reihe ersetzen (z.b. Toluen)

29 Spot-Test zur Laufmittelwahl Hexan Tetrachlormethan Toluen Auftragen des Trennguts als kleinen Fleck Laufmittel verdunsten lassen Kapillare in der Mitte des Substanzflecks aufsetzen 57 Aceton zirkulares Chromatogramm Standard-Laufmittel Für Kieselgel/Aluminiumoxid (Adsorption) Unpolare Substanzen: Aceton-Toluen (1:10) mittelpolare Substanzen: Aceton-Toluen (1:3) oder Chloroform-Aceton (7:3) 58 stark polare Substanzen: Methanol - Chloroform (1:9) 29

30 Standard-Laufmittel Für Cellulose oder Papierchrom. (Verteilung) Saure Substanzen: n-butanol - Aceton - Eisessig - Wasser (3:3:7:2) Basische Substanzen: 2-Propanol - Ammoniak - Wasser (6:3:1) 59 Merkregel: Säuren in sauren Laufmitteln trennen Basen in basischen Laufmitteln trennen (Similia similibus solvuntur) 7. Praktische Hinweise zur Durchführung Handhabung der Fertigschichten Träger: meist Aluminiumfolie (Kunststoff und Glas wenig verbreitet). Zuschneiden: mit Schere oder Schneidemaschine - Kanten versäubern... Sonst schiefe Chromatogramm-Bahnen! 60 30

31 Praktische Hinweise zur Durchführung Plattenmaterial nur mit Fingerspitzen am Rand berühren Aktivieren: meist nicht notwendig. Wenn, dann max. 30 min bei 120 C 61 Probenvorbereitung Kein besonderes Thema Wichtig: Probe darf in der Adsorptionschromatographie nicht wasser-feucht sein. Auflösen: Lösungsmittel muss Probe vollständig lösen, ungiftig, nicht zu polar, nicht zu hoch siedend

32 Auswahl des Lösungsmittels Polarität des Lösungsmittels = entscheidend für Startzone: Polare Lösungsmittel erzeugen am Start Ringchromatogramme 63 Standard-Lösungsmittel: Adsorption: meist Aceton Verteilung: Wasser, Ethanol Auftragen der Probe Wichtig: Vergleichssubstanzen und Probe immer am SELBEN Chromatogramm auftragen Punkt- oder bandförmig (PSC), nicht zu konzentriert sonst Schwanzbildung durch gekrümmte Adsorptionsisothermen Übersättigung der Schicht 64 32

33 Sorptionsprobleme 65 Analytische Chromatogramme Zuschneiden der Plattengröße entsprechend der Probenzahl (mindestens 2) und der Gefäßgröße Übliche Größe meist ca. 2-4 cm x 6-10 cm ausreichend für ca. 5 Proben 66 33

34 Vorbereitung des Chromatogramms Startpunkte mit weichem Bleistift markieren: KEINE durchgehende Linie 67 Nicht zu dicht am unteren Plattenrand (ca. 1 cm Abstand) sonst Eintauchen der Startpunkte im Laufmittel Beschriftung nur oberhalb der Front Präparative Trennungen 68 Meist auf Glasplatten (20x20 cm) mit ca. 2 mm Schichtdicke. Substanzmenge: pro Platte bis ca. 200 mg Trennung möglich Startlinie wird mit Auftragegerät aufgetragen: Abstand 2-3 cm von der Unterkante. Alternativ kann auch mit Lineal und Pipette Startlinie aufgetragen werden. Achtung: auf genügend Laufmittelvorrat achten - sonst läuft Platte trocken. 34

35 Auftragemethoden qualitative DC mit Kapillaren oder Spritzen manuell auftragen - Volumen nicht genau messbar! 69 Auftragemethoden Füllen der Kapillaren: selbsttätig durch Eintauchen

36 Auftragen Auftragemethoden für qualitative DC s 71 Kapillaren aufsetzen - Entleerung durch Kontakt mit Sorbensoberfläche... Schicht nicht beschädigen! Konzentration möglichst so wählen, dass einmaliges Auftragen reicht. Startzonen vor dem nächsten Auftragen trocknen. Auftragen Auftragemethoden für qualitative DC s Für HPTLC Automatische Auftragung strichförmig oder als Rechtecke Bei Kontaktauftragung (Kapillaren) ist die Trennung stark vom Lösungsmittel abhängig 72 36

37 Auftragemethoden Vor dem Entwickeln Startflecken vollständig trocknen sonst wird auch Lösungsmittel chromatographiert Achtung bei hochsiedenden Lösungsmitteln (z.b. DMF): nicht beim Trocknen durch Überhitzung Probesubstanz zersetzen! 73 Auftragen für quantitative DC s Für quantitative Untersuchungen : Mikrokapillaren oder Auftragepipetten mit definiertem Volumen. DC: µl HPTLC: µl 74 Auftragen mit Auftragegeräten 37

38 Positionierung der Proben Bei quantitativen DC`s: doppelt auftragen (um eine Plattenhälfte versetzt). 75 Positionierung der Proben Bei Identitätsproblemen: Überlappende Auftragung Dadurch besserer Vergleich als durch nebeneinanderliegende Probenflecken 76 38

39 8. Entwickeln Aufgabe des Laufmittels Lösen des Substanzgemisches Transport der Trennsubstanzen über die Sorbensschicht R f -Werte im mittleren Bereich halten Selektivität für das anstehende Trennproblem 77 Anforderung an das Laufmittel Ausreichende Reinheit Ausreichende Stabilität geringe Viskosität lineare Adsorptions/Verteilungsisotherme (Konzentration!) mittlerer Dampfdruck geringe Toxizität 78 39

40 Reinheit des Fließmittels Für qualitative Untersuchungen: übliche Reinheit ausreichend (purum... p.a.) Für quantitative Untersuchungen: hochgereinigte Lösungsmittel für die Chromatographie 79 Achtung: manchen Lösungsmitteln sind Stabilisatoren zugesetzt (Chloroform enthält z. B. Ethanol) Begriff der MOBILEN PHASE Laufmittelgemisch: Auftrennung in flüssige stationäre Phase durch Wanderung in die Poren des Sorbens - a) Verteilungschrom.: Verarmung an Wasser - b) Adsorptionschromatographie: Verarmung an polaren Laufmittelbestandteilen Rest: MOBILE PHASE 80 unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten der Bestandteile: Bildung von β- und γ-fronten 40

41 Auswahl der Laufmittel nach der eluotropen Reihe (gilt nur für Kieselgel!) bei eigenen Versuchen mit mittlerer Elutionskraft und reinen Lösungsmitteln beginnen - dann erst Gemische 81 Möglichst niedrige Viskosität Toxizität beachten Selektivität: β-fronten beachten -diese täuschen falsche R f -Werte vor oder vermindern die Selektivität Ansetzen der Laufmittel Kritische Laufmittel beachten: Säuren, Alkohole, Ester Bedenkliche Laufmittel vermeiden (z. B. Benzen, Ether, CKW...) 82 Einzelkomponenten getrennt abmessen (sonst Fehler durch Volumsänderung) dann gut vermischen (im Vorratsbehälter, nicht in der DC-Kammer) 41

42 Aufbewahren der Laufmittel Vorrat gut verschließen, nicht zu lange aufbewahren Laufmittel nicht wiederverwenden: ungleiche Verdunstung, chem. Reaktion der Komponenten, bevorzugte Adsorption einer Komponente = Verarmung an Laufmittelanteilen 83 Jede DC-Platte hat das Recht auf ein frisches Laufmittel Aufsteigende Entwicklung (= gebräuchlichste Technik, klassisch ) - DC-Platte so in Kammer stellen, dass DC- Schicht nur unterhalb der Startpunkte benetzt wird - Durch Kapillarkräfte steigt Laufmittel max. 20 cm hoch = Transport des Trenngutes 84 - Deckel muss geschlossen sein 42

43 Aufsteigende Entwicklung 85 Startflecken vergrößern sich zur Front hin. Wenn Front erreicht ist, Platte aus DC-Kammer nehmen und Laufmittelfront markieren (Bleistift, einritzen) - Platte gut trocknen. Mehrfachentwicklung Zwischentrocknung Rekonzentrierung dann erneute Entwicklung (verschiedene Laufmittel, z.b. unpolare Verunreinigungen an die Front befördern, dann Auftrennung des eigentlichen Substanzgemisches 86 43

44 Durchlaufentwicklung DC-Kammer mit einem Schlitz im Deckel. Während der Entwicklung verdampft Lösungsmittel an der Front bessere Auflösung für kleine R f -Werte, (große R f -Werte zusammengestaucht) 87 Horizontale Entwicklung Kammer mit eben liegender Platte (1), Laufmittel wird seitlich zugeführt (4). Verwendung: meist für HPTLC 88 44

45 9. DC-Trennkammern Gesättigte Normalkammer für 2 DC-Platten 20x20 cm. Zur Kammersättigung mit Filterpapier auskleiden - Sichtfenster freilassen. 1 cm mit Laufmittel füllen. 89 Gut für große R f -Werte Nichtgesättigte Normalkammer Verdunstung an der Front mehr Lösungsmitteldurchsatz mehr Trennstufen kleinere R f -Werte werden auseinandergezogen bessere Trennung im unteren Bereich (Zusammenlaufen der großen R f -Werte)

46 Durchführung der Entwicklung Temperaturkonstanz beachten Lichtschutz, Trennkammer waagrecht stellen, NICHT bewegen Deckel während der Entwicklung nicht öffnen. Beschriftung Eindimensionale Entwicklung 91 Häufigste Entwicklungsart - besonders bei quantitativen DC s Mehrdimensionale Entwicklung Für schwer trennbare Gemische mit vielen Komponenten Wenn bei der Entwicklung Reaktionen auftreten 92 46

47 10. Trocknen Entfernung des Laufmittels von der Schicht: sonst Verschlechterung des Chromatogramms durch nachträgliche Diffusion nachfolgende Detektion wird beeinträchtigt waagrecht trocknen 93 Bei empfindlichen Substanzen mit kaltem Fön sonst mit warmem Fön (nicht heiß - Thermolyse) Entsorgen des Laufmittels In die entsprechenden Behälter (halogenierte bzw. sonstige organische Lösungsmittel) entsorgen DC-Kammern mit Aceton gut reinigen (sonst ev. Verschmutzung des Laufmittels beim nächsten DC = Artefakte) 94 und gut trocknen (sonst Veränderung des Laufmittels). 47

48 11. Detektion Visuelle Detektion - Tageslicht Detektion bei Tageslicht nur bei färbigen Substanzen 95 Visuelle Detektion - Fluoreszenzlöschung DC-Folien fluoreszieren hellgrün oder hellblau (Fluoreszenzindikatoren F254). UV-aktive Strukturelemente (Aromaten, konjugierte C=C-Doppelbindungen...) löschen Emission (quenchen) 96 dunkle Flecken auf hellfluoreszierendem Hintergrund (Achtung - kurzwelliges UV-Licht, 254 nm) Intensität proportional der Konzentration 48

49 Visuelle Detektion im UV-Licht (365 nm) Detektion bei UV 365 nm: Dunkler Hintergrund, angeregte Substanzen zeigen Eigenfluoreszenz. Gut zum qualitativen Nachweis fluoreszierender Substanzen 97 Intensität nicht proportional der Konzentration! Derivatisierung WANN: wenn Substanzen nicht färbig oder UV-aktiv sind Steigerung der Selektivität Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit Häufigster Fall: Postchromatographische Derivatisierung (nach Entwickeln und Trocknen) 98 49

50 Derivatisierung - Buchhinweise Dünnschichtchromatographie - Reagenzien und Nachweismethoden (H. Jork, W. Funk, W. Fischer) Wiley - VCH 1993 Anfärbereagenzien für Dünnschicht- und Papierchromatographie (Reagenzien - Merck, Darmstadt, 1980). 99 Derivatisierungsreaktionen Thermo- oder Photochemische Reaktion Zersetzung, Reaktion mit modifizierten Kieselgelschichten Aufsprühen von Nachweisreagenzien (häufigste Technik) Tauchen von DC-Platten (umweltfreundlicher, billiger) Bedampfen von DC-Platten - Reaktion mit Iod, Chlor,

51 Derivatisierung durch Aufsprühen Besprühen mit Laborsprüher Homogenes Benebeln mit gleichmäßigem Sprühnebel Sprühen, bis Schicht leicht glänzt - NICHT zuviel! Eventuell nach dem Sprühen erwärmen 101 Derivatisierung durch Aufsprühen 102 In einer Sprühbox (= giftiger, agressiver Reagenznebel, Lösungsmitteldämpfe). Handschuhe und Schutzbrillen tragen Nur frische Reagenzien verwenden. Unter die Platte saugfähiges Papier geben (erleichtert die Reinigung). Flecken am DC sofort mit weichem Bleistift markieren. 51

52 Derivatisierung durch Tauchen Vorteile gegenüber Sprühen: gleichmäßigere Belegung der Schicht keine Abhängigkeit vom Sprühgerät exakte quantitative Auswertung bessere Reproduzierbarkeit keine Kontamination des Arbeitsplatzes keine Sprüheinrichtung mit Abzug notwendig 103 Derivatisierung durch Tauchen Manuelles Tauchen: nicht gut reproduzierbar, aber einfach (personengebundene Angaben; schnelles/zügiges/vorsichtiges Tauchen); meist ca. 1-5 sek eintauchen. Automatische Tauchgeräte: mit definierter Verweilzeit, Senken und Heben = reproduzierbar

53 Tipps zum Tauchen Tauchlösungen weniger konzentriert wie Sprühlösungen Wasser meist durch Alkohol ersetzt Trennsubstanzen und Reaktionsprodukte nicht im Tauchmittel löslich 105 Tauchzeiten ca. 3 sek, dann Platte mit Luft abblasen (15 min) und Rückseite reinigen Tipps zum Tauchen große Substanzmenge (Konzentration) lange Tauchzeiten Kometenschweif (hier ist oft Sprühen (B) besser)

54 Derivatisierungsreagenzien - Ninhydrin Ninhydrin - Nachweis von Aminosäuren, Aminen, 0.2% Ninhydrin in Ethanol oder Butanol; Besprühen oder Tauchen, dann auf ca. 110 C erwärmen... Gelbe, braune, blaue und violette Flecken. 107 Derivatisierungsreagenzien V/S 108 Vanillin - Schwefelsäure für höhere Alkohole, Steroide, etherische Öle...: 0.5-1% Vanillin in konz. Schwefelsäure oder in EtOH-konz.H 2 SO 4 (1:4-1:10); Besprühen oder Tauchen, dann auf ca. 120 C erhitzen. 54

55 Derivatisierungsreagenzien - Beispiele Ammonmolybdat-Cersulfat für höhere Alkohole, Steroide,... Ammonmolybdat (4%)-Cer(IV)sulfat (10%) in Schwefelsäure (10%); Sprühen oder Tauchen, dann auf 120 C erhitzen. 109 Anisaldehyd-Schwefelsäure für Polyalkohole, Steroide, Terpene... Anisaldehyd (1%) - konz. Schwefelsäure (2%) in Eisessig; Sprühen oder Tauchen, dann auf 120 C erhitzen. Derivatisierungsreagenzien - Beispiele Kaliumpermanganat für Polyalkohole, Polycarbonsäuren, ungesättigte Verbindungen... KMnO 4 (0.1-1%) in Wasser oder 5% Sodalösung; Sprühen oder Tauchen, eventuell auf 100 C erhitzen

56 Derivatisierungsreagenzien - Beispiele Bedampfen mit Ioddämpfen - unspezifischer Nachweis vieler Substanzen... Kleine Porzellanschale mit Iod in einem verschlossenen Glasgefäß - dunkle Flecken. 111 Bedampfen mit Chlor für den Nachweis von Säureamiden: Chlor aus KMnO 4 /HCl erzeugen, Chromatogramm bedampfen, dann mit Fön abblasen und mit KI- Stärke-Lösung besprühen - braune bis blaue Flecken 12. Auswertung Visuelle Auswertung Qualitativ: Kontrolle von Syntheseansätzen (Identifikation, Reinheitsprüfung): R f -Werte sind nicht genau reproduzierbar, deshalb IMMER Referenzsubstanzen am selben Chromatogramm

57 Visuelle Auswertung Halbquantitativ: Konzentrationsreihen - Vergleich, ob Grenzwerte unter/überschritten sind. Auswertung durch visuellen Vergleich oder Messung der Fleckendurchmesser (+/- 10% bestimmbar). 113 Optische Auswertung Direktauswertung mit UV/Vis-DC-Scanner - oberhalb 400 nm mit Wolframlampen (für Farbstoffe) nm mit Deuteriumlampe - Fluoreszenzmessung bei 365 nm mit Hg- Hochdrucklampen

58 Optische Auswertung Auswertung nach Derivatisierung mit Vis- DC-Scanner Quantitative Auswertung: mit Standard im Absorptionsmaximum eichen gleiche Proben- und Standardvolumina auftragen mit DC-Scanner abscannen. 115 Optische Auswertung 116 Kopplungsmethoden zur Substanzidentifikation: Analyse von aufgetrenntem Substanzgemisch mit FTIR (mit Störbanden - bei Suchtstoffen erfolgreich) RAMAN (spezielle HPTLC-Schichten ohne Störbanden) MS 58

59 13. DC-Auswertegeräte UV/Vis DC-Scanner Densitometrische Messung AD-Wandler 16 Bit Quantitative Auswertung 117 UV/Vis DC-Scanner Analoges System mit Lichtquelle ( nm), Spalt, Monochromator, Objektiv und Photomultiplier, AD-Wandler

60 Auswertung mittels Digitalisierung Bildaufnahmeteil: 8-12 Bit Digitalkamera Beleuchtungssystem: 254 nm: Fluoresz.löschung 366 nm: Fluoreszenz nm: Farbstoffe 119 Auswertung mittels Digitalisierung Datenverarbeitungsteil: PC mit Chromatographiesoftware Bildausgabeteil: Videoprinter oder Laser/Tintenstrahldrucker 120 Quantitative Auswertesoftware aber nicht so empfindlich und reproduzierbar 60

61 14. DC-Chromatographie-Kurs Photochemische Umlagerung von Azobenzen Bakk: Dryflash SC, LA: nur DC Trennung von Aminosäuren DC-Analyse eines unbekannten Substanzgemisches 121 DC-Untersuchung von Blütenfarbstoffen (LA) Photochemische Umlagerung von Azobenzen N N hν N N 122 trans (E) - Azobenzen cis (Z) - Problemstellung: Herstellung von einheitlichem (E)-Azobenzen (E) -> (Z)-Isomerisierung von Azobenzen durch UV Auftrennung durch Säulen-Chromatographie (nur Bakk.) DC-Untersuchung der beiden Isomeren (sie besitzen unterschiedliche Polarität) 61

62 Trennung von Aminosäuren R NH 2 O OH + O O O O OH N O O 123 Problemstellung: Auftrennung von Aminosäuren: stark polare Verbindungen (Amino- oder Carboxylgruppe) - Verteilungschromatographie auf Cellulose Visualisierung: meist im UV unsichtbar - daher Derivatisierung mit Ninhydrin DC-Analyse eines unbekannten Substanzgemisches Problemstellung: Probengemisch von 2 Substanzen Vergleich mit 4 Substanzen unterschiedlicher Polarität C H 3 C H 3 O N H N-Phenyl-acetamide Acetanilid Dodecan-1-ol OH (1R,2S,5R)-2-Isopropyl-5-methyl-cyclohexanol Menthol 1,5-Diphenyl-penta-1,4-dien-3-one Dibenzalaceton O CH 3 H 3 C CH 3 OH UV-aktive Substanzen - 2 Substanzen, die nicht im UV-Licht detektiert werden können Verwendung von 3 unterschiedlichen Standardlaufmitteln 62

63 DC-Untersuchung von Blütenfarbstoffen Problemstellung (nur Lehramt): Unterschiedlich gefärbte Blüten Aufarbeitung zu glykosidfreien Farbstoffen DC-Trennung auf Cellulosefolie Detektion durch Farbvergleich, UV- Betrachtung und ph-änderung 125 Protokoll über durchgeführte DC- Trennungen???-Azobenzen???-Azobenzen 126 o. R f -Wert =