Quantitative Betimmung der Vitamine A, D 2, E, K 1, K 2 mittels Microbore-HPLC und Multi-Level-Kalibrierung

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1 Blockpraktikum Chromatographie HPLC Rev Seite 1 Universität Regensburg LS für Organische Chemie Prof. B. König Dr. R. Vasold Abteilung Instrumentelle Analytik CH Quantitative Betimmung der Vitamine A, D 2, E, K 1, K 2 mittels Microbore-HPLC und Multi-Level-Kalibrierung MCH-MSc-M 03 Grundmodul Bioanalytische Chemie Blockpraktikum Chromatographische Methoden HPLC

2 Seite 2 Blockpraktikum Chromatographie HPLC Rev Inhalt I Theoretischer Teil I.1 Einleitung... 3 I.2 Vitamine... 3 I.2.1 Vitamin A Retinol (Axerophthol)... 3 I Vitamin A Hypovitaminosen:... 4 I Vitamin A Hypervitaminosen:... 4 I.2.2 Vitamin D (Calciferol)... 5 I.2.3 Vitamin E (Tocopherol)... 5 I.2.4 Vitamin K (Phyllochinon, Menachinon)... 6 I.3 Zielsetzung... 8 I.4 Vorteile und Grenzen der Microbore-HPLC... 9 I.5 Der Temperatureinfluss in der HPLC I.6 Die Multi-Level-Kalibrierung mit ISTD I.6.1 Wahl eines geeigneten Tracers I.7 Der Trennfaktor α I.8 Bestimmung wichtige Kenngrößen aus einem Chromatogramm Peaksymmetrie Aufgaben zum theoretischen Teil II Experimenteller Teil II.1 siehe Aufgaben

3 Blockpraktikum Chromatographie HPLC Rev Seite 3 I Theoretischer Teil I.1 Einleitung Die HPLC (High Performance/Pressure Liquid Chromatography) ist eine leistungsfähige Methode zur analytischen, wie auch präparativen chromatographischen Trennung und quantitativen Bestimmung von organischen und anorganischen Verbindungen fast aller Klassen. So stellt die HPLC auch in der Medizinischen Chemie eine unerlässliche analytische Methode dar I.2 Vitamine Vitamine sind eine strukturell sehr verschiedenartige Gruppe organischer Verbindungen. Gemeinsam ist ihnen, daß sie für den Menschen essentiell sind und nur in kleinen Mengen benötigt werden. Dadurch unterscheiden sie sich von den anderen Nahrungsbestandteilen. Die meisten Vitamine sind Vorstufen wichtiger Cofaktoren (Coenzyme oder prosthetische Gruppen). Als solche sind sie unerläßlich für die Funktionsfähigkeit des Organismus. Werden sie nicht in ausreichendem Maße zugeführt, sind meist schwerwiegende Mangelerscheinungen die Folge. I.2.1 Vitamin A: Retinol rophthol) Retinol (Axerophthol) gehört zu den Isoprenoiden. Der menschliche Organismus kann Retinol aus β -Carotin erzeugen, daher bezeichnet man β-carotin auch als "Provitamin A": β -Carotin ist ein Kohlenwasserstoff mit vielen konjugierten Doppelbindungen und ist deshalb farbig. Auch Retinol weist ein ausgedehntes konjugiertes p-system auf und ist gefärbt; beide Substanzen sind orange-gelb.

4 Seite 4 Blockpraktikum Chromatographie HPLC Rev Retinol erfüllt verschiedene Funktionen im Organismus. Es ist ein Schutzstoff für die Epithel-Gewebe des Ektoderms, es stabilisiert insbesondere die normale Struktur der Epithelien. Durch Oxidation geht Retinol in den zugehörigen Aldehyd, Retinal, über. Retinal ist Bestandteil des Rhodopsins (Sehpurpurs). Als solches ist es unerläßlich für den Sehprozeß. I Vitamin-A-Hypovitaminosen: Ein Vitamin A-Mangel wirkt sich zunächst in einer Funktionsverminderung des Gesichtssinns aus, da nur unzureichend Rhodopsin produziert bzw. regeneriert werden kann. Dies zeigt sich insbesondere bei abnehmender Lichtstärke: "Nachtblindheit" (Nyktalopie). Bei fortschreitendem Retinol-Mangel treten Veränderungen der Epithelien in den Vordergrund: Es bilden sich verhornte Epithelschichten, die leicht von Mikroorganismen besiedelt werden können. Häufige Folgen sind Xerophthalmie (Verhornung der Cornea - daraus resultiert die alte Bezeichnung "Axerophthol" für Vitamin A), Glossitis (Zungenentzündung), Vulvadystrophie, sowie bei Kindern und Jugendlichen Wachstumsstörungen. Xerophthalmie Bei der Xerophthalmie handelt es sich um Augenveränderungen, die durch Vitamin A-Mangel verursacht sind. Sie ist die häufigste Ursache für eine Erblindung bei Kleinkindern und kommt heute noch häufig in Entwicklungsländern vor. Die ersten Anzeichen sind Nachtblindheit (Nyktalopie) und eine trockene und verdickte Bindehaut. Dann treten Bitot-Flecken und später Epithelläsionen auf. Bei den Bitot-Flecken handelt es sich um mattweiße, meist dreieckige Hautschuppen, die aus verdicktem Oberhautgewebe bestehen und fest auf der darunterliegenden Bindehaut haften. Dehnt sich die Austrocknung auf die Hornhaut aus, nimmt diese ein trübes, glanzloses Aussehen an. Unbehandelt kommt es zu Hornhautgeschwüren mit Einschmelzungsvorgängen (Keratomalazie), wobei das Gewebe abstirbt. Die Folge ist Erblindung. Bitot-Flecken fortgeschrittene Xerophthalmie Bildquelle: Karl-May-Stiftung I Vitamin-A-Hypervitaminosen: Vitamin A gehört zu den wenigen Vitaminen, bei denen bei übermäßiger Zufuhr Hypervitaminosen beobachtet wurden. Sie kamen z.b. bei Polarforschern nach dem Verzehr von Eisbärleber vor. Häufige Symptome sind Schmerzen, Schwindel und Erbrechen, Haarausfall und Verdickung der Knochenhaut (Periost). Während der Schwangerschaft sind teratogene Wirkungen möglich.

5 Blockpraktikum Chromatographie HPLC Rev Seite 5 I.2.2 Vitamin D: Calciferol VitaminD3 VitaminD2 Die aktive Form der Calciferole ist das Calcitriol. Calcitriol reguliert zusammen mit Calcitonin und Parathormon den Calcium- und Phosphatstoffwechsel, es wirkt als Hormon. Calcitriol entsteht durch Hydroxylierung aus Calciol (Cholecalciferol, Vitamin D 3 ) oder Ergocalciol (Ergocalciferol, Vitamin D 2 ). Im menschlichen Organismus werden Ergocalciol aus Ergosterol (kommt in Hefe und einigen Pflanzen vor) und Calciol aus 7-Dehydro-cholesterol und synthetisiert. Da 7-Dehydro-cholesterol aus Cholesterin hergestellt werden kann, handelt es sich bei Calciferol nicht um ein Vitamin im eigentlichen Sinne. Bei unzureichender UV-Einstrahlung treten jedoch Avitaminosen auf: Rachitis bzw. Osteomalazie. Vitamin D und seine Provitamine sind lipophil und werden normalerweise leicht resorbiert. Da das Vitamin im Körper gespeichert wird, kommt es bei (erheblicher) Überdosierung zu einer Hypervitaminose, die zu vermehrter Calciumfreisetzung führt. Sie äußert sich in Nephrokalzinose (Ablagerung von Calciumsalzen in den Tubulusepithelien und dem Nierengewebe), Kopf- und Gelenkschmerzen, Muskelschwäche und Verdauungsstörungen; es können sich Nierensteine bilden. Ein Mangel an Vitamin D führt zu Störungen des Calcium- und Phosphat- Stoffwechsels. Es kommt zunächst zu mangelhafter Calcium-Resorption aus dem Darm. Die dadurch hervorgerufene Hypokalzämie (Absinken des Calciumspiegels im Blut) induziert einen sekundären Hyperparathyreoidismus (kompensatorische Überfunktion der Nebenschilddrüsen Ausschüttung von Parathormon). Parathormon bewirkt die Knochenentkalkung, also die Freisetzung von Calcium aus dem Skelett, sowie eine verminderte Rückresorption von Phosphat in den Nierentubuli. Die Diagnose erfolgt meist durch Röntgen-Untersuchungen und Bestimmung der Calcium- und Phosphat-Konzentration im Serum. Als Therapie werden hohe Dosen an Vitamin D gegeben (oral, außer bei Resorptionsstörungen), ggf. verbunden mit UV-Bestrahlung.

6 Seite 6 Blockpraktikum Chromatographie HPLC Rev I.2.3 Vitamin E: Tocohperol Zu den Tocopherolen ("Vitamin E") gehören mehrere fettlösliche, strukturell ähnlich gebaute Substanzen. Das verbreitetste ist a-tocopherol. Tocopherol wirkt als lipophiles (fettlösliches) "Antioxidans". Es verhindert insbesondere die Oxidation von Bestandteilen der Zellmembran. Die Oxidation wird meist durch einen Angriff "freier Radikale" eingeleitet. Tocopherol kann diese freien Radikale abfangen. ("Radikalfänger") Man nimmt an, daß darauf die eigentliche Wirkung des Tocopherols beruht. Es kann die Alterung - insbesondere der Haut - verlangsamen, beugt Muskelschäden vor, verzögert diabetische Spätschäden und besitzt anticarcinogene Wirkung. Tocopherol darf fettreichen Nahrungsmitteln, z.b. Pflanzenölen, Margarine und Kakao-Produkten, zugesetzt werden, wobei als Höchstgrenze 500 mg/kg für Lebensmittel und 1000 mg/kg für Essenzen und Arzneimittel festgesetzt wurde. Außerdem kommt Vitamin E in Kosmetika zum Einsatz. Die menschliche Nahrung ist tocopherolreich, daher ist eine Unterversorgung sehr selten. Tocopherol kommt in fast allen Pflanzenfetten vor, besonders tocopherolreich sind Weizenkeim- und Baumwollsamenöl. Vitamin E-Mangelkrankheiten sind beim erwachsenen Menschen nicht bekannt. Bei Frühgeborenen wurden - bei stark erniedrigten Plasma-Tocopherol-Werten - Anämien, Ödeme und verstärkte Erregbarkeit beobachtet. In den USA wird a-tocopherol Räucherschinken zugesetzt, um die Bildung cancerogener Nitrosamine zu verhindern. Vitamin E: Tocopherol als Radikalfänger Man nimmt an, daß die wichtigste Funktion des Tocopherols im Abfangen freier Radikale besteht, bevor diese Radikale die Lipide der Zellmembran angreifen. Mit seiner unpolaren Isoprenoid-Seitenkette ist es in der Membran verankert. Der radikalische Angriff ungesättigter Fettsäuren führt zu einer irreversiblen Strukturänderung der Fettsäure. Die Zellmembran wird dabei destabilisiert und ihre Funktionsfähigkeit gestört. Dies kann zum Absterben der Zelle führen.

7 Blockpraktikum Chromatographie HPLC Rev Seite 7 Als "Radikalfänger" dienen Systeme, die besonders leicht mit Radikalen reagieren, wobei ein relativ stabiles, weniger reaktives Produkt entsteht. Meist handelt es sich um leicht oxidierbare aromatische Systeme. Das entstehende aromatische Radikal ist mesomeristabilisiert und dadurch wenig reaktiv. Tocopherol besitzt ein dem Ubihydrochinon ähnliches Hydrochinon-System, das bei der Reaktion mit dem Radikal in ein Chinon-System übergeht. Als Radikalfänger und Antioxidantien dienen außer Tocopherolen auch Ascorbinsäure (Vitamin C), Ester der Gallussäure sowie Derivate und Salze von Milchsäure, Weinsäure und Zitronensäure. I.2.4 Vitamin K: Phyllochinon (Menachinon) Die natürlichen Phyllochinone sind an der 3. Positon des Ringes substituiert: Die Seitenkette besteht bei Vitamin K1 aus vier und bei Vitamin K2 aus sieben Isopren-Resten. Phyllochinone gehören, wie auch die Vitamine A, D und E, zu den Isoprenoiden, die der tierische Organismus nicht selbst aufbauen kann, aber für den Stoffwechsel benötigt. Sie gehören zur Gruppe der fettlöslichen Vitamine. Phyllochinone sind eine Gruppe mehrerer Substanzen: Phyllochinon (Vitamin K 1 ) und Menachonin (Vitamin K 2 ), kommen natürlich vor, Menadion (Vitamin K 3 ), Hydroxychinon (Vitamin K 4 ) und andere Derivate sind synthetische Produkte. Vitamin K wird vor allem bei der Blutgerinnung benötigt. Ein Vitaminmangel führt daher vor allem zu einer Verlängerung der Gerinnungsdauer. Vitamin K 1 kommt hauptsächlich in grünen Pflanzen (z. B. Luzerne, Brennesseln und Früchten) vor, wohingegen Vitamin K 2 ein Stoffwechselprodukt einiger Darmbakterien ist. Deshalb ist eine Hypovitaminose bei einem Erwachsenen nahezu ausgeschlossen. Zu einer Unterversorgung kann es nach oraler Antibiotikagabe (Wachstumshemmung der Vitamin K liefernden Darmbakterien) kommen; dies passiert aber nur bei gleichzeitiger Mangelernährung. Wie bei anderen fettlöslichen Vitaminen auch, kann es bei einer intestinalen Fettresorptionsstörung (z. B. bei Gallengangsverschluss) zu Mangelerscheinungen kommen.

8 Seite 8 Blockpraktikum Chromatographie HPLC Rev Cumarinderivate und 1,3-Indandione sind Antagonisten zu Vitamin K. Sie werden bei Therapien verwendet, bei denen die Blutgerinnungszeit verlängert werden soll (Thrombose- und Infarktprophylaxe). Ein Beispiel für ein Antikoagulans ist Phenprocoumon (4-Hydroxy-3-(1-phenylproply)- cumarin; Marcumar ). Der durch Vitamin-K- Phenprocoumon (Marcumar ) Antagonisten gesenkte Prothrombinspiegel normalisiert sich in der Regel nach Stunden wieder. I.3 Zielsetzung Ziel dieses Praktikums ist es, eine spezielle Fragestellung aus dem Bereich der Medizinischen Chemie mit der Methode der Hochdruckflüssigchromatographie zu lösen. In diesem Praktikum sollen u.a. aufbauend auf das im HPLC Grundpraktikum (siehe Praktikumsskript / 5. Semester HPLC bzw. Skriptum Analytische Chemie II, Seite 1-30). gelernte, die einzelnen Bestandteile und Komponenten eines HPLC-Trennsystems sowie die Funktionsweise vertieft werden, wie: die stationäre Phase (in diesem Fall eine sog. Microbore-RP-Phase). die mobile Phase mit Eluentenversorgung, Pumpen und Einspritzventil (Autosampler), die Detektoren, hier besonders der DAD-Detektor und der ISOPLOT die Steuerungs- und Auswertesoftware; die Trennleistung eines Systems an einem Beispiel aus der medizinischen Chemie beurteilt werden; Die Kenntnis wichtiger chromatographische Kenngrößen, wie Retentionszeit, Durchbruchszeit, Retentionsvolumen, Durchbruchsvolumen, Wanderungsgeschwindigkeit der mobilen Phase, Kapazitätsfaktor etc. und deren Berechnung, sowie die quantitative Bestimmung mittels Internem Standard wird in diesem Praktikum als bekannt vorausgesetzt. (siehe Praktikumsskript 5. Semester / Skriptum Analytische Chemie II Seite 1-30). Die gleichzeitige quantitative Bestimmung mehrerer chemischer Substanzen mit der Methode des Internen Standards über einen größeren Konzentrationsbereich (Multi-Level-Kalibrierung) soll hingegen neu eingeübt werden.

9 Blockpraktikum Chromatographie HPLC Rev Seite 9 Injektor Pumpe Microbore-Säule Mobile Phasen DAD- Detektor Fluoreszenzdetektor Computergesteuerte Auswertesoftware Aufbau der verwendeten HPLC Apparatur I.4 Vorteile und Grenzen der Microbore-HPLC Obwohl noch immer viele HPLC-Anwender mit Säulen von z.b. 4.6 mm Innendurchmesser arbeiten, geht man in der modernen HPLC mehr und mehr dazu über, Säulen mit einem deutlich reduzierterem Innendurchmesser (< 2.0 mm ), sog. Microbore-Säulen zu verwenden. Es gibt gewichtige Gründe dafür, den Innendurchmesser sogar noch weiter zu reduzieren (z.b. Kapillar- HPLC, ID 50 μm).

10 Seite 10 Blockpraktikum Chromatographie HPLC Rev Vorteile der Microbore-HPLC: Der Lösungsmittelverbrauch sinkt mit dem Quadrat des Säulendurchmessers. Mittlerweile unentbehrlich für Spurenanalytik bei begrenzter Probenmenge. Einige Kopplungsverfahren (z.b.) LC-MS benötigen kleine Volumenströme an mobiler Phase. Mit Microbore-Säulen kann die Nachweisempfindlichkeit deutlich gesteigert werden. Grenzen der Microbore-HPLC: Mit der Reduktion des Volumenflusses steigen auch die apparativen Anforderungen z.b. an das Pumpensystem. Es müssen konstante, sehr kleine Flussraten (bis hin zu 6ul/min bei z.b. 1mm-Säulen) gefördert werden können. Die Reproduzierbarkeit von Gradientenprofilen muss gewährleistet sein. Oft ist eine Miniaturisierung der Detektorzelle (Micro,Semi-microzellen) erforderlich. Das Kapillarsystem der HPLC-Apparatur muss entsprechend kleine Innendurchmesser aufweisen. I.5 Der Temperatureinfluss in der HPLC Es ist nicht möglich allgemein gültige Regeln für den Einfluß der Temperatur auf HPLC-Trennungen aufzustellen. Oft wird die Trennleistung einer Säule bei erhöhter Temperatur besser, weil die Viskosität der mobilen Phase abnimmt und dadurch der Stoffaustausch erleichtert wird. In manchen Fällen kann jedoch auch eine Abnahme der Trennleistung auftreten. Ebenso kann der Trennfaktor α (Definition: siehe Skriptum Analytische Chemie II) entweder zu oder abnehmen. Vorteile einer Temperaturerhöhung: Die Analysenzeit kann oft deutlich verkürzt werden. Bei hochviskosen Proben ist eine Erhöhung der Temperatur oft unerlässlich Bei hochviskoser mobiler Phase kann durch eine Temperaturerhöhung der Druck während der HPLC-Trennung oft deutlich reduziert werden.

11 Blockpraktikum Chromatographie HPLC Rev Seite 11 Nachteile einer Temperaturerhöhung: Lösungsmittel oder Probenkomponenten zersetzen sich leichter Mit Erhöhung der Temperatur steigt auch der Dampfdruck des Lösungsmittels, damit steigt auch die Gefahr der Blasenbildung z.b. im Detektor. Mit Steigender Temperatur nimmt die Löslichkeit von Silicagel in allen mobilen Phasen stark zu (die Temperatur darf bei Silicasäulen max. 120 C, bei chemisch gebundenen Phasen max. 80 C betragen). I.6 Die Multi-Level-Kalibrierung mit Internem Standard (ISTD) In der HPLC ist es von größter Wichtigkeit, dass die vom Detektor erhaltenen Daten quantitativ ausgewertet werden können und somit unter geeigneten Bedingungen eine quantitative Bestimmung der untersuchten Komponenten erlauben. Als Meßgröße dient in der Regel die Fläche unter einem Peak. Bei exakt symmetrischen (Gauß-) Peaks kann auch die Peakhöhe als Maß herangezogen werden. Peakfläche bzw. Peakhöhe sind dann proportional zur Menge der zu analysierenden Substanz. Das Detektorsignal ist jedoch außer von der Konzentration des Analyten auch stark von dessen Extinktionskoeffizienten abhängig. So können zwei Substanzen in einer Lösung durchaus die gleiche Konzentration besitzen, aber in der Messung eine gänzlich andere Fläche (oder Peakhöhe) ergeben. Aus diesem Grund sollte bei quantitativen Analysen vorzugsweise mit einem Internen Standard gearbeitet werden oder ein vergleichbarer Korrekturfaktor verwendet werden. I.6.1 Wahl eines geeigneten Tracers Beim Verfahren des Internen Standards gibt man sowohl der zu untersuchenden Probenlösung, als auch jeder Stammlösung eine weitere Komponente, den sog. Internen Standard (Tracer) zu. Eine Substanz, die als interner Standard eingesetzt werden soll, muß aber unbedingt einige wichtige Bedingungen erfüllen: sie darf nicht von vorneherein in der zu untersuchenden Realprobe vorkommen. sie muß chemisch stabil bzw. inert sein gegenüber den restlichen Komponenten in der Probe, sowie gegenüber dem Packungsmaterial der Säule und der verwendeten mobilen Phase. sie sollte in möglichst hoher Reinheit vorliegen.

12 Seite 12 Blockpraktikum Chromatographie HPLC Rev sie sollte über möglichst ähnliche physikalisch-chemische Eigenschaften (Retentionszeit, Detektorverhalten, Löslichkeit, etc.) wie die zu bestimmende Substanz verfügen. sie sollte von allen in der Realprobe enthaltenen Substanzen unter den chromatographischen Bedingungen gut getrennt werden und in vergleichbarer Konzentration zugesetzt werden. Nach der HPLC-Analyse unterschiedlich konzentrierter Eichlösungen, welche die Stammlösung mit den genauen Einwaagen der zu bestimmenden reinen Probenkomponenten, und den internen Standard in jeweils exakt gleicher Konzentration enthalten müssen, läßt sich für jede Substanz i ein sog. Kalibrierfaktor KF i aus den Kalibrierläufen K folgendermaßen ermitteln: Flächenverhältnisse K a Tr a K i = KF i K m Tr m i K Steigung = KF i Konzentrationsverhältnisse Multi-Level-Kalibrierung mit internem (ISTD) m x i mi x = KF a i a x i x Tr m Tr = Masse der Komponente i in der Probenlösung (X) m x Tr = Masse des Tracers in der a x i a x Tr Probenlösung (X) = Fläche der Komponente i = Fläche des Tracers Da auch jeder Probenlösung der interne Standard in exakt gleicher Menge und gleicher Konzentration (Masse m Tr ) zugesetzt wird, lassen sich mit Hilfe der aus den Eichungen ermittelten KF-Werte die Massen der gesuchten Komponenten nach obiger Formel ermitteln.

13 Blockpraktikum Chromatographie HPLC Rev Seite 13 I.7 Der Trennfaktor α (siehe Skriptum Analytische Chemie II) Der Quotient aus den Retentionsfaktoren k 2 und k 1 zweier benachbarter Peaks wird als Selektivität (oder Trennfaktor) bezeichnet und gibt Aufschluß über die Güte einer Trennung: k2 ts (X 2 ) mit k k k t 1 s (X 1 ) 2 1 I.8 Bestimmung wichtige Kenngrößen aus einem Chromatogramm Ein Musterchromatogramm mit den elementaren Kenngrößen t m, t R (X) und t S (X) ist im Skriptum Analytische Chemie II, Kapitel II.8 (Abb. 1.2) abgebildet. Auf einige weitere wichtige Kenngrößen sei im Folgenden hingewiesen. Im Idealfall sollten die Peaks eines Chromatogramms als symmetrische Gaußkurven eluieren. Aus einem solchen idealen Musterchromatogramm lassen sich dann weitere wichtige Größen, wie die Diffuse Bandenverbreiterung τ (X) sowie t w (X) als Basisbreite ablesen: Detektorsignal t R (X 1 ) t R (X 2 ) 2 (X 1 ) h p h p t m 2 (X 2 ) 0,61 h p 0,61 h p Probenaufgabe 15 s 40 s 80 s 4 (X 1 )= t w (X 1 ) 4 (X 2 ) = t w (X 2 ) t s (X 1 ) t s (X 2 ) Zeit [ s ]

14 Seite 14 Blockpraktikum Chromatographie HPLC Rev Die Auflösung zweier benachbarter Peaks hängt natürlich nicht nur von deren Trennfaktoren, sondern auch von der jeweiligen Peakbreite ab. Das kann man sich an nebenstehendem Chromatogramm klar machen. Die Retentionszeiten der beiden benachbarten Peaks und damit der Trennfaktor bleiben gleich, aber die Peakbreiten und damit die Auflösung ändern sich. t R (X 1 ) t R (X 2 ) schlecht aufgelöstes Peakpaar Aus dieser Erkenntnis heraus kann man eine geometrische Definition für die Auflösung R S zweier gaußförmiger Peaks definieren und R S berechnen. Die entsprechenden, dazu benötigten Größen kann man aus obigem Chromatogramm entnehmen. R S ( t t ) R (X 2 ) R (X 1 ) 05, ( t t ) w (X 1 ) w (X 2 ) I.9 Peaksymmetrie Betrachtet man die Peaks eines Chromatogramms genauer, so erkennt man, dass diese in den meisten Fällen nicht symmetrische Gauß-Form zeigen, sondern oft Tailing oder Fronting (Leading) aufweisen. Geringe Abweichungen von der Gauß- Form sind bedeutungslos, eigentlich fast normal. Stärkere Asymmetrien lassen jedoch darauf schliessen, daß das chromatographische System nicht optimiert ist. Weil starkes Tailing die Bodenzahl der Säule verkleinert und damit die Auflösung sinkt und zudem auch die Integration erschwert wird, sollte man die Ursache, wenn möglich, eliminieren.

15 Blockpraktikum Chromatographie HPLC Rev Seite Aufgaben zum theoretischen Teil: 1.) Nennen sie vier Vorteile der Microbore-HPLC? 2.) Welche Anforderungen an das apparativen System bzw. welche Voraussetzungen müssen für die Durchführung einer Microbore-HPLC erfüllt sein? 3.) Nennen sie drei Vorteile die eine Temperaturerhöhung in der HPLC mit sich bringen kann? 4.) Nennen sie drei Nachteile, die eine Temperaturerhöhung in der HPLC mit sich bringen kann? 5.) Welche Eigenschaften muss ein geeigneter Tracer aufweisen (4 Beispie le)? 6.) Wie ist der Retentionsfaktor (Kapazitätsfaktor) in Abhängigkeit von Retentions- und Durchbruchszeit definiert? 7.) Welche Folgen kann starkes Tailing haben (3 Beispiele).

16 Seite 16 Blockpraktikum Chromatographie HPLC Rev II II.1 Experimenteller Teil Durchführung der HPLC-Analysen Es steht folgende Vitaminlösung zur Verfügung: Vitamin-Stammlösung (Lösung A) bestehend aus: Vit K 3 Vit A acetat Vit D 2 Vit E Vit E acetat Vit K 1 [0.200 mg/ml MeCN] [0.333 mg/ml MeCN] [0.667 mg/ml MeCN] [0.400 mg/ml MeCN] [0.267 mg/ml MeCN] [1.333 mg/ml MeCN] Aufgabe 1) Chromatographieren sie obige Lösung aus den Vitaminen K 3, Aac, D 2, E, Eac und K 1 bei einer Säulentemperatur von 20 C / Inj. Vol. 1 ul / 220nm / Run Time = 15 min / Flow = 0.4 mlmin -1 (Chromatogramm_00.D). Aufgabe 2) Nach Ende der Analyse soll eine Zuordnung aller relevanten Peaks mit Hilfe der Diodenarray-Spektrenbibliothek erfolgen. Erklären sie in diesem Zusammenhang kurz die wesentlichen Vorteile eines DAD-Detektors. Aufgabe 3) Nach Identifikation der Peaks soll die Messung bei einer Säulentemperatur von 40 C wiederholt werden (Chromatogramm_01.D). Aufgabe 4) Vergleichen Sie an Hand der UV-Spektren beide HPLC-Trennungen miteinander und interpretieren sie das Ergebnis anhand der ermittelten Retentionszeiten. Aufgabe 5) Vergleichen sie die Güte der Trennung bei den Peaks der Vitamine Eac und K 1 bei 20 C und bei 40 C. Welche Säulentemperatur ist für eine möglichst schnelle aber ausreichende Trennung zu bevorzugen.

17 Blockpraktikum Chromatographie HPLC Rev Seite 17 Aufgabe 6) Nach der unter Punkt 5 ermittelten Messtemperatur soll ein geeigneter Tracer für eine spätere quantitative Analyse gefunden werden. Welche Eigenschaften muss ein geeigneter Tracer aufweisen? Aufgabe 7) Sie haben die Wahl zwischen zwei Tracerlösungen: Lösung 1) Lösung 2) Vitamin K3 [0.06mg/ml MeCN] 9-Phenylanthracen [0.06 mg/ml MeCN] Für welchen Tracer entscheiden Sie sich und warum? Aufgabe 8) Vermessen sie den Tracer, für den sie sich entschieden haben bei der unter Aufgabe 5 ermittelten optimalen Trenntemperatur und einer Wellenlänge von 254 nm (Inj. Vol 1 ul). (Chromatogramm_02.D) Beurteilen sie die Lage des Tracers anhand seiner Retentionszeit im Vergleich zum Vitamin-Chromatogramm. Aufgabe 9) Vergleichen sie die für den Tracer ermittelte UV-Spur (254nm) mit der gleichzeitig gemessenen Fluoreszenz-Spur (0.Ordnung). Was stellen sie bezüglich der Retentionszeiten fest. Begründen sie das Ergebnis. Aufgabe 10) Geben sie zu 100ul Vitamin-Stammlösung (Lösung A) 100 ul Tracer- Stammlösung [0.06mg/mlACN]. Daraus erhalten Sie eine neue Lösung (Lösung A+T) aus Vitaminen und Tracer mit den folgenden Konzentrationen: K 3 Tracer A(acetat) D 2 E E(acetat) K 1 [0.100 mg/ml ACN] [0.030 mg/ml ACN] [0.167 mg/ml ACN] [0.334 mg/ml ACN] [0.200 mg/ml ACN] [0.134 mg/ml ACN] [0.667 mg/ml ACN]

18 Seite 18 Blockpraktikum Chromatographie HPLC Rev Chromatographieren sie diese Lösung unter folgenden chromatographischen Bedingungen: Flow: 0.4 ml/min Solvent A (H2O) = 5%, Solvent B(MeCN) = 95%, isokratisch Stop Time: 7 min Inj. Vol: 2 ul (Warum?) Wellenlänge = 254nm, BW=10 nm, Ref, off FLD Einstellung: 0.Ordnung / PMTGain 6 / 55Hz Als Ergebnis erhalten sie Chromatogramm_03.D. Aufgabe 11) Vergleichen sie Chromatogramm_03.D mit dem bei 220 nm aufgenommen Chromatogramm_01.D. Was stellen Sie fest. Aufgabe 12) Wechseln sie zur Darstellung von Chromatogramm_03 in den Isoplot. Wählen sie eine Absorptionsskala von 0 bis 2000 mau. Aufgabe 13) Ermitteln sie durch Variation von Retentionszeit- und Wellenlängenskala im Isoplot die jeweils optimale Detektionswellenlänge (ab >200 nm) für die Vitamine K 3, Aac, D 2, E, Eac, und K 1, sowie für den Tracer. Tragen sie die Ergebnisse der optimierten Wellenlängenspur in folgende Skala ein: Signal A: nm nm nm nm nm min min min min ab 4.4 min Aufgabe 14) Generieren sie nun eine neue Messmethode in die sie die optimierten Detektorparameter gemäß Aufgabe 13 für die Signalspur A in eine Timetable über

19 Blockpraktikum Chromatographie HPLC Rev Seite 19 Aufgabe 15) Chromatographieren sie Lösung A+T mit den so optimierten Detektoreinstellungen (Chromatogramm_04.D). Aufgabe 16) Für eine Multi-Level-Kalibrierung ( 3 Levels) sollen aus Lösung A folgende verdünntere Lösungen B und C hergestellt werden: Lösung A (Level 1) Lösung B (Level 2) Lösung C (Level 3) Faktor unverdünnt x 0.75 (150ul A + 50ul MeCN) x 0.50 (100ul A + 100ul MeCN) Jetzt werden jeweils 100 ul der Lösungen A-C mit jeweils 100 ul der Tracerlösung [0.06 mg/ml] versetzt und man erhält: Lösung A+T [mg/ml MeCN] Lösung B+T [mg/ml MeCN] Lösung C+T [mg/ml MeCN] K Tracer Aac D E Eac K Für die quantitative Vitaminbestimmung aus einer unbekannten Probe X soll die entsprechende Sequence-Methode erstellt werden. Aufgabe 17) Vermessen sie als letzte Probe die unbekannte Vitaminlösung X+T. Erstellen Sie danach für die gemessene Sequence die Multi-Level-Calibration-Table und ermitteln sie die in der Probe enthaltenen Vitaminkonzentrationen durch erstellten des ISTD-Reports (Detail-Report).