Evolution von Genexpression

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1 Evolution von Genexpression Evolutionsbiologie II für Bachelor-/Lehramtsstudierende 20. Februar 2017 Miriam Linnenbrink

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3 Ausgangspunkt: Eine Zelle Bsp. Tierzelle Bild:

4 Molekulare Grundlage DNA-Sequenz Beispiel: und teilen über 99.8% ihrer Genome!

5 Genexpression Die Expression von Genen beschreibt den Prozess, bei dem die in der DNA gespeicherte Information für die Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt oder Zeitraum nutzbar gemacht wird.

6 Genexpression Die Expression von Genen beschreibt den Prozess, bei dem die in der DNA gespeicherte Information für die Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt oder Zeitraum nutzbar gemacht wird.

7 Verschiedene Zelltypen paradoja7.com

8 Embryonalentwicklung biokurs.de

9 Zentrales Dogma der Molekularbiologie Francis Crick Nukleotide: ACGT ATGGTAGCT DNA Replikation Transkription 4 Nukleotide: ACGU AUGGUAGCU Translation 20 Aminosäuren

10 Genexpression

11 Toxine Anitkörper Kollagen Keratin Enzyme Genetischer Code Nicht-überlappend, degeneriert 4 3 = 64 Triplets/Codons (inkl. START/STOP) AUG GUA GCU UAA Start Val Ala STOP

12 Genexpression 1. Promotor 2. Transkriptionsfaktor 3. Enhancer/Silencer Kontrollsequenzen weitere TFs nötig

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14 Verschiedene Phänotypen woher kommt die Information?? Komplexer Zusammenhang zwischen Gen und Phänotyp: Verschiedene Arten von Molekülen, Signalen, Interaktionen... Phänotypischer Evolution liegen viele Mechanismen zugrunde Strukturelle Veränderungen: Veränderungen in der kodierenden DNA-Sequenz, CNV Regulatorische Veränderungen: Veränderungen in der Menge des produzierten Proteins

15 1. Start und Stop der Transkription 2. Produktion der prä-mrna 3. Transport der mrna ins Cytoplasma 4. Start der Translation 5. mrna und Proteinstabilität Genregulation

16 Differentialle Genregulation - cis vs. trans Cis Änderung in der regulatorischen Sequenz (Promoter oder Enhancer des Zielgens) trans Änderung in einem anderen, nicht verbundenen Gen (z.b. Transkriptionsfaktoren), welche die Genexpression des Zielgens beeinflusst Cheung & Spielman, 2009 Wie können wir diese beiden Möglichkeiten unterscheiden?

17 Evolutionary changes in cis and trans gene regulation Wittkopp et al. (2004) Kreuzung: / / x D. melanogaster D. simulans Vergleich der Expressionsstärken in Genen der Eltern und der F1- Hybriden Methode: Pyrosequenzierung Sehr sensitiv Expression von 2 Allelen in einem heterozygoten Individuum kann unterschieden werden

18 Evolutionary changes in cis and trans gene regulation Wittkopp et al. (2004) Erwartung: cis Beide Allele sollten unterschiedlich transkribiert werden in den Hybriden und den Expressionsunterschieden zwischen den Eltern entsprechen trans Beide Allele sollten gleich exprimiert werden in den Hybriden ( gleicher Pool an Transkriptionsfaktoren) Ergebnis: Test von 29 Genen mit unterschiedlicher Expression zwischen den beiden parentalen Arten 28 (97%) zeigten Expressionsunterschiede in den Hybriden (cis) Für 50% dieser Gene waren diese Unterschiede ausschließlich durch cis-änderungen erklärbar

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20 Quantitative Trait Loci Bereich(e) im Genom, die phänotypische Auswirkungen auf ein quantitatives Merkmal haben (z.b. Körpergröße) Identifizierung über viele über das Genom verteilte Marker natürliche Populationen, Hybridstudien Pallares et al. 2014

21 expression Quantitative Trait Loci (eqtl) Zusammenhang zwischen DNA-Polymorphismen und Expressionsunterschieden Kombination von Transkriptomdaten und Genotyping SNPs (= Single Nucleotide Polymorphisms), welche mit Genexpression korrelieren, heißen eqtl Wolen & Miles, 2012 Gutes Review: Albert and Kruglyak 2015

22 Beispiele für regulatorische Genexpression Laktoseintoleranz KITLG ist assoziiert der menschlichen Haarfarbe Balancierende Selektion am Gen B4galnt2 in der Hausmaus

23 Laktoseintoleranz Laktoseintoleranz bei Kindern: Gendefekt aufgrund von einer Mutation im Gen LCT Laktoseintoleranz bei Erwachsenen: Geringe oder fehlende Produktion von Lactase Die Expression von LCT wird durch ein regulatorisches Element in einem Gen nahe LCT gesteuert, welches polymorph ist in der menschlichen Population

24 KITLG ist assoziiert mit der menschlichen Haarfarbe Guenther et al. 2014

25 Balancierende Selektion am Gen B4galnt2 in der Hausmaus fish to humans mice Cis-regulatory mutation C57BL6/J RIIIS/J RIIIS/J lab strain model for von Willebrand Disease two divergent haplotypes Johnsen et al Johnsen et al Mohlke et al Montiel et al Sweeney et al. 1990

26 Balancierende Selektion am Gen B4galnt2 in der Hausmaus cost: prolonged bleeding benefit:??? balancing selection Johnsen et al. 2009

27 domesticus M. m. musculus M. spretus Balancierende Selektion am Gen B4galnt2 in der Hausmaus M. m. MC (Johnsen et al. 2009) IR C57/C57 RIII/RIII C57/RIII CRK/CRK no expression SP no expression KH Es sind anscheinend 2 Regionen in der cis-regulatorischen Region für die differentielle Expression verantwortlich Linnenbrink et al. 2011, MBE

28 Balancierende Selektion am Gen B4galnt2 in der Hausmaus Staubach et al Linnenbrink et al., unpublished results

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30 Wie viele geschlechtsspezifische exprimierte Gene gibt es? Absolute Anzahl hängt von verschiedenen Faktoren ab: Art und Gewebe Experimentelle Methode Grad der Replikation Statistische Kriterien zur Definition von Expressionsunterschieden Beispiele: - D. melanogaster, ganze Fliegen: ~57% der Gene zeigen geschlechtsspezifische Expression - M. musculus, somatische Gewebe (Yang et al. 2006): 10,000 Gene mit geschlechtsspezifischer Expression

31 Veränderung in Expression kann zu phänotypischen Unterschieden und Adaption führen Bisher: Änderungen im Phänotyp durch Änderung der Genexpression eines einzigen Lokus mit großem Effekt (QTL-Analysen, candidate gene approaches) Was ist mit komplexen Phänotypen? Beispiel: Verschiedene Kasten in Feuerameisen Evolution of gene expression in fire ants: the effects of developemental stage, caste and species Ometto et al., Mol Biol Evol 2010; 19: Vergleichende Genexpressionsanalysen (comparative transcriptomics) und Modelle zur Evolution von Genexpression

32 Wittkopp et al. 2007

33 Veränderung in Expression kann zu phänotypischen Unterschieden und Adaption führen Schnabelform in Darwin-Finken The calmodulin pathway and evolution of elongated beak morphology in Darwin's finches Abzhanov et al., Nature 2006; 442:563-7 Fellfarbe in Sandmäusen The developmental role of agouti in color pattern evolution Manceau et al., Science 2011; 331:1062-5

34 Neutrale oder adaptive Evolution? Harrison et al. (2011) Anwendung der neutralen Theorie genetischer Evolution (Kimura): Arten von Selektion können bestimmt werden durch die Berechnung des Verhältnisses von Expressionsvariation innerhalb und zwischen Populationen I. Variation innerhalb Populationen < Divergenz zwischen Populationen positive Selektion II. Variation innerhalb und zwischen Populationen klein negative Selektion III. Variation innerhalb Populationen Divergenz zwischen Populationen genetische Drift

35 Negative Selektion ist stärker für Gene, die in mehreren Geweben exprimiert werden Khaitovich et al. (2006)

36 Expressionsunterschiede in Geweben zwischen Mensch und Schimpanse Khaitovich et al. (2006)

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38 Positive Selektion?

39 Wie können Expressionsunterschiede festgestellt werden?

40 Methodenübersicht 2 Möglichkeiten: 1) Quantifizierung der Menge an mrna Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) Northern Blots Microarrays Next-Generation-Sequencing (RNA-Seq) 2) Quantifizierung der Proteinmenge Western Blot (zb immunologische Verfahren) Massenspektrometrie Bradford Assay (photometrisch) Lowry Assay (photometrisch)

41 Quantifizierung der Menge an mrna Microarrays Beispiel: Geschlechtsspezifische Expression Sample 1 Sample 2

42 Ein typisches RNA-Seq Experiment 2 Schritte: a) Gewinnung der Daten b) Analyse der Daten Martin & Wang, 2011

43 Bradford Assay Farbreaktrion bei der Coomassie Blau von rot (456nm) zu blau (595nm) umschlägt, wenn es an das zu untersuchende Protein bindet. Protenkonzentrationen zwischen µg/mL Photometrische Messung

44 Quantifizierung der Proteinmenge Lowry Protein Assay labome.com 2+ Cu -Ionen bilden mit Peptidbindungen einen quadratisch-planaren, blauvioletten Komplex 2+ Reduktion 2+ der Cu -Ionen durch bestimmte AS-Reste (v.a. Tyr und Trp) Cu -Ionen dienen als Reduktionsmittel für Molybdän- und Wolframat-Ionen (enthalten im Folin-Ciocalteu-Phenol-Reagens, kurz: Folin-Phenol) Entstehendes Molybdänblau kann im Photometer bei 750nm gemessen werden

45 Danke für s Zuhören!