Einfluss sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe auf das Fettsäuremuster und die endogene Fettsäuresynthese der Regenbogenforelle

Transkript

1 Einfluss sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe auf das Fettsäuremuster und die endogene Fettsäuresynthese der Regenbogenforelle Claudia Grimm Gesellschaft für Marine Aquakultur mbh 7. Büsumer Fischtag

2 Einleitung Omega-3 EPA DHA aid.de Einleitung Konversion von Vorläuferfettsäure zu Eicosapentaensäure (20:5n-3, EPA) und Docosahexaensäure (22:6n-3, DHA) unzureichend bei Menschen essentiell 2

3 Einleitung im Fisch variiert Bedarf an essentiellen Fettsäuren (EFA) je nach Spezies und Entwicklungsstadium abhängig von Umwelt und Ernährung Marin EFA: C 20/22 PUFA wie EPA, DHA und Arachidonsäure (20:4 n-6) Jtsv Süßwasser EFA: hauptsächlich n-3 & n-6 C 18 PUFA, auch C 20/22 PUFA Jtsv Einleitung geringe Versorgung mit langkettigen mehrfach ungesättigten Fettsäuren (LC-PUFA) führt zu eventueller Beeinträchtigung der Produktqualität 3

4 Einleitung Süßwasser natürliche Nahrung gering an EPA und DHA endogene n-3 LC-PUFA Synthese Vorläufer Fettsäure: ALA (α-linolensäure) Konversionsrate abhängig von: Spezies Fettsäuren in der Nahrung Menge an ALA, EPA und DHA Temperatur Regenbogenforelle: < 6 % ALA wird zu EPA umgewandelt < 1 % zu DHA [1] Konversionsrate ist langsam (2-4 Wochen [2] ) Problem bei vegetarischem Futter Peroxisom Endoplasmatisches Reticulum 18:3n-3 ALA 18:4n-3 SDA 20:4n-3 20:5n-3 EPA 22:5n-3 DPA 24:5n-3 24:6n-3 22:6n-3 DHA 6-Desaturierung 2C-Elongation 5-Desaturierung 2C-Elongation 2C-Elongation 6-Desaturierung β- Oxidation Syntheseweg aus Elongation und Desaturierung von n-3 PUFAs. (nach Burdge 2004 & Sargent et al. 2002). 4

5 Modifikation der hepatischen n-3 Synthese durch sekundäre Pflanzenstoffe 6-Desaturase Enzym 6-Desaturase mrna ALA 6-Desaturierung 6-Desaturase Einleitung Peroxisom Endoplasmatisches Reticulum 18:4n-3 20:4n-3 EPA 22:5n-3 24:5n-3 24:6n-3 DHA Syntheseweg aus Elongation und Desaturierung von n-3 PUFAs. (nach Burdge 2004 & Sargent et al. 2002). 2C-Elongation 5-Desaturierung 2C-Elongation 2C-Elongation 6-Desaturierung β- Oxidation? Enzym + direkt + PPARα mrna sekundärer Pflanzenstoff + + PPARα indirekt indirekt 5

6 Eingesetzte sekundäre Pflanzenstoffe Resveratrol (RV) Genistein (G) Potentieller Ligand für PPARα [3] Potentieller Ligand für PPARα [5] Potentiell direkter Einfluss auf 6-Desaturase [4] Stilbenoid aus Trauben und Japanischem Staudenknöterich Antioxidant Antioxidant Isoflavon aus Soya und Rotklee Einleitung Kardioprotektive und Antikarzinogene Eigenschaften Geringe estrogene Wirkung Phytoestrogen Kardioprotektive und Antidiabetische Eigenschaften 6

7 V1: Durchführung V juvenile Regenbogenforellen (36,35 ± 0,03 g) 9 Futtermittel triplikater Ansatz 56 Fütterungstage bei 15 C Start- und Endbeprobung Nährstoffzusammensetzung Fettsäureanalyse Futtermittel + + qrt-pcr ELISA Ganzkörperhomogenat + + V1: Material & Methoden Leber

8 V1: Versuchsdiäten V 1 Rohstoffe [% TM] F4 F2 F0 Fischmehl (Clupea sp.) 10,0 10,0 10,0 Casein 5,9 5,9 5,9 Raps Konzentrat 13,0 13,0 13,0 Erbsenprotein Isolat 13,6 13,6 13,6 Weizengluten 17,9 17,9 17,9 Weizenstärke 20,0 20,0 20,0 Vitamin Mineral Premix 0,5 0,5 0,5 Lysin 0,7 0,7 0,7 Dicalcium-phosphat 1,0 1,0 1,0 Füllstoff* 6,8 6,8 6,8 Fischöl 4,0 2,0 - Leinöl 1,5 0,9 0,4 Rapsöl 3,2 6,1 9,0 Sonnenblumenöl 1,9 1,6 1,2 F4 Kontrolldiät F2 50% Fischölaustausch F0 100% Fischölaustausch 0,3 % 0,3 % V1: Material & Methoden Nährstoffzusammensetzung [% TM] F4 F2 F0 F4+RV F2+RV F0+RV F4+G F2+G F0+G Trockenmasse 93,2 93,1 93,2 93,3 92,9 91,7 92,8 93,1 93,1 Rohprotein 50,1 50,3 50,2 50,0 50,3 50,8 50,5 50,5 50,1 Rohfett 14,9 15,1 15,1 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 15,1 Rohasche 6,4 6,4 6,4 6,4 6,4 6,2 6,4 6,3 6,5 KOH** 28,6 28,2 28,4 28,6 28,3 28,0 28,1 28,2 28,4 Bruttoenergie [MJ kg -1 TM] 22,7 22,7 22,7 22,8 22,8 22,9 22,7 22,7 22,7 * Füllstoff: CMC = Carboxy-methyl-cellulose ** KOH: gesamt Kohlenhydrat= 100-(Rohprotein+Rohfett+Rohasche) 8

9 V1: Fettsäuremuster Diäten V F4 F2 F0 Kontrolldiät 50% Fischölaustausch 100% Fischölaustausch PUFA [% FAMEs] EPA DHA RV G V1: Ergebnisse % FAMEs F4 F2 F0 F4+RV F2+RV F0+RV F4+G F2+G F0+G EPA/DHA 0,75 0,72 0,61 0,75 0,72 0,54 0,75 0,72 0,61 ALA 10,95 10,11 9,29 11,00 10,07 8,93 10,75 10,03 9,28 n-3/n-6 0,58 0,49 0,43 0,58 0,48 0,40 0,58 0,48 0,39 PUFA = Polyunsaturated fatty acid, mehrfach ungesättigte Fettsäure FAME = Fettsäure-Methyl-Ester 9

10 V1: EPA+DHA im Ganzkörper V 1 PUFA [% FAMEs] ,0 ab ab ab a bc c ab ab bc RV G EPA DHA Initial (EPA+DHA) F4 F2 F0 Kontrolldiät Resveratrol hat positiven Effekt auf relativen EPA+DHA Gehalt aber negativen Effekt auf Rohfettgehalt 50% Fischölaustausch 100% Fischölaustausch V1: Ergebnisse Rohfett [% OS] 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 a a a a b b a a a RV PUFA = mehrfach ungesättigte Fettsäure, FAME = Fettsäure-Methyl-Ester, OS = Originalsubstanz, Mittelwerte±SD, n=3, initial n=1, unterschiedliche Buschstaben=signifikant unterschiedlich (p<0,05) G Gründe: schlechtere Futteraufnahme schlechtere Futterverwertung (FCR, PER, PPV) 10

11 V1: mrna Level (qrt-pcr) V 1 Daten und Analysen: Staats & Billerbeck 6-Desaturase mrna 6-Desaturase [Kopien/µL] * * * F4 Kontrolldiät F2 50% Fischölaustausch F0 100% Fischölaustausch PPARα mrna RV G Ende Initial 8 V1: Ergebnisse PPARα [Kopien/µL] * * * RV G RV und G wirken nicht auf 6-Desaturase Expression und eher hemmend auf PPARα Espression PPARα und 6-Desaturase mrna Kopienanzahlen sind normiert auf das Housekeeping-Gen EF1α. Mittelwerte±SD, n=3, initial n=1, *=signifikant unterschiedlich (p<0,05) 11

12 V1: Proteinmenge (ELISA) V 1 Daten und Analysen: Staats 6-Desaturase (ng/mg Protein) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 6-Desaturase * F4 F2 F0 Ende Initial Kontrolldiät 50% Fischölaustausch 100% Fischölaustausch RV G Mittelwerte±SD, n=3, initial n=1, *=signifikant unterschiedlich (p<0,05) V1: Ergebnisse Zugabe von RV und G erhöht die Menge an 6-Desaturase 12

13 Zwischenfazit V1 V 1 Fettsäuremuster: Erhöhung der relativen Menge an EPA+DHA durch Resveratrol mrna-expression: Keine signifikante Wirkung auf 6-Desaturase Expression eher hemmende Wirkung auf PPARα Expression Proteinmenge: Erhöhung der 6-Desaturase Menge durch Resveratrol und Genistein V1: Ergebnisse in vitro Versuche mit Humanen HepG2 Leberzellen: Resveratrol & Genistein steigern 6-Desaturase Expression bei PPARα Expression keine Effekte in vitro Versuche: Staats & Knopp GMA 13

14 V2: Durchführung V juvenile Regenbogenforellen (81,57 ± 0,50 g) 6 Futtermittel veränderte Formulierung triplikater Ansatz 62 Fütterungstage bei 18 C Start- und Endbeprobung Nährstoffzusammensetzung Fettsäureanalyse V2: Material & Methoden Futtermittel + + Ganzkörperhomogenat

15 V2: Versuchsdiäten V 2 Rohstoffe [% TM] F4 F0 Fischmehl (Clupea sp.) 10,0 10,0 Sojamehl200 13,5 13,5 Gelatine 3,0 3,0 FedermehlGeproGold 2,0 2,0 Blutmehl 5,5 5,5 Erbsen Protein Isolat 10,0 10,0 Weizengluten 23,0 23,0 Weizenstärke 19,5 19,5 Vitamin Mineral Premix 0,5 0,5 Lysin 1,2 1,2 Dicalcium-phosphate 0,5 0,5 Füllstoff (Bentonit) 1,37 1,37 Fischöl 4,0 - Leinöl 2,00 0,36 Rapsöl 2,05 9,57 Sonnenblumenöl 1,88 - F4 Kontrolldiät F0 0% Fischöl 0,3 % 0,3 % V2: Material & Methoden Nährstoffzusammensetzung [% TM] F4 F0 F4+RV F0+RV F4+G F0+G Trockenmasse 84,7 82,6 84,9 82,2 84,2 83,9 Rohprotein 52,9 53,5 53,2 53,2 52,7 53,1 Rohfett 14,7 14,9 14,6 14,9 14,7 14,9 Rohasche 5,7 5,7 5,7 5,7 5,7 5,7 KOH* 26,7 25,9 26,6 26,2 26,9 26,3 Bruttoenergie [MJ kg -1 TM] 22,7 22,9 22,8 22,9 22,7 22,8 * KOH: gesamt Kohlenhydrat=100-(Rohprotein+Rohfett+Rohasche) 15

16 V2: Fettsäuremuster Diäten V 2 PUFA [% FAMEs] EPA DHA F4 F0 Kontrolldiät 0% Fischöl 1 0 F4 F0 F4 F0 F4 F0 RV G V1: Ergebnisse % of FAMEs F4 F0 F4+RV F0+RV F4+G F0+G EPA/DHA 0,67 0,59 0,72 0,61 0,73 0,59 ALA 11,97 8,65 12,22 8,63 12,18 8,61 n-3/n-6 0,59 0,39 0,59 0,38 0,59 0,38 PUFA = Polyunsaturated fatty acid, mehrfach ungesättigte Fettsäure FAME = Fettsäure-Methyl-Ester 16

17 V2: EPA+DHA im Ganzkörper V 2 16 PUFA [% FAMEs] EPA DHA initial (EPA+DHA) F4 F0 Kontrolldiät 0% Fischöl V2: Ergebnisse Rohfett [% OS] a a a b ab ab F4 F2 F4 F2 F4 F2 RV G a a ab b ab ab F4 F0 F4 F0 F4 F0 RV G Resveratrol hat positiven Effekt auf relativen EPA+DHA Gehalt aber negativen Effekt auf Rohfettgehalt Bestätigung von V1 PUFA = mehrfach ungesättigte Fettsäure, FAME = Fettsäure-Methyl-Ester, OS = Originalsubstanz, Mittelwerte±SD, n=3, initial n=1, unterschiedliche Buschstaben=signifikant unterschiedlich (p<0,05) 17

18 V1 und V2: Fazit Erhöhung des EPA und DHA Gehaltes durch Resveratrol V 1 EPA V 2 DHA Analyse der zugrundeliegenden Mechanismen deutet auf eine Erhöhung der Proteinmenge von 6-Desaturase in den Leberzellen hin indirekter Weg über PPARα Expression nicht bestätigt Steigerung der 6-Desaturase Expression bislang nur im humanen Zellmodell bestätigt gleichzeitig geringerer Rohfettgehalt in Gruppen mit supplementierten Diäten V1+V2: Fazit der sinkende Fettgehalt überlagert den Anstieg an EPA und DHA, so dass absolut betrachtet kein positiver Effekt vermerkt werden kann Anti-Obesity Effekt [4], [6], [7] Jtsv 18

19 Ausblick Systemspezifische Evaluierung des Einsatzes der Pflanzenstoffe Welche Menge kann/muss eingesetzt werden? Apetenzsteigerung beim Einsatz von Resveratrol und Genistein GMA GMA Einsatz von Rohstoffen, die etwaigen unerwünschten Geschmack der Pflanzenstoffe überdecken Salzwasserspezies Ausblick Anti-Obesity-Effekt Wie kommt es zu der Abnahme des Rohfettgehalts der Fische beim Einsatz von Resveratrol in der Diät? Verfügbarkeit der Makronährstoffe für den Fisch? (Verfügbarkeitsstudie) Jtsv 19

20 Danke für die Aufmerksamkeit! Claudia Grimm Gesellschaft für Marine Aquakultur mbh 20

21 Bildnachweise und Literaturangaben Literatur: Einleitung [1] Tocher, D, R., Sargent., J. R. (1990). Incorporation into Phospholipid Classes and Metabolism via Desaturation and Elongation of Various 14C-Labelled (N-3) and (N-6) Polyunsaturated Fatty Acids in Trout Astrocytes in Primary Culture. J Neurochem 54(6): [2] Bell, M. V., Dick, J. R., Porter, A. E. A (2001). Biosynthesis and Tissue Deposition of Docosahexaenoic Acid (22 6n 3) in Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss). Lipids 36(10): [3] Frémont, L. (2000): Biological effects of resveratrol. Life Sciences, 8, [4] Momchilova, A., Petkova, D., Staneva, G., Markovska, T., Pankov, R., Skrobanska, R., Nikolova-Karakashian, M., Koumanov, K. (2014): Resveratrol alters the lipid composition, metabolism and peroxide level in senescent rat hepatocytes. Chemico-Biological Interactions, 207, [5] Kim, S., Shin, H.-J., Kim, S.Y., Kim, J.H., Lee, Y.S., Kim, D.-H., Lee, M.-O. (2004): Genistein enhances expression of genes involved in fatty acid catabolism through activation of PPARalpha. Molecular and cellular endocrinology, 2, [6] Ajmo, J. M, Rogers, C.Q., Pennock, B., You, M. (2008). Resveratrol Alleviates Alcoholic Fatty Liver in Mice. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology 295(4): G (September 17, 2014). [7] Baile, C A., Yang, J.-Y., Rayalam, S., Hartzell, D., Lai, C.-Y., Andersen, C., Della-Fera, M. A. (2011). Effect of Resveratrol on Fat Mobilization. Annals of the New York Academy of Sciences 1215(1): Burdge, G. (2004). α-linolenic Acid Metabolism in Men and Women: Nutritional and Biological Implications. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care 7(2): Linolenic_acid_metabolism_in_men_and_women_.6.aspx. Sargent, J.R., Tocher, D.R., Bell, J.G., (2002). The Lipids, in: Halver, J.E., Hardy, R.W. (Eds.), Fish Nutrition. Academic Press, London, p Bildnachweise (Folie 6): baumschule-horstmann.de, discoverlife.org, looduskalender.ee, veoverde.com 21